Rongeurs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Venues d'élevages commerciaux ou de lignées jugées sanitairement douteuses, 1 075 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Vingt mâles sont vasectomisés, les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones puis sont tuées pour qu'on récupère leurs ovocytes, et les receveuses subissent une chirurgie de transfert d'embryons de dix minutes. Elles ne seront pas réimplantées une seconde fois, le porteur indiquant que la zone devient trop vascularisée et saignerait abondamment. Une partie des femelles finira replacée comme "femelles de compagnie" des mâles vasectomisés, vingt par an selon le texte, deux cents selon le décompte joint au résumé, les autres étant tuées.
Objectifs
Le but du projet est de produire des souris génétiquement modifiées en bonne santé, dans un environnement totalement sain, c’est-à-dire sans microbes ou parasites. Pour cela, on utilise une méthode qui consiste à réimplanter des embryons dans des conditions stériles. Ces embryons peuvent venir de souris vivantes, de sperme ou d’embryons congelés. Il est essentiel que les souris utilisées en recherche soient exemptes de toute pathologie pour garantir leur bien-être et assurer la fiabilité des résultats scientifiques. Lorsqu’une lignée provient d’un établissement dont les normes sanitaires sont moins strictes, une procédure de « décontamination » est nécessaire. Celle-ci vise à éliminer tout agent pathogène ou microbe potentiel, afin de permettre l’intégration des animaux dans la plateforme d’hébergement dans des conditions sanitaires optimales. Cette décontamination se fait en récupérant les embryons de souris donneuses, en les lavant soigneusement, puis en les transférant dans des femelles receveuses saines. Les souris donneuses sont traitées par injection d’hormones sexuelles afin de produire un grand nombre d’œufs (ovocytes), qui seront ensuite fécondés. Les femelles dans lesquelles seront réimplantés les embryons (femelles receveuses) seront préalablement accouplées avec des mâles rendus stériles (par vasectomie) pour que les embryons réimplantés soient dans un environnement hormonal propice à leur développement au cours de la gestation. Les embryons peuvent être obtenus naturellement par accouplement, ou créés en laboratoire par fécondation in vitro à partir de sperme frais ou congelé. Aujourd’hui, le transport de souris se fait de plus en plus souvent sous forme de matériel génétique (embryons ou sperme congelé), plutôt que de déplacer des animaux vivants entre animaleries parfois très éloignées. Grâce à ce matériel congeler, il est ensuite possible de « faire revivre » une lignée en recréant des souris vivantes, tout en limitant les risques sanitaires liés au transport d’animaux. Les souris produites sont utilisées par les chercheurs afin de mieux comprendre le rôle de certains gènes, à étudier des mutations génétiques, et à tester de nouvelles thérapies, quand les modèles alternatifs ne peuvent pas être utilisés. En moyenne, la plateforme réalise environ quinze projets de transfert d’embryons par an, soit en décontaminant des animaux vivants, soit en réimplantant des embryons obtenus à partir de matériel congelé.
Bénéfices attendus
Le transfert aseptique d’embryons permet de garantir que toutes les souris élevées de la plateforme d’hébergement grandissent dans un environnement totalement sain, sans microbes ou germes nuisibles. Ce niveau sanitaire de propreté est défini par l’absence de bactéries, virus et parasites définis par une liste officielle de référence. Grâce à cette méthode, les souris vivent sans risque d’infections tout au long de leur vie. Cela permet non seulement de garantir leur bien-être, mais aussi d’assurer une bonne reproduction et des résultats fiables pour les recherches scientifiques. Enfin, comme ces souris sont élevées dans des conditions sanitaires très strictes, elles peuvent être envoyées sans problème dans d’autres centres de recherche pour y poursuivre des expérimentations.
Procédures
Le transfert aseptique d’embryons nécessite 3 types d’intervention sur 3 lots différents de souris. Pour un projet de décontamination d’une lignée : - Un lot de 20 souris mâles sera rendu stérile par vasectomie. Ils seront utilisés pour tous les projets de transfert aseptique d’embryon réalisés au cours d’un année. Ces souris subiront une chirurgie visant à couper le canal délivrant les spermatozoïdes dans le sperme. Afin de limiter la douleur, les animaux seront anesthésiés par injection d’un mélange d’anesthésiant et d’analgésiques. Chaque animal recevra une injection d’antidouleur sous la peau (5 sec), suivi 30 min après d’une injection antalgique/anesthésique sous la peau (5 sec). Pendant l’anesthésie, ils recevront une injection d’anesthésique local sous cutanée sur la zone d’incision. L’opération chirurgicale de transfert d’embryons dure 10 min. Une deuxième injection d’antidouleur sous la peau (5 sec) sera réalisée 6-8h après l’opération. Les injections ne nécessitent pas de contention en main pour immobiliser les souris ce qui limite le stress. - Un lot de 8 souris (maximum) donneuses d’embryons par projet recevra deux injections (5 sec/injection) sous la peau avec deux hormones sexuelles séparées de 48h. - Un lot de 5 femelles receveuses par projet sera réimplanté sous anesthésie après réalisation d’une petite incision permettant l’accès aux ovaires. Ces animaux subiront le même type d’intervention que les mâles qui subissent une vasectomie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables observés dans ces procédures sont principalement liés aux injections et aux petites chirurgies réalisées sur les souris. La piqûre d’aiguille pour les injections réalisées sous la peau (comme celles d’hormones, d’anesthésiques ou d’antidouleurs) entraine une légère douleur et de courte durée et un léger stress physique de très courte durée (quelques secondes). Les interventions chirurgicales des mâles vasectomisés et des femelles recevant les embryons sont peu invasives et peuvent un léger stress physique. Elles entrainent une douleur qui peut se prolonger quelques heures après l’opération. Elles peuvent provoquer une gêne passagère.
Devenir
Chaque mâle rendu stérile sera utilisé pour plusieurs projets de transfert d’embryons pendant 12 à 18 mois ou jusqu’à l’observation d’absence de bouchons vaginaux lors de l’accouplement avec des femelles. Il pourra être ensuite utilisé comme animal de compagnie pour une souris femelle qui a dû être isolée. Les femelles qui ont été traitées pour produire des ovules en grande quantité seront mises à mort pour récupérer les ovocytes fécondés ou à féconder in vitro. Les femelles réimplantées avec des embryons ne pourront pas être réimplantées une seconde fois à cause d’une vascularisation important de la zone de réimplantation provoquant des saignements abondants. Néanmoins, 20 femelles par an, soit au total 100 souris, pourront être replacées comme femelles de compagnie des mâles vasectomisés.
Remplacement
Le but du projet de transfert aseptique d’embryons est de « décontaminer » des lignées de souris porteuses de microbes ou de les faire revivre à partir d’embryons ou de sperme congelés. Pour ce type de travail, il n’est pas possible d’utiliser une autre espèce que les souris. Il n’existe pas de méthodes alternatives non-animales. Cette technique est la plus efficace pour obtenir un bon nombre de souris saines, sans microbes. Traiter les souris contaminées avec des médicaments ne permet pas d’éliminer tous les microbes et peut mettre en danger les autres lignées de souris élevées dans des conditions très strictes. Une contamination pourrait nuire gravement à l’élevage des souris et compromettre les recherches en cours. Avant d’accepter une nouvelle lignée par transfert d’embryons, la plateforme s’assure que l’équipe de recherche a bien obtenu l’autorisation de son comité d’éthique, notamment sur les questions liées au remplacement des animaux ou à leur utilisation. Enfin, ce transfert d’embryons ne sera réalisé que si la lignée concernée n’est pas déjà disponible ailleurs avec un statut sanitaire optimal, similaire à celui requis pour l’élevage de ces souris.
Réduction
Grâce à plus de 15 ans d’expérience, la plateforme de conservation et d’élevage des souris génétiquement modifiées a optimisé l’utilisation des souris pour les projets de décontamination par transfert d’embryons ou de reviviscence à partir de matériel génétique congelé. En général, 5 réimplantations suffisent pour obtenir entre 5 et 15 souriceaux. Ce bon résultat est possible grâce à une collaboration efficace entre l’équipe d’élevage et l’équipe spécialisée en embryologie (qui s’occupe de récupérer, congeler ou féconder les embryons). Aujourd’hui, 90 % des projets réussissent dès la première tentative, ce qui montre la fiabilité des méthodes mises en place Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’équipe reste attentive aux dernières avancées scientifiques dans le domaine. Par exemple, l’injection des hormones classiquement utilisées pour stimuler l’ovulation a été remplacée par un mélange plus efficace. Cela a permis de réduire le nombre de femelles donneuses de 10 à 8 souris par projet. Cette amélioration est déjà appliquée pour les projets de relance de lignées congelées. Les mâles vasectomisés sont aussi utilisés au maximum tout au long de leur vie, en vérifiant leur efficacité à chaque fois. Toutes les idées ou innovations qui peuvent permettre de réduire encore le nombre de souris utilisées seront étudiées avec la structure chargée du bien-être animal ou le comité d’éthique, afin de les appliquer pendant la durée du projet.
Raffinement
Les souris reçues d’élevage commerciaux ont au moins une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les procédures. Nous avons amélioré nos pratiques pour rendre les injections moins stressantes. Les injections d’hormones, d’analgésiques et d’anesthésiques sont maintenant systématiquement réalisées sous la peau, alors qu’elles étaient effectuées dans l’abdomen. Cette méthode est tout aussi efficace et provoque moins de douleur et ne nécessite plus d’immobiliser l’animal. Lors des injections, le volume minimal nécessaire est injecté. Pour les chirurgies, tout est mis en place pour réduire au maximum la douleur et le stress. Les souris sont endormies avec une anesthésie générale, et elles reçoivent des antidouleurs avant et après l’opération. Elles sont installées sur des tapis chauffants avant, pendant et après la chirurgie pour rester à bonne température. Tout le matériel est stérile, les surfaces sont bien nettoyées, et on protège leurs yeux avec un gel pour éviter qu’ils ne sèchent. Au réveil des souris, des croquettes humides sont mises à disposition pour qu’elles puissent manger et boire facilement, même si elles sont encore un peu fatiguées. Nous avons aussi défini des critères très précis pour repérer si un animal ne récupère pas bien après une opération. Dans ce cas, une décision d’euthanasie peut être prise pour éviter toute souffrance inutile. Les jours suivant une chirurgie, la surveillance des animaux est accrue pour s’assurer qu’ils vont bien et qu’ils ne souffrent pas. Un score de douleur est établi lors des surveillances quotidiennes après la chirurgie et un protocole de gestion de la douleur peut être mis en place si nécessaire. Afin d’éviter un stress lié à l’isolement, les mâles vasectomisés seront maintenus en permanence avec une femelle dites de « compagnie » après leur premier accouplement. Ils ne peuvent pas être hébergés avec leur congénère car ils deviennent souvent agressifs après accouplement.
Choix des espèces
Les équipes de la plateforme développent des souris génétiquement modifiées (ou transgéniques), car cette espèce est particulièrement bien adaptée aux techniques de modification génétique. Ces techniques consistent, par exemple, à injecter un gène dans l’embryon ou à modifier des cellules souches embryonnaires. Une fois le modèle créé, la lignée de souris est conservée vivante pour produire les animaux nécessaires aux futures expériences et la justification de leur utilisation fera l’objet d’autres demandes d’autorisation de projets. Les souris sont utilisées à différents stades de développement : Mâles vasectomisés: ils sont opérés à 4 semaines d’âge, puis utilisés à partir de 7 semaines pour une durée d’au moins un an, voire 18 mois. Femelles pour la production d’ovocytes en grand nombre : pour que la stimulation hormonale soit la plus efficace possible, on utilise des femelles encore immatures (environ 4 semaines), car leurs ovaires n’ont pas encore été influencés par leurs propres hormones. Femelles receveuses : elles doivent être sexuellement matures (entre 7 et 26 semaines, ou entre 20 et 30 grammes). Si elles pèsent plus de 30 g, la graisse autour de leurs ovaires peut compliquer la chirurgie.
Evaluation pré-clinique de thérapies innovantes dans des modèles précliniques de glioblastome chez les rongeurs EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 705
Greffés d'un glioblastome dans le cerveau au cours d'une opération de trente minutes, 3 510 souris et 705 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, tous tués pour les prélèvements. Chaque animal peut subir jusqu'à cinquante-six injections, vingt-huit prélèvements sanguins, cinquante et une séances d'imagerie, huit ouvertures de la barrière hémato-encéphalique, une résection de la tumeur et une séance de radiothérapie, avec un transport entre deux établissements. Le porteur indique que la tumeur provoque des troubles neurologiques et des difficultés de déplacement, et que les animaux immunodéficients attrapent plus facilement des infections. Les bénéfices restent formulés comme une ambition, identifier des traitements qui pourront ensuite être évalués chez l'humain, quand les 4 215 greffes, elles, sont programmées.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de la nécessité d'utiliser des appareils d'imagerie spécifiques disponibles seulement dans le second établissement.
Bénéfices attendus
Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes à 4h, 51x maximum, animal anesthésié). Certaines imageries nécessiteront un transfert d'un établissement à un autre (transfert de 10 minutes, 1 fois, animal vigile). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. Certaines imageries devront être réalisées dans un autre établissement, les animaux pourront ressentir un stress lié au transport entre les deux établissements et aux changements d'environnement. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.
Remplacement
Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients (PDCLs) ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.
Réduction
4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.
Raffinement
Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.
Choix des espèces
Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.
Etude comparative de modèles murins avec des modèles 3D bio-imprimés de cancers féminins pour évaluer l’efficacité d’une chimiothérapie.
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour vérifier que des modèles de tumeurs imprimés en 3D donnent les mêmes résultats que des souris, 224 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe chirurgicale de tumeur du sein ou de l'ovaire, puis jusqu'à cinq injections hebdomadaires d'une chimiothérapie, avec pesées et mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant neuf semaines. Toutes sont tuées au plus tard soixante-dix jours après l'implantation, ou plus tôt si le volume de la tumeur atteint le point limite. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, utiliser moins d'animaux non-humains grâce aux modèles imprimés, ce qui suppose ici d'en greffer et d'en tuer 224 pour l'établir.
Objectifs
En 2020, le cancer du sein est le deuxième cancer le plus fréquent et le cancer de l'ovaire est le troisième cancer gynécologique le plus fréquent. Ces chiffres soulignent la nécessite de mettre au point de nouveaux médicaments plus efficaces. Pour évaluer l'efficacité de ces nouveaux médicaments, des nouveaux modèles ont été développé par les chercheurs à l'aide d'une imprimante 3D : les modèles 3D bio-imprimés. Pour cette preuve de concept nous avons sélectionné une chimiothérapie efficace pour de nombreux cancers, notamment des cancers du sein et de l’ovaire. Nous émettons l'hypothèse que l'efficacité de ce médicament dans les nouveaux modèles sera comparable à l'efficacité de ce dernier chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait d'utiliser moins d'animaux pour l'évaluation de nouveaux médicaments en ayant recours aux modèles 3D bio-imprimés.
Procédures
Pour chaque souris : 1 injection d’un anti-douleur 30 min avant la chirurgie, 1 implantation de la tumeur par chirurgie sous anesthésie, 1 injection par semaine sur animal vigile du composé testé (durée < 30s) (maximum 5 injections), mesures de la tumeur et pesées (durée < 2 minutes) 2x/semaine (maximum sur 9 semaines). Pour certaines souris : un prélèvement sanguin (durée quelques secondes) sous anesthésie avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
- Douleurs post-chirurgicales après implantation de fragments de tumeurs et suture - Douleur de courte durée lors de l’injection (quelques secondes maximum) - Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux et pesées (quelques minutes maximum, 2x/semaine) - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite.
Devenir
Les animaux seront mis à mort au maximum 70 jours post-implantation si aucun point limite n’a été atteint avant.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation de souris afin de récolter les données nécessaires à l’établissement de la preuve de concept sur l’intérêt des modèles 3D bio-imprimés pour l’évaluation des thérapies anti-cancéreuses, afin de réduire l'utilisation des modèles murins. Dans ce projet, les données récoltés à partir des tumeurs de souris seront comparées aux données obtenues à partir de modèles 3D bio-imprimés et de modèles cellulaires 2D.
Réduction
Le nombre d'animaux strictement nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été calculé à l'aide d'un logiciel de statistiques.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux manipulateurs pendant 7 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un anti-douleur sera administré au minimum 30 min avant l’intervention chirurgicale afin de palier à la douleur. Les souris seront anesthésiées avant la chirurgie et avant la mise à mort pour minimiser leur stress. Les animaux seront hébergés en groupe de 6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 70 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai.
Choix des espèces
Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs. Afin d’éviter le rejet de la greffe des cellules tumorales humaines, l’utilisation d’une souche murine fortement immunodéprimée est requise. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Traitement anticancéreux Activé par Rayonnements Ionisants appliqué aux Tumeurs Solides
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau ou directement dans le pancréas au cours d'une opération de quarante-cinq minutes, puis elles passent des séances d'IRM d'une heure et de TEP sous anesthésie avant d'être irradiées. Le porteur décrit une tumeur pancréatique qui peut gêner la prise alimentaire, une tumeur sous-cutanée qui peut se nécroser et entraver la marche, et annonce une preuve de concept transférable en clinique. Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort immédiatement, et les tumeurs sous-cutanées sont mesurées au pied à coulisse deux fois par semaine pour surveiller le volume à partir duquel l'animal sera tué.
Objectifs
L’un des objectifs majeurs de la recherche en cancérologie est l’amélioration de l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette amélioration combine un meilleur ciblage de la tumeur avec une meilleure efficacité tout en limitant les dommages qu’ils peuvent causer au tissu sain (effets secondaires). Un des axes de recherche développé dans cet objectif est la fabrication de composés théranostiques (qui provient de la contraction des mots thérapie et diagnostic). Ces composés moléculaires permettent la cartographie des cellules cancéreuses dans le corps et leur traitement de façon ciblée. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des composés chimiques en cours de validation in vitro (toxicité, activation par les radiations ionisantes). Les composés les plus prometteurs, une fois injectés, sont détectés par des techniques d’imagerie (cartographie de la tumeur) puis activés par radiothérapie de façon à induire les effets thérapeutiques souhaités, tels que la destruction des cellules cancéreuses, l’activation du système immunitaire, etc ... L’action thérapeutique est donc contrôlée de façon à limiter l’impact sur les tissus sains et les effets secondaires associés à une chimiothérapie classique. Dans ce projet nous nous intéresserons particulièrement à des tumeurs solides du pancréas dont les traitements actuels sont peu efficaces. L’objectif de ce projet est donc d’étudier la biodistribution de nos composés théranostiques les plus prometteurs, de déterminer l’efficacité de leur effet thérapeutique sous radiothérapie dans des modèles de cancers du pancréas chez la souris avec pour finalité une utilisation dans le domaine clinique.
Bénéfices attendus
La grande majorité des composés activables par stimulations externes actuellement décrits dans la littérature ne permettent pas une application dans le domaine clinique. Notre projet vise à combler ce manque en caractérisant des composés théranostiques développés pour une application clinique. Ces composés représentent un outil innovant dans la recherche en cancérologie, car ils permettent à la fois une visualisation de la tumeur et une amélioration de l’efficacité de la radiothérapie. Si la preuve de concept se fera sur des tumeurs du pancréas, la non-spécificité de nos molécules pour un type de cancer donné ouvre la perspective d’une application à d’autres types de tumeurs solides. A court terme, ce projet permettra de valider ce concept innovant de traitement qui pourra par la suite être transféré en clinique.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales pancréatiques seront injectées en sous-cutané (durée du geste inf à 10 sec) ou dans le pancréas de souris placés sous anesthésie générale, analgésiques et antalgiques (durée du geste 45 min). La croissance des tumeurs est observée via des imageries de bioluminescence réalisées au maximum toutes les semaines (durée de l’acquisition d’image : 1 min, avec les animaux sous anesthésie générale gazeuse). Dans un second lot d’animaux sains, la toxicité des composés sera étudiée. Plusieurs formulations de composés à différentes concentrations seront injectées aux souris saines par plusieurs voies d’administrations (durée des injections inférieur à 1 min par animal, réalisé une seule fois). Dans un troisième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, des imageries seront réalisés (IRM : réalisé une seule fois, durée d’une heure par animal sous anesthésie générale gazeuse ; TEP : réalisé plusieurs fois si nécessaire avec un délai minimal de 15 jours entre chaque imagerie, durée de 10min par animal sous anesthésie générale gazeuse) afin de visualiser l’anatomie de la tumeur et caractériser son activité métabolique. Ensuite, nous ferons de prélèvements d’organes afin de doser la quantité de composé accumulée dans les organes vitaux. Dans un quatrième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, plusieurs doses d’irradiation seront testées sur différents animaux afin de vérifier la dose la plus appropriée pour nos futurs traitements (durée d’irradiation de 15 min maximum par animal, sous anesthésie générale gazeuse). Dans un cinquième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, les composés seront injectés (la formulation, la concentration et la voie d’administration seront choisies en fonction des résultats obtenus sur le 2ème lot d’animaux, la durée des injections reste inférieur à 1 min par animal) puis un traitement par radiothérapie sera réalisé (la dose d’irradiation sera choisie en fonction des résultats obtenus sur le 3ème lot d’animaux, avec une durée d’irradiation de 15 min maximum par animal). Nous étudierons ainsi l’efficacité de nos composés sur les tumeurs pancréatiques.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales comprenant des implantations tumorales peuvent occasionner des douleurs. Le développement tumoral dans le pancréas peut engendrer des difficultés dans la prise alimentaire ou encore une perte de poids. Le développement tumoral sous-cutané peut engendrer de la nécrose ou une gêne lors de certains mouvements, notamment pour la locomotion. Lors des tests de toxicité, une perte de poids peut être observée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour les analyses post-mortem
Remplacement
Avant toute étude chez l’animal, les composés théranostiques (famille appelée radioswitch) ont subi de nombreux tests préliminaires in vitro., notamment pour valider leur capacité à se fixer sur leurs cibles présentes à la surface des cellules tumorales. Ces travaux ont montré des résultats très concluants in vitro, qui nécessitent à présent d’être confirmés in vivo. En effet, il s’agit d’étudier la capacité de ces composés à se fixer sur leurs cibles lorsque les cellules tumorales sont présentes dans un organisme et également à délivrer après activation un signal conduisant à la mort de la cellule (directement ou bien grâce à l’intervention du système immunitaire)
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un test logrank sur logiciel G*power.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Pour limiter la souffrance des animaux, la procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec recours aux anesthésiques locaux et aux analgésiques. Les animaux sont également observés après les greffes afin de détecter tout signe de souffrance ou de mal être. Les animaux sont observés quotidiennement et pesés 5 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant les chirurgies. Puis, les animaux sont observés et pesés 3 fois par semaine afin de détecter tout signe de mal être ou de détérioration de leur état durant le développement des tumeurs. Si une souris présente une perte de poids de 20% par rapport à son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Les tumeurs en sous-cutanée, sont mesurées au pied à coulisse au minimum 2 fois par semaine afin de suivre leur vitesse de pousse. Nous serons particulièrement attentifs à l’atteinte du point limite éthique lié au volume de la tumeur selon le site d’implantation. Pour les tests de toxicité, les animaux sont observés et pesés 7 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant l’injection des composés, puis ils sont pesés 3 fois par semaine. Si les animaux présentent des effets secondaires suite à l’injection des composés, les symptômes seront identifiés et traités de façon adéquat. Les irradiations ne sont pas douloureuses et sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements de l’animal. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Nous serons attentifs à tout signe de mal-être tel que décrit dans la grille de score et prendrons les mesures adéquates pour arrêter la souffrance de l’animal notamment la mise en place de soins de support. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de biodistribution / biopharmacocinétique et de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique largement utilisé pour les études impliquant des molécules et/ou de la radiothérapie ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes car les tumeurs du pancréas chez l’homme touchent quasi exclusivement l’adulte.. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7/8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats Des animaux adultes et ayant fini leur développement sont nécessaires auquel cas, lors des implantations, les tumeurs pourraient migrer et nos études seraient alors inexploitable.
Création, amplification et archivage de lignées de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
28 150 souris vont être utilisées, chaque femelle porteuse recevant cinq injections et une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les donneuses sont stimulées par deux injections d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle puis tuées pour récupérer leurs embryons. Les porteuses sont tuées le lendemain de la mise bas théorique ou au sevrage de leurs petits, l'établissement indiquant ne pas pouvoir les réutiliser après une chirurgie. Ce travail se vend : le porteur écrit que la quantité d'animaux a été adaptée pour remplir les conditions stipulées dans les contrats avec les clients, et qu'il n'y a donc pas d'approche statistique.
Objectifs
Notre travail est de créer, d’amplifier et d’archiver des lignées de souris génétiquement modifiées. Ces lignées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Notre coeur de métier est la création, l'amplification et l'archivage de lignées génétiquement modifiées de souris pour le service des chercheurs et de la commumauté scientifique. Notre rôle est de fournir aux chercheurs des lignées précises, établies et robustes en améliorant sans cesse nos techniques afin de répondre aux exigences de réduction et raffinement. La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente.
Procédures
Les souris donneuses d'embryons vont subir 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle pour stimuler la production d'embryons. Certaines souris, futures mères-porteuses seront synchronisées par 2 injections d'un composé chimique à 24h d'intevalle. Ces actes rapides se font sur animaux vigiles et sous contention. Les souris mères-porteuses recevront lors de la chirurgie de transfert d'embryons : Une injection d'analgésique 30 minutes avant l'injection du cocktail anesthésique (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissment suffisamment profond, la chirugie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. Avant le réveil des animaux, une dernière injection d'anti-inflammatoire combinée à une réhydratation sera pratiquée. Chaque femelle mère porteuse recevra au total 5 injections. (synchronisation x 2, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire/réhydratation).
Impact sur les animaux
Les souris peuvent ressentir un léger stress de courte durée lors des manipulation/contentions pour réaliser les différentes injections. Lors des injections des différents produits utilisés dans cette procédure, les animaux vont sentir une légère douleur de courte durée, le temps de l'introduction de l'aiguille. Lors des chirurgies, la plaie générée peut s'inflammer ou s'infecter dans de très rares cas. Les animaux en post chirurgie peuvent s'attaquer à leur cicatrice (automutilation).
Devenir
Les donneuses d'embryons seront mises à mort pour récupérer les embryons au stade souhaité. Pour les mères-porteuses, dès lors qu'il y a eu chirurgie de transfet d'embryons, elle seront mises à mort soit le lendemain de la mise bas théorique pour pratiquer une césarienne, si elles n'ont pas mis bas naturellement, ou au plus tard au sevrage de leurs petits (soit 3-4 semaines post partum). Nous ne pouvons pas les réutiliser comme reproductrices ou de nouveau mère porteuses, ayant déjà subi une chirurgie.
Remplacement
Nous n'avons pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour toutes ces techniques de création, d'amplification et d'archivage de lignées de souris génétiquement modifiées. L'état actuel de nos connaissances ne permettent pas de s'affranchir d'utiliser des animaux en recherche fondamentale ou appliquée.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. L’amélioration des techniques permet sans cesse de répondre aux exigences de réduction et de raffinement. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés. La superovulation de jeunes femelles va permettre d’augmenter le nombre d’embryons produits par femelle et ainsi réduire considérablement le nombre d’animaux donneurs utilisés. La synchronisation des femelles va permettre une forte réduction du nombre de femelles futures mères-porteuse en stock. En revanche, cette technique n'est applicable que pour les transferts d'embryons au stade 1 et 2 cellules. Les souches de mères-porteuses choisies sont d’excellentes mères, calmes. Elles peuvent donner naissance à de grandes portées de nouveau-nés. Ce qui permet de réduire significativement le nombre de femelles mère-porteuses utilisées. Ces techniques sont utilisées en prestation de service, la quantité d'animaux utilisée a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats avec les clients. Il n'y a donc pas d'approche statistique.
Raffinement
Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour palier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Nos souris sont hébergées en cages ventilées, en groupe dans la mesure du possible, avec de l'enrichissement : nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.
Choix des espèces
La souris est un très bon modèle d'expérimentation animale car elle est de petite taille, son génome est parfaitement connu et elle a un taux de reproduction très rapide. Elles sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Elle est couramment utilisé par les chercheurs pour des créations de lignées transgéniques. Les femelles utilisées pour produire les embryons sont prépubères car elles répondent mieux aux traitements hormonal de superovulation. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes matures. La souche choisie, est connue pour être d’excellentes mères, très calmes, qui peuvent donner naissance à de grandes portées de nouveau-nés, ce qui permet de réduire significativement le nombre de femelles mères porteuses utilisées.
MODIFICATION: Gestion de la production d’animaux qui développent spontanément une colite chronique et collecte de lait de mère.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Porteuses d'une mutation qui les prive d'une protéine anti-inflammatoire, ces souris développent d'elles-mêmes une inflammation chronique de l'intestin, avec diarrhées, déshydratation et perte de poids pouvant atteindre 20 %. 1 250 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les mères allaitantes sont endormies, reçoivent une injection d'ocytocine et sont séparées de leurs petits pendant deux à quatre heures pour que leur lait soit collecté et analysé. Le porteur indique que 820 souris passeront dans d'autres procédures, les autres étant tuées à l'apparition de signes de souffrance, faute de portée depuis deux mois, ou à vingt-quatre semaines parce qu'elles sont alors jugées trop âgées.
Objectifs
Ce projet porte sur l’élevage et l’observation d’une lignée de souris qui, avec le temps, développe naturellement une inflammation chronique de l’intestin, appelée colite. Cette maladie chez la souris est utilisée comme modèle pour mieux comprendre les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) chez l’être humain, comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Ces maladies touchent de plus en plus de personnes et sont liées à un déséquilibre complexe entre notre système immunitaire, notre environnement et les milliards de bactéries vivant dans nos intestins (appelées le microbiote). Dans cette étude, nous utilisons une lignée de souris porteuse d’une mutation dans un gène important pour contrôler l’inflammation (le gène IL-10). Ces souris développent spontanément des signes de maladie intestinale, ce qui en fait un bon modèle d’étude pour les MICI. Il est connu que la composition du microbiote a un rôle déterminant dans le déclenchement ou l’aggravation de la maladie chez ces animaux. L’un des objectifs de ce projet est de décrire les conditions d’élevage et les soins apportés à ces souris sensibles, afin d’assurer leur bien-être tout en permettant l’observation des signes de la maladie. MODIFICATION: Un autre objectif est de collecter du lait maternel chez des souris malades et des souris en bonne santé, pour analyser sa composition. À terme, ce modèle permettra de mieux comprendre comment certains composants du lait maternel peuvent influencer la santé intestinale des nouveau-nés, et comment cela pourrait prévenir ou aggraver les maladies comme les MICI. Ce projet vise également à tester de nouvelles approches thérapeutiques, notamment basées sur de petites molécules naturelles appelées micro-ARN, connues pour réguler de nombreux mécanismes biologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de maintenir et d’utiliser une lignée spécifique de souris (appelées souris IL10-KO) qui développent naturellement une inflammation intestinale, afin de soutenir nos recherches, ainsi que celles de nos partenaires, sur les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ces souris sont essentielles pour tester des hypothèses sur l’origine et le développement de ces maladies. MODIFICATION: Une autre partie importante du projet consiste à collecter du lait maternel chez les mères souris, utilisées pour le maintien de la lignée, ce qui nous permettra d’analyser sa composition et de voir s’il existe un lien avec l’état de santé des petits. Cela nous aidera à comprendre si certains composants du lait influencent la survenue ou la gravité des maladies intestinales plus tard dans la vie. Grâce à ce modèle, nous espérons mieux comprendre comment ces maladies se développent dès les premiers jours de vie. Ce travail pourrait mener à l’identification de nouveaux signes précoces (biomarqueurs) de la maladie, mais aussi de nouvelles cibles pour des traitements plus efficaces. Enfin, ces souris nous permettront de tester de nouvelles molécules anti-inflammatoires et de les comparer aux traitements actuellement utilisés chez les patients atteints de MICI, dans le but d’améliorer les options thérapeutiques à l’avenir.
Procédures
MODIFICATION: Du lait sera collecté chez les mères allaitantes, ce qui nécessite deux étapes : une injection d’ocytocine (une hormone qui stimule la lactation), geste qui dure environ 10 secondes, et une séparation temporaire des petits pendant deux à quatre heures avant la collecte.
Impact sur les animaux
Certaines souris utilisées dans ce projet, appelées souris IL10-KO, peuvent développer naturellement, au fil du temps, une inflammation chronique de l’intestin. Cette maladie peut provoquer des diarrhées importantes, une déshydratation, ainsi qu’une perte de poids rapide pouvant atteindre 20 % du poids initial. Dans ces cas, l’expérimentation sera arrêtée pour ces souris afin d’éviter toute souffrance excessive. D’après nos observations précédentes, environ 85 % des femelles et 90 % des mâles atteignent l’âge de 14 semaines sans complication majeure. MODIFICATION: Par ailleurs, nous prévoyons de collecter du lait chez les mères allaitantes, ce qui nécessite deux étapes : une injection d’ocytocine (une hormone qui stimule la lactation), et une séparation temporaire des petits pendant deux à quatre heures avant la collecte. Il est connu que ces manipulations peuvent entraîner un léger stress chez la mère, mais les injections sont rapides, réalisées avec soin, et les souriceaux sont suffisamment grands (entre 14 et 16 jours après la naissance), ce qui réduit considérablement les risques de comportements anormaux, comme le rejet ou le cannibalisme. L’ensemble des procédures a été conçu pour minimiser les nuisances et garantir le bien-être des animaux tout au long du projet.
Devenir
Les souris générées dans ce projet seront soit intégrés dans un protocole expérimental dès 4 semaines de vie, soit gardés en vie pour la gestion des accouplements, soit euthanasiés lorsqu'elles présenteront des signes de souffrance ou lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois ou âgées de 24 semaines (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche). Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est essentielle pour cette recherche, car les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont très complexes. Elles impliquent plusieurs facteurs comme le système immunitaire, les microbes intestinaux, la génétique et l’environnement. Ces maladies affectent non seulement l’intestin mais aussi d’autres organes et provoquent une inflammation persistante dans tout le corps. Pour comprendre comment l’environnement et les microbes interagissent avec l’organisme, les souris sont le modèle le plus adapté. À ce jour, il est impossible de recréer ces interactions complexes en laboratoire uniquement avec des cellules.
Réduction
Nous ajusterons l’élevage des souris en fonction des besoins de recherche de l’équipe de recherche. Ayant une connaissance approfondie de cette lignée (son mode de reproduction, le nombre et la taille des portées), nous sommes en mesure de gérer l’élevage de manière efficace et raisonnée. Concrètement, nous maintenons en permanence deux couples reproducteurs pour assurer la continuité de la lignée. Si une expérience spécifique est prévue et approuvée, nous augmentons temporairement le nombre de souris pour répondre aux besoins de l’étude. MODIFICATION: La collecte de lait chez les mères est réalisée au moment même où ces femelles sont utilisées pour maintenir la lignée, ce qui évite d’ajouter de nouvelles souris uniquement pour cette procédure. Cela contribue à réduire le nombre total d’animaux utilisés, tout en obtenant les échantillons nécessaires pour nos recherches.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’élevage, les souris seront surveillées chaque jour par du personnel qualifié et formé au bien-être animal. Certaines souris de cette lignée peuvent développer une inflammation intestinale appelée colite, qui sera suivie avec attention. Un système de suivi basé sur une grille d’évaluation standardisée permettra de repérer les premiers signes de cette inflammation. Cette grille prend en compte plusieurs éléments comme la perte de poids, l’aspect extérieur, les selles ou encore le comportement général de la souris. En fonction de cette évaluation, des mesures adaptées seront prises : - Si les signes s’aggravent, la fréquence des contrôles sera augmentée. - Si les animaux montrent des signes de déshydratation ou de perte de poids, ils auront accès à une gelée de réhydratation dans leur cage. - Si les signes deviennent trop importants, l’expérience sera arrêtée pour l’animal concerné, afin d’éviter toute souffrance. MODIFICATION: Concernant la collecte de lait, cette procédure est également soigneusement encadrée : - La mère est endormie brièvement et en douceur à l’aide d’un gaz anesthésiant (isoflurane). - Une injection d’ocytocine, une hormone naturelle, est réalisée pour faciliter l’expulsion du lait. L’injection est faite de manière rapide, précise, et par du personnel expérimenté. - Les petits sont temporairement séparés de leur mère pendant 2 à 4 heures, ce qui est bien en dessous de la durée habituellement utilisée pour ce type de procédure (généralement 6 à 12 heures). Durant cette séparation, les petits restent confortablement installés dans leur nid d’origine dans une boîte aérée et sécurisée. De plus, le volume de liquide injecté à la mère est supérieur à celui du lait prélevé, ce qui permet de préserver son hydratation. L’ensemble de ces gestes est maîtrisé par les expérimentateurs et a été optimisé pour limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Si, malgré ces précautions, un animal montre des signes de souffrance, les expériences seront adaptées, atténuées ou même suspendues si nécessaire. Enfin, l’environnement des souris sera enrichi (avec du coton, des abris, un cycle jour/nuit respecté) afin de favoriser des comportements naturels et réduire le stress.
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’intestin lui-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entrainant ainsi une inflammation intestinale ressemblant à une colite hémorragique chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris pourront commencer à se reproduire dès l’âge de 5 semaines, qui correspond à leur maturité sexuelle.
Rôle d’un couple ligand récepteur dans le développement vasculaire utérin.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Injectés sous la peau dans leurs premiers jours de vie pour déclencher une modification génétique, 476 souriceaux sont ensuite tués entre deux et vingt et un jours après la naissance pour que leurs tissus soient découpés et analysés. Les procédures sont classées en niveau de souffrance modéré. Le projet cherche le rôle d'une molécule dans la formation du réseau lymphatique de l'utérus, un travail que le porteur qualifie d'exclusivement fondamental, avec une suite déjà annoncée sur le cancer de l'endomètre. Pour tirer plus de données de chaque animal, les cornes utérines sont coupées en deux et les expérimentateurs prélèvent en plus le diaphragme et l'oreille des mâles.
Objectifs
Le système lymphatique est constitué d'un réseau ouvert, unidirectionnel et à faible pression de vaisseaux lymphatiques. Il maintient le volume et la composition du liquide situé entre les cellules de l’organisme, participe à l'absorption intestinale des graisses et des vitamines alimentaires et contribue au bon fonctionnement du système immunitaire. Ces vaisseaux sont tapissés par des cellules qui délimitent l’intérieur du vaisseau et le tissu. La formation du réseau lymphatique à partir de la vascularisation préexistante est un processus hautement contrôlé appelé lymphangiogenèse. Ce mécanisme fait intervenir de nombreuses molécules, dont des molécules connues pour contrôler le développement du système nerveux. Ce projet vise à comprendre le rôle d'une de ces molécules et de son récepteur au cours de la mise en place de ce réseau lymphatique dans l’utérus. Ce projet sera réalisé à l’aide de plusieurs modèles génétiques murins permettant de moduler l’expression de gènes d’intérêt dans un tissu spécifique et à un moment donné. Ce contrôle spatio-temporel permet d’éviter les événements délétères sur les animaux. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et l’organisation des vaisseaux lymphatiques au cours du développement mais également d’ouvrir de nouvelles perspectives d’études dans des conditions pathologiques comme le cancer. En effet, le système lymphatique est impliqué dans la progression métastatique où il est une voie de dissémination pour les cellules cancéreuses, notamment dans les cas de cancer de l’endomètre.
Bénéfices attendus
Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle d’une molécule de guidage axonal et son récepteur dans la mise en place du réseau lymphatique de l’utérus. Si ce projet aboutit à l’identification d’une fonction pour ce couple ligand/récepteur. Nous déposerons une nouvelle demande de projet pour tester ce rôle dans un contexte tumoral (cancer de l’endomètre). En effet, le système lymphatique est connu pour être une voie de dissémination métastatique dans les cancers de l’endomètre.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons uniquement des interventions sur des nouveau-nés. Nous réaliserons une injection sous-cutanée (15 secondes). Enfin, nous prélèverons les tissus post-mortem pour des analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Les nouveau-nés recevront une injection sous-cutanée d’un analogue d’une hormone sexuelle afin de déclencher l’évènement génétique permettant d’étudier la fonction de nos gènes d’intérêt. Nous n’attendons pas d’effet délétère fort, mais plutôt un retard de croissance du système lymphatique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, car nous réaliserons des analyses sur tous les animaux(histologiques, transcriptomiques).
Remplacement
La compréhension du développement du système vasculaire lymphatique ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du réseau vasculaire lymphatique est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions tissulaires. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.
Réduction
Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur des caractères histologiques qui seront quantifiés. Nous avons pu ainsi déterminer à l’aide d’outils statistiques le nombre d’individus nécessaires permettant d’obtenir des résultats robustes. Par ailleurs, les cornes utérines seront scindées en deux ce qui permet de diviser par 2 le nombre d’individus. Dans un souci de réduction, nous collecterons également chez les individus mâles le diaphragme et l’oreilles qui sont des modèles d’étude de la mise en place du réseau lymphatique. De la sorte, nous pourrons généraliser nos observations dans l’utérus à l’intégralité de l’organisme.
Raffinement
Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections sous-cutanées seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Le contrôle spatial et temporel de l’évènement génétique permet de restreindre les défauts au système vasculaire lymphatique par rapport aux animaux constitutivement invalidés pour les gènes étudiés.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Dans ce projet, le système lymphatique sera analysé grâce à des souris génétiquement modifiées dont l’expression des molécules candidates est perturbée. Les analyses seront réalisées à différents âges qui ont été choisis suite à une étude préliminaire qui a montré que le système lymphatique de la corne utérine se développe entre 2 jours post-natals et 21 jours post-natal (le réseau a atteint sa maturité).
Rôle des cellules immunitaires du foie dans l’athérosclérose chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Gavées, mises à jeun jusqu'à douze heures et soumises à dix prélèvements sanguins sur animal vigile, 1 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes. L'objet déclaré est de comprendre comment les cellules immunitaires du foie participent à l'athérosclérose, avec l'espoir lointain de nouvelles cibles thérapeutiques. Sur la façon dont ces 1 600 animaux ont été comptés, le résumé tient en une ligne, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de décès dans les pays développés. Parmi elles, l’athérosclérose, une maladie caractérisée par le dépôt de graisses dans les artères, est particulièrement redoutée pour ses conséquences, comme la crise cardiaque. L'inflammation joue un rôle central dans l'évolution de l'athérosclérose, ce qui fait de sa compréhension et de sa modulation une priorité de santé publique. Les cellules immunitaires du foie jouent un rôle dans la régulation de l’inflammation au sein de cet organe, et pourraient également contribuer, à plus large échelle, à l’inflammation chronique des artères et des organes immunitaires, associée aux maladies cardiovasculaires. L’objectif de ce projet est d’étudier la contribution des cellules immunitaires du foie dans le développement de l’inflammation et des maladies cardiovasculaires. Nous allons utiliser un modèle d’athérosclérose chez la souris pour explorer les mécanismes immunitaires et inflammatoires impliqués dans le développement de ces maladies. Les objectifs de ce projet sont de 1) caractériser les cellules immunitaires du foie ainsi que leur devenir dans les maladies cardiovasculaires et 2) étudier leur contribution dans l’athérosclérose et l’inflammation.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes liant le foie à l’athérosclérose, et pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires du foie, chez les patients souffrant d’athérosclérose.
Procédures
Les animaux auront jusqu'à 4 injections sur toute la durée de la procédure (durée inférieure à 30 secondes par injection). Les animaux vigiles auront un gavage (durée inférieure à 30 secondes) au cours de la procédure. Des prélèvements auront lieu sur animaux anesthésiés (une seule fois avec une durée inférieure à 30 secondes) ou vigiles (jusqu'à 10 prélèvements de moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : - la préhension et contention des animaux génèrent un inconfort léger et de courte durée - la mise à jeun avant les tests de tolérance à l'insuline (5h) et au glucose (12h) génère un inconfort - l'individualisation des animaux génère un stress léger durant la durée des tests - le gavage génère un stress et un inconfort légers de courte durée - les prélèvements de sang génèrent une douleur légère de courte durée - l'injection génère une légère douleur de courte durée au point d’injection - le prélèvement sanguin génère un stress et une douleur modérée de courte durée - l'anesthésie gazeuse génère un stress et une hypothermie légère de courte durée
Devenir
A l'issue des différents gestes techniques, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure dans le but de prélever les différents organes ou tissus d'intérêt.
Remplacement
Actuellement il n'existe pas de modèle plus pertinent que la souris pour l’étude de l’athérosclérose et de l’obésité. L’expérimentation animale est également le seul moyen permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans ce contexte.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel technique qualifié de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. La mise en place de points limites adaptés permettront d'identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie locale adaptées.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude de l’athérosclérose et l'obésité avec notamment le développement de plaques d’athérosclérose et du syndrome métabolique dans un laps de temps raisonnable. De plus, c’est le seul modèle animal dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Grâce à ces modèles, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet. Les souris seront utilisées au stade adulte, à partir de 8 semaines. Le développement de l’athérosclérose est corrélé à l’âge, c’est pour cela qu’on utilisera des souris adultes.
Étude de la barrière hémato-encéphalique après traumatisme crânien léger unique ou répétépar imagerie
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
Jusqu'à huit chocs à la tête et vingt séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures étalées sur quatre-vingt-dix jours : 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles reçoivent aussi un radiotraceur et passent trois tests comportementaux répétés à cinq dates, coordination motrice, mémoire spatiale et anxiété, pour suivre l'état de la barrière hémato-encéphalique après une commotion cérébrale. Le porteur décrit des signes passagers de désorientation et de baisse d'activité après le traumatisme, et compte sur ces travaux pour mieux diagnostiquer les séquelles chez les sportifs et les militaires. Il retient la souris parce que son cerveau ressemblerait au nôtre sur ces points, et choisit des animaux de quatre à huit semaines, jeunes adultes encore capables de récupérer d'un stress.
Objectifs
Le traumatisme crânien léger, aussi appelé commotion cérébrale, est une blessure du cerveau souvent considérée comme bénigne, mais qui peut avoir des effets à long terme, notamment sur la mémoire, l’humeur ou le comportement. Certaines études montrent qu’il pourrait être lié à des maladies neurodégénératives comme Alzheimer. Ce projet vise à mieux comprendre les effets du traumatisme crânien léger sur une structure protectrice du cerveau appelée la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cette barrière empêche les substances indésirables de pénétrer dans le cerveau. Après un choc, elle pourrait devenir plus perméable, favorisant des réactions inflammatoires durables. Grâce à des techniques d’imagerie avancées (notamment la tomographie par émission de positons, TEP) et à un modèle expérimental chez la souris, nous allons observer comment la BHE est modifiée après un choc à la tête, et pendant plusieurs semaines. Ces recherches permettront de mieux évaluer les risques, améliorer le diagnostic et, à terme, aider à mieux prendre en charge les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet a avant tout pour but d’améliorer la compréhension des effets à court et long terme d’une commotion cérébrale (ou traumatisme crânien léger) sur le cerveau et sur sa barrière naturelle, la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui pourrait être fragilisée après un choc. Les résultats pourront servir à identifier de nouveaux outils pour diagnostiquer plus tôt les complications liées aux traumatismes crâniens, mieux évaluer les risques à long terme, et adapter la prise en charge des personnes exposées de manière répétée, comme les sportifs ou les militaires. Ce projet pourrait donc contribuer à mieux prévenir les séquelles neurologiques liées aux commotions cérébrales.
Procédures
Les interventions prévues sont listées ci-dessous : • Réalisation sous anesthésie gazeuse d’un traumatisme crânien léger (ou commotion cérébrale) (durée 1 seconde répétable 8 fois au maximum, 1078 animaux) • Réalisation au maximum de 20 sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, espacé sur 90 jours, 1232 animaux) • Injection d’un radiotraceur, sous anesthésie générale (durée 1 min ; 1232 animaux) • Des tests comportementaux seront réalisés chez 1232 souris. Chaque animal réalisera trois types de tests évaluant la coordination motrice (10 min), la mémoire spatiale (15 min) et l’anxiété (10 min). Ces tests seront conduits à J3, J15, J30, J60 et J90 selon un calendrier alterné pour limiter la fatigue. La durée cumulée n’excédera 30 minutes par session et par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans la cage de l’animal. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important. • Après le traumatisme crânien les souris peuvent montrer des signes passagers de désorientation, de baisse d'activité ou de modifications légères de leur comportement..
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
Ce projet utilise un modèle animal (la souris) car il n'existe pas, à ce jour, de méthode alternative permettant d'étudier de manière fiable et complète les effets d’un traumatisme crânien léger (comme une commotion) sur le cerveau vivant. En particulier, il s’agit ici d’observer la barrière hémato-encéphalique (BHE), une structure essentielle qui protège le cerveau, et de suivre dans le temps ses éventuelles altérations à l’aide d’imagerie cérébrale et de tests comportementaux. Aucun modèle informatique ou sur cellules ne permet aujourd’hui de reproduire toutes les réactions complexes du cerveau après un choc : inflammation, circulation sanguine, comportements, etc. Les souris sont donc utilisées pour observer ces effets dans un organisme entier, en conditions réelles. Cependant, afin de réduire le recours aux animaux, les étapes de préparation du projet (comme les tests sur les doses ou les images de référence) sont réalisées autant que possible à partir de données déjà existantes ou sur cellules.
Réduction
Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétiques au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 2 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utilisons des souris car elles sont l’un des modèles les plus couramment employés en recherche biomédicale. Elles présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne la barrière hémato-encéphalique (BHE), les processus inflammatoires et les réactions au traumatisme crânien. Leur petite taille, leur génétique bien connue et la possibilité de suivre leur comportement en détail en font un modèle adapté pour ce type d’étude. Les souris utilisées ont entre 4 et 8 semaines au début des expériences. Cet âge correspond à un stade jeune adulte, c’est-à-dire à un moment où le cerveau est complètement formé, mais où l’animal est encore en bonne santé et capable de récupérer d’un stress. Ce choix permet de mieux modéliser les effets du traumatisme crânien léger (TCL) chez l’humain adulte, tout en garantissant que les résultats soient pertinents et reproductibles.
Effet des œstrogènes sur les artères
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour savoir si des œstrogènes ou des molécules apparentées protègent encore les artères après la ménopause, 1 320 souris subissent l'ablation des deux ovaires, la souris n'ayant pas de ménopause naturelle. Toutes vont être tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit ensuite une injection unique du composé à tester, l'autre moitié une capsule à libération prolongée posée sous la peau, avant prélèvement des tissus. Le porteur ramène les effets indésirables à une douleur, une perte de poids et un stress, et renvoie à une grille d'évaluation de la douleur appliquée après chaque chirurgie, sans dire quel seuil déclenche la mise à mort.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité chez les femmes, mais leur lien avec la ménopause reste encore mal compris. Après cette période, la chute des œstrogènes augmente le risque de développer des problèmes cardiaques. Ce projet vise à déterminer si certains traitements à base d’œstrogènes ou de molécules similaires peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, un modèle de souris dont les ovaires sont retirés est utilisé afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes, puisque la souris ne présente pas de ménopause naturelle. L’effet des traitements sera évalué en étudiant comment les gènes des vaisseaux réagissent. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé en culture cellulaire, car les cellules perdent rapidement leur capacité à détecter et répondre aux œstrogènes une fois isolées et cultivées en laboratoire. L’expérimentation animale est donc indispensable pour reproduire les conditions hormonales et physiologiques d’un organisme vivant. L’objectif est d’identifier les types d’œstrogènes ou les molécules capables de bien activer leur récepteur, afin de préserver la santé des vaisseaux sanguins après la ménopause. Ces résultats pourraient contribuer au développement de traitements mieux adaptés pour prévenir les maladies cardiovasculaires chez les femmes.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre d’identifier les traitements hormonaux les plus efficaces pour protéger les artères après la ménopause, une période où le risque cardiovasculaire augmente fortement chez les femmes. En comparant différents types d’œstrogènes et de molécules ciblant leur récepteur, il deviendra possible de mieux comprendre quels composés sont réellement bénéfiques pour le système cardiovasculaire. À terme, ces connaissances pourraient aider à améliorer les traitements existants ou en développer de nouveaux, plus sûrs et plus adaptés aux besoins des femmes ménopausées. Cela contribuerait à réduire la mortalité cardiovasculaire chez les femmes, en tenant mieux compte de leurs spécificités biologiques souvent négligées dans la recherche médicale.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 1320 animaux 2-Injection aigu de composé (1min) 660 animaux 3-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 660 animaux
Impact sur les animaux
Les chirurgies sur la souris telles que l’ovariectomie, l'injection en aigu de composé ou la pose de pellet peuvent engendrer une douleur, une perte de poids et un stress.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.
Remplacement
Le processus vasculaire implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire les variations hormonales, d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentes dans le vaisseau perdent leur capacité à réagir aux œstrogènes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 10 animaux/groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle de mise à mort, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du récepteur aux oestrogènes ou de ces sous fonctions. Ces souris sont issues d’une lignée génétique bien connue, souvent utilisée pour mieux comprendre les maladies du cœur et des vaisseaux. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, après la puberté, à partir de 7 semaines d’âge dans le cadre de l'étude de la ménopause.
Mécanorécepteurs: Etude du rôle en hémostase et thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées sans jamais se réveiller pour 378 d'entre elles, 438 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, les 60 autres dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Aucune ne peut survivre au prélèvement de sang dans l'aorte, et celles qui passent par la chirurgie sont mises à mort pour éviter, selon le porteur, toute souffrance au réveil. Chaque souris subit une mesure du temps de saignement par section du bout de la queue, quarante minutes durant, ou une chirurgie de prélèvement aortique, ou une expérience de thrombose de cinquante minutes, sous anesthésie profonde. Le porteur compte comme réduction le fait de réutiliser les souris passées par le temps de saignement pour en prélever le sang, et annonce qu'il renoncera aux expériences de thrombose in vivo si les essais en microfluidique ne montrent rien.
Objectifs
Les plaquettes sanguines jouent un rôle clé dans l'hémostase pour éviter les hémorragies mais à l'inverse sont aussi responsables des thromboses artérielles. Lors de lésions ou de thromboses, les plaquettes sont activées, agrègent et forment un clou plaquettaire (hémostase) ou thrombus (thrombose), partiellement ou totalement occlusif. Les plaquettes sont les acteurs principaux des thromboses artérielles. Depuis une dizaine d'année, on sait que les forces mécaniques sont ressenties par des récepteurs spécialisés présents dans la membrane des cellules et modifient le comportement des cellules. L'objectif est de décrypter le rôle de ces récepteurs encore peu étudiés afin de trouver de nouveaux traitements pour éviter les hémorragies et prévenir les thromboses. Pour cela, nous effectuerons des expériences de thrombose sur souris génétiquement modifiées pour ces récepteurs.
Bénéfices attendus
Ces expériences nous permettront de comprendre dans quelle mesure ces récepteurs sont impliquées en hémostase normale ou en thrombose. De manière plus générale, les perspectives de ce projet sont pour l'instant essentiellement fondamentales mais le cas échéant ouvrent à terme des perspectives cliniques et thérapeutiques intéressantes pour de nouveaux traitements anti-thrombotiques ou anti-hémorragiques.
Procédures
Contention et piqûre pour les anesthésies (moins d'une minute). Mesure du temps de saignement par section de l'extremité de la queue (1 mesure par souris, durée totale 40 minutes), chirurgies pour prélèvements de sang au niveau de l'aorte (durée totale 10 minutes, 1 prélèvement par souris) et expériences de thromboses (durée totale 50 minutes, 1 expérience par souris), l'ensemble de ces procédures se faisant sur souris profondément anesthésiées.
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, une complication attendue est le risque de saignement au site d’injection ou d’incision. Les piqures pour l’injection des anesthésiants entrainent une douleur légère de courte durée au point d’injection. La section de l’extrémité de la queue induit une légère douleur au réveil, de courte durée.
Devenir
Les animaux ne peuvent survivre à l'issue des prélèvements de sang en aorte. A l'issue des procédures chirurgicales, les animaux sont mis à mort pour éviter toute souffrance au réveil. De plus, ayant déjà subi une intervention cardiovasculaire, ils ne pourraient être réutilisés pour des raison de fiabilité des résultats scientifiques.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de protéines plaquettaires dans l’hémostase et la thrombose artérielle. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’hémostase in vitro. Cependant, il existe des modèles de perfusion de sang dans des chambres microfluidiques qui miment partiellement les mécanismes de la thrombose artérielle. Ils seront également utilisés pour visualiser l’impact de l’inactivation des gènes dans la souris. Les processus d’hémostase et de thrombose étant particulièrement complexes et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, protéines plasmatiques) ainsi que les conditions de flux sanguin, les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité.
Réduction
Les animaux utilisés pour les modèles de temps de saignement seront réutilisés pour le prélèvement de sang pour thrombose in vitro afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Au cas où nous n'aurions aucune différence en thrombose in vitro, nous ne ferons pas les expériences de thrombose in vivo. Nous avons utilisé des tests statistiques adaptés pour déterminer un nombre d’animaux qui nous permettra d’atteindre l’objectif de notre projet.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués : - Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. - Par une anesthésie générale de l’animal avant toutes les procédures et une analgésie adaptée à chaque procédure, maintien de l'animal sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie, l’application de gel hydratant sur les yeux pour éviter la sécheresse oculaire. - Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s'ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car nous disposont de souris génétiquement modifiées avec inactivations de gènes. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 8 et 18 semaines, à l'exception des expériences de thrombose sur mésentère qui nécessitent des souris de 3 semaines, au delà le dépot de graisse entraine des résultats peu fiables. Mâles et femelles seront évalués.
Evaluation de la performance diagnostique de produits de contraste IRM sur un modèle de métastases cérébrales chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées à l'issue, à la fin du suivi par IRM, à un point limite ou, faute de métastase visible à six semaines, pour fournir des tissus témoins, 144 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Sous anesthésie, chacune reçoit dans le cœur une injection de cellules humaines destinée à provoquer des métastases cérébrales, puis passe de la deuxième à la sixième semaine deux séances d'IRM par semaine, d'une heure à une heure quinze chacune. Le porteur décrit des tremblements, une incoordination et des paralysies partielles, et prévient qu'au-delà de quatre semaines un envahissement massif du cerveau peut survenir, avec "un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané". Le projet compare un nouvel agent de contraste IRM à des produits de référence, et le porteur décrit comme "indispensable" l'absence de rejet des cellules humaines, d'où le choix de souris immunodéficientes.
Objectifs
L’imagerie IRM (imagerie par résonnance magnétique) avec administration d’un agent de contraste permet de mieux détecter de nombreuses pathologies cérébrales, notamment en cancérologie, en en rehaussant le signal de la lésion. Outre le dépistage de la maladie et la pose du diagnostic, l’IRM avec agent de contraste permet le suivi de l’évolution de la pathologie et le suivi de l’efficacité thérapeutique mise en place pour le patient. L’enjeu est particulièrement important dans la détection de métastases cérébrales où le pronostic du patient (par exemple : taux de survie à 5 ans) est étroitement corrélé au stade de développement tumoral. Un diagnostic le plus précoce possible de l’ensemble des lésions a un impact direct sur la bonne prise en charge du patient. Le nombre de tumeurs et/ou de métastases ainsi que les caractéristiques de ces lésions (infiltrantes, vascularisées…), leur localisation et l’identification de leurs marges tumorales sont d’autant d’éléments importants pour proposer le meilleur traitement au patient (chirurgie, radiothérapie ciblée, etc..). Dans cet objectif final, le projet vise à évaluer les performances diagnostiques d’un nouvel agent de contraste IRM dans la détection précoce de tumeurs et/ou de métastases cérébrales. Les agents de contraste faisant partie de la classe des médicaments injectables, il s’agira de trouver le meilleur compromis entre la nature et la dose de produit de contraste injectée et l’apport diagnostique pour le patient. Le présent projet sera conduit sur un modèle de souris reproduisant la maladie. Des produits au stade prototype ou déjà commercialisés et considérés à l’heure actuelle comme des références serviront de comparatifs. Cette étude préclinique nous permettra d’obtenir des éléments de réponse avec des paramètres quantitatifs (rehaussement de contraste, nombre et temporalité des lésions détectées) et d’estimer au plus juste la dose qui apportera le meilleur compromis entre performance de détection des lésions et réduction de l’agent de contraste administrée au patient.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons une idée cliniquement pertinente de la performance diagnostique du produit testé et de la dose à administrer (comparativement à des produits de référence) pour une détection précoce des métastases cérébrales tout en proposant la dose efficace la plus faible possible (compromis entre dose de gadolinium administrée au patient et efficacité du rehaussement à détecter, caractériser et suivre l’efficacité du traitement mis en place). Nous aurons une idée précise, pour une dose donnée, si le nombre de métastases détectées est augmenté par rapport au produit de référence, si la taille minimale de détection et ou le délai d’apparition est réduit, permettant un diagnostic plus précoce, et évaluerons la facilité de délimitation tumorale. Ces résultats permettront d’éclairer les choix de la dose à tester en étude clinique dans l’objectif de mettre à disposition des radiologues un produit de contraste plus performant, en termes de détection et de précocité de détection, améliorant ainsi la prise en charge des patients et, potentiellement, leur taux de survie à 5 ans.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux anesthésiés et sédatés. Le projet se déroulera en trois phases : Phase A – Mise en place du modèle expérimental Chaque animal recevra une intervention unique, d’une durée d’environ 10 à 15 minutes, visant à simuler un processus de dissémination tumorale. Cette étape sera réalisée une seule fois par animal, au début de l’étude. Phase B – Suivi par imagerie cérébrale À partir de la semaine 2 et jusqu’à la semaine 6, les animaux seront suivis par imagerie cérébrale deux fois par semaine. Chaque séance durera environ 1h à 1h15 par animal, incluant la préparation, l’installation et l’acquisition des images. Ce suivi permettra d’observer l’évolution des lésions et de comparer différents protocoles d’imagerie. Une semaine supplémentaire de suivi pourra être ajoutée selon l’état de santé des animaux. Phase C – Fin de l’étude L’euthanasie sera pratiquée : • à la fin du suivi par imagerie, • ou plus tôt en cas de problème ou selon les critères de fin d’étude.
Impact sur les animaux
L’administration de médicaments, tels que les analgésiques morphiniques ou l’anesthésie générale, chez l’animal vigile peut provoquer une douleur aiguë au moment de l’injection, ainsi qu’un stress lié à la contention. L’injection intra-cardiaque, utilisée pour l’induction du modèle, est une procédure invasive pouvant entraîner des nuisances importantes. Elle est susceptible de provoquer des douleurs transitoires, des arythmies, des lésions myocardiques, des réactions inflammatoires ou infectieuses, ainsi que des hémorragies internes. Au cours de la phase de développement des métastases cérébrales, les animaux peuvent présenter des troubles neurologiques modérés à sévères : tremblements, incoordination, paralysies partielles, apathie, diminution de la prise alimentaire, perte de poids et déshydratation. Ces signes traduisent une altération progressive de l’état général. L’imagerie par IRM, nécessitant des anesthésies répétées et prolongées, peut induire une hypothermie et une déshydratation. Ces effets sont d’intensité modérée mais peuvent s’accumuler au fil des séances, entraînant une réduction des prises alimentaires et hydriques. Enfin, au-delà de quatre semaines après l’injection tumorale, un envahissement métastatique massif du cerveau peut survenir, provoquant une dégradation rapide de l’état de l’animal, avec un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané.
Devenir
Les souris ayant développé des lésions métastatiques au niveau cérébral (ou dans d’autres territoires si cela arrivait) seront euthanasiées à l’issue du suivi par imagerie IRM, ou à l’atteinte des points limites. Eventuellement, le cerveau des animaux sera prélevé et une analyse histologique ou imagerie élémentaire/moléculaire de coupes cérébrales seront réalisées. Les souris n’ayant pas eu de pousse métastatique (visible en IRM) au bout de 6 semaines post-induction seront euthanasiées et des tissus prélevés pour être utilisés comme matrices biologiques témoins (vierges de certains produits) ou pour des mises au point de bioanalyses.
Remplacement
Si les paramètres physico-chimiques d’un agent de contraste peuvent être déterminés in vitro, l’ensemble des paramètres d’internalisation (entrée dans les cellules cérébrales) et d’extravasation (sortie des vaisseaux) / élimination dans une lésion tumorale sont directement dépendants des caractéristiques intrinsèques de la lésion étudiée et ne peuvent donc être évalués que sur des modèles in vivo. En effet, l’accès à celle-ci dépend directement de l’état d’ouverture de la barrière sang-cerveau et de sa localisation dans le territoire cérébral, ainsi que des caractéristiques propres à chaque lésion (perméabilité, taille, état de vascularisation, tortuosité des vaisseaux, grade, structure du tissu… etc…).
Réduction
L’étude, réalisée en cross-over (comparaison des performances diagnostiques de deux agents de contraste ou doses différents chez un même animal à 24h d’intervalle) permet de diminuer le nombre d’animaux de moitiéen permettant également d’augmenter la puissance statistique d’analyse comparative car : - Chaque lésion métastatique est son propre témoin entre deux comparaisons, permettant de comparer les deux produits sur des lésions avec exactement les même propriétés (taille, perméabilité, accessibilité, nécrose, type…) - Un animal peut présenter plusieurs métastases cérébrales augmentant ainsi le nombre de lésions métastatiques analysé sans augmenter le nombre d’animaux Enfin, selon notre retour d’expérience, le rendement d’animaux répondeur étant variable, l’étude sera réalisée par lot d’implantation de seulement n = 12 animaux à la fois, avec une phase de mise au point afin d’ajuster ce chiffre, de façon à s’approcher au plus juste de l’effectif attendu, c’est-à-dire n = 8 animaux avec lésion(s) métastatique(s) au niveau cérébral. Les animaux ne présentant pas de lésions métastatiques ni signes cliniques pourront servir de matrices biologiques en vue de mises au point d’imagerie moléculaire ou élémentaire.
Raffinement
L’implantation tumorale mise au point sous échographie évite toute ouverture de la peau au niveau du crâne, réduisant de façon importante la souffrance et favorisant la récupération de l’animal. Elle ne sera effectuée qu’une seule fois, avec un volume faible. Par rapport à l’étude antérieure, le protocole d’imagerie a été optimisé afin de réduire les temps d’acquisition des séquences IRM, permettant une anesthésie totale plus brève (de la pose de la voie intraveineuse au réveil, environ 1h contre 1h30 lors de la précédente étude), tout en conservant une bonne qualité de détection des lésions en imagerie réhaussée. D’autre part, une administration d’anti-douleur sera mise en place avant toute intervention invasive afin d’assurer une bonne analgésie. L’administration d’anti-douleur pourra être renouvelée si l’état des animaux le nécessite. Lors des anesthésies générales, les muqueuses oculaires des animaux seront protégées par du gel oculaire pour prévenir de la déshydration. Un appareil de mesure de la respiration nous permettra de suivre la profondeur de l’anesthésie qui sera adaptée en fonction de la réponse de chaque animal. Afin de lutter contre une hypothermie éventuelle, une plaque thermostatée ou un circuit d’eau chaude thermostatée passant sous l’animal seront utilisés lors des anesthésies. Lors des phases de réveil, les animaux seront placés sous lampe rouge (chauffante). Pour le suivi clinique des animaux, une grille de scoring avec différents paliers sera mise en place. Au besoin, nous consulterons un vétérinaire et des mesures seront prises : système particulier d’alimentation ou d’hydratation, analgésie supplémentaire, traitement médicamenteux, etc. Enfin, par retour d’expérience, l’étude menée en interne en 2014 a montré qu’un suivi journalier rigoureux à l’aide de la grille de scoring minimisait fortement les dommages inhérents au modèle et que l’imagerie IRM permettait de détecter les lésions cérébrales avant que celles-ci n’engendrent une souffrance animale sévère ou un décès spontané.
Choix des espèces
Le modèle murin reste le plus utilisé dans la recherche en neurologie et cancérologie et largement reconnu pour apporter robustesse et prédictivité. Les grosses métastases observées chez la souris sont très comparables (tailles, vascularisation, localisation spatiale) à de petites métastases humaines. Sa faible taille remplit tous les critères d’accessibilité pour les administrations d’agents de contraste, taille suffisante pour les implantations tumorales et analyses robustes des images acquises en imagerie IRM. L’attraction importante des cellules pour le cerveau permet qu’aucune lésion tumorale ne soit observée dans d’autres organes. Ce modèle repose sur des souris immunodéficientes, c’est-à-dire qu’elles de possèdent pas ou peu de système immunitaire fonctionnel. Cela évite le rejet des cellules humaines implantées, ce qui est indispensable pour que ces cellules puissent survivre, proliférer et former des métastases dans l’animal et qui serait impossible avec un modèle de souris ayant une immunité classique. Les animaux seront adultes (au minimum âgés de 6 semaines) au moment de l’induction du modèle. En effet, la population d’étude visée est l’adulte.