Rongeurs

Les souris utilisées sont immunodéficientes, choisies pour leur incapacité à rejeter des cellules humaines. 1 120 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules souches du sang humaines modifiées par thérapie génique, après un conditionnement qui leur fait perdre du poids, et un prélèvement sanguin qui peut leur léser un œil. La mise à mort sert à récupérer leur moelle osseuse et à mesurer si les cellules injectées s'y sont installées, l'enjeu déclaré étant d'évaluer la toxicité à long terme de ces modifications avant leur passage chez des patients.

Objectifs

Parmi les méthodes thérapeutiques modernes, on retrouve la greffe de cellules souches sanguines (CSH). Le but est de permettre l’installation de ces cellules dans la moelle osseuse des patients au sein de « niches », où elles pourront produire de nouvelles cellules fonctionnelles et saines nécessaires à la personne traitée. Ces cellules peuvent être modifiées par thérapie génique dans le but d’améliorer et de corriger leur activité. Il est cependant nécessaire d’évaluer l’impact et l’efficacité de ces modifications, d’autant qu’elles peuvent induire une toxicité non souhaitée pour les CSH. Cette étude vise à déterminer si les modifications sont toxiques à long terme.

Bénéfices attendus

Cette étude portant sur les greffons sanguins permettra de caractériser les modifications apportées aux CSH modifiées par thérapie génique ainsi que leurs capacités de greffe (survie, auto-renouvellement, différenciation). Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les greffons de thérapie génique avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques modifiés par thérapie génique, et (iii) d'évaluer le risque à long terme de la toxicité de la thérapie génique.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet seront anesthésiées avant d’être soumises à une greffe de cellules. Il s'agit d’injections réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Les injections se feront sur animaux vigiles (2 à 24h d’intervalle). Le suivi de la prise de greffe se fait par un unique prélèvement sanguin sous anesthésie (30 secondes).

Impact sur les animaux

Le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (

Devenir

A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.

Remplacement

L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des microenvironnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH, analyse de la génotoxicité) seront réalisées chaque fois que possible en vue de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Réduction

Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions d’optimisation testées, le nombre d’animaux injectés a été fixé à 7, qui est le nombre minimum d’animaux pour avoir une significativité suffisante lors de la réalisation des tests statistiques. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation. Les souris seront hébergées en animalerie adaptée aux souris immunodéprimés, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en conformité avec la réglementation en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu adapté pour entretenir le bien-être des animaux. L’ensemble des animaux recevront un traitement analgésique et/ou anesthésique prévu pour parer à toute souffrance ou stress, réfléchit pour chaque acte pratiqué. Les points limites ont été définis et appliqués pour le suivi de ces animaux. Notamment, la souffrance et la gêne des animaux seront évaluées à travers une grille de points limites adaptée permettant d’anticiper au plus tôt la souffrance des animaux et de mettre en place les procédures conservatoires adéquates.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons des souris immunodéficientes. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression. Cette souche de souris représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

Un régime riche en graisses pendant huit ou seize semaines, appliqué pour installer une inflammation puis une fibrose du foie : 60 souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer une protéine dans cet organe vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ne décrit comme atteintes que le stress de deux pesées par semaine et une perte de poids d'environ 5 % la première semaine, alors que la maladie qu'il provoque évolue chez l'humain vers la cirrhose et le cancer du foie. Il revendique un "besoin urgent" d'optimiser le traitement de cette maladie et écrit qu'il serait "intéressant d'affirmer" que sa protéine y joue un rôle. Toutes sont tuées après un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour qu'on collecte leurs tissus.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la Maladie Hépatique Associée au Syndrome Métabolique (MASH). La MASH est caractérisée par une inflammation et une dégradation des cellules hépatiques dues à une accumulation de graisse dans le foie. Au stade précoce, la MASH est souvent asymptomatique et généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, évoluant vers un cancer du foie dans les cas les plus graves. Le Resmetirom, 1er médicament approuvé par la FDA (mars 2024) pour la MASH, permet seulement de retarder l’échéance en réduisant la fibrose chez 24% des patients. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser le traitement de la MASH. Au sein de notre laboratoire nous étudions une protéine localisée sur la membrane cellulaire, qui joue un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Il serait maintenant intéressant d’affirmer que cette dernière joue un rôle important dans le développement de la MASH. Pour cela, un nouveau modèle de souris a été développé avec une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’affirmer l’implication de cette dernière sur le développement de la MASH. Afin d’induire un modèle pertinent de MASH avec fibrose hépatique in vivo, un régime spécifique riche en graisses sera appliqué.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre en profondeur le rôle de notre cible thérapeutique dans le développement de la MASH. Par exemple l’étude de son rôle fonctionnelle dans le foie et le métabolisme (réponse au stress oxydatif, inflammation, impact sur la signalisation immunitaire et métabolique) dans le cas de la MASH. Ce modèle avec une suppression ciblées de notre cible permettra de comprendre comment notre protéine d’intérêt participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouveau biomarqueur ainsi que des signatures moléculaires spécifique.

Procédures

Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation (pendant 8 semaine dans un groupe et 16 semaines dans un autre). Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Un modèle à base d’un régime alimentaire spécial, permettra de récapituler le développement de la maladie chez la souris permettant le développement d’une maladie hépatique liée au syndrome métabolique (MASH). Un stress de la souris peut être observé dû à la pesé des animaux 2 fois par semaine. Une légère perte de poids la première semaine du régime est observée (environ -5%).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie. Les animaux sont observés quotidiennement. A l’arrivé des souris dans l’animalerie, une période d’acclimatations de 7 jours sera appliquée avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une MASH. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).

Deux heures d'anesthésie d'affilée, dont un quart d'heure avec une aiguille-capteur enfoncée au centre de la tumeur : 110 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales du sein ou du pancréas leur sont injectées dans le flanc, la tumeur pousse deux à trois semaines, puis vient l'examen complet, une heure quinze d'IRM, trente minutes d'échographie et la mesure directe de la pression interne. Toutes sont tuées ensuite pour que la tumeur soit découpée et comparée aux images. Le porteur retient la souris parce que les appareils d'imagerie ont été conçus pour elle et qu'il est plus aisé de trouver des points de comparaison dans la littérature.

Objectifs

Les tumeurs solides sont principalement composées de cellules et d'autres éléments comme les fibres de collagène, qui affectent leurs caractéristiques physiques. Certaines caractéristiques sont connues pour rendre la tumeur plus sévère et plus résistante aux traitements médicaux. Parmi ces propriétés, seule la dureté de la tumeur peut actuellement être mesurée de manière précise et non invasive en imagerie. Il est alors intéressant de développer des techniques pouvant mesurer les autres caractéristiques tumorales, pour évaluer la sévérité tumorale de manière plus précise. La technique envisagée dans ce projet est l’élastographie par imagerie par résonance magnétique (IRM) sous compression. L’élastographie est la mesure des propriétés mécaniques du tissu comme l’élasticité, la dureté, etc… On utilise un dispositif vibrant pour générer des ondes à travers le tissu d’intérêt. Pour acquérir l’image de ces ondes qui se déplacent, on peut utiliser l’IRM (dont les images sont créées grâce à des champs magnétiques) ou l’échographie (dont les images sont créées grâce à des ultrasons). On peut également mesurer des propriétés plus complexes en réalisant un examen d’élastographie sous compression, c’est-à-dire en appuyant de manière continue sur le tissu pendant l’examen d’imagerie. Des études utilisant l’élastographie échographique sous compression ont été menées sur le foie en dehors du corps et ont montré que ces propriétés étaient liées à la manière dont sont organisées les fibres à l’intérieur du cancer, ce qui affecte sa sévérité. Le but de ce projet est de transposer cette méthode développée avec les ultrasons vers l’IRM. Ce type d’imagerie informe sur un volume entier, ce que ne fait pas l’échographie. Il y aura ainsi une information complémentaire et une meilleure précision dans les mesures. Cette nouvelle technique sera appliquée sur des tumeurs implantées chez la souris, avec deux modèles différents : des tumeurs du sein et des tumeurs du pancréas. Les valeurs obtenues seront ensuite comparées à des données provenant de la microscopie pour valider l’utilisation de cette méthode pour déterminer l’organisation des tissus et la sévérité de la tumeur. La validation de la méthode sera d’autant plus assurée que ces deux modèles possèdent des compositions et des propriétés physiques différentes. Cela permettra d’offrir une méthode sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d’un cancer et adapter ensuite le traitement donné au patient. MODIF: Prolongation.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’approfondir les connaissances fondamentales relatives aux propriétés mécaniques du cancer. En particulier, l’objectif est d’obtenir des marqueurs non-invasifs d’imagerie pouvant indiquer la sévérité tumorale qui est liée à la fois à la composition de la tumeur et à sa pression. Cette étude pourra notamment permettre de définir de nouvelles méthodes d’imagerie afin d’aider le clinicien dans le diagnostic du cancer et, également, adapter le traitement aux caractéristiques de la tumeur.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront anesthésiés pour une injection unique des cellules tumorales en sous-cutané dans le flanc. Cet acte aura une durée totale de 10 min par animal. Les animaux seront observés de manière bihebdomadaire pendant la croissance tumorale. Une fois que la tumeur aura atteint une taille suffisante (environ 2 à 3 semaines après l’injection des cellules), un examen complet sera effectué. Il comprendra un examen d’imagerie IRM, un examen d’imagerie échographie et une mesure de la pression tumorale, tous réalisés au sein d’une même anesthésie gazeuse. Pour la mesure de la pression tumorale, un capteur de pression ressemblant à une aiguille sera introduit au centre de la tumeur pour obtenir des mesures de pression qui seront comparées avec les mesures d’imagerie. Cette comparaison permettra de valider l’intérêt de l’imagerie IRM et échographie comme méthode de mesure de pression non-invasive. Au total, cette intervention aura une durée de 2h pour chaque animal, avec environ 1h15 d’acquisition d’images IRM, 30 min d’acquisition échographique et 15 min de mesures de pression.

Impact sur les animaux

Des cellules tumorales seront injectées dans le flanc droit de l’animal, ce qui peut occasionner un stress ou une légère douleur au point d’injection. La croissance tumorale peut engendrer une gêne, voire une perte de poids pour l’animal. Cette perte de poids sera en revanche limitée, car surveillée deux fois par semaine. De plus, la taille de la tumeur ne devrait pas excéder les 1000 mm3, ce qui limite de potentiels effets indésirables sur la mobilité de l’animal. Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et passer à l’intérieur d’un tunnel d’IRM avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l’animal. Cependant, les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l’examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que l’hypothermie (refroidissement de l'animal) et la diminution du rythme respiratoire.

Devenir

A la suite de l’examen complet (imageries et mesure de pression), les animaux seront euthanasiés et la lésion tumorale sera disséquée. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène) qui composent la tumeur. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

A notre connaissance, il n’y a pas d’alternatives en dehors d'un système vivant (construction de cellules ou morceaux de tumeurs) ou de modélisation numérique qui ont été validées et qui peuvent être utilisées comme solution de remplacement. Afin de valider l’imagerie comme solution non-invasive de mesure de la pression tumorale, les mesures doivent être effectuées sur des modèles animaux afin de reproduire l’environnement hétérogène et les propriétés tumorales qui pourront être retrouvés en clinique chez les patients atteints de lésions tumorales.

Réduction

Les dispositifs d’imagerie utilisés dans ce projet ont déjà été validés en amont, ce qui évite d’avoir une phase de test et de validation sur petit animal. Le nombre d’animaux par groupe a été défini selon des données obtenues précédemment et les données de la littérature.

Raffinement

En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu deux fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence, de son comportement et de la taille de la tumeur. En cas d’atteinte des points-limites, l’animal sera euthanasié. En cas de score intermédiaire, une injection d’antidouleur sera réalisée et le suivi clinique sera réalisé quotidiennement. Tous les examens seront effectués sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress provoqués par les examens. La durée des examens sera réduite au maximum (temps total prévu de 2 heures au maximum) et tous les examens seront réalisés au cours de la même anesthésie pour éviter plusieurs anesthésies successives. Les animaux seront maintenus dans des cages de cinq maximum afin qu’ils aient suffisamment d’espace et qu’ils maintiennent un comportement social. Du matériau favorisant la nidification leur sera fourni. Les animaux seront hébergés en animalerie avec un statut adapté et manipulés sous hotte.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour cette étude, car elles permettent de greffer en sous-cutané des modèles de tumeurs humaines. Les dispositifs d’imagerie ont été développés pour les souris. De plus, la plupart des études d’imagerie sur tumeurs greffées en sous-cutané ont été réalisées sur des souris et il est donc plus aisé de trouver des informations dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte (au moins 8 semaines) afin de bénéficier d’animaux plus grands et plus à même de supporter les lésions tumorales étudiées. De plus, les cancers du sein et du pancréas sont généralement observés chez des patients adultes.

672 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir dix injections, subir quatre heures de piqûres de filaments sur la face ou la patte les jours d'injection, boire pendant une semaine une eau qui irrite son intestin, et passer six séries de trente minutes de bruit au cours d'une même nuit. Les procédures sont classées en niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour le prélèvement d'organes. Le projet cherche un mécanisme commun entre migraine, fibromyalgie et douleurs viscérales, du côté des cellules satellites gliales qui entourent les neurones. Le porteur situe le bénéfice possible au-delà de ce projet, tester un jour de nouvelles molécules, quand les stimulations douloureuses, elles, sont datées et comptées.

Objectifs

Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs du viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones dans les ganglions, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, de fibromyalgie, douleur viscérale et migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraines chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.

Procédures

Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui est difficilement réalisable chez le rat. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, incapable de rejeter les cellules cancéreuses humaines qu'on lui greffe et maintenue à l'abri des germes pour ne pas s'infecter. 40 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une injection de cellules de cancer du foie, puis sa tumeur est mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine sous anesthésie, jusqu'à une possible ulcération de la peau au point de greffe. Toutes sont tuées après un dernier prélèvement de sang, pour que leurs tissus servent à mesurer l'effet d'une protéine membranaire sur la croissance de la tumeur.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire afin d’améliorer les thérapies actuelles. Nous avons identifié une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, et particulièrement le carcinome hépatocellulaire. Une expression élevée de cette protéine est notamment associée à un mauvais pronostic chez les patients, suggérant qu’elle pourrait être une cible thérapeutique pertinente dans le carcinome hépatocellulaire. Ce projet a donc pour objectif de comprendre les effets de la variation d’expression de cette protéine sur la croissance tumorale, en utilisant des lignées cancéreuses humaines ou murines dans lesquels l’expression de la protéine est supprimée (perte de fonction) ou surexprimée (gain de fonction). Ces cellules sont ensuite greffées sous la peau des souris, permettant le développement de tumeurs où il nous sera possible de suivre leur croissance. L’objectif à terme est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire et d’ouvrir de nouvelles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire. Ce projet pourrait ouvrir vers de nouvelles pistes thérapeutiques pour prendre en charge le cancer du foie, ainsi que les autres cancers exprimant fortement la protéine que nous avons identifiée.

Procédures

Pour étudier l’effet du gain ou de la perte de fonction du récepteur, les animaux seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse sur animal anesthésié, et cette mesure prend moins d’une minute à être réalisée. A la fin de la procédure, les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules, entraînant une douleur modérée de courte durée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Plusieurs stratégies de remplacement ont été mises en place afin de réduire au minimum le recours à l'expérimentation animale. Nous utilisons également en parallèle des modèles in vitro afin de confirmer notre hypothèse avant de passer sur le modèle animal. Néanmoins, dans les essais de pharmacocinétiques pour toutes substances thérapeutiques, les tests sur animaux entiers ne sont pas substituables par des tests simplifiés in vitro. Cela en raison du besoin de mesurer les variations de concentration de la substance thérapeutique dans le plasma d’un organisme ayant des organes et des systèmes pleinement fonctionnels. Également, les modèles cellulaires ne permettent pas de reconstituer l’effet de l’angiogenèse (formation de nouveaux vaisseaux qui peuvent influencer la réponse thérapeutique en entrainant l’activation de certaines voies de signalisation) ou toute la complexité biologique (interaction des éléments du microenvironnement tumoral avec le système biologique de la souris ou modélisation de l’hétérogénéité cellulaire et génétique d’une tumeur) d’un être vivant sur l’efficacité d’un traitement. La validation de ces dernières nécessite le recours à l'expérimentation animale en raison de sa grande complexité. De plus, les modèles cellulaires ne peuvent récapituler que partiellement la pathogenèse complexe du CHC.

Réduction

Pour garantir la fiabilité de nos résultats tout en limitant le nombre d’animaux, nous avons déterminé, grâce à des calculs statistiques, un effectif minimum par groupe qui nous permet de détecter une différence significative entre chaque condition. Nous avons prévu quelques animaux supplémentaires pour compenser d’éventuelles variations et n’avons pas inclus de groupes superflus. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques reconnues pour valider nos comparaisons.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, et des tunnels kraft pour leur permettre de se cacher. Ils auront accès sans restriction à la nourriture et à l'eau pendant toute la durée de l'expérience. Les animaux immunodéficients seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées en zone exempt d'organismes pathogènes spécifiques, ce qui permet que les animaux immunodéprimés ne développent pas d'infection. Les animaux immunocompétents seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées. Les animaux seront manipulés à l’aide de tubes de manipulation afin d’éviter toute préhension stressante par la queue de l’animal. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Une méthode anesthésique sera appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères proches de l’homme. Les phénomènes biologiques mis en jeu chez ces 2 espèces sont très comparables lors d’un traitement anti-cancéreux. Ces modèles ont contribué dans le passé à établir une meilleure compréhension des voies moléculaires impliquées dans la carcinogenèse ainsi que le potentiel curatif de combinaisons thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum, afin de mimer la pathologie qui touche principalement les adultes. De plus, il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après douze à quatorze heures de jeûne, un produit irritant leur est administré directement dans le côlon pour provoquer une inflammation de trois jours, avec une perte de poids attendue pouvant approcher 20 %, puis ils passent une IRM sous anesthésie avant d'être tués par injection létale. L'objet est de savoir si l'IRM permet de mesurer l'épaississement de la paroi du côlon, en vue d'études ultérieures sur l'effet des polluants. Le porteur qualifie les six animaux par groupe d'"indispensables" pour compenser les différences individuelles, sans autre calcul, cette étude préliminaire devant précisément servir à dimensionner les suivantes.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. Pour comprendre l’effet de certains polluants sur l’inflammation de l’intestin, notre projet recherche de nouveaux outils permettant de suivre l’évolution et l’étendue de l’inflammation en utilisant des outils capables de mesurer précisément l’ampleur de cette inflammation, notamment en observant l’épaississement de la paroi du côlon. D'autres segments du tube digestif pourront également être explorés. Nous n'avons jusqu'à présent pas une notion suffisante de la capacité de résolution et de la précision de l'outil IRM pour réaliser une mesure précise de l'épaisseur de la paroi intestinale. Ce projet a ainsi pour ambition de lever cette incertitude.

Bénéfices attendus

Afin de répondre à un certain nombre de questionnements sur l'implication de ces polluants environnementaux dans le développement et la modulation de l'inflammation, nous cherchons des outils matériels pertinents qui permettraient de mesurer l'étendue de l'inflammation notamment de l'infiltration inflammatoire par la mesure de l'épaisseur des couches de la paroi colique. Nous savons qu'au cours du développement de la phase inflammatoire, l'infiltrat de cellules inflammatoires va épaissir progressivement la paroi du tissu d'intérêt. Grâce à l’imagerie par résonance magnétique, il est possible d’obtenir des informations très utiles pour mesurer ces changements sans avoir besoin de sacrifier l’animal à chaque étape. Cela permet de suivre l’évolution de l’inflammation chez le même animal à plusieurs moments, selon le traitement reçu. Cette approche aide à mieux comprendre le phénomène tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences futures.

Procédures

Dans ce projet, une inflammation contrôlée du colon est provoquée chez les rats en administrant un produit irritant directement dans le côlon, après une période de jeûne de 12 à 14 heures. Cette inflammation, modérée et de courte durée (3 jours), est conçue pour limiter au maximum les effets négatifs sur les animaux. Une perte de poids modérée, inférieure à 20%, peut survenir au cours des deux premiers jours. À la fin des trois jours, les animaux sont placés sous anesthésie gazeuse pour passer par l’imagerie par résonance magnétique, puis endormis avant mise à mort afin de permettre des prélèvements et analyses de tissus.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé dans cette étude provoque une inflammation très modérée du côlon chez les rats. De notre expérience du modèle, on attend une perte de poids modérée au cours des deux premiers jours, sans autres changements détectables de comportement. L’injection du produit qui déclenche l’inflammation dure environ deux minutes et se fait sous anesthésie générale. Pour éviter que les animaux ne prennent froid pendant l’anesthésie, ils sont installés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil. Ensuite, chaque rat retourne dans sa cage, où il est régulièrement surveillé pendant 6 heures après la procédure pour s’assurer de son bon état de santé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par administration létale d'anesthésique après la session de passage à l'IRM, afin de réaliser les prélèvements tissulaires et analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation de rats dans ce projet se justifie parce qu’il n’existe pas d’autres modèles capables de mimer fidèlement les phénomènes étudiés, comme l’inflammation de l’intestin ou le comportement des animaux. Les modèles utilisant uniquement des cellules, des simulations informatiques ou des petits organismes comme les vers ou les insectes ne sont pas adaptés pour reproduire les interactions complexes entre les différents organes comme l’intestin, le microbiote, le cerveau ou le foie. De plus, certains effets de l’inflammation, par exemple l’augmentation de la température corporelle, ne peuvent être étudiés que chez un organisme vivant qui peut s’adapter, notamment par des changements dans le sommeil ou l’alimentation. Les jeunes rats offrent aussi un modèle pertinent, reproductible et validé dans la communauté scientifique.

Réduction

Cette étude est une étude préliminaire. Nous prévoyons d’utiliser 12 rats, répartis en deux groupes de 6. Ce faible nombre nous permet d’obtenir les premiers résultats qui serviront de base s’ils sont positifs pour calculer au plus juste le nombre de rats nécessaires pour une étude plus importante. C’est pourquoi dans cet esprit de réduction nous choisissons uniquement de jeunes mâles adultes pour limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Avoir 6 animaux par groupe est indispensable pour compenser les différences individuelles et obtenir des résultats fiables sur le plan statistique.

Raffinement

Afin de limiter l’inconfort des animaux, toutes les manipulations pouvant causer un stress ou une douleur, comme l’injection dans le côlon ou l’imagerie par résonance magnétique, seront réalisées sous anesthésie générale. Les rats seront hébergés dans des cages spacieuses au sein d’un environnement adapté (endroit calme et climatisé) où ils pourront bouger librement, se redresser et s’allonger, afin de préserver leur comportement habituel. Plusieurs éléments favorisant leur bien-être seront ajoutés : les rats seront hébergés en petits groupes stables pour maintenir une vie sociale, des objets qu’ils peuvent manipuler seront mis à leur disposition (comme des tubes en carton ou des frisettes), et un fond musical varié sera diffusé. Enfin, les cages transparentes permettront une bonne visibilité et un environnement visuel stimulant.

Choix des espèces

Pour cette étude, nous émettons l’hypothèse que l’exposition aux polluants pendant les phases sensibles du développement, comme l’enfance et l’adolescence, pourrait favoriser la survenue de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. C’est pourquoi nous utilisons des rats jeunes adultes car ils réagissent physiologiquement et comportementalement de manière proche des humains face à différents polluants environnementaux. Ce modèle est reconnu scientifiquement pour l’étude de l’inflammation intestinale et les installations nécessaires à leur hébergement sont bien adaptées depuis plusieurs années.