Rongeurs

Neuf séances d'imagerie de quarante minutes chacune, sous anesthésie par injection intrapéritonéale, étalées sur huit semaines : 180 souris porteuses d'un glioblastome vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent une chirurgie d'induction de la tumeur, des injections d'agent de contraste dans la veine de la queue, et pour une partie d'entre elles une craniotomie avec extraction de la tumeur. Le résumé prévoit un affaiblissement transitoire, une perte de poids au fil des séances, un risque d'hypothermie et une embolie gazeuse pouvant tuer l'animal, et pour la lignée transgénique l'apparition d'un comportement épileptique après induction. Les effectifs concernés par la craniotomie, par l'excision et par la mise à mort hebdomadaire ne sont jamais chiffrés, le résumé s'en tenant à "un petit nombre d'animaux" et à "un petit groupe".

Objectifs

Le cancer du cerveau, et en particulier le glioblastome multiforme (GBM), représente un des cancers au pronostic le plus faible. Aujourd’hui, son pronostic est largement lié à la réussite de la chirurgie, qui est rendue difficile par la présence de multiples vaisseaux afférents à la tumeur et au risque d’hémorragie. Ce projet vise à étudier la vascularisation du GBM afin de proposer des outils pour la chirurgie, grâce à une technique d’imagerie faiblement invasive et peu chère qui pourrait être utilisée de manière longitudinale, et en particulier pendant la chirurgie. À terme, cela pourrait permettre d’augmenter drastiquement la survie des patients atteints de GBM. Ce projet repose sur une technique récente basée sur l’échographie : l’imagerie de microscopie de localisation ultrasonore (ULM) ou superrésolution. Cette permet d’imager avec une précision sans précédent les vaisseaux sanguins, ainsi que de mesurer le flux précisément à chaque endroit. L’objectif de ce projet est - De mieux comprendre le développement vasculaire du GBM - De proposer des biomarqueurs permettant d’identifier les vaisseaux tumoraux - D’identifier l’effet de la récidive tumorale sur la vascularisation post-chirurgie Le but à long terme est de pouvoir mieux comprendre la maladie, et proposer des outils permettant aux chirurgiens d’optimiser l’extraction de la tumeur, afin d’augmenter le taux de survie des patients.

Bénéfices attendus

Le GBM est une tumeur du cerveau difficile à traiter, notamment parce qu’il est souvent difficile de distinguer la tumeur des tissus sains pendant l’opération. Ce projet vise à développer une nouvelle méthode d’imagerie par ultrasons permettant aux chirurgiens de mieux comprendre et identifier la tumeur, en particulier en termes de ses vaisseaux sanguins. Cette technique pourrait aider à retirer la tumeur de façon plus précise, tout en limitant les risques d’hémorragie et de récidive. À terme, elle pourrait améliorer la prise en charge des patients et augmenter leurs chances de guérison.

Procédures

Les procédures réalisées dans ce projet impliquent des manipulations limitées et sont effectuées sous anesthésie. Une chirurgie d’induction sera réalisée pour chacun des deux modèles utilisés, sous anesthésie générale gazeuse et avec injection d’analgésique, une fois par animal. Pour les acquisitions hebdomadaires d’imagerie, l’anesthésie sera réalisée par injection intrapéritonéale, et durera environ 40min. Il s’agira de 9 séances maximum par animal sur 8 semaines, avec deux séances uniquement réalisées le même jour pour un petit groupe (pré et post-excision tumorale). Une injection intraveineuse continue sera réalisée au niveau de la queue de l’animal anesthésié. Il s’agit d’un agent de contraste utilisé en imagerie. Ces injections peuvent entraîner une gêne légère et transitoire liée à la manipulation et à l’injection. Dans le cas du modèle transgénique, une craniotomie puis l’extraction tumorale sera réalisée une fois par animal sur un petit nombre d'animaux, également sous anesthésie générale gazeuse avec analgésique. Des analgésiques et du glucose seront administrés par injections dans les jours suivant l’excision de la tumeur.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de ce projet. Le transport pour faire venir les animaux, le changement d’environnement et les manipulations répétées peuvent être source de stress pour les animaux, pouvant se traduire par des modifications de comportement. Les séances d’imagerie ainsi que les chirurgies nécessitent une anesthésie générale. Bien que maîtrisée, cette anesthésie peut entraîner : • un affaiblissement transitoire, • une perte de poids au fil des séances, • un risque de déshydratation, • ainsi qu’un risque d’hypothermie, en particulier lors d’anesthésies prolongées. Les chirurgies, ainsi que les injections intraveineuses répétées au niveau de la queue peuvent également entraîner : • des lésions locales, • un risque infectieux, • une hémorragie, • et une gêne pouvant affecter la mobilité de l’animal. Un risque exceptionnel mais grave d’embolie gazeuse existe en cas d’injection accidentelle d’air dans la circulation sanguine, pouvant entraîner la mort de l’animal. Le glioblastome étant une tumeur agressive, il peut induire : • une douleur liée au développement tumoral, • une altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité), • et des modifications du comportement (isolement, agressivité, diminution de la prise alimentaire ou hydrique). Enfin, dans le cas des souris transgéniques, un phénotype dommageable apparait après induction, avec la mise en place d’un comportement épileptique

Devenir

La plupart des animaux seront réutilisés chaque semaine pour imagerie, la procédure d’imagerie étant peu sévère et l’anesthésie limitée à 40min. Pour le modèle syngénique, un petit nombre d’animaux sera mis à mort à l’issue de la séance d’imagerie chaque semaine à partir de la semaine 4 après induction pour prélèvement et analyse histologique. Pour le second modèle, un petit groupe d’animaux sera mis à mort chaque semaine après l’imagerie prélèvement du cerveau à partir de la semaine 4 après induction, à l’exception du groupe de mise au point et du groupe pour lequel la tumeur sera excisée, qui seront mis à mort après l’imagerie de la semaine 9 après induction. Aucun animal ne sera gardé en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement de ces techniques d’imagerie, des méthodes alternatives à l’expérimentation animale sont utilisées autant que possible. Des modèles in vitro sont notamment mis en œuvre, tels que des gels (agar ou gélatine) dont les propriétés (rigidité, organisation interne) peuvent être contrôlées. Ces modèles permettent de tester et d’optimiser les techniques d’imagerie dans des conditions maîtrisées. Des simulations numériques peuvent également être utilisées dans certains cas. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas de représenter fidèlement : • l’organisation et le fonctionnement des vaisseaux sanguins, • les interactions entre la tumeur et les tissus environnants, • ni l’évolution dynamique de la tumeur dans le temps. Or, ces éléments sont essentiels pour répondre aux objectifs du projet, qui visent à caractériser les tumeurs dans des conditions proches de la réalité physiologique.

Réduction

Le projet est conçu de manière à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Nos protocoles d’imagerie ont été optimisés de manière exhaustive sur des modèles in-vitro afin de s’assurer de leur efficacité et limiter le nombre d’animaux utilisés inutilement. L’imagerie ultrasonore utilisée est peu invasive, ce qui permet de réaliser des mesures répétées chez les mêmes animaux au cours du temps. Cette approche longitudinale (une séance d’imagerie par semaine) permet de suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les groupes expérimentaux, et donc de réduire significativement le nombre total d’animaux, même si des animaux seront mis à mort à chaque stade tumoral pour référence histologique. Enfin, le nombre d’animaux prévu est volontairement estimé de manière prudente. Toutefois, une adaptation en cours d’étude sera mise en place : si les résultats obtenus sont suffisants avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, les expériences seront arrêtées de manière anticipée, permettant de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux sont acclimatés à leur environnement, manipulés de manière douce (tunnels, prise à la main) et hébergés en groupe dans des cages enrichies. Les souris développant des tumeurs font l’objet d’une surveillance régulière, avec des points limites définis entraînant l’arrêt de l’expérimentation si nécessaire. Les procédures sont réalisées sous anesthésie, avec maintien de la température corporelle et surveillance des paramètres physiologiques. Après les anesthésies les animaux bénéficient d’un réveil encadré en environnement chauffé et sont remis avec leurs congénères après récupération complète. Une évaluation régulière de l’animal est réalisée : administration de substances à effet analgésique si nécessaire, et mise à mort anticipée en cas de douleur ou détresse persistante ou importante. Une évaluation accrue est mise en place pour les animaux au phénotype dommageable après l’induction de ce phénotype, avec évaluation spécifique des conséquences de ce phénotype et points limites pour l’administration d’antalgiques ou la mise à mort précoce.

Choix des espèces

L’étude nécessite un modèle in vivo, car les caractéristiques des tumeurs (vascularisation et interactions avec les tissus environnants) ne peuvent être reproduites en dehors d’un organisme vivant. La souris est choisie comme modèle expérimental car elle permet : • la mise en œuvre de modèles tumoraux pertinents, incluant des tumeurs apparaissant dans un environnement physiologique, • la possibilité d’études longitudinales, • et l’utilisation de modèles génétiques bien caractérisés. Les modèles choisis sont particulièrement adaptés à l’étude du microenvironnement tumoral, qui est central dans ce projet. Par ailleurs, le laboratoire dispose d’une expertise solide sur l’imagerie du rongeur, et en particulier l’imagerie cérébrale. Les souris seront accueillies à l’âge adulte afin de limiter l’impact du développement cérébral sur le développement vasculaire observé.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, leur dos est épilé à la crème dépilatoire puis irrité par une série de collages et décollages de ruban adhésif, pendant une quinzaine de minutes, avant des injections de molécules et jusqu'à un prélèvement sanguin par semaine. L'inflammation cutanée ainsi provoquée entraîne des démangeaisons qui se traduisent par un grattage plus fréquent, et le résumé prévoit de surveiller l'apparition d'automutilation. La rubrique sur le remplacement décrit des cultures cellulaires et des peaux reconstruites déjà employées en amont, pour conclure qu'aucune méthode alternative validée ne reproduit l'ensemble des mécanismes recherchés.

Objectifs

L'inflammation cutanée est impliquée dans de nombreuses pathologies dermatologiques aiguës et chroniques. Malgré les progrès réalisés dans leur prise en charge, ces maladies restent responsables d'une morbidité importante et nécessitent le développement de nouvelles approches thérapeutiques capables de contrôler efficacement la réponse inflammatoire tout en favorisant la restauration de la fonction barrière de la peau. Le modèle d' « irritation de la peau » est un modèle expérimental reconnu permettant d'induire une altération contrôlée et reproductible de la barrière cutanée par l'application répétée d'un adhésif sur la peau. Cette procédure provoque une augmentation transitoire de la perméabilité épidermique et déclenche une réponse inflammatoire locale. Ce modèle reproduit plusieurs mécanismes physiopathologiques observés au cours des maladies inflammatoires cutanées associées à une altération de la fonction barrière. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'efficacité de molécules candidates susceptibles de moduler la réponse inflammatoire induite par l'altération de la barrière cutanée. Les effets des traitements seront évalués par des observations cliniques, des analyses histologiques, des dosages de molécules inflammatoires ainsi que par la caractérisation des populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire locale. Ce modèle permettra de déterminer si les molécules étudiées sont capables de limiter l'inflammation cutanée, d'accélérer la restauration de la barrière épidermique et de favoriser le retour à un état tissulaire normal. Les résultats obtenus contribueront à l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires de la peau. L'utilisation de ce modèle est justifiée par l'absence de méthodes alternatives permettant de reproduire l'ensemble des interactions complexes entre la barrière cutanée, les cellules immunitaires, les cellules résidentes de la peau et la circulation sanguine au sein d'un organisme vivant. Toutes les procédures expérimentales seront conçues conformément au principe des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de minimiser leur douleur, leur stress et leur inconfort.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse inflammatoire cutanée consécutive à une altération de la fonction barrière de la peau. Il contribuera à identifier les voies biologiques modulées par les molécules étudiées et à mieux caractériser leur mode d'action dans un contexte d'inflammation cutanée. Le modèle expérimental utilisé constitue un outil pertinent pour évaluer, dans un organisme vivant, l'efficacité de nouvelles molécules capables de limiter l'inflammation, de favoriser la restauration de la barrière cutanée et de promouvoir le retour à une peau normale. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les candidats thérapeutiques les plus prometteurs en vue de leur développement préclinique. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques destinées au traitement de maladies inflammatoires cutanées caractérisées par une altération de la barrière épidermique, telles que la dermatite atopique, les dermatites de contact ou d'autres affections inflammatoires de la peau. Les connaissances acquises pourront également améliorer la compréhension des mécanismes de résolution de l'inflammation et être utiles au développement de traitements ciblant d'autres pathologies inflammatoires. Enfin, les données générées permettront d'enrichir les connaissances fondamentales sur les interactions entre la barrière cutanée, les cellules et pourront servir de base à de futurs projets de recherche visant à développer des approches thérapeutiques plus efficaces et mieux ciblées.

Procédures

Au cours des expérimentations les animaux subiront une épilation avec une crème dépilatoire suivi d'une irritaion de la peau grace à une serie de collage et decollage de ruban adhésif, tout ceci sous anesthésie durant une quinzaine de minutes. Les animaux subiront des injections de substance. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.

Impact sur les animaux

L'irritation de la peau induit une altération localisée et transitoire de la barrière cutanée. Cette procédure entraîne le développement d'une réaction inflammatoire locale. Les animaux peuvent présenter un inconfort modéré ainsi qu'un prurit pouvant se traduire par un toilettage ou un grattage plus fréquent de la zone concernée. Les administrations des molécules expérimentales pourront entraîner un stress transitoire lié à la contention ainsi qu'une gêne ponctuelle au site d'administration, en fonction de la voie utilisée (application cutanée, injection ou gavage). Les prélèvements biologiques, lorsqu'ils sont réalisés sur animal vivant, pourront provoquer un inconfort bref et limité. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique régulière comprenant l'évaluation de l'état général, du comportement, du poids corporel et de l'évolution des lésions cutanées. Une attention particulière sera portée à l'apparition de signes d'inconfort, d'automutilation ou de lésions cutanées excessives. En cas d'aggravation des lésions ou d'altération de l'état général répondant aux critères d'arrêt définis dans le protocole, l'animal sera retiré de l'étude et euthanasié selon les procédures réglementaires. Compte tenu du caractère localisé et réversible de l'inflammation induite ainsi que des mesures de surveillance et de raffinement mises en œuvre, les nuisances attendues sont limitées dans le temps et compatibles avec une procédure de gravité modérée.

Devenir

A l'issu de la procédure c'est à dire entre 2 et 10 jours après l'induction de la pathologie, tous les animaux seront mis à mort. Après vérification du décès des animaux (coeur non battant), certains organes tels que la rate, les ganglions et la peau lésée seront prélevés afin de réaliser des études complémentaires et définir les mécanismes cellulaires mis en jeu.

Remplacement

Le projet s'inscrit dans une démarche visant à appliquer le principe de Remplacement en recourant aux méthodes alternatives chaque fois qu'elles permettent de répondre aux objectifs scientifiques. En amont des expérimentations in vivo, les molécules candidates sont sélectionnées et caractérisées à l'aide d'approches in vitro, notamment sur des cultures cellulaires et, lorsque cela est pertinent, sur des modèles reconstruits de peau. Ces modèles permettent d'évaluer leur cytotoxicité, leurs effets sur certaines voies de signalisation inflammatoires et leurs propriétés biologiques. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les différentes cellules de la peau, les cellules immunitaires circulantes, le système lymphatique et la circulation sanguine. Elles ne permettent pas non plus d'étudier le recrutement des cellules immunitaires, la dynamique de la réponse inflammatoire, la restauration de la barrière cutanée ni les effets pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des molécules administrées. À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative validée permettant de reproduire l'ensemble de ces mécanismes physiologiques dans un système non animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet sera limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse et la validité statistique des résultats. Les effectifs par groupe expérimental seront déterminés sur la base de l'expérience acquise par l'équipe avec ce type de modèle, des données de la littérature et, lorsque cela est possible, de calculs de puissance statistique prenant en compte la variabilité des paramètres étudiés. Le modèle d'irritation de la peau est un modèle reproductible, permettant de limiter la variabilité expérimentale et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour mettre en évidence un effet biologique des traitements évalués. La randomisation des animaux entre les groupes expérimentaux et l'utilisation de protocoles standardisés contribueront également à améliorer la qualité des données obtenues. Plusieurs paramètres (évaluation clinique, analyses histologiques, dosages de biomarqueurs et analyses immunologiques ou moléculaires) seront mesurés à partir des mêmes animaux, afin de maximiser les informations obtenues pour chaque individu et d'éviter la constitution de cohortes supplémentaires. Lorsque cela sera scientifiquement justifié, des groupes témoins communs seront utilisés entre différentes séries expérimentales réalisées dans des conditions identiques, afin d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Les expériences seront planifiées de manière à limiter les répétitions inutiles et seules les molécules ayant démontré un potentiel lors des études préalables seront évaluées in vivo. L'ensemble de ces mesures permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés tout en assurant la qualité scientifique et la reproductibilité des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages stériles avec de la nourriture de la litière et de l’eau stérile dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec un enrichissement du milieu adapté à leurs besoins physiologiques et comportementaux (matériel de nidification, abri et objets d'enrichissement). Une période d'acclimatation d'au moins une semaine sera respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié au changement d'environnement. Les animaux seront manipulés par un personnel formé et compétent, selon des techniques visant à réduire le stress associé à la contention. Les procédures expérimentales seront réalisées dans un environnement calme et selon des protocoles standardisés afin de limiter leur durée et leur variabilité. L'altération de la barrière cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane et limitée à une zone restreinte du dos et réalisée selon une procédure reproductible, en utilisant le nombre minimal de tape strips nécessaire pour obtenir le niveau d'inflammation recherché. Les traitements administrés respecteront les volumes maximaux recommandés et les bonnes pratiques d'expérimentation animale. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique régulière tout au long de l'étude. Seront notamment évalués l'état général, le comportement, le poids corporel, l'aspect du pelage ainsi que l'évolution des lésions cutanées (érythème, desquamation, œdème). Une attention particulière sera portée aux signes de prurit important, de grattage excessif ou d'automutilation. Tout animal présentant une altération importante de son état général, une perte de poids supérieure aux seuils définis dans le protocole, des lésions cutanées sévères, des signes de douleur ou de détresse persistants, ou toute autre atteinte incompatible avec la poursuite de l'étude, sera retiré de l'expérimentation et mis à mort selon une méthode réglementaire. Les expérimentateurs seront formés à la reconnaissance des signes précoces de douleur et de mal-être afin d'assurer une prise en charge rapide des animaux. L'ensemble de ces mesures de raffinement permettra de limiter les nuisances induites par les procédures expérimentales tout en garantissant l'obtention de données scientifiques de qualité.

Choix des espèces

La souris est le modèle expérimental de référence pour l'étude des mécanismes de l'inflammation cutanée et l'évaluation préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son système immunitaire est largement caractérisé et présente de nombreuses similitudes fonctionnelles avec celui de l'Homme, permettant l'étude des interactions complexes entre les cellules immunitaires et les cellules résidentes de la peau au cours de la réponse inflammatoire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris jeunes adultes, âgées de 6 à 12 semaines au début de la procédure expérimentale. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature et la structure de la peau est stabilisée, permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après altération de la barrière cutanée. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés.

Une amputation de la phalange distale dans les huit premiers jours de vie, pratiquée sur toutes les souris pour les identifier et les génotyper, ouvre le protocole. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposées à des sons de deux heures et pouvant aller jusqu'à huit heures, puis suivies par des séances d'audition d'une heure toutes les une à deux semaines, une partie subissant en plus une chirurgie d'une heure suivie de deux heures de mesures. L'objet est de mesurer ce que le bruit abîme dans le système auditif et ses relais cérébraux, chez des souris dont beaucoup portent des mutations de gènes de surdité. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés", et que leurs corps servent ensuite, quand c'est possible, à des entraînements à la dissection au sein du centre de recherche.

Objectifs

Objectif : Etudier les conséquences d’un son d’intensité moyenne à forte et ce dans la durée sur les réseaux neuronaux auditifs et la santé des individus. LE SYSTEME AUDITIF Le système auditif humain comprend l’oreille externe, l’oreille moyenne, l’oreille interne, ainsi que les centres neuronaux de traitement des stimuli auditifs. La cochlée comporte l’organe de Corti, qui abrite les cellules sensorielles, dites cellules ciliées. Il repose sur une membrane basilaire, qui contribue à l’analyse fréquentielle du son. Il y a quelques 14 000 cellules ciliées chez l’homme. Sous l’effet de la stimulation sonore, leur dépolarisation conduit à la libération de neurotransmetteur. Au total, ces 30 000 neurones chez l’homme forment le nerf auditif, qui lie la cochlée au noyau cochléaire, premier relais auditif du cerveau. Ensuite, l’information chemine à travers les divers autres noyaux du cerveau jusqu’au centre auditif. LE BRUIT ENVIRONNEMENTAL L’exposition à un bruit excessif est la première cause environnementale de troubles de l’audition. La surexposition sonore dans les mégapoles dont la densité de population ne cesse de croître ainsi que dans de nombreuses activités de loisirs pour lesquelles l’exposition sonore est peu ou mal contrôlée constitue une menace grandissante pour l’audition à l’échelle planétaire. Les conséquences au niveau central, aussi bien du point de vue des réseaux neuronaux que du point de vue des performances de l’individu dans des tâches auditives sont en outre peu étudiées. A un niveau plus intégratif encore, les conséquences du bruit sur la santé des individus et leurs interactions sociales restent également un sujet de recherche actif. Des résultats suggèrent en outre que les lésions cochléaires dues à une surexposition au bruit sont à l’origine d’une exacerbation de la progression de la perte auditive liée à l'âge (presbyacousie).

Bénéfices attendus

En caractérisant les atteintes auditives liées à la surexposition sonore et également dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : - Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les modèles porteurs des mutations des gènes étudiées. - Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à des expositions sonores répétées d’intensités moyennes. - Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients exposés ou porteurs de mutations spécifiques dans des gènes de surdité en testant de nouvelles molécules aux effets protecteurs face à une exposition traumatique sonore.

Procédures

Les interventions seront : - Un prélèvement de phalange sera effectué sur tous les animaux pour l’identification des souris, dans les 8 premiers jours de vie du projet afin de déterminer s’ils sont porteurs ou non de mutations du gène étudié et pour pouvoir commencer les expérimentations à partir du stade P12. Cette procédure dure une dizaine de secondes. Les prélèvements seront utilisés pour le génotypage. De plus cela permettra de constituer les cohortes avant le sevrage et de ne pas maintenir en vie des animaux non nécessaires à la reproduction ou aux expérimentations. Pour les expérimentations sur l’adulte, les animaux seront identifiés soit par prélèvement auriculaire soit par une puce implantée en sous-cutané. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de de l’exposition sonore et dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu à la suite de l’exposition et au cours du temps, approximativement toutes les unes à deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par le bruit. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie soit terminale soit pour permettre des enregistrements électrophysiologiques sur l’animal éveillé ensuite. Chaque chirurgie aura une durée de 1h et suivi de 2h de mesures fonctionnelles.

Impact sur les animaux

La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou modérées ou une succession d’expérimentations légères. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner des nuisances : - L'identification se fait par amputation de la phalange distale dans les 8 premiers jours de vie, douleur au moment de l’amputation. - Certaines expositions sonores d’une durée de 2h et pouvant aller jusqu’à 8h pourraient induire un stress temporaire sur l’animal, n’excédant pas quelques heures. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. - En ce qui concerne les chirurgies : Si celles-ci sont terminales, un protocole de médication antidouleur sera appliqué à l’animal en début de procédure. Pour les chirurgies de préparation aux enregistrements neuronaux sur animal éveillé, la douleur et l’inconfort modérée seront contrôlés par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant impossible leur réutilisation par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

La réduction a pour objectif d’utiliser le nombre suffisant d’animaux pour avoir des résultats scientifiques significatifs. Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons des tests classiques pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous appliquons plusieurs mesures sur le même animal dès que possible.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des chirurgies, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Un renforcement des enrichissements (igloo, coton, tunnel, roue…) est utilisé dans les cages d’hébergements. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratations sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel nutritif ou de croquettes mouillées. Plusieurs points limites spécifiques et précoces pendant la chirurgie (hémorragies, baisse des constantes vitales etc…), post-chirurgie (infections, douleurs persistantes) ou post-stimulation sonore basés sur une grille de scorage incluant aspect extérieur, activité de déplacement, capacité à boire et s’alimenter, réactivité à la préhension, isolement du groupe, sont établis pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de P10-P12. Le projet impliquera principalement donc des animaux âgés d’au moins P10 afin de pouvoir étudier les effets du bruit sur le système auditif au cours de la vie de l’animal.

Jusqu'à quatorze injections dans l'abdomen par animal, pratiquées sur souris vigiles à raison d'une toutes les deux semaines, plus jusqu'à quatre prélèvements sanguins : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le résumé qualifie ces gestes de "stress transitoire" et de "douleurs légères à modérées", tout en indiquant que certains composés injectés peuvent altérer le comportement de l'animal. Les souris dont la réponse immunitaire est jugée la meilleure sont tuées les premières pour prélever les organes produisant les anticorps, les autres restant en hébergement quatre à huit semaines et pouvant recevoir un nouveau cycle de vaccination avant leurs propres "prélèvements terminaux". Ce maintien en vie assorti d'une seconde immunisation figure dans la rubrique consacrée à la réduction des effectifs.

Objectifs

Les anticorps sont des protéines sécrétées par des cellules spécialisées du système immunitaire qui s’attachent aux substances étrangères au corps (bactéries, virus), appelées antigènes, afin de les neutraliser dans le but d'être évacuées ou détruites par d’autres composants du système immunitaire. Ces antigènes sont gardés en mémoire par le système immunitaire, permettant de réagir plus rapidement en cas de nouvelle exposition. Depuis les années 1980, le développement d'anticorps a profondément amélioré les traitements thérapeutiques dans de nombreuses pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Les premiers anticorps utilisés en médecine étaient produits chez la souris et pouvaient provoquer des effets secondaires importants mais ils étaient précurseurs d'une révolution dans les soins. Grâce aux progrès des biotechnologies et du génie génétique, il est aujourd’hui possible de développer des anticorps modifiés de plus en plus proches des anticorps humains, ce qui réduit fortement les effets indésirables. Plus d’une centaine d’anticorps thérapeutiques sont désormais utilisés en médecine et de nombreux autres sont en cours de développement. Malgré ces avancées, le développement de nouveaux anticorps reste long et complexe. L’une des principales difficultés est le délai entre l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique potentielle par les laboratoires publics ou privés et la possibilité de tester cette cible en clinique. Ce projet s’inscrit dans la première étape de découverte des anticorps à visée thérapeutique et vise à accélérer la découverte et la sélection de nouveaux anticorps thérapeutiques avant leur évaluation dans des études précliniques.

Bénéfices attendus

Le projet faisant l’objet de cette demande permettra la découverte et l’obtention rapide d’un panel de nouveaux anticorps d’intérêt thérapeutique notamment dans le cancer et les maladies inflammatoires.

Procédures

- Des injections dans l’abdomen réalisées sur animaux vigiles en 2 min maximum/animal à une fréquence d’une injection toutes les 2 semaines durant 6 à 8 semaines. Toutes les souris du projet seront concernées. Nous envisageons que cela correspondrait à 1500 animaux. En fonction de la stimulation du système immunitaire, des injections supplémentaires peuvent être nécessaires suivant la même procédure. - Des injections en intraveineuse réalisées à l’ animal en 2 à 4 min sous anesthésie. Nous évaluons que cela correspondrait entre 150 et 300 animaux. - Des prélèvements sanguins sont réalisés sur animaux vigiles à une fréquence de toutes les 2 semaines (6 jours après chaque injection dans l’abdomen à partir de la deuxième injection). Cette opération est réalisée en 2-3 min maximum/animal. Toutes les souris du projet seront concernées, soit 1500 animaux au maximum.

Impact sur les animaux

Suite aux procédures que nous réalisons dans ce projet, les animaux peuvent subir : - du stress transitoire lié à la contention nécessaire à la réalisation des injections (de 4 jusqu’à 14 injections par animal) et des prélèvements sanguins (jusqu’à 4 prélèvements par animal maximum). - des douleurs légères à modérées dues au mode d’injection et à l’injection de certains composés pouvant altérer le comportement de l’animal.

Devenir

Les animaux présentant les meilleurs résultats seront choisis pour réaliser les étapes finales de la procédure. Seuls les animaux sélectionnés seront euthanasiés afin de prélever les organes produisant les anticorps et réaliser les étapes suivantes de recherches d'anticorps. Les animaux restants seront gardés et surveillés en hébergement durant 4 ou 8 semaines supplémentaires jusqu’à obtenir les résultats à partir des premiers animaux. Si les premiers résultats ne permettent pas d’identifier des anticorps d’intérêts, les animaux conservés pourront recevoir un nouveau cycle de vaccination, dans le but de renforcer la réponse immunitaire avant la réalisation des prélèvements terminaux. Si les résultats de séquençage sont concluants, les animaux seront euthanasiés dès que possible.

Remplacement

L’utilisation des animaux reste indispensable pour développer de nouveaux anticorps thérapeutiques. En effet, aucun autre modèle biologique ou chimique ne permet actuellement de produire des molécules de structure aussi complexe et variée. Les biotechnologies ne permettent pas de mimer ou reproduire totalement la réponse "anticorps" du système immunitaire rendant l’utilisation d’animaux encore indispensables pour la découverte de nouveaux anticorps comme de potentiels médicaments en immunothérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque expérience sera déterminé à partir des données scientifiques disponibles concernant la cible d’intérêt thérapeutique afin d’évaluer la complexité de la cible et la nécessité d’effectuer plusieurs stratégies de vaccination. Toutes les procédures expérimentales seront recensées numériquement permettant une traçabilité et un suivi des expériences menées. Ce suivi comprendra notamment les souris utilisées, les antigènes testés, les résultats obtenus et leurs interprétations ainsi que toute observation ou information pouvant être utile par la suite. Une attention particulière sera portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Ainsi, les souris non sélectionnées pour les étapes finales du protocole (prélèvement d'organes) seront conservées. Si les premiers résultats ne permettent pas d’identifier des anticorps d’intérêts, les animaux conservés pourront recevoir un nouveau cycle de vaccination, dans le but de renforcer la réponse immunitaire avant la réalisation des prélèvements terminaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (mini-dôme en cellulose et lanières en papier kraft pour former des nids), maintien des animaux en groupes de 3 à 4 afin d’éviter l’isolement et une période d’acclimatation de 7 jours est respectée systématiquement avant les manipulations. Afin d'atténuer la douleur chez l'animal, nous avons recours à l'anesthésie gazeuse lors de certains gestes techniques. Durant toute la durée d'une expérience, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement pour s’assurer : des conditions adéquates de stabulation (paramètres environnementaux, litière, alimentation, boisson) et de l’état de santé des animaux (comportement, aspect physique), pesée 2 fois par semaine en temps normal et quotidiennement en cas d’apparition de signes importants de douleur chez l’une des souris du protocole. Si un état persistant de douleur durant plus de 2 jours été observé, l’animal sera euthanasié. Les animaux euthanasiés de manière anticipée après atteinte d'un point limite ne feront pas l'objet de prélèvements, leur état clinique pouvant compromettre la qualité des tissus et des cellules recherchés.

Choix des espèces

La souris reste l’animal le plus utilisé pour le développement d’anticorps à visée thérapeutique, car le génome de la souris est proche de l’homme à 95%. Le développement d’anticorps thérapeutiques par modification génétique est basé sur des anticorps d’origine murine. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation. Pour les modèles génétiquement modifiés difficiles à générer, une tolérance de 8-12 semaines sera admise. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation. Pour les modèles transgéniques ou KO difficiles à générer, une tolérance de 8-12 semaines sera admise.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection sous anesthésie générale puis dix injections sur animal vigile, et celles portant la tumeur TC-1 quatorze anesthésies générales de plus pour le suivi par imagerie, la croissance tumorale et l'immunothérapie pouvant entraîner une perte d'appétit et de poids. L'objet est de reproduire par une combinaison d'anticorps les signaux qu'émettent les cellules tumorales mourantes, afin de renforcer une immunothérapie déjà employée en clinique. Les retombées annoncées contre le cancer du poumon sont placées à long terme, quand le porteur affirme dans le même résumé qu'aucune technologie ne permet de reconstruire un système immunitaire fonctionnel hors de l'animal, et que le recours à "un organisme complet fonctionnel (la souris)" est "indispensable".

Objectifs

Certaines thérapies anticancéreuses induisent une mort cellulaire immunogène (immunogenic cell death, ICD), une forme de mort cellulaire régulée capable de déclencher une réponse immunitaire antitumorale durable grâce à l’émission coordonnée de signaux de danger (damage-associated molecular patterns, DAMPs. Nous avons démontré, dans un projet précédent, qu’une reconstitution de ces signaux de danger grâce à des lignées cellulaires génétiquement modifiées est suffisante pour induire une mémoire immunitaire durable et renforcer la sensibilité des tumeurs au blocage du point de contrôle immunitaire PD-1. Fort de ces résultats mécanistiques, nous développerons une stratégie thérapeutique visant à reproduire pharmacologiquement les fonctions immunostimulatrices de ces signaux. Nous évaluerons une combinaison d’anticorps monoclonaux anti-CD47 et anti-CD39 associée à un agoniste de HMGB1 (RS-09) afin de reproduire in vivo les principales conséquences immunologiques induites par les DAMPs. Cette approche sera systématiquement combinée au blocage du point de contrôle immunitaire PD-1, dans un contexte thérapeutique directement compatible avec la pratique clinique et présentant ainsi un potentiel translationnel nettement supérieur à celui d’approches reposant sur des cellules tumorales génétiquement modifiées (projet précédent). Démontrer l’efficacité de cette combinaison sur la croissance tumorale constituera ainsi une validation préclinique robuste de notre stratégie thérapeutique.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace avec l’utilisation de combinaison d’anticorps et d’agoniste. Nous pourrons mettre aussi en évidence que cette stratégie sera possiblement applicable contre plusieurs types de cancer. À long terme, cela permettra le développement de nouvelles immunothérapies combinatoires contre le cancer du poumon, plus adaptées aux patients et beaucoup mieux tolérées.

Procédures

Les souris seront manipulées régulièrement (

Impact sur les animaux

Diverses procédures (immobilisations et injections) peuvent provoquer du stress chez l'animal et une légère douleur transitoire au point d'injection. La croissance tumorale et l'immunothérapie peuvent entraîner une perte d'appétit modérée, qui peut à son tour entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est indispensable car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements par l'activation du système immunitaire. De nos jours, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo ou in silico à cause de la limite des technologies actuelles. Il n’y a, en effet, aucune technologie existante qui le permette. C’est pourquoi le recours à un projet sur un organisme complet fonctionnel (la souris) est indispensable.

Réduction

Une analyse statistique a été réalisée pour calculer le nombre d'animaux requis. Plusieurs paramètres seront suivis sur chaque animal (croissance tumorale, survie) et plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) afin d'extraire un maximum de données pour cette expérience. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Nous avons établi une grille de score regroupant les critères relatifs au bien-être de l’animal, elle sera utilisée tout au long du projet, les points limites précoces y ont été définis et seront strictement appliqués. Par ailleurs, des mesures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme et disposant de nids et de tunnels en carton. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou non selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Les points d’injections pour les traitements seront alternés d’une fois à l’autre.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons: - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - La souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 semaines pour s'assurer que l'organisme a terminé son processus de développement et que le système immunitaire est pleinement fonctionnel.

L'objet de ce projet est d'amplifier chez des souris une lignée de cellules tumorales humaines qui ne prolifère pas en culture, sans qu'aucun traitement y soit évalué. 50 souris immunodéprimées NSG vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection de cellules de lymphome T angioimmunoblastique sous anesthésie, puis jusqu'à dix prélèvements sanguins rétro-orbitaires hebdomadaires, pendant un à trois mois, jusqu'à ce que la tumeur atteigne "le maximum tolérable". La rubrique consacrée à la réduction ne justifie que 6 souris, et le résumé n'explique nulle part d'où viennent les 44 autres.

Objectifs

Le système CRISPR/Cas9 est dérivé du système immunitaire bactérien. Il repose sur l’utilisation d’une nucléase Cas9 associée à un ARN guide (ARNsg) complémentaire d’une séquence cible de 20 nucléotides, permettant d’induire des cassures double brin dans l’ADN et ainsi d’inactiver spécifiquement le gène ciblé. Cette technologie peut être appliquée à l’échelle du génome entier dans le cadre de criblages CRISPR, permettant l’étude fonctionnelle systématique des gènes. Les criblages CRISPR constituent aujourd’hui un outil majeur pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, les modèles actuellement utilisés reposent principalement sur des lignées cellulaires établies, qui reproduisent imparfaitement la complexité biologique des tumeurs humaines et ne sont pas disponibles pour certaines entités tumorales. Notre projet porte sur le lymphome T angioimmunoblastique, qui représente l’une des formes les plus fréquentes de lymphome T périphérique. Cette pathologie correspond à une prolifération maligne de lymphocytes T et demeure associée à un pronostic défavorable, avec une survie globale à 5 ans d’environ 70 %. Les options thérapeutiques restent limitées, notamment en raison de l’absence de modèles expérimentaux adaptés et de lignées cellulaires disponibles pour cette pathologie. Afin de contourner ces limitations, nous utiliserons des modèles de xénogreffes dérivées de patients (Patient-Derived Xenografts, PDX), consistant en la transplantation sériée de cellules tumorales humaines chez des souris immunodéprimées. Les cellules tumorales seront modifiées génétiquement afin d’exprimer la nucléase Cas9 ainsi que des ARNsg. Ces cellules ne pouvant pas être amplifiées efficacement in vitro, leur passage chez la souris est indispensable pour assurer leur expansion. L’objectif du projet est donc d’amplifier une lignée de PDX de lymphome T angioimmunoblastique exprimant la Cas9 afin de disposer, à terme, d’un modèle compatible avec la réalisation de criblages CRISPR in vivo. Ces travaux pourraient permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et contribuer au développement de stratégies visant à améliorer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’amplifier une lignée de xénogreffe dérivée de patient (PDX) de lymphome T angioimmunoblastique exprimant la nucléase Cas9 et des ARN guides (ARNsg). Ce modèle présente un intérêt particulier en raison de l’absence actuelle de lignées cellulaires disponibles pour cette pathologie. À terme, ce modèle pourra être utilisé pour la réalisation de criblages CRISPR in vivo visant à identifier des gènes impliqués dans la progression tumorale, ainsi que des gènes suppresseurs de tumeur. Ces travaux pourraient ainsi conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans le lymphome T angioimmunoblastique.

Procédures

Après une période d’acclimatation, les souris recevront une injection unique de cellules tumorales par voie sous-cutanée (J0), réalisée sous anesthésie générale à l'isoflurane, ce qui provoquera le développement d’un lymphome. L'injection dure moins d'une minute et la durée totale de la manipulation, incluant l'induction anesthésique et le réveil, est d'environ 3 à 5 minutes. À partir de deux semaines après l'injection (J14), des prélèvements sanguins rétro-orbitaires seront réalisés une fois par semaine sous anesthésie générale de courte durée et ajout d’un collyre analgésique à base de tétracaïne, afin de suivre la progression de la maladie. Chaque prélèvement dure moins d'une minute et la durée totale de la manipulation, anesthésie comprise, est d'environ 3 à 5 minutes. Les animaux seront suivis pendant une durée comprise entre 1 et 3 mois, selon la cinétique de développement tumoral. Chaque animal fera l’objet d’un maximum de 10 prélèvements sanguins de 40µl avant sa mise à mort. Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale lorsque les critères d'arrêt de l'étude ou les points limites seront atteints (Annexe). La mise à mort sera réalisée conformément à la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Nous allons injecter des cellules tumorales soit par voie sous cutanée soit par voie intrapéritonéale sur des souris endormies ce qui provoquera une douleur légère aux souris. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang quand les souris seront endormies. Cela leur provoquera une douleur modérée. Nous prélèverons du sang toutes les semaines pour suivre l'évolution des cellules tumorales. Nous sacrifierons les souris sous anesthésie par dislocation cervicale, cela ne leur provoquera donc pas de douleur.

Devenir

Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral atteindra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines (durée la plus couramment publiée) puis mises à mort pour analyse.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle de culture cellulaire adapté au lymphome T angioimmunoblastique. Cette pathologie présente des caractéristiques biologiques complexes et hétérogènes qui rendent difficile le développement de modèles in vitro représentatifs. L’absence de lignées cellulaires limite l’étude des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ainsi que l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Par ailleurs, les cellules issues des modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) de lymphome T angioimmunoblastique ne prolifèrent pas en conditions in vitro. Il est donc nécessaire de recourir à un modèle animal afin d’assurer leur amplification et le maintien du modèle tumoral. Les souris immunodéprimées, notamment les modèles NOD/SCID ou NSG, présentent une déficience en cellules immunitaires (cellules T, B, et NK pour les NSG) permettant l’implantation et la croissance de cellules tumorales humaines. Ces modèles reproduisent de manière fidèle les caractéristiques biologiques et moléculaires du lymphome T angioimmunoblastique humain et constituent ainsi un outil pertinent pour l’étude de cette pathologie. Enfin, l’utilisation de ce modèle est indispensable pour le développement ultérieur de criblages CRISPR in vivo visant à identifier des gènes impliqués dans la progression tumorale ou des gènes suppresseurs de tumeur, dans l’objectif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En résumé, le recours à la souris est nécessaire pour permettre l’amplification stable d’une lignée PDX de lymphome T angioimmunoblastique exprimant la nucléase Cas9 et des ARN guides (ARNsg), en l’absence d’alternative in vitro adaptée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé sur la base d’un taux de prise de greffe d’environ 50 %, observé dans les modèles PDX de lymphomes T, de la variabilité du rendement de transduction lentivirale des cellules tumorales, des pertes cellulaires associées aux manipulations ex vivo, ainsi que de la nécessité d’obtenir une quantité suffisante de cellules tumorales exprimant de manière stable la nucléase Cas9 et les ARN guides (ARNsg) pour permettre l’amplification du modèle. L’objectif étant d’obtenir un à deux modèles PDX exploitables exprimant de manière stable la Cas9 et les ARNsg, 6 souris seront utilisées afin de tenir compte des échecs de prise de greffe et des pertes expérimentales potentielles, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés conformément au principe de réduction des 3R.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (prélèvement sanguin et transplantation). Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur (Annexe 2). Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si des signes cliniques apparaissaient, les animaux seront mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement est enrichi par des dômes en carton et/ou du coton.

Choix des espèces

En l’absence de modèles in vitro adaptés au lymphome T angioimmunoblastique, le recours à un modèle animal est nécessaire pour l’étude de cette pathologie. Le modèle murin est actuellement le modèle de référence le plus largement utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude des lymphomes humains, notamment dans le cadre des modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX). Les souris immunodéprimées de type NSG (NOD scid gamma) présentent une déficience sévère du système immunitaire, incluant l’absence de lymphocytes T, de lymphocytes B et de cellules NK. Cette immunodéficience permet l’implantation et le maintien de cellules tumorales humaines tout en limitant les phénomènes de rejet de greffe. Ces modèles reproduisent de manière pertinente les caractéristiques biologiques et moléculaires du lymphome T angioimmunoblastique humain et constituent ainsi un outil expérimental adapté pour l’amplification des cellules tumorales modifiées génétiquement ainsi que pour le développement futur de criblages CRISPR in vivo. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome T angioimmunoblastique dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte.