Rongeurs

15 180 souris vont être utilisées dans l'étude de la réponse immunitaire de la vessie, chacune pouvant recevoir quatre injections et deux administrations sous anesthésie, puis subir jusqu'à neuf prélèvements urinaires et trois prélèvements sanguins. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées pour que leurs tissus soient collectés. Le porteur décrit par ailleurs deux modèles sans animaux déjà développés dans son laboratoire, un organe sur puce à partir de cellules progénitrices humaines et un modèle ex vivo réutilisant des tissus issus d'autres projets. L'objectif du projet tient en une phrase, les nuisances attendues en deux lignes, et aucun calcul n'est produit pour justifier ces 15 180 animaux.

Objectifs

L’objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection et aux immunothérapies dans la vessie.

Bénéfices attendus

Nous comprendrons mieux le fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie ce qui permettra d’identifier des cibles thérapeutiques afin de développer de nouvelles thérapie et ainsi améliorer la prise en charge et le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 4 injections, 2 administrations sous anesthésie, 9 prélèvements urinaires, 3 prélèvements sanguins maximum. Chaque intervention sera inférieure à 30 secondes par animal.

Impact sur les animaux

Les injections et administrations de composés ainsi que les prélèvements peuvent provoquer une légère douleur de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus.

Remplacement

En complément de ce projet in vivo, nous avons développé deux modèles pour remplacer nos expériences sur les animaux. Le premier est un modèle d'organe sur puce utilisant des cellules progénitrices humaines. Ce modèle peut remplacer certains aspects du modèle d'infection in vivo, comme la mesure de l'attachement des bactéries aux tissus. Nous pouvons également tester le rôle du sexe biologique dans ce modèle en utilisant des cellules de femmes ou d’hommes ou de l'urine de femmes ou d’hommes. Le deuxième modèle est un modèle ex vivo permettant la réutilisation d'animaux ou de tissus provenant d'autres projets.

Réduction

Le nombre de groupe de souris (groupes témoins et groupes tests) a été optimisé pour utiliser le moins d'animaux possible. Dans la mesure du possible, sans compromettre l'intégrité de l'expérience, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes tests afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'utilisation de tissus provenant d'autres équipes qui mettent à mort des souris pour d'autres recherches (notre modèle ex vivo) contribuera également à réduire le nombre de souris dont nous avons besoin. Enfin, une veille bibliographique sera effectuée afin de ne pas répéter inutilement des connaissances bien établies.

Raffinement

Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress et la douleur au cours de ces expériences. Les souris seront surveillées plusieurs fois par semaine pour vérifier leur bien-être. En cas de signes de douleur, des analgésiques seront administrés. Enfin, les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car les infections urinaires chez les souris reflètent, à bien des égards, la maladie observée chez l'homme. La voie utilisée par les bactéries chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme modèle approprié pour l'infection des voies urinaires. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 48 semaines. Cet âge chez la souris est équivalent à l'âge adulte chez l'homme.

Infectées par gavage avec un parasite intestinal, 980 souris immunodéficientes passent jusqu'à douze jours hébergées sur grille en cage métabolique pour que leurs fèces soient récoltées. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue, l'agent en cause étant transmissible à l'humain. Le porteur décrit un ramollissement des fèces pendant plusieurs jours, une prostration possible et une légère perte de poids à partir du douzième jour après l'infection. La finalité est l'entretien d'un stock : Cryptosporidium parvum ne se congèle pas et perd son infectiosité au bout de quatre mois environ, ce qui impose plusieurs passages par animal chaque année, 900 souris étant prévues pour la seule multiplication des souches.

Objectifs

Cryptosporidium parvum est un parasite unicellulaire qui se multiplie dans l’intestin avant d’être excrété dans le milieu extérieur avec les selles. Il est responsable de la cryptosporidiose, une maladie conduisant à des diarrhées sévères chez les individus jeunes ou immunodéprimés, que ce soit chez les ruminants ou chez l’humain. Les moyens de contrôle vis-à-vis de la cryptosporidiose sont limités et de nouvelles cibles thérapeutiques doivent donc être identifiées. La possibilité de modifier génétiquement le parasite est un outil précieux pour nos recherches portant sur la réponse immunitaire de l’hôte face à l’infection et la mise en place de nouvelles stratégies de contrôle : suivi d’infection in vitro et in vivo, identification de facteurs de virulence, génération de mutants ou de vaccins, test d’efficacité de nouveaux traitements. De plus, nos projets de recherche requièrent des quantités importantes de parasites. Comme il n’existe pas de système in vitro permettant de générer ou de multiplier efficacement une souche transgénique, nous utilisons pour cela un modèle murin sensible à la cryptosporidiose. Par ailleurs, le parasite ne peut être congelé, il peut être conservé à 4 °C, mais au-delà de plusieurs mois (environ 4 mois) une diminution progressive de sa capacité à infecter les cellules est observée. Nos études exigent des parasites fraichement multipliés, aussi plusieurs multiplications par an sont nécessaires pour conserver chaque souche générée. Ce projet a pour but de générer puis de maintenir des souches transgéniques de Cryptosporidium parvum in vivo, puisque celles-ci ne peuvent être congelées ou stockées au réfrigérateur plus de 4 mois (perte de leur infectiosité).

Bénéfices attendus

De nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiées pour lutter plus efficacement contre la cryptosporidiose, que ce soit en santé humaine ou animale. Le développement et l’utilisation de souches parasitaires transgéniques permettra d’accélérer les recherches conduisant à l’identification de nouvelles molécules. En effet, ces souches permettent de rendre diverses applications possibles (ex : génération de mutants ou de vaccins, identification et caractérisation de facteurs de virulence parasitaires par génétique inverse) et/ou plus aisées, robustes et rapides au laboratoire (ex : criblage et test d’efficacité de nouveaux traitements, suivi d’infection in vitro et in vivo). Des multiplications régulières sur animaux sont nécessaires pour conserver et maintenir l’infectiosité de chaque nouvelle souche transgénique générée, et ainsi permettre la continuité des études au laboratoire.

Procédures

Les souris adultes vigiles seront toutes soumises à une ou deux administration(s) orale(s) par gavage, sous contention. Ce geste dure quelques dizaines de secondes. Les animaux reçoivent deux administrations de ce type dans la transfection (au maximum 80 souris sur 5 ans) et une seule dans la multiplication (au maximum 900 souris sur 5 ans).

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis sous contention à une (inoculation de parasites) ou deux (inoculation de sodium bicarbonate puis parasites) administration(s) orale(s) selon la procédure considérée. Le gavage réalisé sur animal vigile génère un stress du fait de la contention et une gêne par l’introduction de la sonde par voie buccale. Il n’y a pas de souffrance liée au gavage oral. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée si le gavage est effectué en douceur par du personnel expérimenté, ce qui est toujours le cas. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Chez les rongeurs, on n’observe pas de diarrhée mais un ramollissement des fèces durant plusieurs jours et éventuellement une prostration des animaux et une légère perte de poids à partir d’une douzaine de jours après infection par le parasite. L’hébergement des animaux sur grille en cage métabolique durant une partie du protocole (12 jours maximum) est nécessaire pour la récolte des parasites qui constitue l’objectif du projet. Les déplacements ou postures statiques sur la grille peuvent engendrer de l’inconfort pour les animaux.

Devenir

Les animaux entrent dans un protocole expérimental en zone confinée et sont tous infectés avec un agent pathogène zoonotique de classe II (risque pour l'humain et pour l’environnement). Ils sont donc mis à mort en fin d’expérimentation selon les normes réglementaires et de sécurité biologique.

Remplacement

Pour l’obtention de nouveaux parasites infectieux, la complétion du cycle parasitaire incluant une phase de reproduction sexuée est requise (durée de 3-4 jours). Les cultures cellulaires conventionnelles, utilisées par le laboratoire, permettent de reproduire le début du cycle mais pas la fécondation ni la production de nouveaux parasites infectieux. La complétion du cycle parasitaire a été récemment obtenue par quelques laboratoires dans le monde, mais uniquement à l’aide d’approches impliquant un système de bio-ingénierie ou basées sur des structures cellulaires tridimensionnelles dérivées de cellules souches. Surtout, ces quelques approches in vitro non conventionnelles permettent l’obtention d’oocystes en très faible quantité. Ce faible rendement est très éloigné des quantités dont le laboratoire a besoin pour ses recherches, et qui ne peuvent être obtenues à l’heure actuelle qu’à partir d’un modèle in vivo.

Réduction

Les effectifs d’animaux utilisés pour ce projet ont été définis d’après la littérature et notre expérience sur les 8 dernières années. Ils permettent d’assurer l’obtention du nombre de parasites requis pour nos études, tout en utilisant le moins d’animaux possible.

Raffinement

Avant la phase de récolte des matières fécales, les animaux sont hébergés au maximum par 4 dans des cages sur litière et un enrichissement comprenant des feuilles de papier cellulose, bâtonnets de bois et abri en polycarbonate est ajouté. Durant la phase de récolte des matières fécales, les souris sont toujours hébergées au maximum par 4 sur grille dans des cages de récolte et durant 12 jours maximum. Ces cages de récolte sont enrichies de bâtonnet de bois, d’un abri en polycarbonate et d’une plateforme de repos ajoutée au centre de la cage, afin que les animaux puissent monter dessus pour se reposer et ne pas être continuellement sur cette grille. Les animaux reçoivent une récompense alimentaire (ex : graines de tournesol, popcorn…) après l’administration orale des parasites. Pour limiter l’impact de l’infection sur le poids des animaux et éviter une éventuelle déshydratation, un complément alimentaire riche en calories (DietGel® Boost, Clear H20) sera ajouté sur une plateforme dans chaque cage de récolte dès le début de l’excrétion parasitaire et cette supplémentation sera maintenue jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis seront définis dans une grille de suivi clinique (perte de poids, apparence, comportement de l’animal) et tout animal atteignant l’un de ces points limites sera pris en charge sans délai.

Choix des espèces

Les espèces pouvant être infectées par Cryptosporidium parvum sont nombreuses. En élevage, les ruminants sont les plus touchés par la cryptosporidiose. Les souris adultes immunodéficientes utilisées pour la totalité de ce projet représentent un bon modèle d’étude de cette maladie car il reproduit bien la sensibilité des patients immunodéprimés. Ce modèle permet également une multiplication du parasite sur animaux exempt d'agents pathogènes spécifiques et opportunistes, ce qui évite les contaminations par d’autres espèces ou souches de Cryptosporidium, ou par d’autres parasites ou agents pathogènes. Cette lignée murine est plus sensible aux infections (notamment par des parasites).

Opérées de la cochlée entre leur sixième et leur neuvième jour de vie pour y recevoir un vecteur viral, 504 gerbilles de Mongolie attendent au moins huit semaines avant une seconde intervention dont elles ne se réveillent pas. Pendant celle-ci, leurs potentiels évoqués auditifs sont enregistrés de quatre à douze heures sous anesthésie entretenue par réinjections. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour la totalité de l'effectif, et le porteur ne mentionne comme nuisances que la douleur suivant l'injection intracochléaire et le stress lié aux piqûres. Toutes sont tuées pour que leur oreille interne et leur cerveau soient examinés au microscope, l'objet étant de préparer un implant cochléaire fonctionnant à la lumière plutôt qu'à l'électricité.

Objectifs

En 2050, près de 2,5 milliards de personnes dans le monde auront des problèmes d’audition. Pour 700 millions d’entre elles, ces problèmes seront très graves. Aujourd’hui, la meilleure solution pour les personnes qui n’entendent presque plus, c’est l’implant cochléaire électrique. C’est un petit appareil placé dans l’oreille interne. Il capte les sons et les transforme en courants électriques pour faire travailler directement les nerfs de l’oreille. Mais il y a un souci : l’électricité stimule trop large. Elle excite beaucoup de nerfs en même temps, ce qui fait perdre la précision des sons. Par exemple, dans un restaurant bruyant ou dans une classe, c’est difficile de comprendre une conversation. Pour améliorer ça, nous travaillons sur une nouvelle idée : utiliser la lumière au lieu de l’électricité. Comment ? On rend les nerfs sensibles à la lumière grâce à des petites protéines spéciales. Ensuite, on envoie de la lumière avec des mini-lampes dans l’oreille. Cette lumière active les nerfs, mais de manière beaucoup plus précise, un peu comme un rayon laser au lieu d’un éclair. Grâce à ça, on espère que les personnes entendront beaucoup mieux et comprendront les voix même dans le bruit. Notre projet a deux buts : Trouver la meilleure manière de rendre les nerfs sensibles à la lumière. Savoir exactement quels nerfs réagissent à cette lumière.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, un million de personnes qui ne pouvaient plus entendre utilisent déjà des implants cochléaires électriques. Grâce à ces appareils, la plupart arrivent à comprendre la parole quand il n’y a pas de bruit, par exemple dans une pièce calme. Mais dès qu’il y a du bruit autour – dans la rue, un restaurant, une salle de classe ou un bureau – ça devient très difficile. Parfois, ils n’arrivent presque plus à comprendre ce qu’on leur dit. Et il y a un autre problème : ils ne peuvent pas vraiment profiter de la musique, car les sons sont trop simplifiés. Pour améliorer ça, nous développons un implant cochléaire qui utilise la lumière. Cette nouvelle technologie devrait permettre d’entendre plus clairement, même quand il y a du bruit, et peut-être aussi de mieux profiter des sons comme la musique. Pour y arriver, il faut deux étapes importantes : Trouver la meilleure façon de rendre les nerfs de l’oreille sensibles à la lumière. Comprendre comment ces nerfs réagissent à la lumière pour pouvoir les contrôler de manière très précise. Ces recherches sont essentielles pour amener un jour cette nouvelle technologie aux patients et leur rendre une audition la plus naturelle possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales. La première procédure consiste à injecter un vecteur viral dans les cochlées des animaux entre le sixième et le neuvième jour de vie. Cette procédure permettra de photosensibiliser les neurones cochléaires. Cette procédure nécessitera environ 30 minutes par animal, en incluant l'induction de l'anesthésie et le réveil. La seconde procédure chirurgicale sera réalisée au moins 8 semaines après l’injection du vecteur viral, lors d’une procédure durant laquelle les animaux ne se réveilleront pas. Durant cette procédure, les potentiels évoqués auditifs seront enregistrés sur une durée de 4 à 12 heures. L'état de profonde anesthésie sera maintenu par reinjection régulière d'anesthésiant durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les différentes nuisances ont été identifiées: - suite à l’injection intracochléaire à 6-9 jours de vie, douleur post-opératoire; - injection d’antalgiques et anesthétiques : stress

Devenir

À la fin de chaque étape, les animaux devront être euthanasiés (endormis définitivement sans douleur). C’est nécessaire car nous devons analyser leur oreille interne (cochlée) et leur cerveau pour vérifier si la thérapie génique a bien fonctionné. Pour cela, il faut prélever ces organes afin de les examiner au microscope.

Remplacement

Les travaux prévus nécessitent une organisation cellulaire extrêmement complexe, formant un réseau qui ne peut pas encore être reproduit en culture cellulaire ou dans les modèles in silico les plus sophistiqués. Une telle organisation cellulaire complexe ne peut être trouvée que chez d'autres mammifères, tels que les rongeurs. En outre, l'objectif du présent travail est de prédire les performances d'un implant cochléaire optique pour l'homme. Nous devons donc utiliser un modèle animal dont le système auditif est anatomiquement et physiologiquement aussi proche que possible de celui de l'homme. Nous avons donc choisi la gerbille de Mongolie. Les données générées seront partagées avec les scientifiques qui développent des modèles informatiques des voies auditives, ce qui permettra, nous l'espérons, d'utiliser des modèles in silico plutôt que des modèles animaux dans le cadre d'études futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin grâce à un outil statistique. L’objectif est d’utiliser le moins d’animaux possible, tout en s’assurant que les résultats soient fiables. Pour cela, nous avons choisi des critères précis pour garantir que les expériences soient assez puissantes pour montrer un effet réel. Dans ce projet, les deux sexes (mâles et femelles) seront inclus sans faire de distinction.

Raffinement

Le bien-être des animaux est notre priorité pendant toute la durée du projet. Si un animal se retrouve seul, nous ferons en sorte qu’il ne reste pas isolé en le mettant avec d’autres animaux. Au début, un séparateur percé sera utilisé pour qu’ils puissent s’habituer les uns aux autres sans risque. Nous savons que manipuler les animaux peut être stressant pour eux. C’est pourquoi nous allons les habituer doucement à venir d’eux-mêmes sur la main des chercheurs, plutôt que d’être attrapés. Après l’injection (faite très tôt après la naissance), les animaux seront surveillés tous les jours et recevront des médicaments contre la douleur pendant deux jours. Ces médicaments seront donnés après une courte anesthésie (moins de 5 minutes) pour éviter tout stress. Si nous voyons qu’un petit n’est pas bien (par exemple, s’il n’est plus soigné par sa mère), il recevra des soins supplémentaires après avis d’un vétérinaire. Si malgré tout son état ne s’améliore pas, il sera endormi sans douleur. De même, si un animal montre des signes de souffrance plus tard, nous utiliserons une grille d’évaluation spéciale et, après avis du vétérinaire, il recevra des soins ou sera euthanasié.

Choix des espèces

Notre objectif est de savoir si l’implant cochléaire optique pourrait bien fonctionner chez l’être humain. Pour cela, nous devons faire des tests sur un animal qui a une oreille très semblable à celle de l’homme. Nous avons choisi la gerbille de Mongolie, un petit rongeur. Elle entend presque comme nous et sa grande oreille facilite l’accès à la cochlée pour y mettre un implant ou injecter le vecteur viral. Le vecteur viral (qui sert à rendre les nerfs sensibles à la lumière) sera injecté quand les petits ont entre 6 et 9 jours. Pourquoi ? Parce que le traitement marche beaucoup mieux à cet âge. Parce qu’à cet âge, l’os autour de l’oreille n’est pas encore formé, ce qui permet de faire l’injection sans opération lourde. Après 10 jours, cet os se durcit et il faudrait une chirurgie beaucoup plus invasive. Enfin, les mesures (tests) seront faites au moins 8 semaines plus tard, quand les animaux seront adultes et que leur système nerveux sera complètement développé.

616 souris se répartissent en quatre groupes selon ce qu'elles subissent : 136 reçoivent deux injections d'air sous la peau, 208 sont infectées par voie orale après cinq jours d'antibiotiques, 160 sont infectées par inhalation sous anesthésie profonde, et 112 développent une inflammation intestinale provoquée par un produit ajouté à leur eau de boisson. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue, un prélèvement sanguin terminal précédant le retrait des poumons et des intestins. Le porteur décrit pour les dernières des selles molles ou sanglantes après cinq à sept jours de traitement, une perte de poids et une baisse d'activité. L'objet est de vérifier si une protéine identifiée in vitro joue le même rôle dans un organisme vivant, le porteur affirmant que le recours à un "organisme entier" reste "indispensable" pour cette question.

Objectifs

Le système immunitaire possède un premier niveau de défense, appelé immunité innée, qui réagit très rapidement lorsqu’un microbe entre dans le corps. Ce système reconnaît certains éléments typiques des microbes (comme ceux produits par les bactéries) et déclenche une réaction de protection, souvent sous forme d’inflammation, pour limiter l’infection. Certaines substances produites uniquement par les bactéries jouent un rôle important dans cette réaction. Pour qu’elles soient détectées par les cellules du corps, elles doivent d’abord entrer à l’intérieur de celles-ci. Notre équipe a récemment identifié une protéine qui pourrait agir comme une porte d’entrée, permettant à ces substances de pénétrer dans les cellules. Ce rôle a déjà été observé lors d’expériences en laboratoire. L’objectif de ce projet est maintenant de vérifier si cette « porte d’entrée » joue le même rôle dans un organisme entier, dans différents contextes d’inflammation. Pour cela, nous utiliserons d’abord un modèle d’inflammation localisée sous la peau, afin de mieux comprendre comment cette réponse se met en place. Nous étudierons ensuite la réaction inflammatoire dans les poumons, un organe souvent exposé aux bactéries, notamment dans des maladies comme la mucoviscidose. Enfin, nous nous intéresserons à l’intestin, un environnement naturellement riche en bactéries, pour voir si cette voie est impliquée dans des maladies intestinales chroniques, comme la maladie de Crohn. Là encore, des bactéries spécifiques seront utilisées pour déclencher une inflammation et tester le rôle de la protéine étudiée. En complément, un modèle d’inflammation intestinale chronique sera utilisé pour observer si l’absence de cette protéine aggrave ou au contraire limite l’inflammation intestinale, reproduisant des situations proches de maladies humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines substances produites par des bactéries déclenchent une réaction inflammatoire dans le corps. En identifiant le rôle d’une protéine potentiellement responsable du passage de ces substances à l’intérieur des cellules, le projet permettra de mieux comprendre un mécanisme fondamental de la réponse immunitaire. Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques et médicaux. Sur le plan fondamental, ce travail permettra d’expliquer un processus mal connu, essentiel à la détection des bactéries par le système immunitaire. Sur le plan médical, ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires chroniques (comme la maladie de Crohn) ou certaines infections respiratoires (comme celles observées dans la mucoviscidose), en identifiant de nouvelles cibles potentielles pour réguler l’inflammation. À terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, visant à limiter une inflammation excessive sans affaiblir la capacité du corps à se défendre contre les microbes.

Procédures

136 animaux recevront deux injections d’air en sous-cutanées ainsi qu’une injection d’un traitement (qui dureront 1 minute) et également une injection dans la cavité abdominale (30 secondes). Toutes ces injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Au cours du suivi, les animaux seront pesés le lendemain de l’injection d’air et si une diminution de poids de plus de 10% est visible, elles seront pesées quotidiennement pendant la fin de l’expérience (la pesée dure environ 30 secondes). 208 souris seront traitées avec un mélange d’antibiotiques pendant 5 jours. Puis les souris recevront une injection dans la cavité abdominale (30 secondes). Le lendemain, elles seront infectées par voie orale avec une suspension bactérienne (30 secondes). Au cours du suivi, les animaux seront pesés quotidiennement (la pesée dure environ 30 secondes) pendant la durée de l’expérience. 160 souris recevront une injection dans la cavité abdominale (30 secondes). Puis le lendemain, elles recevront une injection afin d’avoir une anesthésie profonde (30 secondes), puis les souris seront infectées par inhalation sous anesthésie (1 minute). Finalement, une inflammation intestinale sera provoquée chez 112 souris en leur administrant un traitement dans l’eau de boisson. Toutes les souris auront un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les gestes réalisés dans ce projet peuvent provoquer un stress temporaire ou une douleur légère au point d'injection. Certains traitements peuvent entraîner une réaction du corps qui se manifeste par une fièvre ou une sensation de mal-être. Pendant les infections bactériennes, les souris pourront ressentir certains effets liés à l’infection, comme de la fièvre quelques heures après l’exposition, et un état de fatigue ou d’inconfort. Selon la zone touchée, les animaux pourront présenter une irritation dans la gorge et de l’inconfort digestif ou des voies respiratoires. Cela peut entraîner une baisse de l’appétit, une perte de poids et une déshydratation. Lorsque l’inflammation touche l’intestin, les animaux peuvent ressentir de la douleur ou un inconfort digestif, ce qui peut provoquer du stress. On peut alors observer des selles plus molles ou des traces de sang, généralement après 5 à 7 jours de traitement. Cela s’accompagne souvent d’une perte de poids et d’une réduction de l’activité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de prélever des organes indispensables à l'analyse (poumons, intestins). Cette étape est nécessaire pour obtenir des données biologiques impossibles à collecter in vivo.

Remplacement

Des tests réalisés en laboratoire ont déjà été réalisés et ont permis de confirmer le rôle de la protéine d’intérêt au niveau cellulaire. Cependant, les analyses en dehors d’un organisme ne permettent pas de reproduire la complexité du système immunitaire. L’utilisation d’un organisme entier reste indispensable pour comprendre le rôle de cette protéine.

Réduction

De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet afin de limiter au maximum le nombre de répétitions tout en garantissant la robustesse des résultats. De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Le nombre d'animaux est calculé au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation des souris à la contention (i.e. la manipulation de souris) (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser l'angoisse des souris lors de l'expérience . 2) Anesthésie gazeuse pour chaque acte potentiellement douloureux pour la souris 3) Minimisation de la fréquence de manipulation. 4) Les souris seront surveillées quotidiennement (quand cela est necessaire) et individuellement pendant la durée de l’expérimentation. Leur poids et leur état général sera suivi. Toute souris arrivant à un point limite sera immédiatement retirée de l’étude, anesthésiée sous anesthésie générale gazeuse et euthanasiée. Les doses de traitement et la fréquence d’administration des molécules résultent de plusieurs retours d’expériences bibliographiques.

Choix des espèces

Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, vertébré Mammifère) avec un fonctionnement immunitaire et hormonal reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal pour l’étude des délétions de gènes comme utilisé dans ce projet. La souris est un modèle très utilisé pour étudier les maladies inflammatoires, que ce soit pulmonaires ou intestinales. Elle présente de nombreux avantages : les chercheurs disposent de nombreux outils adaptés à cette espèce pour mesurer l’inflammation et des modèles expérimentaux déjà bien connus, comme celui de l’inflammation intestinale. De plus, la souris réagit de manière similaire à l’humain pour ce qui concerne certaines réponses immunitaires. Tout cela en fait un modèle particulièrement adapté à ce projet. Les expériences débuteront à l’âge de 6 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature.

Soumis à un clampage de l'aorte au-dessus des artères rénales, 80 rats subissent une intervention de soixante à soixante-douze minutes destinée à provoquer une ischémie puis une reperfusion des reins. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une molécule bloquant l'héparanase et un préconditionnement ischémique. Parmi les nuisances attendues, le porteur cite la contention au moment de l'injection des anesthésiques, avant les douleurs abdominales dès le réveil et la réduction de la mobilité. L'apparition de signes cliniques de souffrance, respiration difficile, poils hérissés, prostration, constitue le seuil à partir duquel un rat est retiré de l'étude et mis à mort.

Objectifs

Le traitement chirurgical ouvert des anévrismes de l’aorte peut nécessiter de bloquer temporairement la circulation du sang vers les reins (clampage des artères rénales). Cette interruption de la circulation provoque un manque d’oxygène suivi d’une reperfusion, ce qui peut endommager les reins et entraîner une insuffisance rénale aiguë (AKI). Cette atteinte rénale est le plus souvent réversible, mais elle augmente le risque de développer plus tard une insuffisance rénale chronique et des maladies cardiovasculaires. Après une chirurgie d’anévrisme juxta-rénal, environ un quart des patients (24 %) présentent une AKI, et ce chiffre peut atteindre 30 % pour les anévrismes situés plus haut (sus- ou pararénaux). Dans 8 à 10 % des cas, une dialyse est nécessaire après l’opération. Nous faisons l’hypothèse qu’une structure appelée glycocalyx endothélial, qui recouvre la surface interne des vaisseaux sanguins, joue un rôle important dans ces lésions rénales. Lorsqu’il est dégradé, notamment sous l’effet d’une enzyme appelée héparanase, il favorise des réactions inflammatoires et des lésions durables du rein. Le but de notre projet est d’étudier, sur un modèle animal, le rôle de cette enzyme héparanase dans les lésions rénales liées au clampage aortique sus-rénal, et de tester deux approches pour limiter ces dommages : 1. L’utilisation d’une molécule qui bloque l’action de l’héparanase. 2. L’application d’un préconditionnement ischémique (une technique visant à préparer le rein à mieux supporter le manque d’oxygène).

Bénéfices attendus

Nous comptons évaluer et caractériser les effets protecteurs de l'utilisation d'une anti-héparanase et du préconditionnement ischémique dans un modèle d'ischémie-reperfusion viscérale reproduisant la cure chirurgicale d'un anévrisme de l'aorte abdominale supra-rénale. Ce projet s'inscrit dans une thématique de recherche sur l'intêret des méthodes de protection lors des chirurgies aortiques. En effet le précondionnement constitue une voie de recherche déjà étudiée chez l'Homme. L'utilisation d'une antihéparanase pourrait aussi constituer une approche thérapeutique interessante et innovante en préservant la fonction endothéliale.

Procédures

La procédure expérimentale concerne l’ensemble des 80 rats inclus dans l’étude. Pour tous les groupes, l’intervention chirurgicale durera entre 60 et 72 minutes. La mise à mort nécessitera une nouvelle induction anesthésique, afin de permettre le prélèvement des organes et du sang, et aura une durée d’environ 10 minutes par rat.

Impact sur les animaux

La nuisance sera la contention de l'animal qui peut le stresser lors de l'injection des anesthésique et analgésique . Des douleurs attendues seront d'ordre abdominal dès le réveil pendant la période de reperfusion et en postopératoire, nous nous attendons également à une réduction de la mobilité du rat.

Devenir

Tous les rats inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la récupération des organes pour des analyses fonctionnelles, moléculaires et structurelles. Cette démarche vise également à prévenir toute éventuelle souffrance.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas encore chez l'Homme de biomarqueurs permettant de diagnostiquer ou d'étudier la dysfonction endothéliale dans l'ischémie-reperfusion viscérale ou rénale. Afin d'étudier les phénomènes physiopathologiques qui entourent une ischémie-reperfusion viscérale et rénale, des modèles ont été créés chez le petit animal tel que le rat. Ce modèle permet de reproduire les conditions réelles chez l'Homme d'une chirurgie aortique nécessitant un clampage au dessus des artères rénales. Ainsi, l'étude de ce modèle animal peut nous permettre de caractériser l'impact du clampage supra-viscéral sur la dysfonction endothéliale, la degradation du glycocalyx et de pouvoir étudier les bénéfices d'une molécule anti-héparanase, novatrice, du pré-conditionnement ischémique. L’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro reproduisant pleinement une chirurgie aortique. De plus, le lien entre dysfonction endothéliale et glycocalyx a été largement étudié et confirmé in vitro sur des cellules en culture. Le recours isolé au préconditionnement ischémique a déjà fait l'objet de plusieurs études chez l'animal. La combinaison de ces deux approches n'a pas été réalisée à l'heure actuelle. Ainsi, la validation de l'effet protecteur de ces deux approches isolées ou combinées ne peut que passer par l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

Nous avons opté pour des études sur des espèces animales élevées à des fins scientifiques, caractérisées par une faible variation génétique entre individus. Cette homogénéité réduit la variabilité des réponses biologiques, permettant ainsi de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Le nombre d'animaux requis a été estimé à partir des études antérieures sur la dysfonction endothéliale menées au sein de notre unité. De plus, nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo lors de la mise à mort. Ce nombre d’animaux garanti un effectif suffisant pour réaliser les analyses histologiques, ELISA et étudier la vasoréactivité à l’aide du myographe de Mulvany. En l’absence de données sur les effets potentiels des anti-héparanases et du préconditonnement ischémique dans un modèle d’ischémie-reperfusion viscérale sur l'atteinte systémique et rénale nous avons estimé qu’il faudrait au moins 20 rats par groupe pour détecter une différence d’au moins 40 % sur la vasoréactivité de l’artère rénale entre les groupes,. Le nombre d'animaux à été determiné avec les analyses statistiques .

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec un environnement enrichi pour favoriser leur bien-être. Une attention particulière sera portée à la qualité de l’anesthésie et de l’analgésie afin d’éviter toute douleur ou stress pendant et après les interventions. L’anesthésie générale sera assurée par inhalation d’un gaz anesthésiant, et complétée par des traitements antalgiques avant et après la chirurgie. Les animaux respireront spontanément sans intubation. À la fin de l’intervention, un anesthésique local sera appliqué au niveau de la cicatrice pour renforcer le confort post-opératoire. Pour réduire le stress, les interventions auront lieu une à deux semaines après l’arrivée des animaux à l’animalerie, afin qu’ils puissent s’adapter à leur nouvel environnement. Les chirurgies et prélèvements seront réalisés dans une pièce calme et isolée, avec un seul expérimentateur, pour limiter les sources de bruit et de distraction. Tout au long de l’expérimentation, les signes cliniques de souffrance (respiration difficile, poils hérissés, posture anormale, prostration, perte d’activité, etc.) seront surveillés. L’apparition de tels signes constituera un point d’arrêt anticipé : l’animal sera alors retiré de l’étude et euthanasié pour éviter toute souffrance. Une grille d’évaluation permettra de suivre leur état général et de définir précisément ces points limites. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour favoriser leur habituation. Ils auront accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et seront hébergés par petits groupes, avec des aménagements dans les cages pour stimuler leur comportement naturel. Après l’anesthésie, le réveil se fera dans des cages individuelles pendant quelques heures afin d’assurer leur sécurité.

Choix des espèces

Les premiers modèles ont été développés chez le rat, en particulier chez le rat Wistar. Les études antérieures menées au laboratoire sur la dysfonction endothéliale chez le rat ont permis d’identifier et de valider des marqueurs spécifiques de cette pathologie. Par ailleurs, notre animalerie dispose d’une infrastructure adaptée, garantissant des conditions optimales d’hébergement et de bien-être pour les animaux. Les animaux utilisés pour l’étude seront des rats Wistar âgés de 8 semaines et qui pèseront entre 300 et 400 g. Ceci correspond à la plupart des études publiées sur le préconditionnement ischémique sus-rénal chez le rat.

Pour déterminer le rôle de l'inflammation dans l'installation de l'obésité, 1 277 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit un régime riche en graisse pendant vingt semaines, puis subit des jeûnes de quinze heures avant les tests de tolérance au glucose, sept micro-prélèvements de sang à la queue par test, un faisceau infrarouge appliqué sur la patte et des séjours en cage individuelle de quatre jours renouvelés une fois. Certaines sont opérées sous anesthésie pour l'implantation d'une pompe sous la peau, d'autres au niveau du crâne, geste pour lequel le porteur attend une douleur modérée. Toutes sont mises à mort à la fin de la procédure pour prélever leurs tissus, que le porteur prévoit de constituer en "bibliothèque d'échantillons" pour de futures analyses.

Objectifs

Ce projet s'intègre dans le cadre général de l'étude des mécanismes cérébraux du contrôle de la prise alimentaire. Plus précisément, le but de ce projet est de déterminer l'importance des réponses inflammatoires dans la mise en place de l'obésité. Les mécanismes neurologiques et immunitaires impliqués dans les troubles de la prise alimentaire sont encore mal connus. Les études les plus récentes indiquent l'existence d'une inflammation dans le tissu gras, mais aussi dans le cerveau chez des animaux obèses. Cette inflammation, dite "de bas grade" serait essentielle à la mise en place et au maintien du surpoids. Les troubles de la prise alimentaire seraient associés à une modification de l’expression de molécules favorisant l’inflammation pouvant agir au niveau cérébral en perturbant le fonctionnement des neurones impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire. Nous émettons l’hypothèse que ces neurones seraient directement ou indirectement la cible de ces molécules.

Bénéfices attendus

Les résultats de ces études devraient permettre des avancées dans la recherche fondamentale et biomédicale : i) participation à l’identification de voies cérébrales clés et caractérisation des mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le métabolisme et la prise alimentaire; ii) sur la base de modèles animaux et d'études humaines passées et en cours, nous devrions pouvoir proposer de nouvelles cibles moléculaires pour le développement d'approches pharmacologiques innovantes pour le traitement de l'obésité et du diabète.

Procédures

La moitié des animaux est soumise à un régime riche en graisse pendant une durée maximum de 20 semaines. L’analyse du métabolisme nécessite que les animaux soient placés pour un maximum de 4 jours (x2) dans des cages individuelles afin de mesurer leurs paramètres physiologiques. Pour la détermination de la composition corporelle des animaux, les animaux sont placés pour une très courte durée (

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime riche en graisse développent une prise de poids et des symptômes pouvant ressembler au diabète. L’analyse du métabolisme énergétique recquiert que les animaux soient hébergés individuellement pour une durée maximum de 4 jours (renouvelé 1X), pouvant générer un stress. Le placement de l’animal dans le tube de l’appareil d’analyse corporelle peut créer un stress. Une douleur légère de courte durée associée aux micro-prélèvements de sang au cours des tests de tolérance au glucose est attendue. Une douleur légère et une gêne de courte durée est attendue chez les animaux implantés avec une pompe délivrant un traitement en continu. Une douleur modérée est attendue chez les animaux ayant subi une chirurgie au niveau du crane.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter des tissus pour analyses biologiques.

Remplacement

L’étude de l’obésité nécessite un système affectant simultanément plusieurs tissus (foie, tissus adipeux, pancréas et cerveau). Le développement de l’obésité, et plus généralement la régulation du poids corporel, faisant appel à plusieurs organes, il est par conséquent pour le moment impossible de pouvoir réaliser notre étude sur la réponse inflammatoire autrement que chez l’animal.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Pour estimer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé un logiciel de calcul de taille d'échantillon. Chaque fois que cela est possible nous utiliserons un groupe de souris contrôles commun à plusieurs séries d'études. Nous optimiserons également la collecte de tissus post-mortem à l’issue de chaque procédure afin de créer une « bibliothèque d’échantillons » pouvant être utilisés pour de futures analyses.

Raffinement

Avant l’expérimentation, les souris sont transférées dans une pièce à lumière inversée (jour/nuit inversés) afin que les tests soient réalisés durant leur phase active qui est la nuit. Elles sont aussi habituées progressivement à être manipulées par les expérimentateurs pour limiter leur stress par la suite. La température des pièces est maintenue à 26°C, proche de la zone de confort thermique pour les souris. Les animaux sont mis au calme 1h avant d’être soumis aux tests métaboliques, et en cas d'hypoglycémie sévère pendant un test, du glucose leur est injecté. Les cages utilisées pour analyser le métabolisme et l’activité permettent aux animaux de conserver un contact visuel et olfactif et sont équipées de façon à fournir des occasions accrues d’interaction avec l’environnement afin de compenser le fait que les animaux doivent être hébergés seuls pendant ce laps de temps. Les prélèvements de sang et de tissus réalisés à la fin de l’étude sont effectués sous anesthésie. Des injections d’anti-inflammatoires sont effectuées pour gérer la douleur post-opératoire des chirurgies. Un anesthésique local est administré avant les incisions. Une analgésie supplémentaire est prévue pour la chirurgie sur le crâne. Durant la procédure, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin d’éviter la perte de température. Nous prévoyons d’utiliser le modèle de pompe osmotique (implantée sous la peau) le plus petit disponible afin de limiter au maximum la gêne pour les animaux. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin de limiter la douleur et l’angoisse des animaux au minimum.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études métaboliques, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Par ailleurs, grâce à la proximité entre le patrimoine génétique de la souris et celui de l’Homme nous espérons pouvoir extrapoler les conclusions de notre étude à l’Homme. Nous réaliserons nos expériences sur des animaux adultes. A l’issue du sevrage, nous souhaitons laisser aux animaux le temps de s’acclimater aux conditions des salles d’hébergement et d’expérimentation avant de démarrer l’exposition aux différents régimes.