Rongeurs
Determiner les modulations du phénotype microglial dans les pathologies neurodégénératives pour détecter des biomarqueurs précoces et développer de nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Chercher des biomarqueurs précoces des maladies neurodégénératives dans la rétine et le cerveau conduit à utiliser 6 104 souris, toutes tuées à l'issue pour prélever système nerveux central, ganglions lymphatiques et rates. 5 240 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 64 un niveau léger, et 800 sont opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. 5 304 souris subissent des lavages oculaires vigiles, 6 040 des injections intrapéritonéales cinq jours de suite dont 2 000 des injections de toxine, et 3 240 des interventions chirurgicales de 30 minutes à 2 heures avant une mise à mort trois à neuf semaines plus tard. La toxine provoque une hypothermie marquée pouvant aller jusqu'à une mortalité aiguë, quand les retombées annoncées, prévenir ou ralentir des pathologies "toujours incurables", restent au conditionnel.
Objectifs
Avec près de 2 millions de cas en France, l’impact sociétal des maladies neurodégénératives est extrêmement élevé et devrait augmenter à l’avenir en raison de la proportion toujours croissante de la population âgée de plus de 65 ans. Ces maladies se caractérisent à la fois par la dégénérescence progressive de certains neurones et par l’apparition d’une inflammation marquée et chronique dans le cerveau. Cette neuroinflammation implique à la fois l’activation de cellules résidentes (astrocytes et microglies) et une infiltration de cellules immunitaires de la périphérie, notamment de lymphocytes et de macrophages. Plusieurs études dont les nôtres ont démontré que la neuroinflammation participe activement à la progression pathologique, a minima en exacerbant les lésions neuronales, voire précédant ces lésions. Dans de précédentes expériences, nous avons mis en évidence un rôle majeur d'une protéine dans la microglie, dans l’orchestration de ces phénomènes dans des modèles de la maladie de Parkinson. Le projet actuel vise d’une part à étudier le rôle de 3 partenaires de cette protéine sur le phénotype microglial, et d’autre part à élargir l’étude à d’autres modèles physiopathologiques impliquant la microglie, notamment au cours du vieillissement et de la maladie d’Alzheimer. Nos travaux permettront de mieux comprendre ces phénomènes biologiques complexes et de déterminer de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces pathologies toujours incurables. Nous mettrons également en évidence des biomarqueurs précoces de ces conditions physiologiques et pathologiques permettant diagnostique et un pronostique précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques impliqués dans les pathologies neurodégénératives, liées ou non au vieillissement. Il permettra en particulier de mieux caractériser la participation des phénomènes inflammatoires dans le déroulement physiopathologique, et de révéler les évènements précoces au niveau de la rétine. Les résultats obtenus pourront ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les fonctions microgliales, permettant la prévention ou un ralentissement de la progression de cette pathologie chez les patients. Par ailleurs, les résultats de ce projet permettront d’identifier des biomarqueurs pronostiques précoces, utiles à la fois pour le diagnostic et le suivi clinique des patients. Ces avancées sont particulièrement cruciales pour des maladies pour lesquelles aucune option thérapeutique curative n’est à ce jour disponible.
Procédures
Au cours de ces procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements issus de lavages oculaires sur animal vigile (5304 animaux). Des animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales (5 jours consécutifs) sur animal vigile (6040 animaux). Parmi ces derniers, certains seront soumis à 2 séries d'injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs dont des injections de toxine (2000 souris). Certains animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie générale (3240 souris). Les interventions dureront 30 minutes à 2h et les animaux seront mis à morts 3 à 9 semaines après l'intervention.
Impact sur les animaux
Les injections par voie intrapéritonéale nécessitent une contention forte qui peut induire de l’anxiété, mais aucune des molécules injectées ne provoque de la douleur post-administration. LEs modèles de la maladie de Parkinson utilisés dans ce projet sont asymptomatiques. Néanmoins, l’administration de toxine entraîne une hypothermie transitoire marquée, susceptible de provoquer une instabilité cardiovasculaire pouvant aller jusqu’à une mortalité aiguë. Les injections stéréotaxiques et intravitréennes seront réalisées sous anesthésie générale, induisant une perte de la capacité de thermorégulation ainsi que des douleurs post-opératoires, minorées par les antalgiques.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. Le organes (systèmes nerveux central, ganglions lymphatiques, rates) seront récupérés pour réaliser des analyses cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Contrairement aux modèles in vitro, l’expérimentation animale permet de restituer la complexité spatio-temporelle des réponses cellulaires dans leur environnement physiologique, en tenant compte de la diversité des types cellulaires impliqués, de leur état métabolique spécifique, ainsi que de leurs interactions fonctionnelles. Les modèles cellulaires immortalisés ou les systèmes in vitro, bien qu’utiles pour des analyses mécanistiques ciblées, ne permettent pas de reproduire avec précision les régulations métaboliques fines ni les interactions neuro-immunitaires observées dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale constitue ainsi une étape indispensable pour valider les hypothèses dans un contexte physiologique pertinent. Une fois ces mécanismes validés in vivo, nous approfondirons l’étude des processus moléculaires à l’aide de cultures primaires de neurones, de microglies et de lymphocytes, ainsi que par le biais de cultures organotypiques de rétine murine que nous avons développées au sein du laboratoire.
Réduction
Nous planifierons rigoureusement chaque expérience afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la robustesse statistique des résultats obtenus. Les modèles d’induction de la maladie de Parkinson sélectionnés ont déjà été validés au sein de notre équipe et chez nos collaborateurs, ce qui nous permet d’optimiser la taille des groupes expérimentaux ; des cohortes de 10 souris sont nécessaires pour obtenir des données exploitables. Pour le modèle de synucléinopathie, l’approche retenue repose sur l’injection unilatérale du vecteur d'intérêt dans un œil, tandis que l’autre œil reçoit un vecteur contrôle, ce qui permet de réduire significativement le nombre d’animaux tout en limitant la variabilité interindividuelle. Par ailleurs, dans la mesure du possible, nous analyserons un ensemble étendu de paramètres cellulaires, moléculaires et transcriptionnels sur les mêmes individus, afin d’optimiser l’exploitation des tissus et de limiter le recours à des procédures expérimentales supplémentaires.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera une priorité tout au long de nos expérimentations et fera l’objet d’un suivi rigoureux, conformément aux recommandations du comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) de notre établissement. Les souris seront hébergées en groupes dans des cages de surface adaptée, avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L’environnement sera systématiquement enrichi (présence de coton pour la construction de nids, tunnels), et une période d’acclimatation à l’hébergement (1 semaine) puis à la manipulation et à la contention (2 semaines) sera mise en place afin de réduire le stress lié aux interventions. La douleur et l’angoisse seront systématiquement limitées par l’utilisation d’analgésiques et le recours à l’anesthésie générale lors des procédures invasives. Afin de prévenir cette baisse de température corporelle, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant au moins une heure (ou jusqu’au réveil si anesthésie générale) après les interventions afin de leur permettre de maintenir une température compatible avec la récupération de leur capacité de thermorégulation. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé dès l’initiation des procédures expérimentales, permettant d’évaluer leur état général (prise alimentaire, comportement social, locomotion, toilettage), et d’intervenir rapidement si nécessaire, notamment via l’aide à l’alimentation ou des ajustements environnementaux. Des critères d’arrêt précis, validés par le SBEA, permettront d’interrompre immédiatement toute expérimentation en cas de dégradation de l’état de santé d’un animal. Tout animal présentant un ou plusieurs de ces signes sera euthanasié sans délai, dans le respect des protocoles en vigueur. Les responsables du projet sont titulaires des autorisations à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Choix des espèces
L’étude des processus de mort neuronale et de neuroinflammation nécessite le recours à des modèles capables d’intégrer l’ensemble des mécanismes physiopathologiques impliqués ces pathologies complexes, qui impliquent différents types cellulaires de différents systèmes physiologiques. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir des résultats exploitables et pertinents au regard de la pathologie humaine. La souris a été choisie en raison de son faible coût, de sa facilité de manipulation, et de sa bonne tolérance aux procédures expérimentales. Le fond génétique C57BL/6J est celui qui présente la meilleure susceptibilité aux modèles utilisés. Ce choix est également justifié par la disponibilité d’outils génétiques adaptés : notre projet repose sur l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées exclusivement disponibles dans ce modèle. Par ailleurs, de nombreux outils moléculaires et immunologiques validés sont disponibles pour cette espèce, rendant possible une dissection fine des mécanismes pathologiques à l’échelle cellulaire. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
Elevage de souris trangéniques immunodéficientes à phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Les souris élevées ici sont transgéniques et immunodéficientes, ce que le porteur qualifie de "phénotype dommageable" et qui les expose à développer des infections. 1 225 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 103 d'entre elles et modéré pour 122, la seule intervention déclarée étant le déclenchement de ce phénotype. Le porteur affirme pourtant que ce phénotype ne s'exprime pas, les conditions d'hébergement en cages ventilées avec litière et aliments stérilisés l'empêchant, et que ces souris se reproduisent normalement en l'absence de pathogène. L'élevage sert à produire des souriceaux pour des greffes de neurones humains, les géniteurs étant tués en fin de fertilité vers six mois et les autres transférés en zone d'expérimentation pour être inclus dans d'autres projets.
Objectifs
Nous élevons des souris immunodéprimées en vue d'obtenir des souriceaux pour expérimentation (greffes).
Bénéfices attendus
Cette lignée est utilisée car son immunodéficience rend possible la greffe de neurones d'autres espèces, et donc la recherche en neurobiologie humaine.
Procédures
La seule intervention qui pourrait intervenir sur les animaux est le déclenchement de leur phénotype dommageable, soit le développement d'infections à cause de l'immunodéficience.
Impact sur les animaux
En présence de pathogène, ces souris risquent de développer des infections. Cependant, en l'absence de pathogène, ces souris se reproduisent normalement et n'ont pas de phénotype dommageable. Vues les conditions d'hébergement, ce phénotype ne s'exprime pas.
Devenir
Les animaux arrivant en fin de fertilité (maximum 6 mois d’âge) sont mis à mort. Les animaux destinés à être expérimentés sont transférés en zone d’Expérimentation et inclus dans d’autres projets d'expérimentation en utilisation continue.
Remplacement
Nous utilisons des souris pour un projet expérimental de greffe de neurones humains. Pour qu'il y ait tolérance de ces neurones, nous devons travailler avec des souris immunodéficientes.
Réduction
Nous élevons les souris en vue d'obtenir des souriceaux pour expérimentation. Il s'agit donc de produire de manière optimale des femelles et des mâles pour accouplement, et des petits pour expérimentation.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Nos conditions d’élevage permettent au phénotype dommageable de ne pas s’exprimer: cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, aliment et eau stérilisés. Les enrichissements sont variés et adaptés au type d’animaux dans la cage. Les points limites définis dans le cadre du suivi des animaux sont précoces avec grille de décision et d'administration d'analgésique de manière à éviter une installation de la douleur.
Choix des espèces
Nous étudions le cervelet humain. Nous avons pour cela besoin d'un modèle mammifère de cervelet. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons pour des raisons éthique la souris comme modèle plutôt q'un primate ou autre Mammifère. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux utilisés auront entre 2 et 6 mois.
Évaluation préclinique des effets potentiellement anxiolytiques et pro-cognitifs d’une nouvelle classe de modulateurs allostériques (‘nanobodies’) du récepteur nicotinique alpha7
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Habituation à l'expérimentateur pendant plusieurs jours, puis une à deux injections de composés répétées jusqu'à quatre fois, deux à trois tests comportementaux d'une heure par jour, un stress aigu induit pharmacologiquement jusqu'à quatre fois, et pour certaines un stress chronique de contention d'une heure par jour pendant deux semaines : 832 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 264 d'entre elles et modéré pour 568. Le porteur attend une anxiété chronique, une perte de poids légère et de possibles altérations de l'état général chez les animaux soumis à la contention répétée. Il précise que les souris ne pourront pas être réutilisées pour tester plusieurs doses d'un même composé, faute de connaître l'ampleur et la durée des effets. Tous les cerveaux sont prélevés après mise à mort, pour des expériences ex vivo sur des modulateurs d'un récepteur nicotinique.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de tester pour la première fois, chez des modèles murins en conditions basales ou après exposition à un stress, les effets potentiellement anxiolytiques et/ou pro-cognitifs d’une nouvelle classe de composés pharmacologiques très sélectifs et capables de stimuler des récepteurs ayant précédemment été impliqués dans les déficits cognitifs associés à plusieurs pathologies neuropsychiatriques et plus récemment à l’anxiété.
Bénéfices attendus
Les pathologies neurodégénératives, neurodéveloppementales et psychiatriques associées à des troubles anxieux et/ou cognitifs représentent l’un des enjeux majeurs de santé publique, et leur prévalence s’accroit. Il n’existe à ce jour pratiquement aucun traitement efficace pour soigner ces pathologies, notamment les troubles cognitifs et l’anxiété qui leur sont associés. A court terme, ce projet devrait permettre une première identification des effets thérapeutiques potentiels d’une nouvelle classe de composés pharmacologiques ciblant certains récepteurs aux neurotransmetteurs, sur ces aspects. Ce projet générera des bases solides pour des études précliniques plus approfondies en vue de futures études cliniques avec nos collaborateurs proches qui ont accès à des cohortes de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux à trois tests comportementaux d’1h maximum par jour, ce jusqu’à quatre fois, susceptibles d’entraîner un stress passager. Ils recevront une à deux injections de composés pharmacologiques, ce répété un maximum 4 fois par animal. Certains animaux seront exposés à un stress aigu induit pharmacologiquement de durée d’une heure maximum, jusqu’à quatre fois. Certains animaux seront exposés à un stress chronique de contention pendant 1 heure par jour pendant deux semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent éprouver un inconfort et une douleur légers de courte durée liés à l’introduction de l’aiguille. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une anxiété transitoire lors de la soumission à un stress aigu, celle-ci devrait disparaitre au bout de quelques heures maximum, on n’attend pas d’altération de l’état général. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une anxiété chronique lors de la soumission à un stress chronique (contention quotidienne durant 1h pendant deux semaines). On peut s’attendre à une perte de poids légère et à de possibles altérations de l’état général et du comportement qui devraient rester légères pendant cette période (une étude montre une perte de poids de 5% après 4 semaines de contention quotidienne de 6h.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo
Remplacement
Pour identifier les effets potentiels thérapeutiques de nouveaux composés sur les processus cognitifs et anxieux, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents
Réduction
La méthodologie statistique a été réfléchie et discutée en amont de la soumission de ce projet sur la base de notre expertise de longue date et de la littérature. Dans nos études, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 12 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souche d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle la même souche de souris est couramment utilisée. Notre expérience en études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés pour tester plusieurs doses d’un même composé car nous ne connaissons pas encore ni l’ampleur ni la durée des effets susceptibles d’être observés. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Entre les expériences, les animaux seront laissés tranquilles dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. et nous nous rapprocherons de la structure responsable du bien-être animal (SBEA) pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Par exemple, du gel hydrique pourra être proposé aux animaux en cas de dénutrition et /ou perte de poids. L’exposition au stress étant utilisé pour la première fois par notre équipe, une évaluation sera faite en continue avec le vétérinaire et la SBEA pour améliorer le bien-être sans interférer l’objectif scientifique. Des points limites sont établis pour chaque procédure avec des actions correspondantes pour limiter la douleur à son minimum sans compromettre les résultats scientifiques.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire. La souris est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite mettre en œuvre des tests relativement rapides mais largement validés et riches en information pour mesurer les fonctions cognitives et les niveaux d’anxiété. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 10 semaines), afin que le cerveau soit suffisamment développé notamment pour l’étude de leur comportement.
Etude préclinique de correcteurs de mutations non sens dans des modèles de cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les 1 800 souris reçoivent toutes une injection de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse, puis 900 sont gavées une à deux fois par jour pendant 28 jours et 900 autres portent une pompe osmotique implantée dans le dos, agrafes retirées une semaine plus tard. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, toutes les souris étant tuées à la fin pour l'analyse moléculaire de leurs tumeurs, et la croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine. Le porteur écrit veiller à ce que les molécules testées ne portent pas atteinte aux "libertés individuelles de l'animal", définies comme l'absence de douleur, de lésion, de maladie, de peur et de détresse, dans un protocole qui commence par greffer une tumeur. Il ne décrit par ailleurs que des lots de cinq animaux en phase exploratoire puis quarante pour la démonstration d'efficacité, sans expliquer comment l'effectif atteint 1 800.
Objectifs
Les mutations non sens sont responsables d’environ 10% des maladies génétiques. La conséquence d’une mutation non sens est la dégradation rapide de l’ARNm porteur de la mutation par un mécanisme de surveillance des ARNm appelé NMD (pour nonsense-mediated mRNA decay). Certaines molécules sont capables de restaurer l’expression d’un gène porteur d’une mutation non sens. Ce type de molécules représente des candidats médicaments pour le traitement de certains patients atteints de maladie génétique. Nous recherchons au laboratoire des molécules capables de corriger les mutations non sens. Pour cela nous criblons des chimiothèques puis validons les molécules sur des lignées cellulaires. Une étude est ensuite entreprise pour déterminer la toxicité des molécules sélectionnées et leur mode d’action. L’étude préclinique est achevée après avoir démontré que les molécules sont capables de corriger les mutations non sens in vivo au sein d’un organisme complexe tel qu’une souris. L’étude in vivo consistera à déterminer la voie d’exposition, la concentration la plus efficace et la cinétique d’action de la molécule. Pour cela, les voies d’exposition qui seront testées sont la voie orale en gavant la souris avec différentes quantités de molécules et la diffusion sous-cutanée au moyen d’une pompe osmotique. Pour évaluer l’efficacité des molécules, nous effectuerons des mesures de croissance tumorale puis une analyse moléculaire sur les tumeurs après mise à mort des animaux.
Bénéfices attendus
La validation de l’efficacité de molécules permettant de corriger des mutations non-sens (entraînant la production de protéines généralement non-fonctionnelles) dans un organisme complexe comme la souris permettra à terme le développement de futurs médicaments pour traiter l’Homme souffrant de maladies génétiques telle que le cancer.
Procédures
L'ensemble des animaux (1800) seront anesthésiés par voie gazeuse afin de procéder à l'injection des cellules tumorales au niveau de leur flanc (durée de l'anesthésie : 10 minutes). L’ensemble des souris seront pesées 1 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (2 minutes). Deux voies d'administration de traitement seront ensuite évaluées. - Traitement par voie orale : une partie des animaux (900) recevront une à deux fois par jour un traitement ou son placebo par voie orale (30 secondes). Le traitement durera au maximum 28 jours. - Traitement par voie sous-cutanée : une partie des animaux (900) auront une implantation au niveau du dos d’un système permettant la délivrance en continu du traitement ou de son placebo (Chirurgie pour implanter une pompe osmotique : 10 minutes). Une semaine après l’intervention, les agrafes sont retirées sous anesthésie gazeuse (1 minute). Le traitement durera au maximum 28 jours.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour but de valider l’utilisation de nouvelles molécules comme éventuel candidat médicament. Bien que des tests de toxicité auront été effectués au préalable sur culture cellulaire, l’effet de ces molécules sur un organisme entier doit être évalué. Pour cela, nous veillerons à ce que ces molécules ne portent pas atteinte aux libertés individuelles de l’animal définies comme étant l’absence de faim, de soif et de malnutrition, l’absence de peur et de détresse, l’absence de stress physique et/ou thermique, l’absence de douleur, de lésions et de maladie ainsi que la liberté d'expression d'un comportement normal de son espèce. Cette observation servira à détecter une nuisance sur du long terme d'exposition à la molécule étudiée. Au cours des procédures, les animaux seront soumis à un stress léger de courte durée lors des anesthésies (par voie gazeuse ou par injection). De même, le traitement par voie orale, bien accepté par l'animal, pourra générer un stress léger et de courte durée lors de la contention. L'implantation de la pompe, réalisée sous anesthésie, ne devrait pas générer de gêne au mouvement de l'animal (placée sous la peau dans le dos) mais pourrait conduire à une douleur post-opératoire qui sera gérée par analgésiques. L'injection des cellules tumorales sera réalisée de manière à ne pas entraver les mouvements de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience afin de pouvoir procéder à l’analyse moléculaire des tumeurs et d’autres tissus.
Remplacement
Dans la première partie du projet, nous disposons d’un programme de caractérisation des nouvelles molécules que nous identifions et sélectionnons basé sur le criblage cellulaire. Cette étape in vitro préalable est essentielle afin de déterminer la dose efficace en culture cellulaire (ce qui nous permet d'extrapoler pour définir une fenêtre de doses qui seront utilisées chez la souris), la toxicité cellulaire et le mode d'action. Cette étape permettra de remplacer l'animal dans la phase de sélection des molécules et d'évaluation des conditions optimales d'utilisation. Cependant, bien qu’une grande partie de l’étude se réalise in vitro remplaçant ainsi le modèle animal, l’expérimentation in vivo demeure nécessaire afin de pouvoir étudier l’effet de ces molécules sélectionnées avec soin dans un modèle physiologique pertinent reflétant la mutation étudiée à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Le projet est conforme aux exigences de réduction puisqu'une phase exploratoire avec un nombre réduit d'animaux par lot (lot de 5) sera effectuée afin d'identifier la voie d'exposition, la concentration et la cinétique d'action de la molécule étudiée et ce afin d'abaisser au minimum le nombre d'animaux qui seront ensuite utilisés pour la démonstration de l'efficacité d'action de la molécule in vivo. Ce nombre sera de 40 ce qui correspondra à deux séries d'expériences avec 10 animaux par condition (avec et sans la molécule). La répétition de l'expérience est nécessaire pour s'affranchir d'un éventuel effet biaisé lié à la préparation de la molécule, au lot d'animaux ou à un stress survenu pendant l'expérience. Le nombre de 10 animaux par condition et par série afin de pouvoir réaliser ensuite un "student test" qui est le test statistique utilisé dans les expériences permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement.
Raffinement
Enfin, concernant le raffinement, l'expérience sera toujours menée de façon à prévenir ou à réduire au maximum toute souffrance. Ainsi, la voie d'exposition efficace la moins invasive sera privilégiée (la voie orale plutôt que sous-cutanée) et une anesthésie sera effectuée lorsque cela est compatible avec l'expérience. Des analgésiques seront utilisés pour pallier toute douleur pouvant survenir à la suite de l'implantation du système de diffusion sous-cutané. Les conditions d'hébergement seront telles que les animaux pourront bénéficier d'un enrichissement de leur environnement permettant une réduction de leur stress.
Choix des espèces
La souris présente l'avantage d'avoir un mécanisme de reconnaissance des codons stop prématurés étudié dans notre projet semblable à celui de l'Homme. De plus, la souris a un cycle de vie compatible avec le test in vivo sur plusieurs semaines de molécules à visées thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de la quatrième semaine après la naissance et jusqu'à 6 mois maximum après la naissance. La limite inférieure correspond à l'âge de maturité du système immunitaire chez la souris et la limite supérieure a été fixée à 6 mois car après, nous les considérons comme trop âgées ce qui pourrait compliquer l'interprétation des résultats.
Analyse de l’effet preventif et curatif du vieillissement par des extraits de plantes sur la mémoire et la cognition
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six tests comportementaux, dont des tests destinés à évaluer des états de type anxieux ou dépressif, qualifiés de "simples, sans douleur" : 400 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. L'extrait végétal est administré dans l'eau de boisson, sans geste invasif, et la seule nuisance retenue est la contention nécessaire à l'injection de la surdose anesthésique qui les tue. Les cerveaux sont prélevés pour analyses histologiques, biochimiques et moléculaires, afin de tester si cet extrait prévient le vieillissement cérébral non pathologique. Le porteur retient des souris de douze mois, assez âgées pour présenter des signes de vieillissement et assez jeunes pour supporter un traitement long, et précise que le produit est déjà vendu dans le commerce et sa sécurité démontrée chez l'humain.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les effets du traitement par un extrait végétal connu pour ses propriétés neuroprotectrices, sur la mémoire, la cognition et le bien-être général chez des souris âgées. Cet extrait végétal a aussi un effet bénéfique sur les sujets avec maladie d’Alzheimer. L’hypothèse centrale est que cet extrait végétal, administré par voie orale, pourrait prévenir ou atténuer les effets du vieillissement cérébral non pathologique. Ceci pourrait à long terme contribuer à la validation scientifique de substances d’origine naturelle comme options thérapeutiques ou complémentaires dans la prévention ou la prise en charge des troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Le vieillissement cérébral entraîne souvent un déclin progressif des fonctions cognitives (mémoire, attention, apprentissage) ainsi que des troubles de l’humeur et de la motivation. Les options pour prévenir ce déclin lié à l’âge restent limitées. Ce projet vise à tester les effets d’un extrait végétal, utilisé dans certaines maladies neurologiques, sur la cognition et le bien-être de souris âgées. Les tests comportementaux évalueront la mémoire, la reconnaissance d’objets, la motivation, l’exploration et la qualité des nids, offrant une vue d’ensemble de l’impact du traitement. Si les résultats sont positifs, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies préventives chez l’humain, d’autant que cet extrait végétal présente un bon profil de tolérance. Le projet aidera aussi à identifier des biomarqueurs du vieillissement cérébral, utiles pour suivre de futures interventions.
Procédures
Les animaux seront soumis à six tests comportementaux simples, sans douleur, afin de mesurer leur mémoire, activité locomotrice, anxiété, dépression. Chaque test sera effectué une seule fois. La durée de ces tests varie entre 6 minutes et 20 minutes pour chaque souris. Une légère nuisance est engendrée lors de la contention pour l’injection de la surdose anesthésique qui dûre 3-5 secondes.
Impact sur les animaux
Les études précédentes n’ont mis en évidence aucun effet secondaire majeur ni indésirable sur les animaux. Toutefois, une légère nuisance peut être engendrée lors de la contention nécessaire pour l’injection de la surdose anesthésique. De plus, certains tests comportementaux, tels que ceux visant à évaluer des états de type anxieux ou dépressif, peuvent induire un niveau de contrainte ou de stress léger et transitoire pour les animaux. L’ensemble de ces nuisances est considéré comme léger et de courte durée, sans conséquence durable sur le bien-être animal.
Devenir
Mise à mort: La mise à mort des animaux est justifiée par la nécessité de poursuivre les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires permettant de comprendre les effets des extraits végétaux sur le vieillissement cérébral et les fonctions cognitives. Ces investigations exigent le prélèvement de tissus cérébraux intacts, fixés ou frais, non compatibles avec la survie des animaux. L’analyse fine des structures neuronales, vasculaires et gliales, ainsi que l’évaluation des marqueurs de vieillissement cellulaire, requièrent donc la mise à mort des souris en fin d’expérimentation afin d’obtenir des échantillons de qualité et de répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Le remplacement des souris par d'autres modèles (in silico, in vitro, organoïdes, etc.) n'est pas envisageable dans le cadre de cette étude, car celle-ci vise à évaluer les effets d’un traitement oral par l'extrait végétal sur des fonctions complexes telles que la cognition, la mémoire, la motivation ou encore le bien-être général dans un contexte de vieillissement. Ces dimensions reposent sur des interactions dynamiques entre plusieurs systèmes (nerveux, immunitaire, endocrinien, digestif…) qu’aucun modèle alternatif ne peut actuellement reproduire de manière intégrée.
Réduction
Pour utiliser le plus petit nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs nous faisons les actions suivantes : 1. Calcul rigoureux de la taille d’échantillon : nous utilisons de logiciels de puissance statistique pour déterminer le nombre minimal de souris requis. 2. Mesures comportementales multiples : nous utilisons plusieurs tests cognitifs chez les mêmes individus pour maximiser les données par animal. 3. Utilisation de groupes contrôles minimum: nous utilisons seulement un groupe contrôle (boisson saline seulement) sans utiliser un groupe sans traitement car ceci est scientifiquement valable. 4. Analyse longitudinale : nous suivons les mêmes animaux à différents temps pour limiter le nombre total requis.
Raffinement
Pour améliorer les conditions de vie et réduire la souffrance des animaux, nous mettons en oeuvre les actions suivantes : 1. Surveillance rigoureuse : suivi clinique durant les deux premières semaines de traitement, puis bi-hebdomadaire, avec pesée hebdomadaire. Surveillance quotidienne assurée par l’équipe zootechnie suivant la grille d’observation (pelage, réactivité, etc) tout au long du traitement. 2. Traitement non invasif : Administration de l'extrait végétal via l’eau de boisson pour limiter le stress lié aux manipulations. Aucun geste invasif n’aura lieu durant ce projet. 3. Tests comportementaux non invasifs : Tous les tests choisis sont conçus pour être faiblement stressants, réalisés à luminosité faible et après acclimatation. Si besoin nous pourrons ajouter du matériel de nidification, d’abris (tunnels, igloos, cabanes), et d’objets à manipuler ou explorer (rouleaux en carton, plateformes, etc.). Ces enrichissements permettent de stimuler les comportements naturels (construction de nids, exploration, interaction sociale), de réduire le stress et d’améliorer les conditions de vie en captivité.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans cette étude est scientifiquement justifiée par les données existantes sur l'extrait végétal , déjà testé chez les rongeurs (souris et rats), avec des effets neuroprotecteurs documentés. Le choix des souris, bien caractérisées pour les études de vieillissement cognitif, permet une évaluation précise des effets du traitement sur la mémoire et le comportement. Les souris présentent également l’avantage d’une variabilité génétique réduite, d’une compatibilité optimale avec les tests comportementaux utilisés, et d’un accès à des outils analytiques validés. L’administration de l'extrait végétal par l’eau de boisson est non invasive, respectant ainsi les principes éthiques de réduction de la souffrance animale. De plus, ce produit est disponible commercialement et sa sécurité a été démontrée chez l’humain, renforçant la pertinence translationnelle du modèle murin dans un contexte de prévention ou d’atténuation du déclin cognitif lié à l’âge. Ce modèle constitue donc une étape essentielle avant une application clinique. Nous utilisons des souris âgées de 12 mois, qui présentent déjà certains signes de vieillissement cérébral tout en étant encore suffisamment jeunes pour permettre un traitement de longue durée.
Effets de la nutrition sur le renouvellement de l’épithélium intestinal chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
8 106 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant subir une biopsie de la queue, un gavage hebdomadaire pendant douze semaines et cinq jours consécutifs d'injections intrapéritonéales de tamoxifène. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 5 166 d'entre elles et modéré pour 2 940, avec un stress lié à la contention, une douleur modérée à la biopsie caudale et des pertes de poids possibles. Les intestins et les fèces sont prélevés après mise à mort, pour comprendre comment l'alimentation agit sur le renouvellement de l'épithélium intestinal, les souris non retenues pour les procédures étant elles aussi tuées. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement", tout en indiquant que certaines études pourront être menées sur des organoïdes issus de ces mêmes souris, et aucun effectif n'est avancé pour justifier les 8 106 animaux.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour objectif de comprendre comment les tissus de l'intestin se renouvellent et d'identifier les mécanismes contrôlant ce renouvellement. Il propose d'étudier les effets de l’alimentation sur ce renouvellement. Il vise à identifier les protéines essentielles à la physiologie intestinale et pouvant être les médiatrices des effets de l'alimentation sur l’intestin. En outre, la contribution de la flore intestinale dans les effets de l'alimentation sur ce tissu sera étudiée.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques (alimentation pauvre en calories) ou délétère (régimes riches en graisses) de l’alimentation sur l'intestin. Ces recherches devraient enrichir la compréhension de la biologie des cellules intestinales mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives de traitements utilisant des approches nutritionnelles.
Procédures
• biopsie de queue : 10 secondes. • Contention pour gavage : 20 secondes (1X par semaine pendant 12 semaines)• Contention pour injection intrapéritonéale tamoxifène: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours). Contention pour injection intrapéritonéale d’anesthésique: 20 secondes. Prélèvement sanguin : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors de la contention, des injections intrapéritonéales et des gavages. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire. Une douleur modérée lors de la biopsie caudale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus dans les procédures expérimentales, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.
Remplacement
L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés. Certaines études pourront être réalisées sur des organoïdes issus de ces animaux, permettant ainsi de tester plusieurs drogues à partir d’une seule souris.
Raffinement
Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des grilles de points limites spécifiques sont établies. Le raffinement comprend l’utilisation d’anesthésiques avant le prélèvement sanguin. Pour les gavages des canules en inox adaptées à l'âge des souris sont utilisées.
Choix des espèces
Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 8 à 16 semaines, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.
Thérapie génique de l’environnement tumoral pour forcer l’entrée et la destruction immunitaire des tumeurs pancréatiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées pour que les tumeurs soient prélevées et l'efficacité du traitement vérifiée, 1 000 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc et 640 dans le pancréas lui-même, 880 subissent deux à trois injections d'un produit d'imagerie suivies de 15 minutes d'anesthésie, environ 1 000 une injection de vecteur viral dans la tumeur et 600 une injection de lymphocytes. La croissance des tumeurs peut entraîner suppurations, nécroses, anémie légère et une perte de poids allant jusqu'à 20 % du poids maximal. Le porteur décrit les gènes thérapeutiques comme un "cheval de Troie" censé casser le "bouclier" du microenvironnement tumoral, et conclut que le recours au modèle in vivo est "indispensable" parce qu'aucune culture cellulaire ne reconstitue ces interactions.
Objectifs
Le cancer du pancréas est l’un des cancers les plus difficiles à traiter, avec un pronostic souvent très mauvais. Parmi les approches prometteuses, il y a l’immunothérapie cellulaire, une technique qui consiste à "reprogrammer" les cellules immunitaires du patient pour qu'elles puissent mieux attaquer la tumeur. Cette méthode a déjà donné d'excellents résultats contre certains cancers du sang. Mais pour le cancer du pancréas, c’est beaucoup plus compliqué. En effet, la tumeur s'entoure d'un microenvironnement (comme un bouclier) qui bloque à la fois les traitements et le système immunitaire du patient. Résultat : même les cellules immunitaires modifiées n’arrivent pas à atteindre leur cible. L'idée de notre projet est de casser ce bouclier protecteur. Pour cela, nous proposons une thérapie génique capable de transformer la tumeur de l’intérieur. Comment ? En utilisant des virus modifiés qui vont aller spécifiquement infecter les cellules cancéreuses pour y introduire des gènes thérapeutiques. Ces gènes agiront comme un cheval de Troie : ils seront portés par les cellules tumorales elles-mêmes et rendront la tumeur plus vulnérable aux attaques du système immunitaire et aux traitements. On ne cherche pas à toucher toutes les cellules tumorales (ce qui est très difficile), mais juste assez pour changer l’environnement local de la tumeur. Cela suffira pour attirer les cellules immunitaires tueuses et ouvrir la voie à l’immunothérapie. En résumé, on veut utiliser la thérapie génique pour affaiblir la tumeur de l’intérieur et permettre au système immunitaire de reprendre le dessus.
Bénéfices attendus
Les nouveaux traitements contre le cancer ne sont pas très nombreux, et ceux qui semblent prometteurs ne fonctionnent malheureusement pas pour tous les types de cancer. Le cancer du pancréas est particulièrement difficile à traiter. Seules certaines tumeurs opérables peuvent être guéries. Pour les autres, les options restent très limitées. Ce projet propose une nouvelle approche thérapeutique innovante. La thérapie génique, qui consiste à modifier génétiquement certaines cellules pour traiter une maladie, est encore très peu utilisée contre le cancer
Procédures
Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : durée 10 minutes – 1 fois par animal, 360 animaux. Greffe de cellules tumorales dans l’organe d’origine afin de reproduire plus fidèlement la tumeur , et éventuellement injection de treatment experimental : durée 10 minutes – 640 animaux. Injection de une substance permettant l'imagerie : durée 1 minute – 2 à 3 fois par animal, 880 animaux. Anesthésie gazeuse durant l’imagerie : durée 15 minutes – 2 à 3 fois par animal, 880 animaux. Injection de LV (vecteur dérivé d’un virus inactif) dans la tumeur : durée 2 minutes – 1 fois par animal, ~1 000 animaux. Injection de lymphocytes par voie intraveineuse : durée 2 minutes – 1 fois par animal, ~600 animaux.
Impact sur les animaux
La greffe de lignées cellulaires tumorales et la croissance des tumeurs peuvent entraîner une altération de l’état général des animaux. Certaines complications, telles que des suppurations, des nécroses ou une légère anémie, peuvent survenir. Une perte de poids pouvant atteindre 20 % du poids maximal est également possible. Signes cliniques rares : abdomen gonflé ou apparition de micrométastases.
Devenir
Nous voulons prélever les tumeurs induites afin de vérifier la bonne intégration du traitement expérimental, et son efficacité, qui implique une infusion de cellules immunitaires dans la tumeur. Pour cela, nous devons euthanasier les animaux.
Remplacement
Des tests sur des modèles cellulaires 2D et 3D in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos LVs (vecteurs dérivés d’un virus inactif) , aussi bien en termes de ciblage que de thérapie génique. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo est indispensable, car elle permet à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, recréant ainsi des conditions proches de la pathologie humaine. À ce jour, il reste impossible de reconstituer in vitro une tumeur avec toutes ses interactions complexes avec le microenvironnement.
Réduction
Le nombre d'animaux par lot sera réduit au maximum afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les experimentations se feront graduellement afin de pouvoir calculer le nombre d'animaux nécessaires en s'aidant d'outils statistiques. Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront effectués pour générer des échantillons qui pourront être utilisés dans des études ultérieures afin d'optimiser les études et de réduire le nombre d'animaux en évitant la répétition d'expérimentations pour obtenir des échantillons supplémentaires.
Raffinement
Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. . Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des points limites ont été mis en place et seront appliqués
Choix des espèces
Nous choisissons la souris parce qu’elle partage l’essentiel de nos mécanismes biologiques, ce qui permet de recréer des cancers humains et murins pour tester rapidement de nouvelles thérapies. Les animaux seront utilisés adultes à 8 semaines de vie. En effet, les cancers modélisés sont des cancers de l'adulte.
Évaluation de nouvelles molécules à visée thérapeutique ou thérapies dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris dont l'état dépasse les points limites définis par la grille de score sont tuées avant la fin du protocole. 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les tissus nerveux. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection d'un peptide de myéline et d'un adjuvant, ce qui provoque une hypotonie de la queue puis une faiblesse voire une paralysie des membres postérieurs, un repli social et une réduction du toilettage, sur environ 30 jours dans les modèles aigus et jusqu'à 45 jours dans les modèles rémittents. Le suivi passe par des tests de sensibilité à la douleur d'environ cinq minutes, répétés selon la progression de la maladie, et le porteur justifie le recours à la souris par des raisons scientifiques et par un "intérêt pratique", faibles coûts, cycles de reproduction courts et facilité de manipulation.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central en détruisant la gaine de myéline entourant les axones. Cette démyélinisation entraîne l’apparition de lésions dispersées dans le cerveau et la moelle épinière, conduisant à une dégénérescence des neurones. Les symptômes varient selon les patients et les zones du système nerveux atteintes, et comprennent des troubles moteurs, sensitifs, visuels, urinaires ou encore des douleurs neurogènes pouvant être associées à des symptômes dépressifs. La maladie évolue souvent par poussées inflammatoires suivies de périodes de rémission plus ou moins marquées. Bien que des traitements existent, leur efficacité est parfois limitée et ils sont associés à des effets secondaires importants, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Ce projet vise à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant un modèle murin bien établi d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, qui reproduit plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques humaine. Les animaux reçoivent une injection d’un peptide dérivé de la myéline associé à un adjuvant, ce qui déclenche une réponse inflammatoire du système nerveux central entraînant des symptômes moteurs et sensoriels. L’évolution de la maladie est ensuite suivie par des tests comportementaux pour mesurer la sensibilité à la douleur et les troubles moteurs. Des analyses complémentaires, notamment histologiques et biochimiques, permettent de mieux comprendre les mécanismes en jeu. Le projet inclut également une approche d’imagerie in vivo, non invasive, permettant d’observer l’inflammation et la progression de la pathologie chez l’animal vivant. Cette stratégie globale permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et d’identifier des biomarqueurs associés à la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules ou associations de molécules dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur la réduction des déficits moteurs et des douleurs neuropathiques associés à cette pathologie. En combinant des approches comportementales, biochimiques et d’imagerie non invasive sur l’animal vivant, il permettra de caractériser l’impact de ces traitements sur l’inflammation et la neurodégénérescence. Il s’inscrit dans une perspective de recherche translationnelle avec pour finalité l’identification de traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients atteints de sclérose en plaques. À court terme, c’est-à-dire pendant la durée du projet, les bénéfices attendus concernent l’identification de molécules ou formulations prometteuses ainsi que l’évaluation comparative de leur efficacité dans des protocoles d’administration variés. Cela permettra de déterminer les doses optimales et les fenêtres thérapeutiques pertinentes, qu’il s’agisse d’une administration préventive ou curative. Le projet favorisera également la détection de synergies d’action entre composés, qui pourraient aboutir à des stratégies thérapeutiques combinées plus performantes. Par ailleurs, l’utilisation d’outils d’imagerie innovants sur l’animal entier contribuera à mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs de la maladie, exploitables pour le suivi non invasif de la réponse au traitement. À long terme, les connaissances générées dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements destinés à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de sclérose en plaques. Ces avancées pourraient également être transposables à d’autres maladies neuroinflammatoires chroniques, pour lesquelles les approches thérapeutiques actuelles restent limitées. En affinant notre compréhension des mécanismes d’action des molécules testées et en enrichissant les modèles de suivi préclinique, ce travail vise à renforcer le lien entre la recherche fondamentale et les applications cliniques, dans le respect des principes éthiques de l’expérimentation animale et au service d’un enjeu de santé publique majeur.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales, nécessaires à l’induction et au suivi du modèle EAE. Les interventions réalisées lors de l’induction du modèle EAE sont les suivantes : 2 injections sous-cutanées (1 minute au total) sous anesthésie gazeuse et 2 injections intrapéritonéales (15 secondes par injection). Les interventions réalisées lors du suivi du modèle EAE sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 minute), test de la sensibilité à la douleur (animal vigile, sur une durée d’environ 5 minutes et répétée à différents temps selon la progression de la maladie), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration et à une fréquence établie en fonction du protocole et du schéma thérapeutique choisi), examens d’imagerie non invasive par fluorescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; injection du traceur par voie intraveineuse d’une durée de 30 secondes maximum ; durée de la session d’imagerie par fluorescence : 60 secondes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum à partir du 18ème jour, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.
Impact sur les animaux
Le modèle EAE utilisé dans ce projet entraîne inévitablement des effets indésirables, dont la nature, l’intensité et la durée varient selon la phase de la maladie induite et la sensibilité individuelle des animaux. Les premiers signes cliniques apparaissent généralement entre 8 et 14 jours après immunisation. Ils se traduisent initialement par une hypotonie de la queue, évoluant vers une faiblesse progressive voire paralysie des membres postérieurs, et dans les formes les plus sévères, des atteintes des membres antérieurs, voire un état prostré. Ces troubles neurologiques sont associés à une réduction significative de la mobilité, pouvant générer une inactivité prolongée. Des pertes de poids significatives sont régulièrement observées durant la phase aiguë de la maladie, liées à une réduction de la prise alimentaire et à l’état général affaibli de l’animal. Des troubles du comportement peuvent également apparaître, comme un repli social, une réduction de la toilette ou un stress accru lié à la manipulation ou à la douleur chronique. La durée des effets varie selon les procédures : dans les modèles aigus, les effets s’étendent sur environ 30 jours, tandis que dans les modèles rémittents, les effets peuvent s’étendre sur 45 jours avec une phase de rémission suivie d’une rechute. Tout au long de l’expérimentation, une surveillance clinique quotidienne est assurée selon une grille de score précise. En cas de dépassement des points limites prédéfinis, les animaux sont euthanasiés immédiatement. L’administration de molécules thérapeutiques peuvent engendrer des effets indésirables qui sont difficiles à anticiper. En effet, la plupart des molécules testées sont des molécules en cours de développement dont nous n’avons pas la connaissance. Les injections par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent entraîner une douleur légère et transitoire. Une surveillance clinique étroite permettra d’en adapter les modalités en fonction des réponses observées. La manipulation, l’administration de la sonde fluorescente et l’anesthésie pour l’imagerie non invasive par fluorescence peuvent provoquer du stress chez l’animal.
Devenir
A l’issue du protocole, les animaux seront mis à mort pour prélever le sang total et/ou pour prélever les tissus nerveux d’intérêt.
Remplacement
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité pharmacologique de nouvelles molécules ou formulations thérapeutiques dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur les troubles moteurs et les douleurs neuropathiques associés à la pathologie. L’utilisation de modèles animaux de sclérose en plaques est incontournable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. De plus, si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement et l’efficacité de nouveaux développements ou molécules thérapeutiques, l’utilisation d’animaux vivants est, à ce jour, indispensable. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro, ex vivo ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. Des approches alternatives sont toutefois intégrées dans la stratégie globale du projet : - Criblages préalables ex vivo (tests cellulaires sur lignées ou cultures primaires) sont réalisés pour évaluer la cytotoxicité, l’activité anti-inflammatoire ou neuroprotectrice des composés avant toute expérimentation in vivo. Ces tests permettent de réduire le nombre de candidats à tester chez l’animal. - Les données issues de modèles informatiques (in silico) et de banques de données moléculaires sont utilisées pour orienter la sélection des molécules candidates, en amont des procédures expérimentales. Cependant, ces approches ne permettent ni de reproduire l’interaction complexe entre système nerveux et système immunitaire, ni d’évaluer de façon fiable les manifestations cliniques fonctionnelles de la maladie (déficit moteur, sensibilité douloureuse, réponse à un traitement sur l’organisme entier). Ainsi, bien que la réflexion sur le remplacement des modèles animaux soit constante, les connaissances disponibles et les limitations techniques actuelles rendent l’utilisation de modèles murins vivants incontournable pour ce projet. Ces modèles sont, en outre, reconnus pour leur validité scientifique dans le domaine de la sclérose en plaques, et sont largement utilisés dans les recherches précliniques ayant conduit aux traitements aujourd’hui disponibles pour les patients.
Réduction
La stratégie d’expérimentation proposée est basée sur des expériences en mesures répétées (études longitudinales). Cette approche permet à chaque animal d’être son propre contrôle et d’être évalué à plusieurs reprises au cours du temps. Une approche statistique est envisagée par une comparaison des groupes d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 par groupe de traitement (groupe d’animaux recevant une molécule à tester ou un traitement thérapeutique) et permet dans ces conditions d’obtenir une significativité suffisante pour conclure. L’utilisation d’imagerie sur animal vivant en suivi longitudinal permettra de préciser la nature des modifications physiologiques qui se mettent en place lors du développement de la pathologie et de limiter de manière significative le nombre d’animaux utilisés sur la durée. Les analyses post mortem des tissus prélevés en fin d’étude permettront d’optimiser les résultats obtenus in vivo et d’éviter les répétitions d’expériences. Cette stratégie globale vise à garantir une recherche de haute qualité scientifique tout en respectant les principes éthiques d’utilisation raisonnée des animaux.
Raffinement
Le principe de raffinement est intégré à chaque étape du protocole expérimental et repose sur une combinaison de mesures préventives, d’adaptations techniques et de suivi quotidien individualisé. Avant le début de la procédure les animaux bénéficient de séances d’habituation à l’environnement expérimental, au matériel et aux expérimentateurs. Ces périodes d’adaptation permettent de réduire le stress induit par les manipulations et de faciliter les évaluations comportementales. L’environnement d’hébergement est enrichi avec des matériaux adaptés (igloo, coton, accès facilité à la nourriture) afin de favoriser le confort, le repos et les comportements naturels, en particulier pour les animaux présentant un score clinique élevé. Les animaux sont suivis quotidiennement selon une grille d’évaluation fondée sur des critères comportementaux et physiologiques précis incluant l’état d’hydratation, la posture, la mobilité, la réactivité, l’aspect du pelage et la perte de poids. Cette grille permet une détection précoce des signes de souffrance et une prise de décision rapide quant à la poursuite de la procédure ou à l’application des points limites conduisant à l’euthanasie. La nourriture est adaptée à la condition de l’animal et fournie sous forme de gel pour faciliter la prise alimentaire même en cas de mobilité réduite. L’induction de la maladie et les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. La manipulation est effectuée par un personnel expérimenté et formé spécifiquement aux procédures utilisées dans le cadre du modèle EAE. L’évaluation de la douleur neuropathique est restreinte aux animaux présentant des scores cliniques faibles afin de ne pas surcharger ceux qui présentent déjà un état avancé de la maladie. L’utilisation de techniques non invasives d’imagerie permet de limiter le nombre d’interventions et d’examens post mortem en suivant les mêmes individus tout au long de l’étude. Cette stratégie contribue à réduire l’inconfort global tout en préservant la qualité des résultats. Un comité de pilotage interne est chargé du suivi scientifique et éthique du projet. Il permettra d’intégrer de nouvelles méthodes de raffinement en fonction des avancées techniques ou des recommandations éthiques récentes. Une veille méthodologique active sera assurée afin d’adapter les procédures en continu et d’améliorer le bien-être animal sans compromettre les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la sclérose en plaques et les pathologies associées (déficit moteurs, douleurs neurogènes...), l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces, (majoritairement chez la souris) pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes (8-12 semaines) seront utilisés dans ce projet. Il s’agit d’animaux adultes qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études. L’induction de la pathologie chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible, fournissant ainsi des résultats satisfaisants. Ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques.
Impact d’un prétraitement par nanoparticules lipidiques sur la biodistribution d’agents thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux injections d'agents thérapeutiques, dont une dans la veine de la queue sur animal éveillé, puis 30 minutes d'imagerie sous anesthésie et un prélèvement terminal du foie : 960 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie d'entre elles est dépourvue de thymus, donc sans système immunitaire fonctionnel, pour recevoir des tumeurs humaines. Il s'agit d'occuper temporairement les voies hépatiques d'élimination avec une nanoparticule lipidique, afin qu'un médicament injecté circule plus longtemps dans le sang. Le porteur présente le suivi par imagerie sur animal vivant comme un moyen de réduire les effectifs, "sans avoir à les sacrifier à chaque étape", alors que les 960 souris sont toutes tuées pour prélèvement du foie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) et de réduire leur toxicité en modifiant la biodistribution des agents thérapeutiques grâce à leur association à une nanoparticule lipidique. La circulation dans le sang des médicaments est essentielle à l’efficacité thérapeutique. Pour atteindre sa concentration maximale dans le tissu cible, comme la tumeur en oncologie, les médicaments doivent surmonter un obstacle biologique de taille : la clairance hépatique. Le rôle du foie est de filtrer le sang afin d’éliminer les composés toxiques, dont un grand nombre de médicaments. Ainsi, de nombreux candidats thérapeutiques prometteurs administrés par voie IV présentent une circulation dans le sang faible, qui se traduit par une accumulation faible ou nulle dans le tissu cible et par une toxicité hors cible potentiellement élevée. Par conséquent, si beaucoup de médicaments présentent un potentiel à l’échelle du laboratoire, la plupart n’ont pas d’avenir clinique. Afin de surmonter cet obstacle, une nanoparticule lipidique a été développée pour augmenter de façon temporaire la biodisponibilité des thérapies administrées par voie IV et pour minimiser le risque d’effets en dehors de la cible. La nanoparticule lipidique est destinée à occuper temporairement les voies hépatiques responsables de la clairance thérapeutique, afin de permettre à un médicament donné de plus fortement s’accumuler dans les tissus cibles pour augmenter son efficacité, tout en minimisant le risque de toxicité hépatique chez le patient. Cette étude a pour but de mieux comprendre comment certains médicaments se répartissent dans le foie après injection. Elle fait suite à une première recherche ayant montré que plusieurs de ces médicaments ont tendance à s’accumuler dans cet organe. Pour cela, ces médicaments vont être testés, seuls ou associés à la nanoparticule lipidique, sur des souris en bonne santé. L’objectif est d’observer comment les médicaments se répartissent entre les différents types de cellules du foie, et de voir si l’ajout de la nanoparticule lipidique permet de modifier cette répartition.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment une nanoparticule lipidique peut influencer la manière dont certains médicaments se répartissent dans le corps, en particulier dans le foie. À court terme, ces recherches permettront de faire progresser les connaissances sur les nanomédicaments et sur la façon dont ils sont éliminés par l’organisme. Elles aideront aussi à améliorer la composition des médicaments pour qu’ils soient plus efficaces et mieux tolérés. À plus long terme, la nanoparticule testée dans ce projet pourrait lever l’un des principaux obstacles qui empêchent certains traitements prometteurs d’être utilisés chez l’humain. En réduisant l’élimination rapide des médicaments par le foie, cette technologie pourrait renforcer l’efficacité de traitements déjà disponibles, et ainsi offrir de meilleurs résultats aux patients.
Procédures
Deux injections d’agents thérapeutiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue ou une injection intraveineuse et une injection par voie intrapéritonéale seront effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Prises d’images pendant 30 minutes sous anesthésie. Le prélèvement du foie est terminal et réalisé sous anesthésie générale terminale (5 min).
Impact sur les animaux
L’injection des composés thérapeutiques peuvent induire un stress bref qui diminue lorsque les souris retrouvent leur cage et leurs congénères. L’imagerie à fluorescence nécessite une anesthésie gazeuse courte qui peut entrainer dans de très rares cas un ralentissement du rythme cardiaque et de la respiration de quelques minutes (2-3 min) n’entrainant pas la mort de l’animal. Le prélèvement du foie est réalisé sous anesthésie générale et analgésie (5 min).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement du foie.
Remplacement
L’utilisation de souris dans ce projet se justifie par le besoin d’étudier la manière dont les médicaments se répartissent et sont éliminés dans un organisme vivant complet. Les tests réalisés en laboratoire sur des cellules (in vitro) sont utiles au début, mais ils ne peuvent pas reproduire la complexité du corps entier, comme la circulation du sang, le fonctionnement du foie ou les réactions du système immunitaire. Certaines étapes essentielles, comme l’élimination des médicaments par le foie ou leur distribution dans les différents types de cellules, ne peuvent être correctement observées que chez un animal vivant. Le modèle de la souris, bien connu des chercheurs et largement utilisé dans le monde, permet donc d’obtenir des résultats fiables et utiles pour mieux comprendre comment les traitements agissent dans le corps.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans cette étude a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum le nombre d’animaux. Ce calcul permet de s’assurer que les différences observées entre les groupes sont réellement dues au traitement testé, et non au hasard. Il s’appuie sur des méthodes statistiques reconnues, utilisant des formules ou des logiciels spécialisés. Par ailleurs, les nanoparticules utilisées dans l’étude sont rendues visibles grâce à des marqueurs fluorescents. Cela permet de suivre leur évolution dans l’organisme des animaux vivants à l’aide d’images, sans avoir à les sacrifier à chaque étape. Cette méthode permet donc de réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour garantir le bien-être des animaux, une période d’adaptation d’au moins 5 jours sera respectée avant le début des expérimentations. Pendant cette phase et tout au long de l’étude, les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans un environnement confortable et contrôlé (température, humidité, lumière, qualité de l’air), avec un système d’alarme pour signaler tout problème. Les animaux seront hebergés par petits groupes, selon les normes en vigueur, et les mêmes groupes seront maintenus autant que possible pour éviter tout stress lié aux changements. Des objets adaptés (comme des abris en carton ou des matériaux pour creuser ou s’abriter) seront ajoutés dans les cages pour enrichir leur environnement et favoriser leur comportement naturel. Les animaux seront surveillés chaque jour par du personnel formé, et un vétérinaire sera présent régulièrement pour s’assurer de leur bon état de santé. Des soins d’urgence seront également disponibles à tout moment, y compris les week-ends et jours fériés. Si un animal montre des signes de souffrance importants, il sera pris en charge rapidement et, si nécessaire, mis à mort pour lui éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées comme modèle préclinique pour étudier comment les traitements se répartissent dans l’organisme. Leur physiologie est bien connue, et il existe de nombreuses souches génétiquement définies, ce qui permet de suivre précisément l’effet des injections dans différents tissus. Deux types de souris seront utilisés dans ce projet : • Des souris qui possèdent un système immunitaire normal. Elles sont un modèle de référence pour étudier la pharmacologie. Elles permettront d’observer comment le système immunitaire peut influencer le traitement. • Des souris dépourvues de thymus et donc sans système immunitaire fonctionnel. Elles sont souvent utilisées pour tester l’efficacité de traitements contre des tumeurs humaines implantées chez la souris. Certaines des thérapies étudiées dans ce projet étant destinées à l’oncologie, ces souris permettront de vérifier l’efficacité et la distribution du traitement dans ce contexte particulier. En combinant ces deux modèles, il sera possible de mieux comprendre comment les traitements se comportent dans différents types d’organismes et s’assurer que les résultats sont fiables et transposables à des études d’efficacité. Les souris utilisées dans ce projet seront des adultes jeunes (entre 7 et 10 semaines), afin que leurs organes et leur système immunitaire soient pleinement développés. Cela permet d’étudier plus précisément comment les traitements se répartissent dans le foie.
Evaluation in vivo de nouveaux vecteurs viraux permettant une étude ciblée de différentes populations neuronales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 48 d'entre elles et modéré pour 96. Un tiers reçoit une injection dans la veine de la queue, un tiers une injection dans le sinus situé derrière l'œil, et le dernier tiers une chirurgie intracérébrale de 35 à 45 minutes sous anesthésie, avec les risques de mort pendant l'anesthésie ou au réveil et d'infection postopératoire que le porteur rappelle. L'enjeu déclaré reste préparatoire, vérifier in vivo que des vecteurs viraux ciblent bien une sous-population de neurones, avant de servir dans d'autres projets sur les protéines étudiées au laboratoire depuis plus de vingt ans. Sur le remplacement, le porteur indique seulement que la validation in vitro a déjà eu lieu et qu'il est maintenant "nécessaire" de tester ces outils in vivo, les cerveaux étant prélevés après mise à mort pour analyse histologique.
Objectifs
Pour mieux comprendre comment fonctionne le cerveau il est nécessaire de pouvoir étudier les principales cellules qui le composent et en particulier les neurones. Il existe différents types de neurones dont les rôles sont bien définis. On distingue ainsi par exemple les neurones excitateurs des neurones inhibiteurs. Dans chacune de ces classes, il existe des sous classes de neurones caractérisées par des morphologies et des fonctionnements différents. Pour mieux comprendre le rôle de chaque type de neurones dans l'organisation cérébrale générale, il est important de pouvoir modifier spécifiquement le fonctionnement de tous les neurones d'une seule sous-classe. Pour cela nous souhaitons développer de nouveaux outils moléculaires qui ciblent spécifiquement tous les neurones d'une seule sous classe. Dans ce projet, nous souhaitons confirmer nos résultats produits à partir de cellules en culture et valider in vivo les nouveaux vecteurs que nous avons conçus. Une fois validés, ces nouveaux outils pourront être utilisés dans le cadre d'autres projets pour étudier le rôle des protéines d'intérêt du laboratoire dans la mise en place, la structure et le fonctionnement de chaque sous population neuronale. Ce projet nous permettra également de tester différentes voies d'administration de nos outils.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de valider in vivo des outils moléculaires destinés à mieux cibler les différentes sous-populations neuronales présentes dans le cerveau. Dans ce projet, maintenant que la validation in vitro a été réalisée, nous allons quantifier l'efficacité et la spécificité de chacun de nos outils in vivo. Une fois ces outils validés in vivo ils pourront servir dans un prochain projet à étudier les protéines d'intérêt que nous caractérisons dans notre laboratoire depuis maintenant plus de 20 ans en ciblant des sous populations neuronales. Ce projet s'inscrit donc dans le processus de connaissance et de découverte suivi par le laboratoire nous permettant de mieux décrire les processus normaux de neurodéveloppement pour mieux en comprendre les dysfonctionnements.
Procédures
Injections intraveineuses sous anesthésie via la veine de la queue : 48 animaux. L'intervention durera moins de 10 minutes. Injections intraveineuses sous anesthésie par voie retro-orbitaire : 48 animaux. L'intervention durera moins de 10 minutes. Injections intracérébrales sous anesthésie : 48 animaux. Temps estimé de l’acte chirurgical de 35 à 45 min/souris. Chaque animal ne sera soumis qu'à une seule intervention.
Impact sur les animaux
Les injections dans la veine caudale peuvent entrainer l'apparition d'hématome et d'inflammation si le produit est injecté en dehors de la veine (injections péri veineuses). Les injections intraveineuses dans le sinus rétro orbitaire peuvent entrainer exceptionnellement des lésions oculaires. Les injections intracérébrales sont des chirurgies. Les risques liés à ces injections sont les mêmes que ceux pouvant survenir au cours de toute chirurgie (décès lors de l'anesthésie ou au moment du réveil, infection post-opératoire,...)
Devenir
Les résultats attendus de ce projet nécessitent de réaliser des analyses histologiques ou immunohistologiques sur des coupes de cerveaux. Les animaux seront donc mis à mort à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Comme précisé préalablement les validations de ces outils ont déjà été réalisées in vitro. Il est maintenant nécessaire que nous puissions tester ces outils in vivo et que nous puissions vérifier que l'expression de nos protéines fluorescentes est suffisante et spécifique dans les sous-populations de neurones que nous souhaitons étudier.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est réduit car nous ne pensons pas avoir une grande variabilité entre les animaux. Il est basé sur ce que nous avons pu lire dans la littérature. Une certaine variabilité peut survenir lors de la réalisation du geste technique. Le personnel de notre laboratoire possède une grande expérience des injections intracérébrales chez la souris et des injections intraveineuses.
Raffinement
Tous les gestes techniques seront réalisés sous anesthésie générale. Un soin particulier sera apporté dans les soins post-opératoires chez les animaux avec une chirurgie stéréotaxique. Une couverture analgésique péri et post-opératoire est prévue pour les animaux avec une chirurgie
Choix des espèces
La souris reste le meilleur modèle pour ce projet. Si nos vecteurs viraux répondent à nos critères, d'autres vecteurs, basés sur la même technologie et permettant d'inhiber ou d'activer certains gènes d'intérêt, seront construits avant d'être injectés chez des souris. Pour ce projet préliminaire nous prévoyons des injections sur des animaux adultes âgés au minimum de 10 semaines et au maximum de 8 mois. Nous souhaitons utiliser des animaux adultes pour lesquels la phase active de neurodeveloppement est terminée. Ce prérequis validé, l'âge exact des animaux a peu d'importance pour ce projet.
Evaluation des effets de candidats médicaments dans un modèle murin d’encéphalite auto-immune expérimentale.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 014 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 840 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir deux administrations du candidat médicament par jour pendant 25 jours et jusqu'à trois ponctions de liquide céphalo-rachidien espacées de sept jours. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injections sous-cutanées et intraveineuses, ce qui déclenche une paralysie progressive partant de la queue vers les membres postérieurs, avec une perte de poids atteignant 30 % dans les cas les plus sévères. S'y ajoutent des prélèvements sanguins hebdomadaires ou quotidiens et quatre tests comportementaux répétés jusqu'à six fois, dont la durée va d'une minute à quatre heures, sans que leur nature soit précisée. Les bénéfices annoncés portent sur une meilleure compréhension de la sclérose en plaques "à moyen terme", quand la paralysie et les prélèvements incompatibles avec la survie sont, eux, programmés.
Objectifs
La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux centrale (SNC) et qui touche environ 1,8 million de personnes dans le monde selon l’organisation mondiale de la santé. Cette maladie, qui touche souvent les jeunes entre 25 et 35 ans, est connue comme la deuxième cause d’handicap acquis chez les jeunes adultes, après les traumatismes. La SEP se caractérise par la dégradation de la gaine de myéline, qui entoure et isole les fibres nerveuses dans le système nerveux central et qui permet la transmission des signaux nerveux entre les neurones, provoquant des inflammations au niveau des zones endommagées du SNC (plaques ou lésions) et menant ainsi à des perturbations cognitives, émotionnelles, motrices, sensitives ou visuelles. Jusqu’à nos jours aucun traitement ne parvient à guérir de la sclérose en plaque. Toutes les approches thérapeutiques existantes visent à limiter l’intensité et la fréquence des poussées inflammatoires et à soulager les symptômes. Le but de ce projet est de développer, chez la souris, un modèle d’Encéphalite Auto-immune Expérimentale (EAE) devant mimer la forme récurrente-rémittente de la SEP, qui est la forme la plus fréquente chez l'Homme caractérisée par des épisodes intermittents d’apparition de symptômes (poussées), suivis par des périodes plus ou moins longues d’absence de crises cliniques (rémissions), pour ensuite tester de nouvelles approches thérapeutiques qui peuvent être prometteuses dans le traitement de la SEP.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont, à moyen terme, une meilleure compréhension des mécanismes d’action impliqués dans la SEP et le développement de nouvelles molécules et approches thérapeutiques pour traiter cette maladie (= démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée (EAE) et évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phase clinique).
Procédures
Pour l’induction de la SEP, les animaux endormis recevront une ou deux injections en sous-cutané (moins d'une minute) et deux injections abdominales, en intraveineux, après l’induction (jour 0 et jour 2, moins d'une minute). Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (1-2 minutes environ) sur 25 jours pmaximum avec deux administrations maximum par jour. Les prélèvements sanguins répétés seront réalisés sur animaux vigile (environ une minute), à raison d’un prélèvement hebdomadaire ou quotidien en fonction du volume prélevé. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien (liquide dans lequel baigne le cerveau) après endormissement de l'animal (20 minutes) maximum 3 fois au cours de l'expérimentation avec 7 jours d'intervalle minimum. Des tests comportements seront réalisés au cours de l’expérimentation (un passage /test/ stade de développement de la maladie) qui peuvent durer entre 1 minute et 4h. Sur chaque groupe d'animaux, 4 tests maximum seront réalisés et répétés au maximum 6 fois.
Impact sur les animaux
L’induction d’une EAE consiste à déclencher une réaction immunitaire au niveau du système nerveux central avec apparition d’une paralysie progressive mais transitoire allant de la queue vers les membres postérieurs puis dans de rares cas vers les membres antérieurs. Cette procédure engendre, un affaiblissement de l’animal avec une perte de poids transitoire dès le début de l’apparition des symptômes (J9-J10) pouvant atteindre dans les cas les plus sévères jusqu’à 30%. D'autres nuisances sont possibles, en effet, lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie ou l'administration d'un candidat médicament, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. De plus, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, prélever du sang, du liquide céphalo rachidien, administrer les composés à tester et de réaliser les tests de comportement peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.
Devenir
Mise à mort des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe et des fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou mise à mort des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le développement de la maladie ou par le(s) produit(s) testé (s).
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la sclérose en plaque (modèle d’Encéphalite Auto-immune Expérimentale), Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 15 / par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera assuré par un ensemble de mesures visant à optimiser le bien-être animal et à minimiser toute forme de contrainte. Tout d’abord, des procédures rigoureuses seront mises au point et le personnel impliqué recevra une formation spécifique afin de garantir la fiabilité des pratiques et la qualité des soins. L’état de santé des animaux fera l’objet d’un suivi quotidien, permettant une détection précoce d’éventuels signes cliniques et une prise en charge rapide en se basant sur une grille de score définie. L’accès à l’eau et à la nourriture sera facilité (croquettes mouillées, tétine longues, etc) et placé dans les cages. Les interventions expérimentales reposeront sur des techniques aussi peu invasives que possible, et des points limites clairement définis permettront de décider rapidement du recours à une euthanasie lorsque cela s’avérera nécessaire. Par ailleurs, les méthodes d’analyse seront optimisées afin de limiter le volume sanguin prélevé, grâce à une amélioration de leur sensibilité. Le recours à l'anésthésie permettra de diminuer la douleur ressentie lors de certains actes et de réaliser de façon plus précise et plus rapide certains prélèvements biologiques. Enfin, une familiarisation progressive des animaux aux procédures expérimentales sera réalisée, dans le but de réduire leur appréhension et d’améliorer leur confort tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est l’une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur le potentiel métastatique de cellules tumorales prostatiques humaines sur un modèle de souris immuno-déprimées NOD Scid. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Les souris utilisées sont des NOD Scid, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, condition posée par le porteur pour que des cellules tumorales prostatiques humaines s'implantent et se disséminent. 75 souris sont ainsi exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour collecte des tissus. Chacune reçoit une greffe de cellules PC3-GFP par ouverture de la cavité péritonéale sur cinq à six millimètres, puis un traitement de 120 secondes par torche à plasma froid par la même voie d'entrée. Le porteur écrit que les lots déjà traités n'ont présenté "aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables", tout en reconnaissant que l'implantation de cellules tumorales peut être associée à des douleurs et altérer l'état sanitaire de l'animal.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.
Bénéfices attendus
Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.
Procédures
Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.
Remplacement
Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL
Raffinement
En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.
Choix des espèces
Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.