Rongeurs

2 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant enchaîner sept prises de sang sur animal éveillé, des injections dans l'orbite de l'œil et soixante-douze heures seule dans une cage métabolique de 500 cm2. Elles reçoivent des régimes hypercaloriques ou privés de méthionine et de choline, et sont mises à jeun huit à seize heures avant les tests de tolérance. Le porteur qualifie les perturbations du métabolisme hépatique ainsi provoquées de "non dommageable pour la souris", alors que le projet vise justement à installer une maladie hépatique métabolique. Une partie des souris est tuée trente minutes après une injection, le sang étant chassé de leurs vaisseaux par une perfusion dans le cœur, pour mesurer la perméabilité de ces vaisseaux.

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

5 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de trois vecteurs qui déclenche un cancer des voies biliaires, puis jusqu'à seize échographies sous anesthésie et trente-deux passages en résonance magnétique sur animal éveillé, auxquels s'ajoutent des vaccins viraux et jusqu'à six traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie. Le porteur annonce une cachexie, une fièvre passagère et un risque de péritonite lié aux injections répétées, et précise qu'aucun médicament de confort ne sera donné pendant les expériences pour ne pas brouiller les résultats immunitaires. Il conclut à l'impossibilité de mener cette étude autrement qu'in vivo, faute d'autre modèle permettant d'évaluer une vaccination et ses mécanismes immunitaires.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins viraux comme nouvelle approche à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer agressif et encore mal pris en charge qui affecte les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire afin, non seulement, de prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi de limiter sa progression et d’améliorer la réponse aux traitements existants.

Bénéfices attendus

Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente l’un des pronostics les plus sombres, avec moins d’un patient sur cinq encore en vie après cinq ans, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de 3 vecteurs pour l’induction tumorale (1 minute par souris vigile, 1 fois). Toutes les souris seront soumises à des examens par: échographie sous anesthésie (10 minutes par animal, 1 fois par semaine, 16 fois maximum) et résonance magnétique nucléaire sur animal vigile (2 minutes par animal, 2 fois par semaine, 32 fois maximum). Toutes les souris seront soumises à des injections pour la vaccination virale (pour un maximum de 2 au total, une minute par souris par jour, la moitié sous anesthésie). Une partie des souris sera soumise à des traitements de chimiothérapie et/ou immunothérapie (pour un maximum de 6 au total, moins d’une minute par souris vigile).

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. L’administration de virus pourrait induire une fièvre transitoire. Les traitements de chimiothérapie et immunothérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins viraux dans un modèle de cholangiocarcinome orthotopique. Ces vaccins viraux ont été développés, in vitro, par clonage de 13 antigènes identifiés (ex vivo) par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination virale et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.é.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 5296 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 16 souris (8 femelles et 8 mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Le nombre d’animaux pourra être réduit à la baisse si les hypothèses sont validées au cours des premières expériences. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, ...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - Notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.

Soumis à une ligature d'artère coronaire de vingt-cinq minutes qui leur provoque une insuffisance cardiaque, 404 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois mois plus tard, une fois la défaillance installée, ils passent quelques jours exposés à une chaleur de type canicule, avec cinq échocardiographies et quatre épreuves d'effort, et 40 % d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour l'implantation d'un capteur de télémétrie. Le calcul des effectifs intègre la mortalité attendue dans ce modèle. Le porteur décrit pourtant des "examens non douloureux" et un "environnement sécurisé et surveillé", et présente le projet comme un moyen de mieux protéger les personnes fragiles pendant les fortes chaleurs.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment les fortes chaleurs, comme celles rencontrées lors des canicules, peuvent aggraver certaines maladies cardiaques. Les animaux seront exposés à une température élevée pendant quelques jours, dans un environnement sécurisé et surveillé. Leur état de santé sera suivi à l’aide d’examens non douloureux, comme l’échographie, ou de petits capteurs mesurant la température ou la pression artérielle. Les résultats aideront à mieux protéger les personnes fragiles lors d’épisodes de chaleur extrême.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment la chaleur intense, comme lors d'une canicule, peut aggraver une maladie cardiaque déjà présente. Grâce à ce modèle animal, il sera possible d’observer les effets de la chaleur sur le cœur et la circulation, et d’identifier des signes d’alerte utiles pour prévenir les complications. L’étude évaluera aussi des outils permettant de surveiller les animaux de manière plus précise et moins stressante. Ces travaux pourraient, à terme, aider à mieux protéger les patients cardiaques pendant les périodes de fortes chaleurs, en améliorant les recommandations médicales.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront différentes interventions, principalement dans un but d’observation ou de mesure. Certaines procédures sont non invasives, comme les échocardiographies (5 fois, 15min max, espacées d'au moins 48h) ou l’évaluation à l’effort (4 fois, 30min max, espacées d'au moins 72h). D’autres sont plus invasives, comme la pose de puces sous-cutanées pour suivre la température ou la pression artérielle (1 seule injection, 2 min max), ou une chirurgie d’implantation de capteur de télémétrie pour effectuer les mêmes mesures (1 seule intervention de 35min concernant 40% des animaux maximum). La mise en place du modèle d’insuffisance cardiaque est obtenue par chirurgie de ligature coronaire sous anesthésie générale avec gestion de la douleur péri et post-opératoire (1 seule intervention de 25min concernant tous les animaux). Tous les gestes sont réalisés sous anesthésie et selon les normes éthiques en vigueur, avec un suivi rigoureux du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront exposés à certaines contraintes liées à leur état de santé, à la chaleur ambiante ou aux examens nécessaires. Les principales nuisances prévues sont : une tolérance réduite au stress, un risque modéré lié à la chaleur (perte d’appétit, fatigue, aggravation cardiaque), une à deux chirurgies espacées d'au moins 3 mois (avec antidouleurs adaptés), et des examens répétés mais non douloureux (échographies, suivi de la température).

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront mis à mort conformément aux normes éthiques en vigueur afin de permettre les prélèvements nécessaires aux analyses post-mortem (histologie, biologie moléculaire, etc.). Ces analyses sont indispensables pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour comprendre les mécanismes tissulaires associés à la décompensation cardiaque.

Remplacement

Le projet porte sur les effets d’un stress thermique sur l’évolution de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection réduite. Les mécanismes étudiés impliquent une réponse cardiovasculaire intégrée, thermorégulatrice et inflammatoire, impossible à reproduire in vitro ou in silico avec pertinence. Les méthodes alternatives ont été considérées pour l’optimisation des phases exploratoires (modélisation informatique, revue bibliographique, données historiques), mais les objectifs scientifiques nécessitent ici l’utilisation d’un organisme entier. Aucun modèle alternatif ex vivo ou cellulaire ne permet à ce jour de simuler la complexité des interactions physiopathologiques impliquées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été optimisé grâce à plusieurs stratégies complémentaires : tout d'abord, l'utilisation d'outils statistiques pour déterminer les effectifs minimum permettant l'obtention de données robustes, la mutualisation de certains groupes entre procédures pour éviter les redondances ; la constitution de sous-groupes expérimentaux permettant de répartir les manipulations et de limiter le stress tout en assurant la robustesse statistique des résultats ; l’exploitation de données historiques internes, notamment pour les groupes témoins lorsque cela est justifié ; l’utilisation de dispositifs de suivi longitudinal (thermopuces ou télémétrie) autorisant des mesures répétées sur un même individu ; et enfin, une estimation rigoureuse du nombre nécessaire d’animaux par calcul de puissance, prenant en compte la mortalité attendue dans ce modèle.

Raffinement

Dans ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place pour garantir le bien-être des animaux et limiter toute souffrance. Des critères cliniques stricts sont utilisés pour évaluer l'état de santé des animaux, permettant d'interrompre toute procédure en cas de signes de souffrance et d'opter pour une euthanasie anticipée si nécessaire. Les interventions stressantes sont réparties de manière à éviter les cumuls sur un même animal, et l'hébergement des animaux en condition de "canicule" est limité dans le temps, avec un suivi clinique renforcé et des aménagements pour améliorer leur confort. De plus, l'utilisation de thermopuces pour la surveillance thermique réduit le besoin d'interventions chirurgicales, et les éventuelles chirurgies, telles que l'implantation de dispositifs de télémétrie, sont réalisées sous anesthésie appropriée, avec des soins analgésiques avant et après l'intervention. Enfin, un suivi clinique rigoureux est effectué pour assurer la santé des animaux tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le choix des rongeurs, et spécifiquement des rats Wistar, est motivé par plusieurs facteurs. Les rats Wistar sont largement utilisés dans des études similaires au sein du laboratoire, ce qui permet de comparer et d’enrichir les résultats avec les données historiques accumulées. Leur taille, qui facilite les manipulations pratiques, ainsi que leur place intéressante dans la phylogénie, sont également des éléments importants. Au début du projet, les animaux seront âgés de 8 semaines. Ce modèle récupère bien d’une chirurgie réalisée au cours de leur 10ème semaine de vie, présentent une insuffisance cardiaque 3 mois après cette chirurgie, stade idéal pour étudier l’évolution de cette pathologie.