Rongeurs
Effets de compléments alimentaires dans la prévention des symptômes associés à la ménopause chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées vingt jours de suite avec une molécule qui accélère la ménopause, soumises à un frottis vaginal quotidien jusqu'à ce qu'elle s'installe, puis à deux prélèvements sanguins, 400 souris femelles de trois à cinq semaines subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Viennent ensuite des tests comportementaux de cinq à dix minutes censés mesurer l'anxiété, la dépression et la mémoire, que le porteur n'énumère pas. Le modèle sert à démontrer l'efficacité du complément alimentaire d'un industriel partenaire, avant une étude clinique chez des femmes ménopausées. Toutes les souris sont tuées pour que leurs cerveaux soient prélevés.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec un industriel du complément alimentaire afin de démontrer l’efficacité de leur produit sur la prévention ou l’atténuation des symptômes associés à la ménopause (troubles de l’humeur, de la mémoire) chez des souris adultes femelles ainsi que les mécanismes d’action mis en jeu dans ces processus. Pour ce faire, un modèle de ménopause chez la souris sera utilisé grâce à des injections d’une molécule accélérant la mise en place de la ménopause chez les murins tout en laissant les ovaires et les autres organes (foie, rate, reins, cerveau) intacts. Ce modèle est couramment utilisé pour mimer le processus de ménopause chez la femme car il permet une transition progressive similaire à celle observée chez les femmes en péri-ménopause et ménopause. De plus, la ménopause est associée à l’apparition de symptômes chez la femme tels que des troubles anxieux, dépressifs ou encore cognitifs, que l’on retrouve également dans ce modèle de souris, justifiant son utilisation.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de démontrer qu’une supplémentation nutritionnelle permet de limiter et de prévenir les symptômes associés à la ménopause tels que les comportements de type anxieux, dépressifs et les troubles cognitifs, fréquemment observés chez les femmes ménopausées et affectant significativement leur qualité de vie. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. En effet, les compléments alimentaires constituent une alternative intéressante aux traitements hormonaux de substitution de la ménopause, souvent prescrits pour réduire les symptômes associés (bouffées de chaleur, troubles de l’humeur) mais dont l’efficacité est contrebalancée par des risques bien documentés : augmentation du risque de cancer du sein, de thrombose veineuse et d’accidents cardiovasculaires. Les résultats attendus sont une amélioration des symptômes associés à la ménopause chez les souris (comportements de type-anxieux et dépressifs, troubles de la mémoire), et serviront de résultats préliminaires pour la conduite d’une étude clinique chez les femmes ménopausées.
Procédures
Les souris femelles seront soumises à des injections (20 jours consécutifs, durée de 1 minute), des prélèvements de sang (2 prélèvements, durée de 1 minute) ainsi qu’à des frottis vaginaux (tous les jours jusqu’à la ménopause, durée de 1 minute). Les femelles réaliseront ensuite une série de tests comportementaux qui dureront entre 5 et 10 min chacun afin d'étudier leurs comportements anxieux et dépressifs et leurs capacités cognitives.
Impact sur les animaux
- Injections : irritation ou inflammation au niveau du site d’injection, douleurs faibles liées aux injections pendant la durée des injections. - Frottis vaginaux : induction d’un stress de courte durée (le temps du test) chez l’animal. - Tests comportementaux : induction d’un stress de courte durée (le temps du test) chez l’animal. - Troubles anxieux/dépressifs et troubles cognitifs liés au modèle. - Prélèvements sanguins : douleur locale, présence d’hématomes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques ou immunohistologiques.
Remplacement
L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, les troubles cognitifs et le modèle de ménopause ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. La sélection des nutriments à tester ne peut être réalisée sans recours à des modèles animaux, car les approches de modélisation ou les essais in vitro, bien qu’informatifs, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions physiologiques systémiques nécessaires à l’évaluation précise de leur biodisponibilité, de leur métabolisme et de leurs effets à l’échelle de l’organisme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence 1) des altérations des performances cognitives et une hausse des troubles de l’humeur (anxiété, dépression) liés à la ménopause et 2) la prévention ou la réduction de ces altérations grâce aux supplémentations nutritionnelles.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique/sédatif avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les signes de stress ou d’inconfort chez la souris (changements comportementaux, posture voutée, diminution de l’activité) seront observés pendant toute la durée des injections et des analgésiques seront administrés si nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris femelle âgée entre 3 et 5 semaines puisque ces dernières doivent avoir un cycle œstral mis en place. C’est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Ce modèle de ménopause est pertinent pour étudier les symptômes associés chez la femme car il permet de mimer la perte graduelle de la fonction ovarienne (et donc les variations hormonales associées) classiquement observée chez la femme. De plus, il permet également d’étudier certains troubles liés à la ménopause tels que les modifications métaboliques, les troubles de l’humeur (anxiété, dépression) ou encore cognitifs (déficits d’attention, troubles de la mémoire).
Développement d’une stratégie thérapeutique ciblée pour traiter la thrombose veineuse.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une souris qui ne réagit plus aux stimulations est tuée sur le champ, et celle dont l'état ne s'améliore pas rapidement l'est aussi. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever le caillot. La veine cave inférieure de chaque animal est ligaturée au cours d'une opération de quarante minutes, puis une injection est faite six ou vingt-quatre heures plus tard, la mise à mort survenant quarante-huit heures après la chirurgie. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer des saignements importants, une paralysie transitoire des pattes arrière et des difficultés de réveil, pour comparer une molécule expérimentale à un anticoagulant déjà utilisé en clinique.
Objectifs
L’hémostase, ou comment le corps arrête les saignements, est un mécanisme naturel qui permet de colmater une blessure. Pour ce faire, le corps forme un petit bouchon, appelé clou plaquettaire, fait de plaquettes sanguines et d’une protéine appelée fibrine. Ce bouchon stoppe le saignement. Mais quand ce système se dérègle, il peut provoquer une thrombose veineuse profonde : un caillot se forme dans une veine et cause une embolie pulmonaire. Pour traiter ces caillots, des médicaments anticoagulants sont utilisés, comme la tinzaparine, qui fluidifie le sang. Dans les cas les plus graves, on peut aussi injecter un médicament, qui dissout le caillot en détruisant la fibrine. Ce traitement s'appelle thrombolyse. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces, et leur principal risque est d’augmenter les saignements ailleurs dans le corps. L’objectif de notre projet est de tester un nouveau type de médicament permettant de cibler son action directement au niveau du clou plaquettaire. Ce nouveau médicament permettrait de limiter grandement les risques de saignements associés aux anticoagulants et de traiter les patients avec des doses très faibles.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de mettre en évidence l’effet antithrombotique de la molecule-X et de montrer son efficacité en terme de traitement lors d’une thrombose veineuse. La molecule-X sera comparé à une molécule utilisée actuellement en clinique pour cette indication : la tinzaparine. Nous pourrons ainsi déterminer si la molecule-X pourrait avoir un effet antithrombotique plus important que la tinzaparine en traitement précoce et en traitement tardif, dans ce modèle de thrombose.
Procédures
Les animaux sont exposés à un prélèvement sanguin sous anesthésie (5 minutes), à une chirurgie sous anesthésie avec ligation de la veine inférieure cave (40 munutes). ils sont également exposés à une injection (5minutes) 6h ou 24h apres le chirurgie). 48 heures après la chirugie les animaux sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
Lors de ces interventions, certains effets indésirables peuvent survenir. Par exemple, l’anesthésie peut parfois perturber la respiration des souris, la rendant irrégulière ou provoquant de courtes pauses. Il existe aussi un risque de saignement important au moment de l’intervention, notamment lorsqu’on sépare certains gros vaisseaux sanguins. Après l’opération, certaines souris peuvent avoir du mal à se réveiller ou ressentir de la douleur à l’endroit où l’incision a été faite. Dans certains cas, une faiblesse ou une paralysie transitoire des pattes arrière peut apparaître. De plus, les souris qui reçoivent un traitement peuvent présenter un risque accru de saignement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. Nous devons prélever le thrombus pour étudier sa composition.
Remplacement
La capacité de la molecule test à cibler la fibrine in vitro a déjà été évaluée avec succès avec de la fibrine de souris et de la fibrine humaine, et a même été évalué en flux sur du plasma humain. Nous aurons uniquement 1 molécule à tester in vivo (sur les 5 synthétisées grace à ces tests in vitro). il est impossible à ce jour de reproduire in vitro l’intégralité du vaisseau (incluant la contractibilité, la perméabilité, les cellules souches musculaires lisses), ni l’activation des cellules endothéliales qui sont à l’origine de la formation de l’amas plaquettaire, ni de tester la molécule cible en présence de tous les éléments figurés du sang sans inhiber la formation de l’amas plaquettaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal permettant d’obtenir une bonne interprétation statistique des résultats. L’analyse du thrombus et des composés sanguins seront réalisés dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Réduction).
Raffinement
Tout a été mis en place pour limiter la douleur et le stress des souris tout au long des procédures. Avant toute manipulation, les animaux disposent de quatre jours pour s’acclimater à leur nouvel environnement. Leur cage est enrichie avec du coton et du papier kraft, ce qui leur permet de construire un nid, un comportement naturel bénéfique pour leur bien-être. Elles sont également hébergées en groupe afin d’éviter l’isolement, source importante de stress. Pendant l’intervention chirurgicale, les souris sont maintenues au chaud pour prévenir toute hypothermie, et elles reçoivent une anesthésie complète ainsi qu’un traitement antidouleur adapté. Des soins spécifiques sont également prévus, comme la protection des yeux pendant l’anesthésie et l’application de collyre avant certaines injections. Après l’opération, un suivi attentif est mis en place : les souris reçoivent un traitement antidouleur régulier, des aliments enrichis en analgésiques sont mis à leur disposition, et leur état est évalué quotidiennement. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix de thrombose veineuse et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel et mature.
Anticorps bioconjugués pour visualiser le tissu adipeux brun in vivo chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Dix jours d'hébergement à 4 °C, ou deux mois à 30 °C, jusqu'à sept injections et cinq prélèvements sanguins : 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines ont 24 mois, un âge auquel le porteur prévoit des décès liés à la vieillesse et gonfle ses groupes en conséquence. La méthode mise au point est présentée comme une imagerie "non invasive" du tissu adipeux brun, et le porteur affirme que visualiser ce tissu dans un "organisme entier" rend le recours à l'animal "indispensable". Toutes les souris sont tuées à l'issue pour récupérer leur sang et leurs organes.
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les tissus adipeux blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les tissus adipeux bruns (et beiges) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Il est clairement admis que la quantité et l'activité du tissu adipeux brun déclinent avec l'âge. Il est aussi aujourd'hui bien démontré que les tissus adipeux bruns sont associés de manière positive à la santé cardiométabolique chez l'homme. Il est donc important de pouvoir visualiser de manière non invasive le tissu adipeux brun pour définir des trajectoires de santé à l'échelle des individus. Plusieurs méthodes d'imagerie du tissu adipeux brun existent à l'heure actuelle. Elles sont pour la plupart basée sur la détection de sondes marquées et des techniques d'imagerie adaptées. Cependant, les sondes utilisées sont souvent des métabolites comme par exemple le glucose. L'intensité du marquage peut fluctuer en fonction de l'activité du tissu (et de l'état de santé métabolique de l'individu comme en cas d'insulinoresistance) et peut générer des faux positifs par l'activité métabolique d'autres tissus. Dans ce projet, nous proposons une nouvelle méthode d'imagerie pour détecter de manière non invasive des protéines membranaires exprimées par le tissu adipeux brun, in vivo chez la souris. Ceci reposera sur l'injection d'anticorps bioconjugués et de sondes marquées avec des fluorochromes pour une détection du tissu adipeux brun par imagerie en fluorescence in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre au point une nouvelle méthode de visualisation du tissu adipeux brun in vivo de manière non invasive. Etant donné que ce tissu décline avec l'âge et dans des contextes de désordres métaboliques, mesurer sa quantité chez un individu pourrait permettre de définir des trajectoires de santé. La méthode utilisée dans ce projet pourrait aussi être élargie à d'autres tissus et d'autres pathologies. En effet, la basigine est surexprimée par de nombreux types de cellules cancéreuses et la méthode proposée dans ce projet pourrait tout à fait être utilisée pour évaluer le développement de certains types de tumeur. Enfin, la méthode développée dans ce projet pourrait être adaptée pour détecter d'autres cibles protéiques, élargissant ainsi l'intêret et les bénéfices liés à ce projet.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements : soit 1 prélèvement sanguin (juste avant la mise à mort) soit 5 prélèvements sanguins (soit sur 2 jours (5 min, 3 heures, 6 heures, 24 heures et 48 heures) soit sur 7 jours (1, 2, 3, 4 et 7 jours)). Les animaux subiront des injections : soit 1 injection, soit 2 injections (1 injection et 1 injection au minimum 24 heures après) soit 3 injections (1 injection, 1 injection au minimum 24 heures après, et 1 injection 1 heure après), soit 7 injections (1 injection quotidienne pendant 5 jours consecutifs, 1 injection 7 jours après et 1 injection 1 heure après). Certains animaux seront soumis à des modifications dans leurs conditions d’hébergement (température d’hébergement de 4°C pendant 10 jours ou de 30°C pendant 2 mois).
Impact sur les animaux
Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections, - les stress liés à l’injection des molécules - et le stress lié aux prélèvements sanguins. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.
Devenir
Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Notre objectif est de visualiser le tissu adipeux brun dans un organisme entier, de manière non invasive. Le recours à l'animal est donc indispensable. Cependant, des tests préalables pour valider l'anticorps et sa reconnaissance par les tétrazines auront été réalisés in vitro.
Réduction
Au regard de la bibliographie concernant des études similaires et de tests statistiques, des groupes de 6 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Dans les expériences effectuées sur des animaux de 24 mois, un nombre initial de 10 animaux sera prévu pour pallier aux décès potentiels liés à l’âge. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Nous proposons une stratégie de suivi longitudinal de marquage sur les mêmes animaux qui permettrait d’éviter l'euthanasie des animaux à différents temps donnés et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les tissus et organes prélevés suite à l'euthanasie seront utilisés pour un grand nombre d’expériences différentes. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus qui nous permettrons, à partir du même échantillon, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels ainsi que surveillées une à plusieurs fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Une grille de score comprenant différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra la valeur seuil, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie du tissu adipeux brun a été particulièrement bien étudiée. Par ailleurs, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). En plus de souris sauvages (contrôles), nous utiliserons une souche de souris génétiquement modifiée. Nous utiliserons des souris sauvages âgées de 2 mois (certaines auront 4 mois en fin de protocole). Les souris âgées de 2 mois, sont matures sexuellement, et présentent un tissu adipeux brun bien développé. L'hébergement à 30°C sera réalisé chez des souris âgées de 2 mois pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver le tissu adipeux brun comme montré par les travaux précédents de l'équipe). L'exposition au froid sera réalisée chez des souris âgées de 3 mois et 20 jours, pendant 10 jours. Des travaux précédents de l'équipe ont montré qu'à 24 mois, les animaux présentent des défauts métaboliques importants dans le tissu adipeux brun, c'est la raison pour laquelle nous avons choisi cet âge pour les souris "âgées". Les souris génétiquement modifiées et leurs contrôles seront utilisées à l'âge de 4 mois, ce qui nous permettra de comparer les résultats avec les souris hebergées aux différentes températures.
Elevage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Deux minutes de contention pour un tatouage et une biopsie de la queue, entre le septième et le douzième jour de vie : 485 souris nouveau-nées subissent cette procédure d'un niveau de souffrance léger, avec un risque d'hémorragie de la queue et de rejet par la mère. Elles naissent d'accouplements programmés tous les quatre mois, dans le seul but d'alimenter des projets sur la maladie d'Alzheimer avec des souris porteuses de la bonne mutation. Le porteur décrit cette lignée transgénique comme "nécessaire" aux études collaboratives et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier le vieillissement pathologique. Celles qui portent le génotype attendu partent en reproduction ou en expérimentation, les surnuméraires vont vers des projets sans exigence de génotype ou vers des formations, les autres sont tuées.
Objectifs
L’objectif du projet est d’assurer la reproduction des souris, de les élever et définir leur génotype dans le cadre de la gestion de projets scientifiques sur la maladie d’Alzheimer pour constituer des groupes de souris issues des croisements programmés. La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Aujourd’hui, aucun traitement n’est capable de prévenir efficacement la maladie qui est initiée plus de 20 ans avant les premiers symptômes. Ces projets cherchent à mieux comprendre les maladies, trouver de nouveaux outils pour les diagnostiquer ou les soigner, et tester de nouveaux traitements, en tenant compte du lien entre la santé des humains, des animaux et de l’environnement. Même si la recherche reste très active, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour évaluer ou prévenir le vieillissement pathologique Alzheimer versus le vieillissement physiologique. L'obtention de lignée de la souris génetiquement modifiée est essentiel pour induire la maladie d'Alzheimer et rechercher des traitements.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu dans ce projet est de pouvoir gérer le nombre d’animaux nécessaires aux projets de recherche sur la maladie d’Alzheimer en fixant le nombre d’accouplements le plus juste pour l’obtention du nombre de souris souhaitées avec un génotype clairement identifié dans les études scientifiques collaboratives publiques. Surveiller les lignées de souris génétiquement modifiées permet de réduire les risques de changements imprévus dans leurs gènes et de garantir la qualité de leur élevage et de leur hébergement.
Procédures
Prélèvement sur animal vigile Tatouage et prélèvement pour génotypage : 1 seule procédure par animal n'excédant pas 2 minutes
Impact sur les animaux
La procédure d'identification et de génotypage consiste en deux actes successifs. Ces deux gestes induisent une douleur légère de courte durée. L'animal est maintenu en contention pendant ces deux actes ce qui est une source de stress. Celle-ci sera minimisée au maximum par l'expérience du zootechnicien réalisant les gestes. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : une légère hémorragie à l'extrémité de la queue ou le rejet des nouveau-nés par la mère.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront utilisés pour la reproduction et dans des projets de recherche sur la maladie d’Alzheimer. Les individus surnuméraires seront utilisés, lorsque possible, dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier ou pour la formation. Les autres seront euthanasiés conformément à la procédure décrite.
Remplacement
Cette lignée de souris transgéniques élevée dans l’animalerie est nécessaire pour répondre aux besoins des études collaboratives évaluées scientifiquement. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour étudier directement chez l’animal (in vivo) les mécanismes liés au vieillissement normal ou pathologique, comme dans la maladie d’Alzheimer, afin d’identifier de nouveaux élements utiles pour le diagnostic ou le traitement, et pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
La stratégie d'accouplement envisagée repose sur les études collaboratives publiques, donc cela évite des accouplements en continu et limite la production d'animaux surnuméraires. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet (environ 1/3). Toutes les souris sont utilisées dans les projets pour comparer les deux phénotypes. Le nombre d’animaux prévu dans cette DAP tient compte du fait que, la première année, deux mâles seront accouplés avec quatre femelles, puis, de la deuxième à la cinquième année, un mâle sera accouplé avec deux femelles. Le nombre moyen de petits est de 7/portée pour cette lignée. Sur une année, on peut compter environ 36 à 40 femelles accouplées sachant que 2 mâles et 4 femelles viendront d'une autre animalerie au début du projet. Les accouplements seront programmés tous les 4 mois pour avoir des souris dans les projets expérimentaux et renouveler les couples reproducteurs. Pour éviter les changements imprévus dans les gènes, les couples reproducteurs sont bien gérés et de nouveaux males et femelles seront introduits au bout des 2 ans et demi.
Raffinement
Des points limites précoces sont mis en place. De plus, les actes d'identification et de prélèvement pour génotypage sont réalisés par du personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par des agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et biopsies sont réalisées avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des règles d'asepsie établies dans la plateforme Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d'expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveaux-nés sont remis en présence de leur mère. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum. Les souris incluses dans cette procédure (âge max 6 mois) n’expriment pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles de souris transgéniques qui sont largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris sont des espèces de choix pour les projets et permettent d'obtenir aisément des lignées génétiquement altérées par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies bien caractérisées. La très grande majorité des animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours. A cet âge, les animaux sont aisément manipulables, le cartilage est souple et les groupes sociaux constitués sont stables. Nous éviterons autant que possible les biopsies sur animal adulte.
Identification de la cellule d’origine des méningiomes à l’aide de modèles de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à l'issue pour prélèvements, ou parce que leur modification génétique interdit toute réutilisation et tout replacement, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un fragment de tissu est prélevé sur chaque souriceau vigile pour établir son génotype, et une partie des animaux reçoit pendant un à cinq jours une molécule activant une mutation. Le porteur indique que les tumeurs cérébrales attendues peuvent entraîner un déficit moteur et des crises d'épilepsie, et que l'administration de la molécule expose les mères à la perte de leurs petits. Les souris sont suivies de la naissance jusqu'à douze mois, le temps que les méningiomes apparaissent, et le porteur affirme que le modèle mammifère est le "seul moyen" d'identifier la cellule d'origine de ces tumeurs.
Objectifs
Les méningiomes se développent dans les méninges, les trois membranes qui entourent le cerveau et la moelle épinière. Ils représentent les tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central de l’adulte. Bien que la majorité des méningiomes puisse être traitée par la chirurgie, une fraction non négligeable est soit inaccessible à la chirurgie, soit présente une histoire naturelle plus proche des cancers, marquée par une agressivité clinique et histologique. Pour ces tumeurs, aucune alternative à la chirurgie n’existe à l’heure actuelle. Le présent projet propose la création de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées de méningiomes en vue d’une meilleure compréhension de l’origine des méningiomes bénins ou malins.
Bénéfices attendus
En permettant l’identification de la cellule d’origine des méningiomes, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la tumorigenèse méningée bénigne et maligne mais également contribuer à une meilleure connaissance de l’anatomie des méninges. Par ailleurs, si les résultats s’avèrent concluants cela pourrait permettre d’utiliser ces nouveaux modèles animaux plus représentatifs de la maladie dans de futures études pré-cliniques. Ceci permettant donc d’obtenir une meilleure translation des résultats obtenus lors d’évaluation de nouvelles thérapies à ce que l’on pourrait attendre chez l’humain. A plus long terme, ces connaissances pourraient permettre de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de méningiomes.
Procédures
Afin de connaitre leur patrimoine génétique un prélèvement d’un petit fragment de tissu sera prélevé chez tous les souriceaux (durée inférieure à 1 minute, une fois, animal vigile). Une molécule sera administrée à une partie des animaux vigiles, pour activer une mutation génétique d’intérêt (1 fois par jour pendant 1 à 5 jours maximum, durée inférieure à 1 minute par administration). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’administration de la molécule pour activer la mutation génétique génèrera une brève et légère douleur au point d’injection, ou un inconfort lors de l’administration orale, et un risque de perte des petits pour les mères concernées. Si les animaux génétiquement modifiés générés et dont la mutation aura été induite par injection d’une molécule développent bien des tumeurs cérébrales, leur apparition pourra engendrer un possible déficit moteur, et, ou, de possibles crise d’épilepsie. Le prélèvement de tissu pour connaitre le patrimoine génétique des animaux induira une brève et légère douleur et un risque de léger saignement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements d’intérêt pour répondre à notre question scientifique, ou parce qu’ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés permettent l'obtention de méningiomes. Ces modèles ont toutefois des limites notamment leur inadéquation en pré-clinique pour des études thérapeutiques et l’impossibilité d’étudier la cellule d’origine des tumeurs. Le modèle animal mammifère est le seul moyen de déterminer avec précision la capacité de chaque population cellulaire méningée à initier ou promouvoir la formation des méningiomes en raison de l’existence de souris génétiquement modifiées générées spécifiquement pour étudier ces populations. La souris reste donc l'espèce la plus appropriée pour cette étude.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au maximum (900 animaux pour l’ensemble du projet) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Nous avons réduit le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir nos animaux génétiquement modifiés d’intérêt au strict minimum et nous piloterons notre élevage de manière raisonnée de façon à ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaires pour nos lots expérimentaux. Afin d'assurer la fiabilité statistique et limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif sur la base de travaux antérieurs et nous analyserons les résultats obtenus à l’aide des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur arrivée avant toute entrée en procédure. Un enrichissement de leur environnement leur sera mis à disposition dans les cages (carré de coton pour nidifier et bâtonnet de bois à ronger au minimum). Ils seront observés quotidiennement et en cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les injections pour induire la mutation génétique seront limitées au strict nécessaire, et une vérification de la zone d’injection sera assurée avant chaque nouvelle injection. Nous privilégierons la voie d’administration induisant le moins d’effets secondaires possible dès que cela sera possible. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible. Il s’agit d’un geste rapide et parfaitement maitrisé réalisé dans un endroit calme et dédié. Les souriceaux sont replacés avec leur mère et le reste de la portée rapidement, puis une surveillance est assurée immédiatement et environ 30 minutes après pour vérifier l’absence de saignement et la bonne prise en charge par la mère. Un suivi spécifique sera réalisé pour les animaux présentant un phénotype induit attendu après injection, notamment une surveillance du poids hebdomadaire en cas de signes de difficultés motrices et une surveillance quotidienne de leurs capacités à s’alimenter et de la présence de signes de souffrance physique et d’inconfort (dépilation, poil ébouriffé).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu, son génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines, il existe déjà des modèles de méningiomes chez la souris, l’existence de ces modèles de méningiomes déjà publiés sera un avantage crucial pour comparer les éventuels nouvelles manifestations cliniques obtenues dans ce projet avec les connaissances de référence sur les modèles murins déjà décrits. Les animaux seront utilisés de la naissance à l'âge de 12 mois en raison de la lenteur d’évolution et d’apparition des tumeurs. Le choix des moments d’activation de la mutation génétique se base sur la chronologie du développement de la méninge chez la souris et l’apparition des différentes populations cellulaires. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux s’effectuera à l’âge de 7 à 10 jours afin de profiter de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre très tôt leur modification génétique.
IronTWIK-(Modification)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont soumises à un régime appauvri en fer, puis leurs petits sont tués par étapes, au stade embryonnaire, à un jour, quinze jours, vingt et un jours, trente jours et soixante jours de vie, pour prélever cerveau, duodénum, neurones de la moelle épinière, nerfs sciatiques, foie et peau du dos. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie des interventions se terminant par une exsanguination sous anesthésie profonde. Aucune ne sera réutilisée ni proposée à l'adoption, le porteur indiquant ignorer les effets tardifs que peut avoir la carence en fer sur ces lignées modifiées. Il écrit pourtant que le projet "ne propose aucune procédure pouvant nuire au bon développement et au bien-être des animaux", tout en classant les 400 souris au niveau de souffrance le plus élevé.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet IronTWIK1 est de montrer que le canal ionique TWIK1 joue un rôle central dans la maturation des fibres nerveuses et que cette fonction est liée au métabolisme du fer par les neurones concernés. Pour cela, nous souhaitons soumettre les femelles gestantes de 3 lignées de souris exprimant ou non des formes différentes du canal TWIK1 (absent, sélectif pour le potassium, non-sélectif pour le potassium) à deux régimes alimentaires se distinguant par des teneurs en fer différentes ; un dit « haut Fer » et un dit « bas Fer ». Nous sacrifierons les souriceaux à différents stades de leur développement pour analyser les niveaux de maturation des fibres nerveuses concernées ainsi que le développement du système nerveux de la peau.
Bénéfices attendus
Le canal TWIK1 participe avec les autres membres de la famille des canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) au maintien du potentiel de repos des cellules excitables et à la protection neuronale. Les neurones liés au toucher et qui constituent les afférences principales des mécanorécepteurs de la peau et des poils sont caractérisés par la présence d’une couche de myéline. Bien qu'on ne s'explique toujours pas le rôle qu'il puisse y jouer, le canal TWIK1 apparait comme le mieux exprimé de sa famille dans ce type de fibres nerveuses. Or, ce canal potassique partage avec les protéines essentielles à la maturation et la myélinisation de ces même fibres nerveuses une localisation subcellulaire et une dépendance au pH qui laisse supposer qu'il pourrait en contrôler l’activité et la maturation. Une telle mise en évidence permettrait d’envisager un contrôle pharmacologique de cette maturation par le contrôle de l’activité ou de la sélectivité de ce canal potassique. Si cette hypothèse était avérée, ce projet, ouvrirait une porte encore jamais utilisée pour comprendre les mécanismes de la maturation des fibres nerveuses ni dans le traitement des maladies neurodégénératives par la pharmacologie liée à ces canaux ioniques.
Procédures
Tous prélèvement prévus dans ce projet sera effectué sur animal euthanasié. Modification : Les actes chirurgicaux pratiqués sur une petite partie des effectifs seront réalisés souris anesthésie profonde et de façon terminale, sans réveil des animaux.
Impact sur les animaux
Outre l’exposition des mères gestantes à un régime appauvri en fer, ce projet ne propose aucune procédure pouvant nuire au bon développement et au bien-être des animaux. Il est possible toutefois qu’une des trois lignées étudiées soit plus sensible que les autres à cette diminution du taux de fer dans la nourriture et que cette sensibilité différente se manifeste par un déficit nerveux altérant le développement normal des souriceaux. Le cas échéant, nous procéderons à l’application des règles établies pour les points critiques qui peuvent aller jusqu’à l'arrêt de la procédure et l'euthanasie des animaux.
Devenir
Nous ne savons pas à l'heure actuelle les effets que peut avoir un régime appauvri en Fer sur les souris génétiquement modifiées pour le canal TWIK1. Même si ces effets ne sont pas visibles en fin de procédure, nous devons envisager que ceux-ci puissent se développer plus tard c'est pourquoi nous ne pouvons pas choisir l'option de réutiliser, replacer ou adopter les animaux.
Remplacement
Le remplacement des souris, par l’utilisation de cultures cellulaires par exemple, a déjà largement été employé dans l’étude de ce canal. L’observation de TWIK1 a débuté par son clonage en 1996. En 2012, les mécanismes de changement de sélectivité lors d'une exposition à des pH acides ont été étudiés dans les ovocytes de Xénopes. Le canal TWIK1 est un canal fonctionnel pour lequel il est à présent indispensable d’étudier le mode de fonctionnement in vivo et son rôle physiologique. L’implication de TWIK1 dans la maturation des fibres nerveuses liées au toucher et à la proprioception nécessite l’utilisation d’un modèle animal car pour le moment, aucun système in vitro ne permet de reproduire l’ensemble des mécanismes physiologiques d’un organisme entier. De par ses similarités avec la physiologie humaine, et parce ce que nous possédons trois modèles murin génétiquement modifié pour TWIK1, la souris constitue le meilleur modèle pour adresser cette question. De plus, la caractérisation de cette maturation doit tenir compte du développement de l'animal et doit donc se faire sur un animal entier.
Réduction
Les 4 lignées de souris concernées par ce projet sont déjà disponibles dans le laboratoire où elles font l’objet d’une étude sur le rôle du canal TWIK1 dans la perception de la douleur et dont les procédures ont été validées par les instances ministèrielles. Ici, nous utiliserons indifféremment les animaux mâles et femelles. Une large recherche bibliographique nous a permis d’optimiser le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir une réponse statistiquement significative. La maturation du système nerveux périphérique s’évalue d’une part par la mise en place des fibres spécialisées et d’autre part par la mesure de l’épaisseur de la gaine de myéline des fibres myélinisées. Cette dernière mesure, comparée à l’épaisseur de la fibre nerveuse sans la myéline, constitue un paramètre appelé rapport-g (ou g-ratio). Celui-ci constitue dans ce projet notre variable d’intérêt. Une consultation de la littérature traitant de ce sujet nous a permis, par un calcul de puissance statistique de déterminer la taille d’effectif la plus juste en tenant compte des conditions expérimentales (2 régimes différents, 2 sexes, 4 génotypes). Le calcul effectué dans ces conditions renvoie des effectifs de 6 souris par groupe. Sur tout animal qui entrera dans l’étude nous prélèverons le cerveau, le duodénum, certains neurones de la moelle épinière, les nerfs sciatiques et une section de peau correspondant à la partie haute du dos. Modification : Nous prélèverons également le foie qui est le principal lieu de stockage du Fer chez les mammifères.
Raffinement
Nous savons que les 3 lignées de souris TWIK1 sont parfaitement viables, qu’elles se reproduisent normalement et que leurs descendances ne présentent aucun signe de mauvais développement. Néanmoins, il n’est pas exclu qu’en présence d’un régime appauvri en Fer la qualité du lait des mères soit modifiée et qu’en fonction de leur génotype, les souriceaux présentent des troubles visibles du développement. Les animaux seront donc observés de façon bihebdomadaire afin de rechercher des signes cliniques indicateurs des différentes conséquences d’un tel régime sur l’organisme. Une feuille d’observation, incluant une grille de score, a été établie qui permettra également d’identifier précocement tout signe de stress ou de douleur. Cette grille de score contient des points limites précis. La mort n’étant pas un point limite acceptable, nous sortirons les souris de l’étude lorsqu’un des points limites sera atteint. Modification : Concernant l’acte de chirurgie pratiquée, celle sera terminal puisqu’elle se termine par une exsanguination. Néanmoins, et durant toute la durée de cet acte, les individus concernés seront profondément anesthésiés pour prévenir les risques de sensations de douleur.
Choix des espèces
L'étude que nous souhaitons mener vise à déterminer l'impact d'un canal TWIK1 excitateur ou inhibiteur sur des structures cérébrales complexes (Cerveau, duodenum, nerfs sciatique et peau velue...). En outre, les analyses de tissus que nous souhaitons réaliser doivent être faites à différents stades du développement. Elles ne peuvent donc pas être faites in vitro au niveau cellulaire car elles requièrent l'intégralité de l'animal. L'espèce animale utilisée sera la souris (Mus Musculus) car c'est le modèle le plus classiquement utilisé pour les manipulations génétiques. De plus, ce modèle présente de fortes similitudes avec l'humain pour les fonctions étudiées. En outre, des souris transgéniques issues du fond génétique des C57Bl6-J exprimant des formes différentes du canal TWIK1, sont déjà disponibles dans notre institut. Celles-ci sont parfaitement viables et ne montrent aucun signe délétère de leur développement. Ce projet concerne 4 lignées. Chaque lignée sera soumise à deux régimes : un dit à « haut Fer » et un dit à « bas fer ». Pour chacune nous prélèverons les embryons au stade E15, les nouveau-nés à P1 puis à P15, à P30 et à P60. Dans les ganglions de la racine dorsale (DRG), la mesure des niveaux d’expression des gènes codant les marqueurs spécifiques des différents types de fibres sensitives montre que dès le stade E13 les neurones qui nous intéressent sont déjà différenciés. En choisissant le stade embryonnaire E15, nous pourrons facilement cibler les neurones où le canal TWIK1 est le mieux exprimé. Le stade P1 nous permettra de visualiser le niveau d’innervation et la maturation des fibres nerveuses au moment de la naissance. Nous proposons les stades P15 et P30 car une étude montre qu’en absence des transporteurs du Fer, la myélinisation des fibres nerveuses est altérée à ces deux stades P15 et P30 puis est compensée pour revenir à un niveau normal. Lors de nos observations de la croissance des souris TWIK1-KO, nous avons observé une alopécie transitoire entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance. En choisissant P60, nous sous assurons d’être au-delà de cette 8ème semaine et de pouvoir observer ces éventuels phénomènes de compensation. Modification: Nous souhaitons le stade P21, pour lequel le phénotype d’alopécie est le plus prononcé. Par ailleurs, des cultures de cellules hépatiques primaires issues des différentes lignées et régimes permettront d’évaluer leur capacité de métabolisation du fer in vitro.
Développement d’un traitement de thérapie génique par AAV pour traiter les muscles et les neurones des souris atteintes de la forme sévère de la maladie de Pompe
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Une injection unique, puis une prise de sang chaque mois, puis des tests d'effort tous les trois mois pendant trois à dix-huit mois : 372 souris déficientes en GAA parcourent ce protocole, 66 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 252 un niveau modéré et 54 un niveau sévère. Les souris laissées sans traitement, qui forment le groupe témoin, développent à partir de quatre mois une faiblesse musculaire visible, colonne cambrée, membres postérieurs écartés, démarche dandinante. Certaines sont utilisées dès la naissance, d'autres à un âge avancé pour que les atteintes cardiaques, respiratoires et cognitives se soient installées. Toutes sont mises à mort pour que soient prélevés le cœur, les muscles et le cerveau et qu'y soit mesurée l'accumulation de sucre.
Objectifs
Notre projet de recherche a pour but de tester un nouveau traitement contre la forme infantile de la maladie de Pompe, une maladie génétique rare qui touche les muscles et le système nerveux. Cette maladie empêche l’organisme d’éliminer correctement un type de sucre, entraînant une faiblesse musculaire sévère ainsi que des problèmes cardiaques, respiratoires, musculaires et cognitifs. Sans traitement, l’espérance de vie des bébés atteints est inférieure à un an. Aujourd’hui, un traitement existe : il s’agit d’une thérapie enzymatique qui aide à ralentir la progression de la maladie. Malheureusement, ce traitement n’est pas parfait : il ne fonctionne pas pour tous les enfants, son efficacité diminue avec le temps et il ne permet pas de protéger le cerveau. Notre objectif est donc de développer une nouvelle approche plus efficace grâce à la thérapie génique. La thérapie génique est une technique qui consiste à introduire un gène sain dans les cellules d’un patient pour corriger ou compenser un gène défectueux responsable de la maladie. Nous avons déjà mis au point des vecteurs capables de mieux cibler les muscles et le cerveau, mais nous devons encore vérifier leur efficacité sur un modèle plus proche de la forme infantile de la maladie. Dans cette étude, nous allons évaluer nos deux meilleurs candidats pour déterminer lequel permet de mieux éliminer l’accumulation de sucre dans les cellules. Nous chercherons également à identifier la plus petite dose efficace et à vérifier si le traitement reste actif sur le long terme. Nos travaux pourraient permettre, à l’avenir, d’offrir aux enfants atteints de cette maladie une prise en charge plus efficace et durable, afin d’améliorer leur espérance de vie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de tester un nouveau traitement contre la forme infantile de la maladie de Pompe, une maladie génétique rare et très grave. Sans prise en charge, les enfants atteints ne survivent souvent pas au-delà de leur première année. Le traitement actuellement disponible, bien qu’il permette d’allonger l’espérance de vie, nécessite des injections répétées (toutes les deux semaines), est très coûteux et voit son efficacité diminuer avec le temps. Malgré cela, l’espérance de vie reste en moyenne autour de 7 ans, avec une qualité de vie fortement altérée. Grâce aux progrès de la thérapie génique, nous espérons qu’une seule injection suffira à corriger durablement la maladie. Le traitement que nous développons cible les muscles, le cœur et les poumons, mais aussi le cerveau, afin de prévenir les complications respiratoires, motrices et cognitives. Les résultats obtenus jusqu’à présent sont très encourageants. Ce nouveau projet nous permettra de tester cette approche sur un modèle plus représentatif des enfants malades, dans l’espoir d’apporter une solution plus efficace et durable, pour leur offrir une vie plus longue et de meilleure qualité.
Procédures
Tous recevront une injection unique (moins de deux minutes). Une prise de sang mensuelle sera réalisée sur chaque animal (moins de deux minutes), la durée des études variant entre 3 et 18 mois. Des tests fonctionnels seront effectués tous les trois mois (moins de trois minutes par test, et jusqu’à 30 minutes pour les études cardiaques et respiratoires). Enfin, tous les animaux seront mis à mort (moins de deux minutes).
Impact sur les animaux
Nuisances modérées liées au développement de la maladie de Pompe (uniquement chez les souris non traitées) : Faiblesse musculaire à partir de 4 mois (cambrure convexe de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche). Nuisances légères liées aux gestes expérimentaux : Pesée : stress lié à la manipulation. Injection : stress lié à la contention et douleur liée à la piqûre. Prélèvements sanguins : stress lié à la manipulation et douleur liée à la piqûre. Tests d’évaluation fonctionnelle : stress lié à la manipulation + fatigue physique suite aux test d'efforts. Mise à mort : stress lié à la manipulation et douleur liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements de différents tissus (cœur, muscles, cerveau, etc.) seront réalisés afin de mesurer la quantité de sucre présente dans ces tissus, indicateur de l’évolution de la maladie, ainsi que la présence de notre médicament.
Remplacement
Les différents éléments composant le candidat thérapeutique ont été préalablement testés sur des cellules musculaires humaines et murines, ce qui a permis de réaliser un premier tri des candidats les moins fonctionnels. Néanmoins, le modèle animal reste indispensable, car l’étude de certains paramètres physiopathologiques requiert un organisme vivant entier. Cela inclut : la correction des symptômes principaux (normalisation de la taille du cœur, réduction du taux de sucre dans l’ensemble des organes, restauration de la force musculaire), l’évaluation des réactions immunitaires, ainsi que la capacité du produit thérapeutique à traverser la barrière hémato-encéphalique pour atteindre le cerveau.
Réduction
Les candidats médicaments que nous testerons ont été préalablement validés sur des modèles cellulaires. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Pour garantir cela, nous avons appliqué une approche statistique rigoureuse. Les résultats de ces calculs montrent que 6 souris par groupe, en fonction des procédures et des paramètres biologiques mesurés pour répondre à la problématique posée, sont nécessaires dans le cadre de ce projet.
Raffinement
Une période d'acclimatation d’environ une semaine sera réalisée avant l'inclusion des souris dans les procédures expérimentales (PE), afin qu'elles s'adaptent à leur nouvel environnement. Pour les PE impliquant des souris non sevrées, les mères gestantes seront transférées en zone d'expérimentation afin de s'habituer aux nouvelles conditions avant la naissance des petits. Les prélèvements sanguins seront effectués sur des souris préalablement anesthésiées. Points limites du modèle : Les souris malades développent une myopathie progressive (dos arqué, légère atrophie des muscles du dos, écartement fréquent des membres postérieurs), dont les premiers signes cliniques apparaissent généralement à partir de 6 mois. Dès l'apparition des symptômes légers, des mesures seront mises en place pour limiter les efforts musculaires, notamment en plaçant l'alimentation au sol. Des observations et une pesée bihebdomadaire seront réalisées, et si une perte de poids supérieure à 10 % est constatée, du DietGel sera ajouté dans la cage. Si la perte de poids devient excessive (>20 %) ou si des symptômes sévères apparaissent, la souris sera mise à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin de la maladie de Pompe constitue un outil précieux pour évaluer l’efficacité thérapeutique d’un produit, car il reproduit des caractéristiques similaires à celles observées chez l’humain : même déficit enzymatique en GAA, accumulation pathologique de sucre dans les muscles, le cœur et le système nerveux, diminution de la force musculaire, et possibilité de développer une réaction immunitaire. La littérature démontre qu’il est possible de corriger ces symptômes grâce à la thérapie génique, bien que des optimisations importantes soient encore nécessaires pour traiter les patients les plus jeunes. Dans ce projet, nous testerons nos candidats thérapeutiques dans différents contextes : - chez des nouveau-nés, afin d’évaluer l’efficacité du médicament dans un organisme non mature, en croissance ; - chez des souris adultes âgées, dont les symptômes sont plus sévères et reflètent davantage ceux observés chez les patients infantiles (atteintes cardiaques, respiratoires, musculaires et cognitives).
Validation de lignées Cre spécifiques de domaines musculaires inductibles au tamoxifène
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une perte de poids de 20 % entraîne la mise à mort immédiate de l'animal. 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs muscles. Elles reçoivent deux injections dans l'abdomen à quatre jours d'intervalle, puis une nourriture contenant du tamoxifène pendant une semaine à deux mois, le changement d'aliment pouvant à lui seul leur faire perdre jusqu'à 10 % de leur poids par néophobie. Le projet vise la validation de lignées génétiquement modifiées que le porteur pourra utiliser "dans de futurs projets", avec cinq souris par groupe et un critère de réussite binaire, cinq animaux sur cinq.
Objectifs
Le tissu musculaire squelettique est affecté par diverses maladies. Souvent, les maladies musculaires touchent une zone spécifique de la cellule musculaire, qui est naturellement multinucléée et de forme allongée. Nous nous intéressons en particulier à des domaines fonctionnels spécialisés tels que la jonction entre le muscle et le tendon appelée jonction myotendineuse, ainsi que la jonction entre le neurone et le muscle appelée jonction neuromusculaire. Pour mieux comprendre les maladies musculaires et trouver des thérapies, il est essentiel de pouvoir manipuler génétiquement uniquement le type de noyau voulu à l'intérieur de la cellule musculaire de l’une ou de l’autre de ces jonctions. Cependant, les lignées de souris existantes dans la recherche sur les muscles concernent toujours tous les noyaux musculaires. Ce projet tente de développer et de valider des lignées de souris génétiquement modifiées innovantes qui nous permettront une manipulation spécifique des noyaux musculaires au centre, jonction neuromusculaire, ou aux extrémités des cellules, jonction myotendineuse. Ces lignées nous permettront de pouvoir étudier, dans de futurs projets, le rôle des protéines exprimées à ces endroits stratégiques de la cellule musculaire et leur implication dans des maladies musculaires.
Bénéfices attendus
Les techniques de manipulation génétiques actuellement disponibles pour la recherche sur le muscle touchent tous les noyaux musculaires. Cependant, certaines activités et maladies musculaires ne concernent que des parties spécifiques du muscle comme la jonction myotendineuse ou la jonction neuromusculaire. C'est pourquoi notre projet développe de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées qui nous permettront d'étudier les cellules musculaires avec une plus grande précision.
Procédures
Les animaux recevront 2 injections intrapéritonéales, qui ne dureront que quelques secondes chacune, à 4 jours d’intervalle puis seront soumis à un changement d’alimentation, d’une alimentation normale à une alimentation contenant la molécule à administrer pendant une période de 1 semaine à 2 mois puis retrouveront une alimentation normale.
Impact sur les animaux
Le traitement administré n’est pas nocif aux quantités qui seront administrées et ingérées sur les différentes périodes. L’administration du traitement, même sur la période la plus longue, ne fera apparaître aucun phénotype. Le changement d’aliment, normal vs traitement, peut induire une perte de poids de 10% au maximum au début du traitement en raison d’une néophobie alimentaire connue chez la souris.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, à la fin de la procédure nous mettrons à mort tous les animaux puis nous collecterons tous les échantillons musculaires pertinents. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de différencier les cellules musculaires in vitro, ces cellules ne contiennent ni les jonctions neuromusculaires ni les jonctions myotendineuses, et sont toujours immatures. Cet aspect de la biologie musculaire ne peut donc pas être étudié dans des modèles de culture cellulaire.
Réduction
Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés, nous testerons d'abord la durée la plus longue d’administration du traitement pour nous assurer que le traitement fonctionne dans la condition la plus extrême. Ensuite, nous testerons progressivement des durées d’administration plus courtes pour trouver la condition la plus efficace avec la durée d’administration la plus courte. Nous arrêterons le projet à la 1ère durée d’administration qui ne marchera plus (sans effet de la molécule). Les durées d’administration plus courte ne seront donc pas testées. Nous utiliserons 5 souris/groupe, ce qui est statistiquement suffisant pour parvenir à une conclusion, car l’analyse qui sera réalisé est de type « on/off ». Nous considèrerons que le traitement fonctionne uniquement si nous avons 100% des animaux chez qui il fonctionne, soit 5 animaux sur 5.
Raffinement
Ce projet ne devrait provoquer aucune souffrance ou douleur supérieure à l’introduction d’une aiguille, pour l'animal. A partir du début du traitement, les animaux seront observés plusieurs fois par semaines. Le suivi comprend l’observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés), l’interaction avec les congénères, les déplacements et l’intérêt pour la nourriture et la boisson. La nourriture et l’eau de boisson sont en accès libre et à volonté y compris pendant le traitement. Un tunnel et un carré de cellulose seront placés dans chaque cage. Le tunnel sera utilisé pour tous les déplacements d’animaux. Nous n’attendons pas l’apparition de phénotype particuliers, de souffrance ou de douleur, ni une perte de poids supérieure à 10 % suite au passage de l’aliment normal à l’aliment contenant la molécule à administrer. Toutefois si au cours de notre projet, un signe d’inconfort ou de douleur venait à apparaître, il serait alors pris en charge par des mesures appropriées en fonction de son niveau, ou par la mise à mort prématurée des animaux concernés en cas d’atteinte de point limite (perte de poids). Les animaux seront pesés lors des 2 injections intrapéritonéales, le poids de la 1ère pesée servira de référence. Ils seront ensuite pesés 2 fois/semaine, en début et en fin de semaine, pour s’assurer qu’ils ne perdent pas de poids. L’observation visuelle régulière du comportement général des animaux permettra également de mettre en évidence une perte de poids rapide. Si une perte de poids égale ou supérieure à 20% par rapport au poids initial devait être constaté alors l’animal serait immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les lignées modifiées génétiquement pour cibler la jonction neuromusculaire et la jonction myotendineuse que nous avons construits, sont créés chez la souris, sur la base d'études antérieures de l’équipe de l'expression des gènes réalisées sur des muscles de souris n’ayant subi aucune procédure. Ces manipulations génétiques utilisées depuis longtemps sont maîtrisées chez la souris. Le modèle murin est donc le plus approprié. Les souris commenceront à recevoir le traitement à partir de l'âge de 10 semaines, car les muscles sont considérés comme pleinement matures à partir de ce moment-là.
Immunothérapie adjuvante des allergies chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une réaction allergique leur est provoquée, avec une inflammation locale ou généralisée, un inconfort respiratoire transitoire et une baisse de la température corporelle mesurée trente minutes après chaque administration d'antigène, puis elles reçoivent des substances une à deux fois par semaine pendant cinq à huit semaines et subissent deux à trois prélèvements sanguins. La mise à mort sert à prélever poumons, intestin, peau et ganglions, le porteur indiquant que ces analyses ne peuvent pas être faites sur des animaux vivants. L'objet reste l'optimisation d'une molécule immunomodulatrice, dont il compare plusieurs versions pour la rendre "plus facile à produire", tout en affirmant qu'aucune alternative au modèle murin n'est disponible et que la souris demeure "incontournable".
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre et d’optimiser une approche innovante pour traiter les allergies. Il repose sur trois grands axes : 1.Observer comment une molécule testée agit sur certaines cellules du système immunitaire, en particulier celles qui fabriquent les anticorps. 2.Vérifier si cette approche pourrait prévenir ou soulager les différents allergies, en l’essayant dans différents modèles d’allergie chez la souris. 3.Améliorer cette stratégie en comparant plusieurs versions de la molécule, pour la rendre plus efficace, mieux tolérée, plus stable dans le temps et plus facile à produire.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’explorer une approche immunomodulatrice innovante dans un contexte allergique, et de caractériser de manière approfondie les mécanismes immunitaires sous-jacents, afin de mieux comprendre leur implication dans l’efficacité thérapeutique. Ces pathologies, en forte augmentation dans les pays industrialisés, touchent aujourd’hui jusqu’à 30 à 40 pourcents de la population mondiale et représentent un fardeau important en termes de santé publique et de coût socio-économique (arrêts de travail, baisse de qualité de vie, consommation de soins). En étudiant les effets immunologiques de cette approche, notamment sur la production d’anticorps et la régulation de la réponse immunitaire, ce projet a pour objectif d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus efficaces, mieux tolérées et adaptées aux besoins des patients allergiques. Les retombées attendues concernent principalement la santé humaine, avec un potentiel impact à long terme sur la prévention et la prise en charge des maladies allergiques. Ce projet contribue également à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation immunitaire, ce qui pourrait bénéficier à d’autres pathologies inflammatoires ou auto-immunes.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions non chirurgicales, réparties sur plusieurs semaines selon le modèle expérimental. Celles-ci incluent des administrations de substances (1 à 2 fois par semaine, quelques minutes, sur une période totale de 5 à 8 semaines, sur animaux vigiles ou sous anesthésie courte), la mesure des paramètres respiratoires (1 fois pendant le projet, environ 20 minutes, sur animaux vigiles avec contention douce) et des prélèvements sanguins (2 à 3 fois par animal sur l’ensemble du protocole, environ 5 minutes, sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
L’induction d’une réaction allergique chez les souris peut provoquer une réponse inflammatoire locale ou généralisée, pouvant entraîner une gêne physique passagère, ainsi qu’un état temporaire de mal-être. Selon le modèle allergique utilisé, cette réaction peut également s’accompagner d’un inconfort respiratoire transitoire. Par ailleurs, cette phase d’induction est susceptible de provoquer une baisse modérée de la température corporelle (stress thermique), nécessitant une surveillance spécifique. Les nuisances attendues incluent le stress lié à la contention temporaire nécessaire pour les injections et administrations, ainsi qu’à la réalisation de mesures de paramètres respiratoires. Ces manipulations peuvent entraîner un inconfort transitoire, sans conséquences durables pour les animaux. Les prélèvements sanguins répétés, indispensables pour le suivi de la réponse immunitaire, peuvent occasionner une douleur brève ainsi qu’un risque localisé d’irritation ou d’hématome. La contention temporaire nécessaire à ces procédures est également susceptible de générer un stress ponctuel, en raison de la restriction de mouvement qu’elle implique.
Devenir
À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet, qui nécessitent l’étude fine des organes impliqués dans les réponses allergiques (poumons, intestin, peau, ganglions, etc.). Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.
Remplacement
La souris est un modèle valide en immunologie et particulièrement dans les études visant à mieux décrire les mécanismes modulant la réponse immunitaire. Aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'est disponible pour cette recherche. Avant d’avoir recours à l’expérimentation animale, des approches alternatives ont été utilisées en amont du projet, notamment des cultures cellulaires et des tests de stimulation in vitro pour étudier certaines voies de signalisation. Ces modèles ont permis de mieux cibler les conditions expérimentales, de réduire le nombre d’animaux nécessaires et d’optimiser les doses utilisées. Toutefois, ces approches ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale d’une immunothérapie ou l’impact d’une modulation immunitaire dans le cadre d’une pathologie systémique comme l’allergie. La souris a donc été retenue comme modèle, en raison de sa pertinence en immunologie et de la disponibilité de lignées transgéniques bien caractérisées, qui permettent une exploration fine des mécanismes impliqués. Ainsi, malgré les efforts de remplacement mis en œuvre, l’utilisation d’un modèle murin reste à ce jour incontournable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
Dans le cadre de ce projet, un total de 2064 souris est prévu sur une durée de 5 ans. Ce nombre représente le minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en respectant le principe de réduction inscrit dans la règle des 3R. Le nombre d’animaux par groupe expérimentale a été défini à partir de calculs de puissance statistique, en se basant sur les données issues de nos travaux antérieurs, afin de garantir une puissance suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures de réduction ont été mises en œuvre : Optimisation des protocoles expérimentaux à partir de données issues de cultures cellulaires et d’études préliminaires in vitro. Planification raisonnée des groupes expérimentaux, en tenant compte à la fois de l’objectif scientifique et des contraintes de stabulation. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux impliqués, sans compromettre la validité scientifique des résultats attendus.
Raffinement
Des mesures spécifiques sont appliquées à chaque étape du protocole pour réduire douleur, stress et souffrance. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, incluant l’observation du comportement dans l’environnement habituel afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Lors de la phase d’induction allergique, une chute de température corporelle pouvant survenir (stress thermique), une mesure systématique est réalisée 30 minutes après l’administration de l’antigène. Un suivi clinique quotidien est effectué. Des critères d’arrêt stricts sont définis. Les prélèvements sanguins répétés sont réalisés à l’aide de techniques peu invasives, et la contention est brève et maîtrisée afin de minimiser la gêne. Les animaux sont hébergés en groupe dans des portoirs ventilés, à température et hygrométrie contrôlées, avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, et un cycle lumineux de 12 heures par jour. L'environnement est enrichi. L’ensemble de ces mesures vise à réduire au strict minimum les contraintes imposées aux animaux, en garantissant leur bien-être tout en assurant la fiabilité et la qualité des données expérimentales. Les procédures peuvent générer un inconfort passager lié à la contention ou aux manipulations, sans effets durables. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel expérimenté, dans des conditions visant à limiter le stress et à préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris dans ce projet se justifie par son statut de modèle validé en immunologie, particulièrement adapté aux études portant sur les mécanismes de régulation du système immunitaire et le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie. La souris offre une excellente reproductibilité des résultats, grâce à sa standardisation génétique, à la disponibilité d’outils immunologiques spécifiques, et à l’existence de nombreux modèles expérimentaux bien caractérisés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte jeune, entre 6 et 8 semaines d’âge. Ce choix correspond à un stade de développement où le système immunitaire est pleinement mature, ce qui est essentiel pour étudier les réponses immunitaires induites dans le cadre du projet.
Etude du vieillissement du globule rouge chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une transfusion sanguine par voie rétro-orbitale, pratiquée sur animal éveillé, avec un risque de complications oculaires et de surcharge de volume pouvant provoquer une insuffisance respiratoire : 2 007 souris vont être utilisées dans l'étude du vieillissement du globule rouge. 1 147 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 860 autres relèvent d'un niveau de souffrance modéré et subissent sept prélèvements de sang éveillées sur vingt et un jours. Toutes sont tuées pour que leur sang soit prélevé et analysé. Les donneuses, âgées de dix à douze semaines, sont choisies pour leur poids et le volume de sang qu'on peut leur retirer, afin de constituer ce que le porteur appelle des "banques de sang", les receveuses ayant six à huit semaines.
Objectifs
Les globules rouges sont responsables du transport d'oxygène dans le sang et ne sont pas touché par les altérations courantes liées au vieillissement des autres cellules puisque constitués presque exclusivement de protéines. L'objectif général de ce projet est de caractériser, dans un modèle de souris, l'impact de drogues modulant la capacité de dégradation de protéines abîmées sur le viellissement du globule rouge en circulation.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires et cellulaires du vieillissement des globules rouges déterminent leur durée de vie en circulation et sont donc des objets d’études cruciaux dans plusieurs contextes physipathologiques qui mènent à l'anémie. De plus, une étude de preuve de concept déterminera l'impact d'une molécule ayant le potentiel de retarder le vieillissement des globules rouges, avec pour objectif à long terme d'améliorer la qualité de circulation des globules rouges en physiologie et de traiter l'anémie dans le contexte physiopathologique de la bêta-thalassémie.
Procédures
Injection sous-cutanée pendant 5-10 secondes, suivie 20 minutes plus tard, d'une injection intra-péritonéale pendant 5-10 secondes, puis quelques minutes plus tard par un prélèvement intracardiaque (sous analgésie et anesthésie générale) pendant 1 minute, effectués une seule fois. Transfusion sanguine rétro-orbitale sur animal vigile pendant 5-10 secondes, effectuée une seule fois. Prélèvement de sang sur animal vigile pendant quelques secondes, effectué 7 fois sur 21 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont modérés. Stress induit par la contention, l'analgésie, la piqûre d'anesthésie, la mise en anesthésie, la transfusion et les prélèvements sanguins. L'anesthésie peut causer une hypothermie. La transfusion peut entraîner des complications oculaires et correspond à un apport aigu d’un volume circulant supplémentaire pouvant entraîner une surcharge volémique avec insuffisance respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever du sang qui sera analysé.
Remplacement
Veille bibliographique permanente pour éviter toute expérimentation inutile ou redondante. L’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo, dans un modèle préclinique, l’impact de drogues sur le vieillissement des globules rouges, puisqu’il est dépendant des contraintes réelles subies qu'il subit dans la circulation, qui ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro. De plus, la clairance du globule rouge sénéscent est réalisée par plusieurs tissus et types cellulaires dont l’activité dépend aussi du contexte physiologique global et complexe d’un individu.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Les tests statistiques utilisés rigoureusement permettent l’analyse d’échantillons de petites tailles. Notre expertise du modèle de transfusion sanguine chez la souris ainsi qu’une analyse statistique utilisant un logiciel nous informent que des groupes de 10 souris sont nécessaires pour générer des résultats robustes. Certaines méthodes ont été optimisées afin d'être réalisées sur de très faibles volumes de sang prélevé, et sur plusieurs marqueurs en parallèle, permettant un suivi longitudinal sur le même animal.
Raffinement
Les transfusions et prélèvements de petits volumes de sang (5µL) sur souris vigiles seront effectués par du personnel expérimenté qui maîtrisent les gestes techniques. Hébergement adapté des animaux, enrichissement de l’environnement. Lorsque l’approche expérimentale le permet, l'analgésie et l'anesthésie est utilisée pour réduire l'inconfort de l'animal. Un protocole de surveillance régulier du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basés sur un score composite d’items d'observations cliniques (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, complications liées à la transfusion).
Choix des espèces
Les lignées de souris consanguines présentent une faible variabilité biologique, augmentant la sensibilité de détection de processus physiologiques et permettant de diminuer le risque d’incompatibilité transfusionnelle. Les souris femelles adultes "donneuses" utilisées seront âgées de 10 à 12 semaines pour la réalisation des banques de sang maximisant le poids des souris et le volume à prélever. Des souris femelles jeunes adultes "receveuses" âgées de 6 à 8 semaines seront utilisées dans tous les modèles de transfusion permettant d’homogénéiser les groupes en terme de volume circulant et d’âge.
Mécanismes cellulaires et moléculaires de la calcification valvulaire aortique dépendante de Pou5f1/ERRalpha et d’une dyslipidémie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris employées sont dépourvues du gène ApoE, ce qui les rend dyslipidémiques par construction et permet d'obtenir la calcification de leur valve aortique. 85 d'entre elles vont être utilisées, 9 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 76 un niveau modéré, toutes mises à mort à l'issue sans que la raison en soit précisée. Quarante-huit reçoivent pendant quatre mois un régime composé de 42 % de matière grasse et privé de vitamine D, puis une échocardiographie sous anesthésie de trente minutes, neuf autres un gavage. Le porteur écrit que l'obésité ainsi provoquée cause un inconfort "mais pas de douleur" et que le gavage se fait "sans causer aucune douleur", alors que 76 de ces 85 souris relèvent d'un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
Environ 500 millions de personnes dans le monde souffriront de calcification de la valve aortique d’ici 2050. La CVAest une maladie progressive caractérisée par une inflammation, une fibrose et finalement une calcification de la valve. Cela conduit à un retréssissement aortique, une maladie grave précipitant le patient vers une insuffisance cardiaque. Le seul traitement pour la calcification de la valve aortique , le remplacement de la valve , n’est pas disponible pour 85% de la population mondiale. En France, 10000 remplacements valvulaires aortiques sont effectués chaque année sans toujours un bon résultat et avec des suites à la chirurgie ou même au protocole sans chirurgie . Il n’existe aucun médicament pour cette pathologie. La dyslipidémie joue un rôle majeur dans la CVA. Cependant, les cellules valvulaires (unités biologiques composant la valve) spécifiquement impliquées dans la maladie sont encore en débat. De plus, les femmes, même atteintes de dyslipidémie, sont beaucoup moins sujettes à lac alcification de la valve aortiqueque les hommes. Fait intéressant, le microbiote intestinal masculin et féminin diffère. Notre projet propose : 1. Le suivi et l'identification des cellules et de leur profil de gènes à l’origine de la CVA dans un modèle murin de dyslipidémie- 2. L 'analyse du microbiote des souris mâles et femelles atteintes de dyslipidémie au cours de la CVA et après dérégulation de la voie dépendante de des hormones oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux cibler une thérapie anti calcification valvulaire par une connaissance plus précise du mécanisme pathologique notre étude devrait apporter des informations sur la différence de pathologie valvulaire ches les hommes et les femmes et des pistes de médicaments pour la maladie. Comme le microbiote de l'intestin de la souris est fonctionnellement similaire à plus de 90 % à celui de l'homme, nous nous attendons à ce que les données soient extrapolables à la situation des patients humains.
Procédures
les animaux seront soumis à : 1. un régime riche en acide gras (42% matière grasse) sans vitamine D3) pendant 4 mois pour 48 souris 2. à une echocardiographie sous anesthésie isoflurane de durée 30 min: pour 48 souris 3. un gavage : protocole de 1 min: chez 9 souris
Impact sur les animaux
L’obésité des souris ApoE-/- en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort (mais pas de douleur) qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie . Le gavage est rapide et réalisé par des experts sans causer aucune douleur
Devenir
tous les animaux seront mis à mort
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous avons au laboratoire et utiliserons des cellules valvulaires aortiques de patients avec calcification de la valve aortique pour suivre le processus de fibrose et de calcification on et identifier les cibles médicamenteuses.
Réduction
Les mêmes souris serviront à nos deux objectifs analyse clonale et micobiote intestinal . Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une signification statistique
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage. Le tamoxifène est donné en présence de progestérone pour éviter les effects néfastes de blocage des récepteurs endogènes. L’anesthésie est utilisée pour l’échocardiographie qui se réalise en positionant l'animal sur un tapis chauffant et une sonde rectale pour controller sa température pendant les 20-30 min du protocole d’ échocardiographie.
Choix des espèces
la souris ApoE-/- est un des très rares modèles animal de calcification des valves les souris seront adultes, seul stade pour observer la pathologie
Evaluation du profil pharmacocinétique d’un candidat médicament chez le rat MODIFICATION
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 532 rats vont être utilisés pour mesurer le devenir de candidats médicaments dans le sang, 3 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 32 sous anesthésie sans réveil. Ils subissent des chirurgies de vingt à quarante-cinq minutes pour l'implantation de cathéters dans les veines ou les artères ou d'une minipompe, des administrations par voie orale, intrapéritonéale, intradermique, intramusculaire, trachéale ou intraveineuse, des jeûnes pouvant atteindre vingt heures et des prélèvements sanguins sous la langue, à la carotide ou à l'artère fémorale. Certains reçoivent une perfusion intraveineuse sous anesthésie pendant trois heures et demie, au terme de laquelle ils sont tués. Le porteur indique que 875 rats pourront être transférés vers d'autres projets, dont des formations, à condition que la gravité réellement subie soit restée légère ou modérée.
Objectifs
Le projet consiste à étudier le devenir dans l'organisme d'un candidat médicament chez le rat (éveillé ou anesthésié), grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons de sang après administration du produit à tester ainsi qu'un prélèvement terminal de liquide cephalo-rachidien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la maladie humaine qui est visée par le/les produit(s) testé(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouveaux médicaments. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques de l’espèce utilisée (le rat) et le développement de méthodes pour améliorer le bien-être des animaux. Ces méthodes sont de plus en plus adaptées à l’espèce animale la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour introduire un tube très fin dans les veines et/ou les artères ou bien introduire une minipompe qui libère progressivement le produit (20 à 45 minutes) ou une chirugie pour l'administration du candidat médicament dans l'intestin (20-30 min). Les rats seront administrés (moins de 2 minutes) avec les produits à tester par différentes voies: orale, intrapéritonéale (au niveau de l'abdomen), sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, dans la trachée, ou intraveineuse (avec une dose unique ou par injection lente). [AJOUT] Certains rats seront administrés par voie intraveineuse sous anesthésie sur une période n'excédant pas 3h30 et seront euthanasiés à la fin de l'administration. Les animaux pourront être mis à jeun la veille de l'administration pour une durée qui est dépendante du produit à tester (maximum 20h). Des prélèvements de sang (moins de 2 minutes) pourront être réalisés: - Au niveau de la veine sous la langue de l’animal transitoirement anesthésié - Au niveau de la veine de la queue, du cou ou des pattes sur l’animal actif au moyen d'un maintien adapté de l'animal - Au niveau de l'artère qui distribue le sang du coeur vers la tête (carotide) ou de l'artère de la cuisse (fémorale) sur animal préalablement implanté d'un tube très fin.
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie, les animaux pourront être hébergé individuellement: 5 jours maximum post chirurgie. Cet hébergement individuel engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'hébergement individuel permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'hébergement individuel en cage de mise à jeun. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets ou si implantés avec les dispositifs médicaux. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (en milieu artificiel ou par informatique) pour évaluer la pharmacocinétique d’un nouveau produit. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 5 par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.