Rongeurs
Intérêt d’une biothérapie acellulaire dans la prévention des lésions d’organes induites par un choc hémorragique traumatique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Anesthésiés, rasés, munis de deux cathéters posés dans la carotide et la jugulaire, 100 rats subissent une injection de glycérol dans les muscles des deux pattes arrière pour provoquer une destruction musculaire, puis un saignement contrôlé d'une heure trente, un remplissage vasculaire et la retransfusion de leur propre sang. Sept heures d'anesthésie au total, coupées par deux heures de réveil, avant une seconde intervention où une caméra collée sur l'abdomen enregistre pendant deux heures la filtration rénale : ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur prévoit cinq rats de plus par groupe pour anticiper les décès pendant l'expérience, et précise que les données d'un rat mort moins d'une heure avant la fin prévue restent exploitables. Les autres sont tués à l'issue de l'enregistrement, pour prélever sang, urine et organes.
Objectifs
Le choc hémorragique, provoqué par une perte importante de sang, est responsable d’environ 1,9 million de décès chaque année dans le monde. Dans près de 8 cas sur 10, il survient à la suite d’un traumatisme grave, comme un accident de la route ou une chute importante. Les traumatismes sévères représentent à eux seuls environ 9 % de la mortalité mondiale. Chez les personnes qui survivent aux premières heures, une réaction excessive du système immunitaire est souvent observée. Cette inflammation importante est déclenchée par les lésions des tissus, qui libèrent des molécules signalant les dommages subis par l’organisme. Si cette réponse est trop intense, elle peut provoquer des atteintes secondaires de plusieurs organes, notamment du foie et des reins, augmentant le risque de complications graves et de décès. À ce jour, il n’existe pas de traitement spécifique permettant de prévenir efficacement ces défaillances d’organes après un choc hémorragique. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules naturellement présentes dans différents tissus de l’organisme. Elles sont étudiées et déjà utilisées dans certaines situations médicales pour leurs propriétés anti-inflammatoires et leur capacité à favoriser la réparation des tissus. Nos travaux précliniques ont montré qu’elles peuvent protéger le foie et les reins après un choc hémorragique. Cependant, l'utilisation de cellules vivantes est difficile à mettre en œuvre dans un contexte d'urgence, notamment en raison des contraintes de préparation, de conservation et de transport. C’est pourquoi nous nous intéressons au « sécrétome », c’est-à-dire à l'ensemble des substances produites par ces cellules, qui sont responsables d'une grande partie de leurs effets bénéfiques. Cette approche, dite « acellulaire », pourrait être plus simple à utiliser en pratique tout en conservant l'efficacité thérapeutique. L'objectif de cette étude est d'évaluer, dans un modèle expérimental de choc hémorragique traumatique, si une administration précoce de ce sécrétome permet de réduire les lésions du foie et des reins. Le recours à un modèle animal est indispensable, car il est aujourd'hui le seul moyen d'étudier simultanément les réactions immunitaires, les troubles de la circulation sanguine et de la coagulation qui conduisent aux défaillances de plusieurs organes. Les résultats attendus fourniront des données essentielles avant d'envisager des essais chez l'être humain.
Bénéfices attendus
L’utilisation de thérapie cellulaire est complexe, en particulier dans des situations d’urgence. En effet, leur mise en œuvre constitue un défi logistique : il faut disposer d’installations spécialisées, de personnel formé, et respecter des délais et des conditions de conservation contraignantes. Face à ces contraintes, une alternative prometteuse consiste à ne pas utiliser les cellules elles-mêmes, mais uniquement les substances qu’elles sécretent. Ces substances sont les principales responsables des effets protecteurs observés avec les cellules. L’intérêt de cette approche est multiple. Contrairement aux cellules vivantes, le sécrétome peut être préparé à l’avance, stocké plus facilement, transporté et utilisé rapidement au moment voulu. Ainsi, cette stratégie pourrait permettre de développer une nouvelle forme de traitement, dite “acellulaire”, combinant efficacité et simplicité d’utilisation. À terme, cela pourrait faciliter l’accès à ces thérapies innovantes, en particulier en contexte d’urgence thérapeutique et dans des environnements isolés.
Procédures
Cette procédure comprend deux étapes réalisées sous anesthésie générale. La première dure environ 5 heures et la seconde environ 2 heures. Ces deux étapes sont séparées par une période de réveil et de récupération d’environ 2 heures. Lors de la 1er étape, l’induction de l’anesthésie sera immédiatement suivie par l’administration sous-cutanée d’une solution d’anesthésiques locaux au niveau du cou et d’un morphinique au niveau du flanc. Au cours de la phase chirurgicale (1h), l’animal sera préparé (délai d’action du morphinique, rasage et dépilation: 40min) et les 2 cathéters nécessaires à l’étude seront posés au niveau du cou (artère carotide et veine jugulaire, 20min). La réalisation du modèle pathologique présente 3 phases : • La phase de choc hémorragique traumatique (1h30) débutera par l’injection intramusculaire dans chacune des pattes postérieures de l’animal d’une substance provoquant le traumatisme musculaire, suivi de la réalisation de l’hémorragie controlée par prélèvement du sang via le catether carotidien. • La phase de remplissage vasculaire (1h00) sera réalisée par perfusion d’une solution saline via le catheter jugulaire. Les traitements expérimentaux seront administrés en bolus dans le flux de perfusion dès le début de la phase de remplissage vasculaire. • Au cours de la phase de re-transfusion (1h00) le sang, prélevé pendant la phase d’hémorragie, sera réinjecté progressivement (1mL/min) par le catheter jugulaire. Au cours de cette première étape quatre prélèvements de sang seront réalisés via le catheter carotidien au début de chaque phase et avant le retrait des catheters (T0, T1h30, T2h30 et T3h30). A l’issue des 5 heures, les cathéters seront retirés et la peau refermée par des sutures (10min). Un morphinique et des anesthésiques locaux seront administrés afin de limiter la douleur post-opératoire. L’anesthésie gazeuse sera ensuite arrêtée et les animaux seront surveillés pendant les 2 heures. Lors de la 2ème anesthésie générale, la fonction de filtration des reins sera évaluée. Pour cela une petite incision cutanée de la peau de 1 cm sera réalisée au niveau de la patte postérieure gauche et une solution fluorescente sera injectée en bolus dans la veine fémorale superficielle. Le signal fluorecent sera enregistré (2h) grâce à une mini-caméra (1,4g) fixée sur la peau de l’abdomen à l’aide d’un patch adhésif non invasif. A la fin de l’enregistrement, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont à prévoir durant le protocole expérimental : 1. Intervention chirurgicale associée à une anesthésie gazeuse de plusieurs heures: La chirurgie réalisée au niveau du cou, nécessaire à la pose et au retrait des cathéters carotidien et jugulaire, présentent un risque d’hémorragie non contrôlée. Par ailleurs l’association de la chirurgie et de l’anesthésie générale prolongée peut entrainer un risque d’hypothermie. Par aillieurs certains animaux pourraient aussi ne pas supporter une anesthésie prolongée. Lors du réveil, la chirurgie réalisée au niveau du cou, peut entraîner une douleur lors de la mastication. 2. Injection de glycérol : L’injection de glycérol dans les muscles tibialis, visant à induire une lésion musculaire de type rhabdomyolyse, provoquera une douleur locale et une réduction de la mobilité des membres postérieurs. 3. Effets du modèle pathologique : L’état général des animaux pourrait être altéré par le modèle expérimental, entraînant une immobilité partielle ou totale.
Devenir
Une seule étape est prévue dans ce projet. À la fin de celle-ci, les animaux seront mis à mort à l’issue afin de permettre le recueil de sang et d’urine pour les analyses biologiques. Certains organes seront également prélevés pour être étudiés au microscope (examen histologique). Cet examen consiste à observer les tissus en détail afin de détecter d’éventuelles anomalies ou des modifications de la structure des cellules. Il permet ainsi de mieux comprendre les effets des traitements étudiée et d’obtenir des informations sur leur impact au niveau des organes.
Remplacement
Les études chez l’animal restent nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet. Elles permettent d’observer comment les thérapies cellulaires se comportent dans un organisme vivant dans son ensemble : quels sont leurs effets bénéfiques éventuels, mais aussi leurs risques ou effets indésirables. À l’heure actuelle, il n’est pas possible d’obtenir ces informations de manière fiable uniquement avec des méthodes alternatives, comme des expériences réalisées sur des cellules in vitro. Ces modèles sont utiles, mais ils ne reproduisent pas toute la complexité d’un organisme vivant, en particulier dans des situations graves comme une hémorragie importante (perte massive de sang) ou une rhabdomyolyse (destruction importante des muscles), où de nombreux organes et mécanismes interagissent en même temps. Cependant, avant de réaliser les études chez l’animal, des expériences sur cellules sont systématiquement menées. Elles permettent de sélectionner les approches thérapeutiques les plus prometteuses et ainsi de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Sur la base des données obtenues précédemment avec ce même modèle de choc hémorragique traumatique, 15 rats par groupe sont nécessaires pour garantir une puissance statistique suffisante. Cinq rats supplémentaires par groupe sont prévus afin d’anticiper les décès liés à la sévérité du modèle pathologique, ainsi que les exclusions éventuelles résultant de contraintes techniques inhérentes à la procédure expérimentale. Le nombre maximal d’animaux prévu par groupe d’intérêt est donc fixé à 20. Cinq groupes d’animaux sont prévus, 2 groupes controles (contrôle négatif et positif) et 3 groupes de traitements. Seules les approches thérapeutiques ayant déjà montré des résultats positifs lors d’expériences réalisées sur des cellules in vitro seront testées dans ce projet. Cela permet de ne retenir que les stratégies les plus prometteuses avant de passer à l’étape in vivo sur l’animal. D’après les résultats obtenus précédemment avec ce même modèle expérimental de choc hémorragique traumatique, nous avons constaté que la gravité de ce modèle peut parfois entraîner le décès de certains animaux avant la fin prévue de l’expérience. Cependant, nous avons observé que lorsque le décès survient moins d’une heure avant la fin prévue de la procédure, les données peuvent tout de même être utilisées, à condition que le prélèvement sang final puisse être réalisé. L’intégration des prélèvements de ces animaux n’altère ni la qualité ni la validité scientifique de l’étude, et permet d’éviter de répéter inutilement certaines expérimentations.
Raffinement
La procédure comprend deux phases réalisées sous anesthésie générale d’une durée globale de 7 heures séparées par une phase de réveil de deux heures maximum. Dès le début de l’anesthésie, un gel hydratant sera appliqué sur leurs yeux pour éviter tout dessèchement ou irritation. L’anesthésie générale sera administrée sous forme de gaz. Elle sera associée à un traitement antidouleur complet comprenant un analgésique puissant ainsi que des anesthésiques locaux injectés aux endroits pouvant occasionner une douleur (au niveau du cou et des muscles des pattes arrières). Deux types d’anesthésiques locaux seront utilisés : l’un agit rapidement mais pour une courte durée (environ 30 minutes), l’autre agit plus longtemps (6 à 9 heures), afin d’assurer une protection continue contre la douleur. Enfin, par précaution, une nouvelle administration d’analgésiques et d’anesthésiques locaux sera réalisée avant le réveil des animaux afin de garantir leur confort au moment du réveil des animaux. En fonction de leur état clinique des animaux pendant la phase de réveil et de l’atteinte éventuelle des points limites, une dose supplémentaire d’analgésique pourra être administrée ou, si nécessaire, l’animal pourra être euthanasié.
Choix des espèces
Le choix d’utiliser des rats non génétiquement modifiés repose sur l’existence de nombreuses études scientifiques portant sur des modèles de choc hémorragique (perte importante de sang) et de rhabdomyolyse (destruction importante des muscles) chez le rat. Cette base de connaissances solide nous permettra de comparer plus facilement nos résultats à ceux déjà publiés et de mieux les interpréter. De plus, notre équipe bénéficie d’une expertise dans la mise en œuvre de modèles de choc hémorragique, qu’il survienne seul ou en association avec des traumatismes, notamment dans le cadre d’études cardiovasculaires. Pour évaluer les traitements, nous utiliserons des rats de la souche Sprague Dawley agés de 7 semaines et pesant entre 250 et 330 grammes. Ce stade de développement correspond à celui le plus souvent choisi dans les recherches sur la fonction rénale. Cela facilitera la comparaison de nos résultats avec les données déjà disponibles dans la littérature scientifique.
Évaluation de composés thérapeutiques administrés en infusion via un cathéter intravésical posé après laparotomie sur des rats porteurs d’une tumeur greffée en intravesicale
- Recherche appliquée
- Cancers
Un prestataire de services en recherche préclinique vend l'évaluation de candidats médicaments sur des rats à qui il greffe une tumeur dans la vessie, protocole qu'il doit d'abord mettre au point : 1 200 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués en fin d'étude parce qu'ils portent des tumeurs, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit un transpondeur sous la peau, subit une chirurgie d'induction tumorale de moins d'une heure trente, puis une seconde chirurgie pour poser un cathéter dans la vessie, et reste isolé de un à dix jours pendant l'infusion du traitement, opération répétable. Les effectifs par groupe vont de trois à quinze rats selon les paramètres évalués. À cela s'ajoutent jusqu'à 30 % de rats supplémentaires, prévus parce que les deux chirurgies sont "des phases critiques techniquement complexes".
Objectifs
En 2020, le GLOBOCAN estimait à environ 573 000 nouveaux cas de cancer de la vessie dans le monde; en 2022, les estimations dépassent 600 000 cas. Ce cancer est parmi les dix plus fréquents, avec de fortes disparités régionales et une prévalence nettement plus élevée chez les hommes; l’incidence est largement liée au tabagisme et augmente dans régions en lien avec vieillissement. L’objectif global de ce projet est d’améliorer la prise en charge clinique au travers du développement de nouvelles thérapies efficaces contre ce type de cancer par l’intermédiaire d’un modèle préclinique pertinent : - Comprendre la biologie : mécanismes moléculaires, voies de signalisation, hétérogénéité tumorale et résistance aux traitements. - Découvrir des cibles et biomarqueurs : identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et des marqueurs pronostiques/prédictifs. - Développer et optimiser des traitements : criblage de petites molécules, anticorps, immunothérapies, thérapies combinées et stratégies de délivrance locale (instillations intravésicales). - Évaluation de la toxicité et pharmacocinétique : sécurité systémique et locale avant essais cliniques. - Réduction des échecs en clinique : validation robuste des hypothèses pour mieux sélectionner candidats et schémas thérapeutiques. - Individualisation des soins : tests ex vivo (organoïdes, cultures primaires) pour prédire réponse et guider thérapie personnalisée. - Aspects translationnels et réglementaires : définir biomarqueurs d’effet, critères d’inclusion pour essais et preuves préalables exigées par autorité L’objectif de ce projet est de développer un modèle de cancer de vessie chez les rongeurs (rats), le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des composés thérapeutiques dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques, à établir une réelle évaluation de l’efficacité de molécules destinées à traiter les tissus cancéreux localisés chez l’homme. Une fois le modèle établi, une évaluation complète des candidats médicament pourra aussi être réalisée avant de lancer un potentiel essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représentent un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux candidats médicament préalablement aux essais qui pourraient être ensuite mené chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases et également les voies d’administration telles que le mise en place d’un cathéter intra vésical par voie antérograde mime déjà pratiqué chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer
Procédures
L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal sous la peau est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant le début de l’étude (inférieur à 5min). Chirurgie permettant l’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h30). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes en poids et/ou volume tumoral (stress léger durant 1 à 2 jours). Au cours des études, des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée, potentiellement après un transport (inférieur à 2h). Des méthodes d’imagerie non invasives (indolore) pourront être réalisées sous anesthésie générale (inférieur à 1h). Mise en place d’un cathéter par chirurgie nécessaire à la mise en œuvre des traitements sera réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h30). Les animaux seront traités par un système d’infusion continue nécessitant le recours à l’isolement temporaire des animaux durant le traitement (1 à 10 jours répétable). La palpation des tumeurs nécessitera une contention des animaux (inférieur à 30s, stress léger). Des prélèvements de sang, pourront être faits sous anesthésie générale . Des prélèvements d’urine pourront être réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention (inférieur à 5min, stress léger). En fin d’étude, tous les animaux sont euthanasiés
Impact sur les animaux
La chirurgie d’induction tumorale pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Un traitement antidouleur sera appliqué aux animaux durant cette période. Le développement de la tumeur dans la vessie pourra également engendrer une gêne. L’implantation chirurgicale d’un cathéter dans la vessie pour la mise en œuvre des traitements pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Un traitement antidouleur sera appliqué aux animaux durant cette période. Les animaux seront maintenus en hébergement individuel durant le temps d’infusion, ce qui pourra engendrer un stress léger. Les périodes de traitements pourront engendrer un stress modéré. Les technique d’imagerie non invasive (IRM ou bioluminescence) pourront induire un stress léger. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral pourront entraîner un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.
Devenir
Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon les critères définis dans l’étude. Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe avec tumeur, non traité et un groupe avec tumeur, traité; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 30% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement pour la mise en place du modèle au moment des chirurgies avant la sélection des animaux. La chirurgie d’implantation du cathéter et d’induction tumorale sont des phases critiques techniquement complexes qui nécessitent un nombre d’animaux excédentaires prenant en compte la complexité de la mise en place du modèle. Avec la pratique et l’amélioration continue des techniques, ce nombre pourra être réduit au cours du temps. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal
Raffinement
La chirurgie d’induction tumorale et l’implantation du catheter par chirurgie en intravesicale sont réalisées sous anesthésie générale avec couverture analgésique (antidouleur) durant toute la procédure et durant les 3 jours suivants celle-ci. Les chirurgies seront réalisées de façon aseptique, avec maintien de la température corporelle et surveillance jusqu’au réveil. Les chirurgies seront effectuées le matin pour surveiller les animaux durant la journée après leur réveil. L’induction tumorale et l’implantation du cathéter pourront se faire au cours de la même chirurgie. Dans le cas où l’induction tumorale et la mise en place du cathéter ne sont pas réalisés en même temps, un délai compris entre 5 et 12 jours devra être respecté avant la seconde intervention chirurgicale. La seconde intervention chirurgicale sera menée sous l’autorité du vétérinaire de l’établissement afin de s’assurer que les animaux est bien eu le temps nécessaire pour récupérer de la première intervention. Les prélèvements de sang seront effectués suivant les recommandations vétérinaires (anesthésie, volume, fréquence, antalgie). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Un enrichissement adapté aux animaux sera disposé dans chaque cage d’aniamux. Des animaux adultes seront utilisés. Une évaluation précise de l’état sanitaire des animaux sera mis en place de manière individuelle à l’apparition des premiers signes cliniques d’évolution de la maladie. Dans toutes les cages, une nourriture adaptée et de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée en fonction des besoins des animaux. Les scores cliniques les plus élevés, l’accumulation de scores intermédiaires et les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront des points limites à l’experience.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales et l’implantation du cathéter en intra vésical. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.
conséquences neurologiques à court-terme et à long-terme des infections virales locales ou systémiques : rôle des cellules dendritiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Une instillation nasale de virus grippal ou une injection de cytomégalovirus dans le péritoine, puis une série de tâches non nommées mesurant anxiété, humeur et mémoire : 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque un syndrome fébrile pouvant durer sept jours, avec perte de poids et anxiété, et chaque souris passe jusqu'à dix jours seule en cage pour l'évaluation individuelle. Le porteur écrit pourtant que "les tests comportementaux ne génèrent aucun stress" et qu'il n'a pas noté d'état de stress lié à l'isolement, dans un projet dont l'objet est précisément de mesurer un état d'abattement et d'isolement provoqué par l'infection. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever organes et sang.
Objectifs
Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions de corps étrangers (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clés du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un corps étranger, les DC produisent des molécules véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de ces molécules spécifiques dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans le cadre du Covid. Au cours des infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), sont la principale source de molécules spécifiques qui signalent l'infection et sont source d'inflammation appelées Interférons (IFN). Les IFN sont indispensables pour limiter la propagation de virus. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables de produire des IFN, l'hôte infecté contrôle toujours efficacement l'infection. La capacité des pDC de produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, cette capacité est donc probablement très ancienne. Il est alors possible que cette fonction ne serve pas uniquement à combattre des infections virales, mais aussi à remplir d'autres fonctions importantes dans l'organisme. Notre objectif est de tester si les molécules produites par les pDC induisent un état d'abattement, d’isolement et d'affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement à court ou long-terme, comportement qui ressemble aux états dépressifs. Les pDC pourraient aussi participer à la mise en place d'une détérioration des cellules du cerveau dans la maladie d'Alzheimer (AD), la première maladie neurodégénérative qui affecte plus d'1 million de personnes en France, a un poids sociétal lourd pour les familles et reste sans traitement efficace. Afin de tester cette hypothèse nous induirons la perte des cellules pDC dans un modèle de souris, combinée ou non à des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer et que nous infecterons avec deux types de virus : la souche A du virus de la grippe (IAV) qui induit une infection restreinte du système respiratoire, ou le cytomégalovirus murin (MCMV) qui induit une infection dans tout l'organisme et persiste sous forme latente, cachée. Nous évaluerons l’impact de ces infections sur le comportement des souris par des tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immunitaire et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production d'agent participant à l'inflammation pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs, ou souffrant d'un affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement progressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans un cadre infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires, les maladies impliquant une dégénérescence des cellules du cerveau et en particulier la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Des souris seront infectées soit par une courte injection par voie intrapéritonéale à l'état vigile d'un faible volume de liquide physiologique contenant du virus. D'autres souris recevront une faible dose de virus par instillation nasale réalisée une seule fois sous anesthésie générale gazeuse de courte durée. Une prise de sang sera effectuée sur les souris infectées, une seule fois sur animal vigile. Il s'agit d'un geste rapide (moins de 5 minute par souris). Un point de compression sera ensuite réalisé à l'aide d'une compresse stérile jusqu'à arrêt d'un saignement potentiel. Les souris effectueront ensuite une séquence de tâches afin d'évaluer leur comportement et plus précisément leur niveaux naturels d'anxiété, leur humeur motivée ou déprimée, et leurs capacités d'apprentissage et de mémoire. La séquence durera moins de deux semaines et comprendra la séparation des animaux pour leur évaluation à l'échelle individuelle sur une durée correspondant à moins de 30 minutes au total par jour pendant 4 jours, ou pendant moins de 10 jours dans le cas de l'évaluation de la mémoire à long-terme. Les souris seront libres de leurs mouvements et en capacité d'explorer dans des cages au cours de chaque test comportemental. Aucune tâche nécessite un effort particulier, ou génère quelque douleur ou angoisse, du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives.
Impact sur les animaux
Dans le cas d'infection par les virus, les animaux présentent un syndrome fébrile, associé à des symptômes généraux comme de la fièvre indiquant que l'organisme lutte contre une infection. Ce dernier peut durer jusqu'à 7 jours et entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les injections ne sont source d'aucun stress particulier, du fait qu'elles ne sont pas répétées, du faible volume injecté, et du fait de la manipulation journalière préalable des souris par le personnel qualifié dans la semaine précédente. La prise de sang peut généré un stress léger du fait de la contention. Dans le cadre d'un test d'évaluation du comportement, les animaux sont hébergés temporairement en cage individuelle. Du fait de l'enrichissement de leur habitat, du caractère temporaire (moins de 10 jours), il n'a pas été noté d'état de stress lié à l'isolement, mais ces manifestations seront étroitement surveillées. Les souris étant libres d'exploration, non restreintes et les tâches étant toutes effectuées dans la salle d'hébergement où elle ont été acclimatées, les tests comportementaux ne génèrent aucun stress et du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives, ceci afin de pouvoir justement mesurer leur état d'anxiété naturel.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser divers prélèvements d'organes et/ou de sang utilisés pour des analyses complémentaires. Ces prélèvements sont essentiels pour étudier les paramètres inflammatoires et les mécanismes cérébraux entrant en jeu dans ce projet.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades moléculaires impliquées dans les capacités cognitives et la réponse adaptative des comportements. Les études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition, et sont ainsi complétées par l'utilisation de l'animal qui seule permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles et leurs intéractions avec le reste de l'organisme et en particulier le système immunitaire.
Réduction
Tous ces animaux seront sous un même fond génétique homogène (gènes communs) pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que l'analyse d'un total de 12 animaux par groupe répartis sur deux expériences reproduites étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés de 2 à 5 individus compatibles. Un animal sera euthanasié en cas de mal-être trop important évalué par l'utilisation d'une grille de scoring. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont : respiration anormale, perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, aspect du poil anormal. Les souris sont préalablement familiarisées avec l'aliment de convalescence (gel) dans les jours précédant l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Lors des prélèvement de sang, avec utilisation de tubes de contention, l'animal sera surveillé et le geste sera réalisé rapidement afin de limiter l'évènement stressant, les souris seront replacées avec leurs congénères et il sera vérifié que le prélèvement ne les a pas affaiblies ou perturbées (changement de comportement). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatées à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les tests ne requièrent que mobilité, exploration libre d'objets, d'eau de boisson sucrée ou stimulus sonore de niveau équivalent à celui auquel elles peuvent être exposée lors du change de cage.
Choix des espèces
Les réactions physiologiques de la souris face à des corps étrangers, ici des virus, sont suffisamment proches de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux de ces 2 espèces. Ce point est maintenant formellement établi dans la littérature en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires, notamment pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. Seuls des animaux adultes seront étudiés ici de façon à ce que leur système immunitaire soit mature. Enfin dans le cas des modèles de la maladie d'Alzheimer, une maladie neurodégénérative dont le premier facteur de risque est l'age, des animaux adultes plus mûrs mais non vieillissants seront étudiés pour correspondre au mieux au métabolisme d'un humain de 45 ans ou plus.
Mécanismes neuronaux sous-tendant l’anxiété et la mémoire de peur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie crânienne d'environ deux heures pour implanter de quoi enregistrer ou moduler des neurones, puis jusqu'à cinq semaines seules en cage pour protéger le matériel : 850 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que cet isolement représente "un appauvrissement pour ces animaux sociaux". L'objectif est de décrire les circuits de l'anxiété et de la consolidation de la mémoire de peur, la perspective thérapeutique étant renvoyée au-delà de dix ans. Les trois tests comportementaux de vingt minutes que subit chaque souris sont annoncés comme évaluant la réponse anxieuse ou émotionnelle, sans être nommés.
Objectifs
Etat de l’art : L’objectif principal du présent protocole est de découvrir les mécanismes neurobiologiques impliqués dans l’anxiété ainsi que l’apprentissage et la consolidation de la mémoire de peur chez la souris. Les troubles liés à la peur et à l'anxiété tels que le trouble de stress post-traumatique sont parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents et représentent un problème majeur de santé publique. Ces troubles sont généralement considérés comme une altération de la mémoire de la peur, en particulier sa consolidation. A ce jour, les circuits et mécanismes responsables de l’anxiété et de la consolidation de la mémoire de peur restent mal connus. De nos données préliminaires et d'une large littérature, le présent projet propose d'étudier les circuits neuronaux de l’anxiété et de la consolidation de la mémoire. Hypothèses de travail : les informations des contextes anxiogènes sont transférées au cortex pour la mise en place d’une mémoire émotionnelle à long-terme, consolidée. De plus des population neuronales dédiées, vont jouer des rôles spécifiques dans la mise en place et le cadençage de ce transfert. Approches : Nous combinerons des techniques de pointe en comportement, neurophysiologie et neurostimulation pour comprendre et manipuler ce circuit et ses mécanismes. Interférer avec ces mécanismes en clinique représente une piste thérapeutique d'avenir.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes neurobiologiques de l’apprentissage et de la mémoire affective est une étape indispensable dans l’adaptation des individus au quotidien ou dans le développement de stratégies thérapeutiques pour les maladies neuropsychiatriques impliquant la peur et l’anxiété. À moyen terme (5–10 ans), ces résultats permettront d’améliorer la compréhension intégrée du fonctionnement des circuits dans différentes structures cérébrales et à long terme (au-delà de 10 ans), de contribuer à une compréhension mécanistique plus fine des désordres émotionnels associés aux pathologies neuropsychiatriques, ouvrant potentiellement la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces circuits.
Procédures
Ce projet faisant intervenir de l’imagerie et de la modulation de neurones spécifiques, tous les animaux utilisés seront soumis à une chirurgie ayant pour objet de pouvoir moduler ou enregistrer l’activité des neurones. Toutes nos chirurgies seront réalisées après analgésie préalable, couvrant la durée de la chirurgie et la période post-opératoire. Elles seront également toutes conduites sous anesthésie générale. Chaque souris sera soumise une chirurgie unique d'environ 2h et 3 tests comportementaux de 20 minutes évaluant la réponse anxieuse ou émotionnelle.
Impact sur les animaux
- Les chirurgies réalisées sur les animaux sont susceptibles d’occasionner stress et douleur. Cela se traduit habituellement par une perte de poids. - Une fois les chirurgies réalisées, les animaux sont maintenus en habitat isolé afin de garantir l’intégrité des équipements, et ce pendant une durée maximum de 5 semaines. Si cet isolement prévient nombre de blessures infligées entre congénères et évite d’endommager les équipements (impératif), elle représente aussi un appauvrissement pour ces animaux sociaux qu'il est important de limiter au maximum dans le temps. - Un stress pourra être observé sur les quelques jours du protocole qui contient des expositions à des environnements potentiellement anxiogènes.
Devenir
Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.
Remplacement
Le présent projet explore le rôle des circuit neuronaux au niveau structurel mais également systémique et comportemental. De ce fait, les approches explorant l’activité de ces cellules in vitro et in silico bien qu’indispensables à la compréhension complète de leur fonctionnement, restent pour l’instant insuffisantes pour remplir nos objectifs scientifiques. De même, la dimension comportementale de l’étude des mécanismes émotionnels dicte l’utilisation d’un modèle animal vigile et non anesthésié.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit à son minimum, en prenant en compte l’effectif nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, déterminé grâce à un calculateur de puissance statistique, ainsi que le taux d'échec des procédures, évalué lors de précédentes expérimentations. Afin de diminuer ce taux d’attrition, certains animaux seront logés en cages individuelles une fois les chirurgies réalisées pour éviter la détérioration des équipements fragiles. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide de formules statistiques standards, en nous basant sur nos données préliminaires et les variables que nous souhaitons soumettre à des tests statistiques. Les données recueillies au cours de ce projet seront traitées à l’aide de logiciels et d’algorithmes adaptés puis la significativité statistique sera évaluée en fonction des données et de leur répartition (normale ou non).
Raffinement
Tous les soins seront pris afin de limiter la douleur et le stress des souris au minimum. Le temps de maintien des souris en hébergement individuel sera réduit à son minimum, et les souris auront néanmoins accès à des stimuli olfactifs, visuels et auditifs provenant d’autres cages (ventilation collective et cages transparentes). Les souris seront quotidiennement pesées et évaluées pendant un minimum de trois jours après la chirurgie. Une analgésie per- et post-opératoire sera délivrée, et une analgésie supplémentaire sera effectuée le lendemain de la chirurgie au besoin. Si des signes de mal-être sont observés en dehors de la période post-opératoire, les animaux seront placés en observation quotidienne afin d’alléger ce mal-être et de remédier à la cause sous-jacente. Une grille d’observation des signes cliniques et un arbre décisionnel correspondant sont mis en place afin de limiter le stress ou la douleur et d’optimiser le bien-être animal. Tout signe de douleur sera pris en charge médicalement, à titre conservatoire, par analgésie, jusqu’à amélioration de l’état de l’animal ou euthanasie si dépassement des points limites. Afin de diminuer le stress provoqué par les expérimentations, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention manuelle nécessaire à la connexion des différents équipements. De plus, ce stress sera maintenu au minimum nécessaire pour induire un apprentissage chez les souris et il est à noter que les souris peuvent à tout moment se réfugier dans un endroit abrité et diminuer leur niveau d’anxiété.
Choix des espèces
Chez l’homme, les traitements disponibles des troubles anxieux (au sens large) pâtissent d’un manque relatif d’efficacité et sont associés à de nombreux effets secondaires, causant notamment des troubles de la mémoire. De plus, chez l’homme, aucune méthode ne permet de comprendre les mécanismes cellulaires de la mémoire, nous devons donc utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Nos objectifs scientifiques nécessitent l’enregistrement et/ou la manipulation de neurones spécifiques d’une part et l’évaluation comportementale du comportement anxieux et de la mémoire de peur d’autre part. La caractérisation très solide de tests comportementaux évaluant les éléments sus-cités chez la souris fait de cette espèce, la plus indiquée pour réaliser notre étude. En effet, compte tenu de leur répertoire comportemental riche, de leur relative complexité cérébrale et de leur position position dans l’évolution des espèces, les rongeurs constituent le meilleur modèle animal pour comprendre les fonctions ou dysfonctions du cerveau humain, en particulier dans la dimension cognitive et notamment les fondements comportementaux et neuronaux de la mémoire. Notre étude ne se concentrant pas sur un stade de développement spécifique, nos procédures seront effectuées sur de jeunes souris adultes de 12 à 16 semaines. Elles seront donc à un âge ne présentant pas de vulnérabilité particulière, tout en réduisant au maximum le temps d’élevage.
Comprendre comment les contaminants alimentaires perturbent la flore intestinale et l’hôte chez la souris en étudiant ses protéines
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. La moitié d'entre elles naissent sans microbiote et reçoivent par un gavage unique une flore intestinale d'origine humaine, puis toutes mangent pendant vingt-huit jours un aliment contaminé par un pesticide, une toxine de champignon ou un désinfectant, avec prélèvement de crottes deux fois par semaine. À la fin, toutes sont tuées pour analyser les protéines de leurs tissus intestinaux, et le porteur annonce que l'exposition alimentaire "ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux". Sur le remplacement, il décrit des méthodes de laboratoire "de plus en plus développées" pour reproduire ces interactions, avant de conclure qu'il "reste nécessaire d'étudier leurs effets chez l'animal".
Objectifs
Le microbiote intestinal est constitué de milliers de micro-organismes, tels que des bactéries, des champignons et des virus, qui vivent dans notre intestin. Il joue un rôle important dans le maintien de notre santé et peut être impliqué dans le développement de certaines maladies. Son équilibre peut être perturbé par différents facteurs, notamment l’alimentation, certaines maladies ou l’exposition à des substances présentes dans notre environnement telles que les pesticides, les toxines produites par des champignons ou les produits désinfectants. Ces perturbations peuvent fragiliser la paroi intestinale et favoriser des problèmes liés au métabolisme ou au système immunitaire. Nous étudierons l’impact des contaminants sur les protéines produites par les souris et les micro-organismes des flores intestinales (de souris ou humanisées), en comparaison avec les souris témoins. Cette étude nous apportera des informations sur l’état de santé de l’intestin et sur les interactions de la flore intestinale avec l’organisme hôte.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment trois contaminants peuvent modifier le microbiote intestinal et altérer le fonctionnement de l’organisme. Les résultats permettront notamment d’identifier les changements dans la composition du microbiote, son activité et la réponse de l’organisme après exposition à ces substances. En mettant ces différents changements en relation, nous chercherons à mieux comprendre comment l’exposition à des substances toxiques peut perturber l’équilibre du microbiote et contribuer au développement de certaines maladies. Les résultats obtenus pourront contribuer à améliorer l’évaluation des risques liés à ces contaminants et à mieux protéger la santé humaine et animale, dans une approche « Une seule santé ». Le projet permettra également de développer des méthodes et des outils d’analyse facilitant l’utilisation de la métaprotéomique pour étudier les perturbations du microbiote, afin de mieux prendre en compte ces effets dans l’évaluation des risques liés aux contaminants.
Procédures
Seules les souris axéniques au départ (souris à flore humanisée) subiront un seul gavage qui ne durera pas plus d'une minute. Le gavage sera effectué sur des animaux éveillés et ne sera réalisé qu’une seule fois pour l’inoculation du microbiote d’origine humaine. L’administration des contaminants se fera par l’alimentation pendant toute la durée de l’exposition (28 jours), après l’inoculation du microbiote et sa stabilisation (sauf pour les animaux avec aliment témoin). Des échantillons de matières fécales (1 à 2 crottes) seront prélevés chez l’ensemble des souris une fois par semaine entre leur arrivée et le démarrage de la supplémentation, puis deux fois par semaine jusqu'à la fin de l’étude.
Impact sur les animaux
Le gavage, qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté afin d'assurer la sécurité des animaux et de réduire leur inconfort lors de la contention. L’administration des contaminants se fera par l’alimentation pendant toute la durée de l’exposition, après inoculation du microbiote et sa stabilisation (sauf pour les animaux avec aliment témoin). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux ni provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif. Les opérateurs sauront rapidement repérer d’éventuels signes cliniques afin de limiter leur souffrance.
Devenir
À la fin de la procédure, l’ensemble des animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses protéomiques sur leurs tissus intestinaux.
Remplacement
À ce jour, il est difficile de reproduire complètement les interactions entre le microbiote intestinal et l’organisme avec des modèles cellulaires. L’intestin est en effet un système complexe qui fait intervenir plusieurs éléments, notamment la digestion, le système immunitaire et le microbiote. Pour les contaminants présents dans les aliments, des méthodes de laboratoire sont de plus en plus développées afin de reproduire ces interactions. Cependant, il reste nécessaire d’étudier leurs effets chez l’animal afin de prendre en compte l’ensemble des mécanismes se produisant après l’ingestion d’un contaminant, ainsi que leurs conséquences sur les protéines présentes dans l’intestin.
Réduction
Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par lot, à savoir 10 souris (5 mâles et 5 femelles) réparties dans 4 lots pour les souris conventionnelles et 4 lots pour les souris à flore humanisée. Ces lots sont eux-mêmes subdivisés en 4 groupes de traitement (comprenant le groupe contrôle de chaque flore et chaque sexe), soit un total de 5 x 2 (sexes) x 4 (lots contaminés ou de contrôle) x 2 (flore murine ou humanisée) = 80 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte de la variabilité des données métaprotéomiques pour les effets de la flore, du traitement et du sexe.
Raffinement
Le transport des animaux sera assuré par un transporteur agréé garantissant leur bien-être. À leur arrivée dans nos locaux, ils seront hébergés par groupe de cinq (mâles et femelles séparés) dans des cages. Pour les animaux axéniques, les cages seront à l’intérieur d’un isolateur avec une ventilation adéquate. Les animaux auront à leur disposition de la litière en bois, un palier et un tunnel suspendu, des igloos, des matériaux pour la nidification et d'autres matériaux d'enrichissement tout au long du protocole. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée, avec utilisation d’une grille de scoring pour la détection des points limites. Le seuil de déclenchement est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, consistance des fèces, perte de poids de plus de 15 %, déshydratation, yeux et abdomen creux) suffisamment prédictifs et spécifiques à ce projet.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé pour étudier les perturbations du microbiote intestinal. La souche utilisée est particulièrement bien documentée et permet de reproduire et d’étudier ces perturbations dans des conditions contrôlées. Elle permet notamment d'administrer facilement des contaminants dans l'alimentation, de contrôler les doses utilisées et de suivre l'évolution de la perturbation du microbiote ainsi que son éventuel retour à l'équilibre. Les souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote, constituent également un modèle reconnu pour étudier le rôle du microbiote humain et ses interactions avec l’organisme. Leur utilisation dans ce projet est cohérente avec la première partie de l’étude qui utilise la même souche de souris, mais avec un microbiote normal. Les souris axéniques auront 5 semaines à leur arrivée et commenceront le traitement à l’âge de 9 semaines. Cet âge correspond au début de la maturité sexuelle et au stade « jeune adulte » chez la souris. Il est adapté aux objectifs du projet, les perturbations du microbiote intestinal étudiées concernant notamment cette période de la vie. Les souris conventionnelles seront également traitées à partir de l’âge de 9 semaines afin de conserver les mêmes conditions d’âge entre les différents groupes.
Allaitement et transmission des Orthoflavivirus (Zika, dengue et fièvre jaune) : approches mécanistiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2 213 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, mères allaitantes et souriceaux de deux à vingt et un jours. Chaque femelle peut être infectée par la dengue, Zika ou la fièvre jaune, subir jusqu'à trois prises de sang en huit jours, recevoir une injection d'hormone, puis passer cinq minutes sous anesthésie générale sans réveil pour le prélèvement de son lait. Les souriceaux sont infectés par voie orale ou par gavage, et le porteur indique que certains peuvent exceptionnellement s'aggraver rapidement jusqu'à la mort, plus souvent avec le virus Zika qu'avec celui de la fièvre jaune. Aucune souris ne sort vivante de la zone de sécurité biologique de niveau 3, et le porteur écrit que cette recherche fondamentale "n'aura pas d'application médicale immédiate".
Objectifs
L’objectif général du projet est de caractériser les mécanismes de transmission par l’allaitement des orthoflavivirus (virus de la dengue, Zika et fièvre jaune) et d’identifier les déterminants viraux et les facteurs du lait maternel impliqués dans cette transmission. Cet objectif se décline en trois objectifs scientifiques : Objectif 1 : Évaluer la transmission du virus de la dengue par l’allaitement et par voie orale • Caractériser la dissémination du virus de la dengue vers les glandes mammaires au cours de l’infection. • Déterminer la présence de virus infectieux dans le lait maternel et en caractériser les formes (virus libre et/ou associé aux cellules). • Évaluer l’infectivité du virus par voie orale chez les souriceaux. • Analyser la transmission du virus aux souriceaux lors de l’allaitement. Objectif 2 : Caractériser les facteurs viraux et la composition du lait en contexte d’infection • Rechercher la présence de la protéine virale NS1 sous forme sécrétée dans le lait maternel pour les trois virus. • Déterminer les formes de NS1 (libre et/ou associée à des lipoprotéines). • Analyser la composition du lait (lipides, lipoprotéines, apolipoprotéines) en conditions infectées et non infectées. • Étudier les interactions entre les particules virales, NS1 et les composants lipidiques du lait. Objectif 3 : Étudier l’infection des glandes mammaires et ses conséquences • Déterminer le tropisme cellulaire de l’infection dans les glandes mammaires. • Évaluer l’impact de l’infection sur l’intégrité des tissus mammaires. • Analyser la réponse immunitaire locale associée à l’infection. Les données obtenues permettront de mieux comprendre les mécanismes de transmission des virus par l’allaitement et d’identifier des facteurs modulant la transmission/l’infectivité virale dans ce contexte. Pour compléter ces expériences, des modèles in vitro d’épithélium intestinal seront utilisés pour étudier l’impact de NS1 et/ou des lipides et des lipoprotéines du lait sur la capacité des virus à franchir la barrière intestinale, étape clé de l’infection orale chez le nouveau-né.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre si certains virus transmis par les moustiques, comme ceux de la dengue, du Zika ou de la fièvre jaune, peuvent également être transmis de la mère au nouveau-né par l’allaitement. Les chercheurs étudieront si ces virus peuvent être présents dans le lait maternel, sous quelle forme ils s’y trouvent et comment ils pourraient éventuellement franchir les défenses naturelles de l’intestin du nourrisson. Ils analyseront également l’impact de l’infection sur les glandes mammaires et sur la composition du lait. Les résultats permettront de mieux comprendre les interactions entre les virus, le lait maternel et le nouveau-né. Ils contribueront à combler un manque important de connaissances sur une voie de transmission encore mal connue. Cette recherche est avant tout une recherche fondamentale visant à améliorer les connaissances scientifiques. Elle n’aura pas d’application médicale immédiate, mais les données obtenues pourront à terme aider à mieux évaluer les risques potentiels pour les nourrissons et à orienter les futures stratégies de prévention.
Procédures
Une partie des souris seront infectées avec un virus (dengue, Zika ou fièvre jaune) par une injection sous-cutanée une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées par administration orale dans la bouche à l’aide d’une pipette ou par gavage avec une sonde souple une fois pour une durée de quelques secondes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Certaines souris feront l’objet d’une injection intrapéritonéale d’hormone une fois pour une durée de quelques secondes puis de prélèvement de lait maternel, sous anesthésie générale sans réveil, une fois pour une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les administrations et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille (ou d’une sonde souple pour le gavage) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. Par conséquent, l’impact principal de nos procédures proviendra de l’infection virale elle-même (virus de la dengue, Zika ou de la fièvre jaune (virus sauvage ou souche vaccinale)). Dans certains cas (selon le virus, la dose infectieuse, la voie d’injection), l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante, une apathie, et des signes extérieurs de souffrance tels qu’un dos voussé, un pelage hérissé, et/ou un faciès de souffrance. Dans le cas particulier de l’infection de souriceaux, d’après notre expérience avec les virus Zika et de la fièvre jaune, certains animaux peuvent exceptionnellement présenter une aggravation rapide de leur état, pouvant entraîner des signes de souffrance importants ou une mortalité malgré la surveillance mise en place. Ce phénomène reste rare, mais il est observé plus fréquemment avec le virus Zika qu’avec le virus de la fièvre jaune.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ces animaux auront été infectés et manipulés en zone de sécurité biologique de niveau 3.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une collaboration de recherche visant à mieux comprendre et mesurer les risques en santé humaine liés à la transmission des virus de la dengue, Zika et de la fièvre jaune par le lait, ainsi que les mécanismes et les facteurs de risques associés. Des expériences in vitro, utilisant des organoïdes et cultures de cellules primaires, seront réalisées en parallèle de ce projet pour caractériser l’impact de facteurs viraux ou composants du lait maternel sur le franchissement de la barrière intestinale du nourrisson. Cependant, aucune expérience in vitro ne peut permettre de répondre aux objectifs de ce projet (étude de la dissémination du virus dans les glandes mammaires des individus infectés, de la charge virale dans les glandes mammaires et le lait, le tropisme cellulaire de l’infection dans la glande mammaire, l’impact de l’infection sur la composition du lait maternel, l’efficacité de transmission par allaitement et l’impact à plus ou moins long terme de l’infection sur l’intégrité et la fonction de la glande mammaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une planification rigoureuse des expériences, permettant de sélectionner les conditions d’étude les plus pertinentes et de limiter les répétitions inutiles. Les résultats acquis au cours des premières étapes du projet seront utilisés pour déterminer les conditions expérimentales dans la suite du projet, et éviter la réalisation de conditions expérimentales superflues sur un grand nombre d’animaux. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de l’expérience acquise lors de travaux antérieurs et de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en utilisant le plus petit effectif compatible avec cet objectif. Les animaux étant infectés et les analyses nécessitant le prélèvement de différents organes, ils ne pourront pas être réutilisés dans d’autres expériences. En revanche, après la mise à mort, un maximum d’échantillons sera prélevé sur chaque animal afin d’exploiter au mieux les tissus collectés et de limiter le recours à des animaux supplémentaires. Le nombre de répétitions pour chaque expérience pourra éventuellement être réduit au cours du projet grâce à des analyses statistiques intermédiaires.
Raffinement
Deux enrichissements seront utilisées dans toutes les cages contenant des souris lactantes et leurs portées : des igloos ainsi que du coton afin notamment que les mères puissent construire des nids pour leurs portées de souriceaux. Durant la gestation et après la mise bas, chaque mère sera toujours hébergée en compagnie d’une autre femelle adulte (mère elle-même ou pas) , ce qui selon notre expérience réduit considérablement leur stress et le risque que la(les) mère(s) mange(nt) ses(leurs) souriceaux. Tous les gestes techniques effectués sur les mères allaitantes et leurs portées ont été discutés avec la structure du bien-être animal et adaptés spécifiquement afin de garantir un maximum de bien-être pour tous les animaux durant toutes les expériences. Les expérimentateurs changeront également de gants entre les manipulations de chaque portée pour ne pas perturber la reconnaissance (par l’odorat) des souriceaux par leur mère. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et d’autres signes de souffrance (dos voussé, poils hérissés, faciès douloureux). Les animaux infectés seront évalués quotidiennement pendant la période symptomatologique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : perte de poids importante (>20%, ou colonne vertébrale visible), dos voussé, faciès douloureux, isolement dans la cage et/ou perte de mobilité. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire. Au besoin, une réhydratation sous-cutanée sera effectuée, et les cages pourront être chauffées. Des points limites (précisés dans chaque procédure) spécifiques et précoces seront utilisés afin de minimiser la souffrance.
Choix des espèces
La souris A129 est un modèle d’étude scientifiquement reconnu pour l’infection par les orthoflavivirus, notamment les virus Zika et de la fièvre jaune . Ce modèle nous a déjà permis d’effectuer des études publiées sur l’efficacité de la transmission des virus Zika et de la fièvre jaune par allaitement, et a permis de montrer des résultats discriminants concernant l’efficacité de cette vie de transmission selon les virus et les souches sauvages ou vaccinales. Cette lignée est établie depuis longtemps et est élevée dans notre animalerie. Bien que les glandes mammaires de souris soient de forme plane et au nombre de 10, leur structure interne et composition cellulaire est semblable aux glandes mammaires humaines. Ce modèle permet d’utiliser un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, comme l’indiquent nos précédentes études. Les animaux utilisés dans les procédures seront : Des souris femelles adultes (procédures 1, 2 et 4, car études concernant les glandes mam-maires et/ou l’allaitement), et des souriceaux mâles et femelles (âge : entre 2 et 21 jours, pro-cédures 2, 3 et 4). Le choix des âges utilisés est lié à la nature du projet, qui est d’étudier la présence de virus infectieux dans les glandes mammaires et le lait, le tropisme viral dans les glandes mammaires, et l’impact de l’infection sur les glandes mammaires ; ainsi que la transmission par voie orale ou directement par allaitement aux souriceaux.
MODIFICATION : Mécanisme de toxicité rénale des maladies du sang associée à une production d’anticorps
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Hébergement individuel de douze heures chaque mois pour recueillir les urines, administration orale quotidienne d'un médicament pendant sept jours à quatre puis à six mois d'âge : 170 souris vont être utilisées, toutes tuées pour récupérer leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris produisent un anticorps humain issu d'un patient, qui se dépose dans leurs reins et provoque des lésions menant à l'insuffisance rénale. Le porteur situe la gravité au niveau sévère. Sa liste d'effets indésirables tient en trois lignes, le stress de l'hébergement individuel et celui de la contention, avec la mention que le médicament "ne provoque pas d'effet secondaire" et que le prélèvement de sang n'en induit pas non plus.
Objectifs
Dans certaines maladies rénales appelées "light chain deposition disease" (LCDD ou maladie à dépôts de chaînes légères d'immunoglobulines monoclonales en français), un anticorps (molécule habituellement destinée à se défendre contre les microbes) fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré-cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. Aujourd’hui, les seuls traitements accessibles pour cette pathologie sont des chimiothérapies ciblant la cellule responsable de la fabrication de l’anticorps en cause. Néanmoins, ces traitements ne sont pas spécifiques et provoquent d’importants effets secondaires. Les mécanismes qui permettent le développement des lésions rénales à la suite du dépôt de l’anticorps ne sont pas connus. Les identifier permettrait donc de développer des médicaments plus ciblés, protégeant le rein des conséquences du dépôt de l’anticorps. Un modèle de souris reproduisant la pathologie humaine a déjà été créé, en permettant la fabrication d’un anticorps humain issu d’un patient atteint de LCDD chez la souris. Cela a permis de montrer que l’anticorps est directement toxique pour le rein. Néanmoins, il reste à comprendre les réponses du rein à la suite de ce dépôt. Nous allons donc utiliser ce modèle de souris afin de répondre à cette lacune des connaissances dans ce domaine. Cela permettra, nous l’espérons, d’identifier des cibles thérapeutiques que nous pourrons cibler pour protéger les reins après dépôts d’anticorps. En particulier, les cellules sénescentes paraissent impliquées dans ce processus. La sénescence, du latin senex ou « grand âge », est un état de la cellule dans lequel la cellule ne peut plus se diviser mais peut secréter un grand nombre de molécules. La sénescence a été impliquée dans plusieurs pathologies, comme le vieillissement ou le cancer par exemple.
Bénéfices attendus
Grace à ce projet nous espérons plusieurs bénéfices - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Caractériser le rôle de la senescence dans le développement des lésions rénale après dépôt d’anticorps. - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Estimer si la suppression des cellules sénescentes permet de protéger le rein de l’apparition de lésions après dépôt d’anticorps. - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec la LCDD) Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions : - collecte d'urines pour mesurer la fuite de protéines dans les urines. Pour cela les animaux seront hébergés de manière individuelle dans des cages spécifiques pendant 12h afin de récupérer leur urine. Cette collecte se fera de manière mensuelle. - traitement par un médicament permettant d'éliminer les cellules senescentes. Ce traitement sera donné par voie orale, à l'aide d'une paille qui sera introduite dans la bouche de l'animal, de manière quotidienne pendant 7 jours, à 4 et 6 mois d'âge. - au moment du sacrifice, les animaux seront anesthésiés et du sang sera prélevé pour mesurer la fonction rénale
Impact sur les animaux
Plusieurs types d'effets indésirables peuvent etre observés. Stress lors de l'hebergement individuel pour collecte d'urine. Stress lors de la contention pour administration du médicament. Le médicament ne provoque pas d'effet secondaire. Le prélèvement de sang n'induit pas d'effet secondaire car les animaux seront anesthésiés et traités par un antalgique.
Devenir
Euthanasie pour collection et analyse d'organe (rein)
Remplacement
Les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie LCDD. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présentes dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.
Réduction
Les procédures ici décrites utilisent des animaux qui risquent de developper des lésions rénales de manière spontanée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous utiliserons la totalité des animaux pour les procédures. Du fait de l’absence de différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons les 2 sexes pour nos procédures. Nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de calculer le nombre minimum d’animaux afin de voir une différence de 15% de la sévérité de l’atteinte rénale après traitement.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Dans les données de la littérature, les souris commencent à développer des lésions rénales microscopiques à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans insuffisance rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Nous étudierons donc les souris tous les mois dès l’âge de 3 mois, jusqu’à 9 mois, âge médian de survie.
Diffusion extravasculaire du variant facteur IX Padua et son rôle potentiel hémostatique dans un modèle murin d’hémophilie B. Modification
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une plaie ouverte dans une patte arrière, puis quinze minutes à compter les caillots qui s'y forment : 27 souris hémophiles B vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent d'abord une injection quotidienne de facteur IX pendant cinq jours, naturel pour un groupe, variant Padua pour l'autre, l'évaluation intervenant sept jours après la dernière injection. La mise à mort est justifiée par un prélèvement d'un millilitre de sang total, volume que le maintien en vie ne permet pas, et les pattes arrière sont ensuite disséquées. Le porteur précise que ces souris, contrairement aux personnes hémophiles, ne saignent pas spontanément et qu'il faut un traumatisme pour provoquer l'hémorragie étudiée.
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX). La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. La prise en charge recommandée est le traitement prophylactique par concentrés de FIX afin de réduire voire éviter les saignements spontanés. Cette prophylaxie peut être également effectuée par la thérapie génique qui permet au patient de produire son propre FIX. Le FIX est une petite protéine qui peut diffuser à l’extérieur des vaisseaux et en cas d’apport régulier de FIX (comme lors d’une prophylaxie au long cours) et y former un réservoir extravasculaire autour des vaisseaux. L’objectif de ce projet est d’évaluer le comportement extravasculaire d’un variant du FIX appelé FIX-Padua chez les souris hémophiles B, ce variant est utilisé pour la thérapie génique de l’hémophilie B chez l’homme.
Bénéfices attendus
Au travers de la comparaison des groupes de souris recevant un traitement par FIX-WT ou FIX-Padua, ce projet pourrait améliorer la compréhension des mécanismes extravasculaires du FIX, en particulier du variant Padua, et clarifier son potentiel à former des réservoirs tissulaires. Il permettra d’évaluer si cette accumulation extravasculaire contribue à une hémostase durable, même en l’absence de FIX plasmatique détectable. Ces résultats pourraient guider l’optimisation des stratégies de thérapie génique pour l’hémophilie B, en améliorant l’efficacité clinique et le phénotype hémorragique en réduisant les saignements sévères, notamment au niveau des articulations et des muscles.
Procédures
Les souris seront séparées en 2 groupes : Groupe 1 : traitement prophylactique par FIX naturel (FIX-WT) Groupe 2 : traitement prophylactique par le variant FIX-Padua Un traitement quotidien par FIX (naturel ou variant Padua) 100 UI/kg sera injecté chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 5 jours. Ensuite, l’activité coagulante du FIX extravasculaire sera évaluée 7 jours après la dernière injection de FIX, en l’absence de tout résidu du FIX dans le sang. Pour cette évaluation, le nombre de caillots sanguins formés seront comptés pendant 15 minutes à partir d’une plaie vasculaire au niveau d’une patte arrière. Un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure de FIX qui doit être indétectable. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et sous médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière et des organes seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche du FIX extravasculaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une plaie vasculaire : 2-3 min 2. Observation de formation de caillots sanguins : 15 min 3. Un prélèvement sanguin : 1 min 4. Une injection: 2 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort: 3-5 min
Impact sur les animaux
Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. Le modèle de souris hémophile KO ne présente pas de saignement spontané mais un risque d’hémorragie en cas de blessure.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude l’étude de la diffusion du FIX dans les tissus dont les articulations. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal.
Raffinement
Application de points limites stricts et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Impact de l’inhibition de la synthese d’aldosterone sur la balance hydrosodee dans l’hypertension arterielle chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement par voie orale vingt jours cumulés, jusqu'à cinq jours par semaine, subissent des régimes pauvres en sodium ou riches en potassium pendant trente jours au plus, passent cinq jours consécutifs en cage individuelle pour le recueil des urines, et voient leur pression artérielle mesurée cinq fois de suite par un ballonnet gonflé sur la queue. L'administration orale peut irriter leur œsophage, le régime et les traitements faire perdre du poids et modifier la mobilité, l'hébergement individuel provoquer un stress social. Cette recherche est fondamentale, et le porteur écrit avoir "besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat" parce qu'il juge impossible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
L'hypertension arterielle et ses complications cardiovasculaires et rénales a une très forte prévalence en Europe et augmente avec l'age pour atteindre près de 50 pour cent après 60 ans. L'hypertension arterielle participe au cercle vicieux liant insuffisance rénale chronique (IRC) et pathologies cardiovasculaires. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre vaisseaux, rein et coeur et d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités. Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’aldostérone, une hormone produite par les glandes surénales, joue un rôle important et induit inflammation et fibrose tissulaire, ce qui joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l'hypertension artérielle. L'aldostérone a également un role crucial dans la balance hydrosodée, régulant l'excretion rénale de sodium et potassium. Les objectifs du projet sont d'étudier les conséquences de l'inhibition de la synthèse d'aldosterone par un nouvel inhibiteur spécifique de l'aldosterone synthase sur la balance hydrosodée et la pression artérielle
Bénéfices attendus
L’insuffisance rénale chronique (IRC) dont la prévalence est d’environ 10 pour cent en europe, selon les pays, a des conséquences cardiovasculaires majeures avec une morbidité et mortalité importantes ce qui représente un cout sociétal considérable. Le nombre de décès liés à l’IRC est estimé à 1,5 million dans le monde et est la 5ieme cause de perte d’année de vie. La proportion de sujets en France ayant une qualité de vie altérée variait de 20 à 50 pour cent dans les dimensions à composante physique selon le degré d’IRC. Disposer d'un modèle rongeur permettant de tester les bénéfices éventuels d'un inhibiteur de la synthase d'aldosterone serait une avancée therapeutique potentielle
Procédures
Les animaux sont soumis à diverses interventions. Certains animaux seront mis sous régimes spéciaux (animal vigile) pendant un maximum de 30 jours pour chaque serie expérimentale. Les animaux seront soumis à une administration orale d'un traitement sur animal vigile, 20 jours maximum cumulés, 1 minute par geste, par periode de 5 jours par semaine, avec une periode de repos de 2 jours, puis une semaine entre les protocoles nourriture controle puis nourriture pauvre en sodium ou riche en potassium. Il est réalisé par une personne formée à cet acte. Pour le recueil des urines (3 fois pendant 8h, une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). Il est réalisé 5 jours consécutifs (animal vigile) pendant 4 périodes selon le protocole avec des temps de repos de 2 jours entre chaque période. Certains animaux ont une injection (1 fois, 1 minute, animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Elle consiste à placer un ballonnet gonflable sur la queue de l’animal puis à mesurer la pression du ballonnet à laquelle le pouls est de nouveau perçu. L’euthanasie est réalisée selon une méthode réglementaire en fin de période expérimentale après prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie (1 fois, quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la douleur et le stress de contention lors de l'administration orale avec irritation possible de l'oesophage , 2) les conséquences de changement de la pression artérielle (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 3) le régime alimentaire spécial et les traitements peuvent entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux, 4) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress social mais les animaux seront dans la même pièce que leur congénères 5) le stress lié à la manipulation et la contention durant l'administration du traitement et la prise de pression artérielle 6) le stress et la douleur légère de courte durée au site d'injection 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro (spécificité de l'antagoniste aldosterone synthase (ASI) dans des cellules de surrénale). Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde par l'aldostérone et de la signalisation sous-jacente dans l'hypertension artérielle. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu
Réduction
Nous avons d'abord fait une étude de la littérature (ainsi qu'une estimation grâce à un algorithme fournis par un logiciel) pour s'assurer de la faisabilité du projet ainsi que pour estimer le nombre d'animaux nécessaire pour qu'on puisse mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 10 rats males ou femelles pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 120 rats
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique: les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après: carré de lanière kraft et batonnet en bois. Un enrichissement pour se cacher et grimper pourra être ajouté (tunnel, hutte ou équivalent en PVC ou autre). Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, certaines analyses cardiovasculaires seront réalisées après habituation, afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis. Pour réduire les nuisances les actions suivantes seront réalisées: le comportement des animaux sera surveillé attentivement, en référence à une grille de scoring de l’animalerie. Les rats sont maintenus 2 par cage au minimum (ça dépend de leur poids, nous suivons les recommandations de la réglementation française). Une période d’acclimatation réglementaire de 7 jours est respectée si les animaux proviennent d’un fournisseur extérieur.
Choix des espèces
L'espèce rat a été choisie car c'est un modèle établi pour le développement de l'hypertension et maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons d'un modèle de rats génétiquement modifiés Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les animaux contrôles sont les littermates (frères et soeurs des même portée) non transgéniques donc élevés au même endroit.
Rôle des perturbations métaboliques associées à l’obésité dans le cancer colorectal héréditaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Quatre lignées de souris à phénotype dommageable développent des lymphomes spontanés à partir de cinq mois, et des tumeurs intestinales à partir de six mois en condition d'obésité. 720 souris de ces lignées vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une alimentation qui les rend obèses, un traitement injecté dans le péritoine, des palpations abdominales deux fois par semaine, et pour les tests métaboliques une mise à jeun la veille puis des prélèvements de sang répétés à la veine de la queue après incision. Le porteur décrit des masses tumorales pouvant entraîner diarrhées, prolapsus, signes d'anémie, et annonce la mise à mort en fin d'expérimentation "afin de réaliser des prélèvements terminaux".
Objectifs
Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus fréquents et représente un enjeu majeur de santé publique. Bien que plusieurs facteurs génétiques jouent un rôle dans son initiation, la majorité des cancers colorectaux sporadiques sont imputables à des facteurs environnementaux tels que l'obésité, le tabagisme et les carcinogènes alimentaires. Il est bien connu que le risque de développer un cancer colorectal augmente avec l'obésité. Cependant, les mécanismes biologiques par lesquels les régimes alimentaires occidentaux influencent le développement du cancer colorectal ne sont pas bien compris. Ce projet de recherche a pour objectif global d’identifier comment les perturbations métaboliques déclenchées par une alimentation obésogène promeuvent la progression du cancer colorectal et de caractériser les liens complexes entre l'obésité et le contrôle du métabolisme.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un enjeu majeur de santé publique et permettra de développer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients obèses atteints de cancers digestifs.
Procédures
Les souris seront soumises ou non à un régime alimentaire les rendant obèse, puis un traitement leur sera administré intra-péritonéalement (temps estimé : 15 secondes). Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien et seront pesés 2 fois par semaine (temps par pesée : 10 secondes). Afin de suivre l’évolution tumorale, les souris seront, à l'occasion de la pesée, palpées au niveau abdominal (temps estimé : 15 secondes). Pour les tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun la veille. Ensuite, les souris recevront une injection intrapéritonéale de glucose ou d'insuline (temps estimé : 15 secondes). A l’issue de l'injection, des prélèvements sanguins seront effectués (temps estimé : 30 secondes) à la veine caudale après incision transversale légère au niveau de la queue à intervalles de temps réguliers pour mesurer la glycémie ou une éventuelle intolérance à l’insuline.
Impact sur les animaux
Le phénotype attendu des animaux est le développement le développement spontané de lymphomes à partir de 5 mois de vie et en condition d’obésité, des tumeurs intestinales, à partir de 6 mois de vie. Les nuisances associées à ce développement de tumeurs peuvent être les suivantes : développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles digestifs (diarrhées, prolapsus notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement. À ces effets liés au modèle s’ajoutent les nuisances expérimentales : les manipulations et contentions répétées peuvent être sources de stress pour les animaux. L’administration de tamoxifène est également susceptible d’induire des effets indésirables transitoires, tels qu’une gêne locale. Enfin, les prélèvements sanguins répétés peuvent engendrer une douleur légère à modérée au point de prélèvement, ainsi qu’un stress associé à la manipulation, et, en cas de répétition rapprochée, un risque d’affaiblissement ou d’anémie.
Devenir
Les souris seront euthanasiées en fin d'expérimentation afin de réaliser des prélèvements terminaux
Remplacement
Les questions posées dans ce projet portent sur la manière dont les tumeurs apparaissent et évoluent au fil du temps. Pour y répondre, il est nécessaire d’utiliser des souris, car elles permettent d’étudier le fonctionnement du corps dans son ensemble. En effet, le comportement des cellules cancéreuses, notamment leur métabolisme, peut être très différent entre des expériences en laboratoire (sur cellules isolées) et un organisme vivant. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier ces phénomènes de façon aussi complète. L’utilisation de souris reste donc indispensable, en particulier pour comprendre les premières étapes de formation des tumeurs. Enfin, ce projet vise aussi à étudier les interactions entre différents organes et la tumeur, ainsi qu’à identifier des marqueurs détectables dans le sang. Ces objectifs nécessitent obligatoirement une étude sur un organisme entier.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant de devoir refaire les expériences. Seuls les régimes alimentaires ayant montré les effets les plus marqués seront testés. Chaque groupe comprendra 20 souris (10 par type d’alimentation), ce qui permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour tirer des conclusions solides. Pour analyser les résultats, nous comparerons la croissance des tumeurs entre les différents groupes au fil du temps, ainsi que les caractéristiques biologiques des tumeurs prélevées. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour comparer les données entre groupes. Au total, sur les 5 ans du projet, jusqu’à 720 souris pourront être utilisées, réparties en plusieurs groupes expérimentaux. Ce nombre repose sur des calculs statistiques ainsi que sur l’expérience du laboratoire avec des modèles similaires
Raffinement
Ces 4 lignées à phénotype dommageable présentent des caractéristiques phénotypiques spécifiques liées à l’émergence de lymphomes spontanés dont il faudra tenir compte. Un examen journalier des animaux inclus dans les groupes expérimentaux sera effectué pour renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux associés à une douleur liée à l’émergence de tumeurs (ataxie, troubles de la respiration, isolement, absence de mobilité ou agitation anormale, modification de l’embonpoint, hérissement des poils, dos voûté…). La sévérité de ces signes sera déterminée selon une grille d’évaluation jointe en annexe qui permettra la mise en place de soins éventuels ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 animaux maximum par cage. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (bâtonnets en coton (safe roll), frisottis, cabane en carton)). Les groupes expérimentaux seront réalisés de telle sorte à limiter la présence d’animaux isolés.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui sont un modèle représentatif de l’homme et présentant une reproduction rapide, ce qui permet de raccourcir le temps des projets. De plus, les modèles de souris ont été validés dans l'étude de la physiopathologie intestinale car elles développent des tumeurs proches de celles observées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel, traitées à partir de 7 semaines, âge correspondant à leur maturité sexuelle.
Evaluation de l’effet vaccinal d’un immunostimulant sur la croissance tumorale
- Recherche appliquée
- Cancers
Tester si un composé immunostimulant injecté avant l'apparition d'une tumeur protège du cancer : 60 souris vont être utilisées pour cette question, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent trois injections hebdomadaires dans la veine de la queue ou sous la peau en étant vigiles, puis une greffe de cellules tumorales sous la peau, et leurs tumeurs sont mesurées trois fois par semaine pendant six semaines. Après l'injection, les souris peuvent présenter fatigue et baisse d'activité comparables à un état grippal, et une gêne pour se déplacer quand la tumeur grossit. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, renseigner sur le caractère préventif du produit, pour un projet qui prévoit la mise à mort des 60 souris.
Objectifs
L’immunothérapie est une stratégie innovante contre le cancer qui consiste à stimuler les défenses naturelles du corps pour qu’elles attaquent les cellules tumorales. Un composé capable d’activer le système immunitaire est connu depuis longtemps pour déclencher une forte réponse immunitaire. Cependant, son utilisation chez l’humain est limitée car il peut être toxique, même à très faible dose. Pour contourner ce problème, une version modifiée, moins toxique et plus efficace a été développée. Chez la souris, ce traitement a permis de ralentir fortement la croissance de plusieurs types de cancers, soit utilisé seul, soit combiné à d’autres immunothérapies, sans provoquer d’effets secondaires graves. Jusqu’à présent, seul l’effet comme traitement du cancer déjà installé a été étudié. En revanche, on ne sait pas encore s’il pourrait aussi agir comme une forme de « vaccin » capable de préparer durablement le système immunitaire à se défendre contre l’apparition d’une tumeur. L’objectif de cette étude est donc d’évaluer si l’injection de ce composé avant l’apparition du cancer peut protéger les souris contre le développement tumoral, à court et à long terme.
Bénéfices attendus
Cette étude va permettre de renseigner sur le caractère préventif du médicament, en plus de sa capacité à freiner la croissance tumorale (curatif).
Procédures
- contention + injection dans la veine de la queue et/ou sous la peau (animal vigile) – durée
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans cette étude peuvent subir plusieurs formes d’inconfort liées aux procédures expérimentales. La manipulation et le maintien des animaux pour les examens ou les mesures des tumeurs peuvent être source de stress. Certaines interventions peuvent également provoquer une douleur légère et de courte durée, notamment lors de l’injection des cellules tumorales sous la peau ou lors de l’administration du vaccin dans la veine de la queue. Après l’injection du vaccin, les souris peuvent présenter pendant quelques heures des signes temporaires de fatigue et de baisse d’activité, comparables à un état grippal chez l’humain. Une perte de poids passagère peut aussi être observée, mais les animaux retrouvent généralement leur poids normal en un à deux jours. Au fur et à mesure de la croissance de la tumeur, les souris peuvent ressentir une gêne pour se déplacer si celle-ci devient volumineuse. Toutefois, le modèle de cancer utilisé ne provoque pas de métastases attendues.
Devenir
Les animaux seront à mis à mort à la fin des procédures dû à la présence de tumeurs.
Remplacement
Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité des différents composés testés a été préalablement validée. Le modèle animal doit être utilisé pour évaluer l’effet de ces composés sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion d’un composé dans le sang et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activée, sa migration et son effet sur la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.
Réduction
Selon les précédentes expériences, le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a pu être déterminé grâce à un logiciel statistique, en tenant compte du pourcentage de prise tumorale. Le nombre d’animaux prévu pourra être revu à la baisse en fonction des résultats obtenus lors de la première procédure.
Raffinement
Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs. Les souris seront randomisées par marquage à la queue (feutre de couleur) afin d’éviter le stress des changements de cages/congénères. De la nourriture humide sera ajoutée après chaque traitement pour encourager la prise, et palier à la perte de poids. Afin d’améliorer le bien-être animal et limiter les gestes subis, les souris contrôles ne recevrons pas d’injections « placebo ».
Choix des espèces
Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats suffisamment représentatifs. Les souris seront utilisées entre 6 et 10 semaines d’âge. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale. Des femelles et des mâles seront utilisés afin d'avoir une bonne représentation de l'effet du médicament.
Evaluation pré-clinique de nouveaux traitements pour le cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une injection de cellules cancéreuses directement dans le foie, par un acte chirurgical de quinze minutes sous anesthésie, ouvre le protocole. 5 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles génétiquement modifiées pour avoir un système immunitaire compromis. Les tumeurs hépatiques attendues se développent "sans affecter de manière importante l'animal", indique le porteur, qui explique aussitôt que le foie est peu innervé et que les tumeurs sont collectées tant qu'elles restent petites. La mise à mort intervient à la fin de chaque procédure, pour collecter les foies.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le principal cancer primitif du foie, dont l'incidence est en croissance constante. Il constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde. Cela est notamment dû à un manque d’options thérapeutiques efficaces, et la survie à 5 ans est inférieure à 10% des patients. Il est donc crucial de développer de nouveaux médicaments pour cette maladie. Notre projet de recherche vise au développement de nouveaux outils thérapeutiques anti-tumoraux basés sur l’activation du système immunitaire contre la tumeur. Il s’agit d’établir une preuve de concept de l’efficacité de ces molécules dans le contexte du carcinome hépatocellulaire et de réaliser les études précliniques préalables au développement d’un essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques contre le cancer du foie, qui provoque plus de 900 000 décès par an à l’échelle mondiale, et de tester leur absence de toxicité pour le foie. Ces étapes sont requises avant de pouvoir lancer un essai clinique chez l’homme. Par ailleurs, si ces composés se confirment être efficaces, leur utilisation pourra possiblement être étendue au traitement d’autres cancers.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection des cellules dans le foie, nécessitant un acte chirurgical sous anesthésie (15 minutes par souris), ou bien à une injection de solution saline contenant de l’ADN (30 secondes par souris). Les animaux recevront les différents composés thérapeutiques par une injection unique. Quelques gouttes de sang seront prélevées au cours des procédures pour réaliser des analyses de marqueurs plasmatiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont l’apparition et la croissance de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte que modérément le fonctionnement de l’organe. Il existe également un stress induit par la contention de l’animal, et une gêne possible liée à la cicatrice. Enfin, le composé thérapeutique peut entrainer un léger état fiévreux pour l’animal dans les 24 heures suivant son administration. Il existe également les effets transitoires de l'anesthésie (ralentissement des fonctions physiologiques et baisse de la température corporelle). Les animaux sont évalués quotidiennement pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et analyser le développement de tumeurs dans cet organe.
Remplacement
Nous avons réalisé le plus d’expériences possible en laboratoire sur des cellules en culture. Cela nous a permis d’obtenir des résultats importants tout en limitant l’usage d’animaux. Cependant, pour tester l’efficacité de nos candidats-médicaments pour le cancer du foie, nous, nous devons maintenant passer à des expériences chez la souris. En effet, la formation et la croissance des tumeurs dépendent de nombreux facteurs qu’on ne peut pas reproduire entièrement dans une boîte de culture : l’environnement du foie, les interactions avec d’autres organes, et la réponse globale de l’organisme. De plus nos composés fonctionnent via l’activation des défenses immunitaires contre les tumeurs, ce qui impose d’étudier leur efficacité au niveau de l’organisme entier.
Réduction
En collaboration avec notre service de statistiques, nous avons soigneusement calculé le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il en ressort qu’il nous faut 10 animaux par groupe expérimental pour pouvoir répondre de manière rigoureuse à notre question scientifique. Par ailleurs, nous avons restreint nos expériences au strict nécessaire, en nous focalisant rapidement sur les trois composés thérapeutiques les plus prometteurs et en réduisant le nombre de moments d’analyse, afin de réduire au maximum l’impact sur les animaux tout en conservant la validité des résultats.
Raffinement
Nous avons soigneusement planifié et optimisé notre protocole expérimental, en suivant les recommandations européennes, afin de réduire au maximum les contraintes pour les animaux. Concrètement, nous avons choisi de combiner un analgésique avec une anesthésie plus légère, nous avons réduit la durée de la chirurgie et nous utiliserons un tapis chauffant pour stabiliser la température corporelle, ainsi que l’application d’une crème réparatrice pour favoriser la cicatrisation. Après la chirurgie, nous donnons aux souris une pâtée enrichie, énergétique, pour favoriser leur récupération. Ensuite, grâce à une grille de surveillance, nous suivrons les animaux quotidiennement pour intervenir si nécessaire et éviter qu’ils ne développent un inconfort lié à la tumeur.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est proche de la maladie humaine. Ces approches sont soutenues par de multiples publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. . Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées, avec un système immunitaire compromis, pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse aux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).