Rongeurs

Un caillot de sang injecté dans la carotide interne, par une chirurgie du cou de trente minutes, provoque l'AVC chez 413 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Suivent deux passages à l'IRM sous anesthésie générale, à J+1 et J+7, et des tests comportementaux que le résumé nomme, le neuroscore et le corner test, répétés à J1, J3 et J7. Les déficits attendus, pertes d'équilibre, faiblesse musculaire du côté opposé à la lésion, difficultés à manger, boire et interagir dans les premiers jours, sont présentés comme ce qui rend justement ces tests possibles. Le porteur justifie le choix du rat par les homologies vasculaires avec l'humain, mais aussi par "le coût relativement bas" et "la logistique aisée" de l'élevage, avant de conclure que leur utilisation "devient incontournable".

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est pathologie cérébrale causée par un caillot sanguin qui bloque une artère dans le cerveau. Actuellement, le traitement principal consiste à administrer un médicament appelé activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour dissoudre le caillot, parfois associé à une intervention chirurgicale appelée thrombectomie. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces et peuvent avoir des effets secondaires graves, limitant leur utilisation à moins de 10% des patients. De plus, l'efficacité du tPA peut varier en fonction de la nature du caillot et de l’origine de la maladie. Pour améliorer la prise en charge des patients à long terme, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet vise à étudier chez le rongeur différentes façons d'administrer des médicaments pour voir comment ils affectent les dommages cérébraux, les saignements dans le cerveau et la récupération après un AVC. Nous utiliserons un modèle d'AVC chez le rat, largement utilisé en recherche. Cela nous permettra d'étudier comment différents traitements pourraient aider les rats à se remettre après un AVC, ce qui pourrait avoir des implications importantes pour le traitement des patients victimes d'AVC. Ce projet sera réalisé sur deux sites, avec un site pour la réalisation des chirurgies et l’évaluation comportementale et un site pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Se déroulera à J-1 un prélèvement de sanguin sur tous les animaux vigiles au niveau de la veine caudale. Ce prélèvement ne prendra pas plus de 5 minutes. Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter un caillot de sang dans la carotide interne provoquant ainsi un AVC. Une fibre doppler sera positionnée sur la tête afin de valider l’AVC. Cet acte chirugical durera 30 minutes, AVC + pose de la fibre. A J+1 et J+7, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 minutes. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 3 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J3 et J7. Nous comptons un total de 15 minutes pour la prise du neuroscore et moins de 10 minutes pour le corner test. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une anesthésie léthale. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes, comprenant la récupération de tissu post-mortem.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir des déficits sensorimoteurs dus aux lésions cérébrales de certaines parties du cerveau. Ces déficits sont visibles chez l'animal à court et moyen terme, ce qui nous permet d'effectuer des tests comportementaux et de tirer des conclusions pertinentes. Après un AVC, les animaux peuvent présenter des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres du côté opposé à la lésion cérébrale. Dasn les premiers jours suivant l'AVC, ils peuvent également rencontrer des difficultés à manger, à boire et à intéragir avec leur environnement, nécessitant une surveillance particulière.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font des rats le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Pour l’étape de mise au point, nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire pour cette étape de mise au point, a été calculé selon l’expérience de l’expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes) désigné pour réaliser ces gestes chirurgicaux. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 15 par groupe dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux, l’augmentation de l’effectif à 20 par groupe expérimentaux est prévu mais non obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 15 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages conformes à la Directive, isolées des nuisances sonores, avec enrichissements, nourriture et eau ad libitum. Les rats sont maintenus à 2 par cage. Le bien-être est suivi deux fois par jour en semaine et quotidiennement les week-ends et jours fériés par du personnel qualifié. Lors des chirurgies, les animaux sont anesthésiés avec analgésie pour soulager la douleur. La température corporelle des rats sera maintenue stable pendant la chirurgie. Le site opératoire est tondu, désinfecté et reçoit une application d'anesthésiant local. Les sutures seront faites par points séparés afin de limiter le risque de déhiscence. Au réveil, les animaux sont placés en cage individuelle chauffée, puis remis en cage avec alimentation facilitée et gel nutritif. La surveillance est continue et renforcée en post-opératoire immédiat. Les points limites sont définis ; en cas de dépassement, ils seront mis à mort. Un suivi strict est assuré les jours suivants (pesée, état général). Le transport entre établissements s’effectue dans les cages d’origine, sur chariot, via un passage souterrain sans exposition extérieure, avec maîtrise des vibrations. À l’arrivée, une période de repos d’1 h est respectée avant toute manipulation.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font des rats un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation des rats devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 6 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 275 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles dèjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Une injection de streptozotocine détruit les cellules du pancréas et provoque une hypoglycémie sévère, dont le porteur attend 10 à 15 % de mortalité. 1 700 souris et 1 700 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour récupérer leurs tissus et leur sang. Devenus diabétiques et amaigris, ils subissent jusqu'à vingt et une prises de sang hebdomadaires chez la souris et quinze chez le rat, des tests de sensibilité mécanique et thermique de trente minutes en cage de contention, une échographie cardiaque sous anesthésie, et vingt heures en cage à métabolisme sur grille, hébergement dont le porteur reconnaît qu'il induit un fort stress et un risque d'hypothermie. Les composés évalués ne sont jamais nommés, et l'effectif de 3 400 rongeurs n'est rattaché à aucun calcul.

Objectifs

Le diabète de type I peut être induit chez le rongeur par destruction des cellules du pancréas à l’aide d’un agent pharmacologique. Lorsqu’un trop grand nombre de cellules sont détruites, l’animal devient diabètique de type I. Les conséquences de la destruction des cellules sont une augmentation du taux du sucre dans le sang. Cela va être toxique pour certains organes tels que les nerfs et neurones périphériques touchant la sensibilité, la motricité, le transit intestinal et le rythme cardiaque et le rein. Ces comorbidités associées au diabète altèrent de façon importante la qualité de vie des patients et sont létales arrivées à un certain stade de la maladie. Or ces comorbidités ne sont pas ciblées par des médicaments efficaces ou alors ciblés par des médicaments peu efficaces. Ainsi, il est important de développer des modèles précliniques permettant l’implémentation de médicaments ou des nouveaux médicaments plus efficaces sur le marché. Nous réaliserons 40 projets sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’étude de nouvelles molécules thérapeutiques plus efficaces sur la neuropathie (altération des neuronnes périphériques), l’insuffisance cardiaque et la néphropathie diabétiques (altération de la fonction rénale associée au diabète).

Procédures

Les animaux recevront des administrations de divers composés (molécule chimique induisant le modèle et composés à tester), les administrations se font sur animal vigile (environ 30 secondes) ou sur animal anesthésié (environ 2 minutes). La sensibilité mécanique et thermique est réalisée sur animal vigile et dure environ 30 minutes où l'animal est dans une petite cage et un stimulus mécanique ou thermique est appliqué maximum 5 fois 10 secondes à intervalle de 5 minutes et ce à 3 reprises durant le projet. Des prélèvements de sang auront lieu toutes les semaines (soit 21 prélèvements pour la souris et 15 pour les rats maximum), sur animal anesthésié (2 minutes) ou vigile (30 secondes). Pour mesurer la fonction cardiaque, nous réaliserons une échographie, l’animal est anesthésié et une sonde est posée sur son thorax. Cette mesure dure environ 20 minutes. Pour mesurer le débit de filtration du rein, l'animal est anesthésié pendant 5 minutes pour placer le moniteur sur dos et injecter le composé fluorescent puis il est réveillé et maintenu en cage individuelle pendant 2h de mesure. Le moniteur est ensuite retiré et l'animal est remis dans sa cage d'origine. Nous récolterons l'urine sur une durée de 20h, l'animal sera donc mis en cage individuelle à métabolisme. Ces mesures seront réalisées 1 fois, en fin de période de traitement.

Impact sur les animaux

L’injection du composé chimique va engendrer un relargage massif d’insuline, donc une hypoglycémie sévère (baisse du taux de sucre dansle sang). Pour limiter cet effet qui peut être mortel, une supplémentation en sucre est mise en place pendant la phase critique (dès l’injection et jusqu’à 24h après la dernière injection). D’après notre expérience, nous attendons 10 à 15% de mortalité. L’état diabétique va induire une perte de poids très importante. Les administrations de traitements réalisées à répétition peuvent générer un stress chronique. Bien que les composés à tester ont pour but d’améliorer l’état de santé de l’animal, ils peuvent avoir des effets adverses. Les prélèvements de sang réalisés peuvent entrainer une infection au niveau du site de prélèvement, notamment sur des animaux diabétiques. Les mesures de sensibilité mécanique et thermique peuvent engendrer un stress et/ou une douleur modérée. Certaines mesures impliquent une anesthésie d’environ 20 minutes. Dans de rares cas, l’animal peut ne pas supporter l’anesthésie. Le test de tolérance au sucre, sur un animal diabétique peut induire des difficultés de retour à une glycémie basale (taux de sucre normal), cela peut entrainer une légère baisse d’activité. Les récoltes urinaires en cage métabolisme implique un hébergement sur grille, en individuel pendant 24h. Cela induit un fort stress et un risque d’hypothermie (baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus et le sang dans le but d’évaluer l’efficacité des composés.

Remplacement

Le diabète est une pathologie touchant de nombreux organes et les atteintes nerveuse et rénale sont des conséquences de ce dérèglement multi organique qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Les cultures de neurones et de cellules rénales peuvent être envisagées dans un premier temps et constitue un des axes de recherche et développement de la société. Cependant cette méthode, bien qu'elle puisse diminuer l'utilisation d'animaux à des fins de recherche, ne pourra pas se substituer à l'utilisation de ces derniers puisque les comorbidités citées sont la conséquence de ce dérèglement multi-organique. L'utilisation d'un composé chimique pour induire le diabète peut être également remplacée par l'utilisation d'animaux spontanément diabétique grâce à des mutations génétiques et sont des modèles auxquels la société s'attarde dans ses axes de recherche et développement.

Réduction

Toutes les procédures seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d’animaux inclut dans l’étude. Des tests statistiques sont réalisés pour démontrer l'efficacité d'un composé.

Raffinement

Dès la première injection du composé chimique, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids et des consommations alimentaire et hydrique, 1 fois par semaine). Une supplémentation en sucre, permettant de limiter la chute du taux de sucre dans le sang qui peut être mortelle, est mise en place durant la phase critique. Une double litière sera déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite en abondance et garantir le confort de l'animal. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une diarrhée, ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier sera mis à mort.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des modèles bien connus pour l’étude du diabète et de ses complications. De plus, il est possible d’induire chez nos rongeurs des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine. Nous utiliserons des animaux adultes donc à partir de l’âge de 8 semaines car le modèle a été développé historiquement comme cela donc nous avons énormément de recul sur l’effet du composé chimique à cet âge et nous souhaitons étudier la maladie se développant chez les adultes.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe ou par Pseudomonas aeruginosa par voie intranasale sous anesthésie générale, puis reçoivent de une à trois administrations de la molécule testée, par la même voie et sous anesthésie à chaque fois. L'infection grippale entraîne perte de poids, perte d'appétit, inactivité et léthargie pendant six à sept jours, l'infection bactérienne agissant sur quarante-huit heures. Le porteur souligne que la molécule a déjà montré son efficacité in vitro à des doses non cytotoxiques, et écrit dans la même rubrique qu'"aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d'un organisme entier".

Objectifs

Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l’efficacité antivirale et antibactérienne d’une molécule que nous appelerons M, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées. Cette demande d’autorisation de projet est couplée avec une première demande qui évaluera au préalable la tolérance de la molécule M, in vivo, chez la souris saine.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à évaluer l’effet antiviral et antibactérien d’une nouvelle molécule prometteuse ayant une activité in vitro contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Avant d’être évaluées in vivo la molécule M a démontré son efficacité contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa in vitro à des doses non cytotoxiques. Au préalable, une étude de toxicité/tolérance sera réalisée (autre demande d'autorisation de projet). La dose la plus appropriée sera ensuite utilisée pour déterminer l’efficacité antivirale et antibactérienne, dans un modèle murin d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa, en traitement curatif. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa.

Procédures

Les souris seront infectées par le virus de la grippe ou P. aeruginosa, par voie intranasale, sous anesthésie générale, puis traitées ou non par la molécule M, administrée 1 à 3 fois, par voie intranasle, également sous anesthésie générale.La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes par souris jsuqu’à son réveil.

Impact sur les animaux

Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces. Par ailleurs, pour étudier l’efficacité de la molécule M vis-à-vis du virus de la grippe ou de P. aeruginosa, les souris seront infectées et feront donc l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids de chaque souris. Ces deux modèles d’infection peuvent conduire aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection pour la grippe. Le modèle d'infection pour P. aeruginosa est beaucoup plus court (48h). Afin d’éviter d’infliger une douleur et une souffrance à l’animal, nous avons établi plusieurs critères d’évaluation afin de déterminer très rapidement les points limites.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que les modèles murins d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa sont bien établis et maîtrisés par l’équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antivirale contre le virus de la grippe et antibactérienne vis-à-vis de P. aeruginosa, à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.

Réduction

Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques. Ainsi, pour évaluer l’efficacité de la molécule M, vis-à-vis du virus de la grippe et de P. aeruginosa, un total de 960 souris au maximum sera nécessaire. Cependant, ce nombre sera réduit puisque 3 modalités de traitement sont envisagées, mais si la première modalité montre une efficacité antimicrobienne, les 2 autres modalités ne seront pas réalisés, réduisant le nombre de 960 à 384 souris.

Raffinement

MODIFICATION : Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). DE PLUS, POUR FACILITE L’APPORT ALIMENTAIRE ET HYDRIQUE LORS DES INFECTIONS, DES CROQUETTES HUMIDIFIEES D’EAU SERONT DISPONIBLES A L’INTERIEUR DE LA CAGE.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous utiliserons des souris parce qu’il s’agit d'une espèce animale appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi pour l'infection par le virus de la grippe et pour l'infection par P. aeruginosa. D’autre part, le modèle d’infection grippale et le modèle d'infection par P. aeruginosa sont pleinement maîtrisés, chez la souris, au laboratoire et les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, le choix de cette espèce limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant, et nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles pour rechercher un éventuel "effet sexe".

11 940 souris vont être utilisées sur trois ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles développent un lupus, avec atteintes rénales, inflammation généralisée, douleurs articulaires, problèmes de peau et perte de poids, et reçoivent des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines, des prises de sang mandibulaires sous anesthésie toutes les deux semaines, et des tests de sensibilité à un stimulus mécanique jusqu'à deux fois par semaine. Le bénéfice attendu reste de repérer des molécules candidates avant toute phase clinique. L'effectif, lui, couvre 109 études dont le porteur écrit que le nombre "ne peut pas être déterminé à l'avance", et il prévoit délibérément une marge pour "éviter des interruptions administratives ou des retards".

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune chronique et complexe caractérisée par la production d’auto-anticorps affectant plusieurs organes (reins, peau, articulations, sang…). Il s’agit d’une maladie du tissu conjonctif dont le symptôme caractéristique est une inflammation associée au système immunitaire. Il touche principalement les femmes (9 femmes pour 1 homme) en âge de procréer. C’est une maladie difficile à prendre en charge, car son évolution est imprévisible, les symptômes varient d’un patient à l’autre, et les traitements actuels, souvent lourds, ne permettent pas de guérir. Ils visent surtout à réduire les poussées inflammatoires et à prévenir les complications. Découvrir de nouvelles solutions thérapeutiques est crucial afin d’offrir des traitements plus efficaces, mieux tolérées et personnalisées améliorant la qualité de vie et réduisant la morbidité et la mortalité. Après une phase de sélection de molécules prometteuses, leur mode d’action sera étudié, et les plus pertinentes seront testées dans des modèles expérimentaux de lupus, qui reproduisent les grandes caractéristiques de la maladie humaine. Les molécules testées auront un potentiel anti-inflammatoire, immunomodulateur ou viseront des cibles biologiques impliquées dans le développement du lupus. Ces recherches, menées dans le cadre d’un programme de maturation préclinique, permettront d’évaluer la sécurité, la tolérance et l’efficacité de ces traitements potentiels avant toute phase clinique. L’objectif final est de proposer des solutions thérapeutiques innovantes qui amélioreront la qualité de vie des patients, tout en respectant les principes éthiques de la recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet au sein du lupus érythémateux systémique. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement de nouvelles thérapeutiques permettant de réduire la mortalité liée au lupus, de soulager les patients atteints de cette maladie, afin qu’ils aient une meilleure qualité de vie.

Procédures

Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Tous les animaux recevront une injection en sous-cutanée pour l'implantation des puces d'identification RFID. Également, les animaux recevront des administrations de traitements. Plusieurs voies d'administrations sont envisagées en fonction du mode d'administration du composé testé. Le traitement sera administré une à sept fois par semaine, jusqu’à deux fois par jour, en fonction de la molécule étudiée et de la voie d’administration, pendant plusieurs semaines. Toutes les deux semaines maximum, les animaux pourront subir un prélèvement de sang au niveau mandibulaire. Ces prélèvements se feront sur animal anesthésié. Des tests de comportement pourront être effectués, jusqu'à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude, en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation, soit un test durant 15 minutes en tout). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour évaluer leur état général.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les souris utilisées vont développer des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes de lupus, une maladie causée par un déséquilibre du système immunitaire. Ces signes peuvent avoir un impact sur leur état général et leur espérance de vie. Par exemple, les souris peuvent développer des dysfonctionnements aux reins, une inflammation généralisée, des douleurs articulaires, des problèmes de peau et de multiples atteintes notamment aux organes sièges de l'immunité tels que la rate et les ganglions lymphatiques. Ces dommages peuvent entraîner une perte de poids et une diminution de l'activité. Ces symptômes peuvent varier en intensité selon les modèles utilisés. Tout au long de l'étude, ces différents paramètres seront surveillés en observant l'état de chaque animal. Leur comportement, leur consommation de nourriture et de boisson, ainsi que leur poids seront régulièrement contrôlés, entre 2 et 5 fois par semaine. Les traitements administrés sont prévus à des doses non toxiques, basées sur des études préliminaires ou la littérature et ne devraient pas entraîner d'effets secondaires importants, hormis une légère gêne transitoire liée aux injections. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de ne pas provoquer de douleur et en respectant les recommandations éthiques des volumes prélevés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir évaluer l’effet de notre molécule sur la maladie.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, sur l’auto-immunité et sur la douleur implique de disposer de modèles animaux mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce souris à travers nos différents modèles reproduit plusieurs aspects du lupus humain. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour évaluer et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation, la production d’auto- anticorps, la prolifération de lymphocytes, la douleur et sur l’aspect histologique des organes, il est essentiel d’examiner l’animal vivant entier.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de la molécule candidate). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux. Pour ce projet nous prévoyons d’effectuer 109 études avec l’utilisation de 11940 animaux sur 5 ans. Toutefois, ce sont des estimations larges car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement, de l’efficacité des molécules, du choix du modèle translationnel pour aller en clinique ainsi que les souches d’animaux choisies en fonction du modèle. En effet, dans le cadre de demande d’autorisation, il est nécessaire d'inclure toutes les souches animales potentielles qui pourraient être utilisées. Chaque souche citée doit être associée à un nombre précis d’animaux, même si, dans la pratique, certaines souches pourraient ne pas être sélectionnées en fonction des besoins des projets en cours et des pilotes. Par conséquent, il est prévu en total un nombre d'études plus élevé que le besoin exact anticipé pour éviter des interruptions administratives ou des retards en cas de changements dans les souches animales requises si nous ne prévoyons pas cette marge dès le début du projet.

Raffinement

Pour minimiser les impacts sur les animaux de laboratoire, des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux pour préparer une étude plus large. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie gazeuse (implantation des puces d’identification, prélèvements sanguins) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les procédures d’implantation des puces d’identification et de prélèvements sanguins sont réalisées sous anesthésie gazeuse (un anesthésique volatile reconnu pour son induction et son réveil rapide, minimisant ainsi le stress et l’impact sur l’animal). L’implantation de la puce est une procédure rapide (quelques secondes) et bien que légèrement invasive, elle ne provoque qu’un inconfort transitoire. De même, les prélèvements sanguins sont effectués de manière à limiter le traumatisme local pour minimiser la douleur et l’inflammation post-procédure. Toutefois, les animaux seront surveillés attentivement après chaque intervention. Une grille de score pour évaluer la douleur sera mise en place incluant un arbre décisionnel avec critères d’arrêt de souffrance. Si des signes de douleur ou d’inconfort prolongés étaient observés (léthargie, prostration, diminution de l’alimentation), un analgésique sera administré toutes les toutes les 6 à 12 heures jusqu’à 48 heures. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude pour détecter les signes de douleur insupportable et euthanasiés en fin d’expérimentation pour des analyses supplémentaires. Les souris seront regroupées par 5 à 6 par cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent se cacher et ronger. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux et/ou un marqueur sanguin ou urinaire. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

En accord avec les recommandations et la littérature, la souris représente un modèle très développé pour étudier le lupus. En effet, chez la souris le lupus ressemble beaucoup au lupus chez l’homme, notamment en ce qui concerne les problèmes rénaux et la production d’autoanticorps. Les modèles murins de lupus se répartissent en deux catégories principales : spontanés et induits. Afin de pouvoir étudier la progression de la maladie, les souris seront âgées de 6 semaines minimum et pourront être étudiées tout au long de leur vie. Ce stade nous permettra de réaliser des études présymptomatiques, symptomatiques et d’étudier l’effet de traitements jusqu’à la fin de la vie des souris.