Rongeurs
Formation à la technique microchirurgicale chez le rat
- Enseignement supérieur
Former 130 chirurgiens et vétérinaires par an à la suture sous microscope : 10 595 rats vont être utilisés, 8 165 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 2 430 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une ou deux chirurgies pouvant durer jusqu'à quatre heures, et tous sont tués à l'issue, le porteur invoquant l'impact qu'auraient les interventions pratiquées. Les rats sont choisis parce que le diamètre de leurs vaisseaux correspond à celui des artères digitales humaines suturées lors des réimplantations. Le porteur écrit que le recours aux rongeurs est "hélas nécessaire" faute de simulateur reproduisant les facteurs thrombogènes du flux sanguin, et signale une baisse de 16,5 % du nombre d'animaux depuis l'ajout de cinq séances préalables sur tissu inerte.
Objectifs
La microchirurgie (chirurgie sous microscope opératoire) est une technique utilisée dans de nombreuses disciplines chirurgicales dont la chirurgie de la main, la chirurgie plastique, en chirurgie orthopédique et traumatologique, en neurochirurgie et en chirurgie pédiatrique. Or pour être parfaitement maîtrisée, la technique microchirurgicale nécessite un entraînement long, régulier et progressif et cet apprentissage ne peut se faire qu’en laboratoire. La formation est obligatoire dans certaines disciplines chirurgicales, telle que la chirurgie de la main et la chirurgie plastique, mais elle est également très utile pour tous les internes en chirurgie, quelle que soit leur future spécialité. C’est une technique rigoureuse qui n’accepte aucune approximation. Cette rigueur et cette précision permettent au chirurgien l’acquisition d’une grande technicité qui lui sera très utile pendant toute sa carrière. L’utilisation des rongeurs dans la formation est hélas nécessaire car actuellement aucun simulateur n'est capable de reproduire la complexité des structures des organismes vivants (organes in-vivo, réseaux vasculaires complexes) ainsi que les facteurs thrombogènes du flux sanguin. L'objectif de ce projet est d'assurer la formation à la technique microchirurgicale de 130 chirurgiens et vétérinaires par an. A l'issue de la formation les apprenants doivent parfaitement maîtriser les techniques, aucune erreur n'étant acceptable chez le patient. Pour atteindre cet objectif nous utilisons la méthode pédagogique consistant à varier les exercices et à augmenter les difficultés techniques au fur et à mesure des séances.
Bénéfices attendus
Formation des chirurgiens et vétérinaires à la microchirurgie leur permettant de traiter des patients/animaux avec une grande maitrise technique.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux chirurgies sous anesthésie générale durant maximum 4h. Les animaux seront soumis à des injections pour l'analgésie (1 à 4 fois) et pour l'anesthésie (1 à 2 fois)
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress léger lié à la préhension /contention et à l'injection pour l'administration de l'anesthésie.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet seront mis à mort à l'issue des procédures chirurgicales en raison de l'impact que pourraient avoir les chirurgies réalisées.
Remplacement
Il a été institué 5 séances de travaux pratiques pour tous les étudiants sur tissu inerte avant l’utilisation d’animaux vivants (compresses, tube en plastique, cuisses et ailes de poulet, dissection sur sujet anatomique) ainsi qu’un visionnage de vidéos des techniques. Plusieurs dissections seront faites sur des animaux fraîchement décédés utilisés dans les autres procédures.
Réduction
Depuis la mise en place de travaux pratiques sur tissu inerte en début de formation, la réduction du nombre d’animaux est de 16,5% par rapport au précédent projet. Le nombre de séances a été défini pour permettre d’atteindre une formation complète des étudiants. De plus, l’apprenant ne peut s’inscrire à la formation longue diplômante que s’il a préalablement effectué une formation initiale
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux. L’ensemble des procédures seront réalisées sous anesthésie, avec une analgésie adaptée et des points limites adaptés ont été instaurés.
Choix des espèces
La taille des vaisseaux des rats correspond parfaitement aux vaisseaux suturés sous microscope chez l’Homme, comme par exemple les vaisseaux des doigts lors de réimplantations digitales, en chirurgie pédiatrique ou lors de réalisation de lambeaux libres. Adulte de 2 à 3 mois. A ce stade de développement les animaux ont des vaisseaux de diamètres correspondants aux diamètres de certains petits vaisseaux humains qui doivent être suturés comme par exemple lors de réimplantation des extrémités digitales.
Etude de l’effet du Romiplostim sur la thrombopénie induite par chimiothérapie CIT ( Chimiothérapie Induisant une Thrombopénie) chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur moelle osseuse. Le nombre vient d'un calcul que le porteur détaille : environ trente mégacaryocytes observables par souris, cent nécessaires par condition, six conditions, donc quatre souris chacune. Elles reçoivent une chimiothérapie qui fait chuter leurs plaquettes, puis une injection de Romiplostim et un prélèvement de sang sous anesthésie. Le porteur décrit la thrombopénie induite comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains en l'absence de saignement, tandis que le bénéfice clinique annoncé, faire progresser la prise en charge des patients sous chimiothérapie, reste renvoyé à plus tard.
Objectifs
Chaque année, en France, environ 370 000 personnes atteintes de cancer reçoivent un traitement de chimiothérapie. Ce traitement provoque fréquemment une forte baisse de la numération plaquettaire, appelée thrombopénie, exposant les patients à des saignements. Ces thrombopénies peuvent avoir des conséquences très graves, notamment des retards dans le traitement du cancer. Les plaquettes sont produites dans la moelle osseuse par les mégacaryocytes. Ce processus est sous l’influence d’une hormone, la thrombopoïétine (TPO). Un médicament prometteur, le Romiplostim, qui imite l'action de la TPO, pourrait aider à traiter la thrombopénie induite par la chimiothérapie. Cependant, la moelle osseuse des patients n’étant pas facilement accessible, on ne connait pas encore son impact réel sur les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. L’objectif de cette étude est une analyse quantitative et qualitative de l’état fonctionnel des mégacaryocytes (MK) de la moelle après traitement au Romiplostim, notamment en évaluant l'impact du Romiplostim sur la morphologie des MKs ex vivo à J+8. Pour se faire il sera utilisé 1) un modèle préclinique murin déjà validé par le laboratoire, 2) des souris génétiquement modifiées, sans phénotype dommageable, possédant des mégacaryocytes fluorescents et 3) une approche d'imagerie de pointe, permettant d’imager en temps réel le comportement des mégacaryocytes dans leur environnement natif.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de la PodoPZ des mégacaryocytes. La PodoPZ est une structure présente sur tout le pourtour du mégacaryocyte qui joue un rôle majeur dans la production et la libération des plaquettes dans le sang. Sur le plan clinique, l’impact du Romiplostim en tant qu’analogue de la thrombopoïétine permettra de faire avancer les traitements de restauration de la numération plaquettaire chez les patients sous chimiothérapie. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l’efficacité du traitement anti cancéreux.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 injections et un prélèvement. Une injection sur animal vigile avec une durée de moins d’une minute et une sur animal anesthésié avec une durée de 2-3 minutes. Le prélèvement sanguin s’effectue sur animal anesthésié et dure moins d’une minute. La durée totale de l’anesthésie est d’environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux sont: - Le stress lié à la préhension et contention de l’animal (léger)- La douleur liée aux injections et prélèvements (léger) - La thrombopénie induite par le traitement (léger) - La baisse, éventuelle, du système immunitaire (léger). Concernant le Romiplostim, il n’est pas attendu d’effets indésirables ; au contraire ce dernier devrait améliorer les effets liés au traitement, notamment pour la thrombopénie. La durée de la procédure n’excédant pas 8 jours, il n’est pas attendu d’altération de l’aspect et du comportement des animaux (état corporel, pelage, mobilité, respiration, etc).
Devenir
Les analyses par imagerie auront lieues sur les moelles osseuses des souris, ex vivo. Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Ce projet a pour but de comprendre la capacité des mégacaryocyrtes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement est fortement perturbé par une chimiothérapie. En effet, le franchissement de la barrière vasculaire met en œuvre, simultanément, des interactions entre les mégacaryocytes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Des expériences préliminaires réalisées in vitro sur des mégacaryocytes, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse. Afin de répondre à nos questions, nous devons travailler sur le fonctionnement du système hématopoïétique (création des cellules sanguines) dans sa globalité ; en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. C’est pourquoi, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant, en l’occurrence des rongeurs, par une autre méthode.
Réduction
Nous savons par expérience qu'il nous est possible d'observer en moyenne 30 mégacaryocytes par souris en imagerie. Afin d’effectuer des tests statistiques cohérents, nous devons obtenir environ 100 mégacaryocytes par condition. Il nous faut donc 4 souris par condition, qui sont au nombre de 6, ce qui fait un total de 24 souris.
Raffinement
Les animaux étant habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. Pour les injections, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, selon la procédure en vigueur et un anesthésique local ainsi qu’un onguent ophtalmique seront utilisés. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress lié à la contention. En ce qui concerne la thrombopénie induite par le traitement, en l’absence de saignement, cette dernière est non impactante pour le bien-être animal. Toutefois, nous anticipons tout risque potentiel de saignement, notamment en cas de bagarre, par un enrichissement supplémentaire (tunnel) et un suivi, rigoureux, des animaux sera effectué deux fois par jour. Cela permettra de détecter au plus tôt tout comportement agressif au sein d’une cage. Pour ce qui est du risque lié à la baisse du système immunitaire induite par le traitement, celui-ci est minime ; toutefois les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé qui permettra d’éviter le développement d’une infection. De plus, des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués le cas échéant.
Choix des espèces
Pour ce qui est du choix de l'espèce, la souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir des mégacaryocytes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques, qui dans notre cas est le Romiplostim. En ce qui concerne le stade de développement des souris : les souris adultes (8–18 semaines, 25–30 g) constituent le modèle le plus adapté car leur système hématopoïétique est pleinement mature, stable et comparable à celui de l’adulte humain, ce qui permet une interprétation pertinente des résultats.
Rôle des senseurs métaboliques dans le comportement et la motivation alimentaires chez un modèle souris de dénutrition
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Trois à six semaines de restriction alimentaire, trois semaines d'isolement, deux séjours de cinq jours en cage métabolique : 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. S'y ajoutent la pose d'un implant crânien sous anesthésie, huit injections sous-cutanées, des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine et une immobilisation par contention de deux à cinq minutes dans une machine IRM. L'objet est de tester si la ghréline et son antagoniste le LEAP-2 modifient la prise alimentaire. Le porteur reconnaît qu'il serait impossible de reproduire chez la souris les aspects multifactoriels de l'anorexie mentale et limite son ambition à un circuit cérébral de la récompense, tout en affirmant que les explorations comportementales sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.
Objectifs
L’anorexie mentale est un trouble du comportement alimentaire qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique associées à de sévères complications. Parmi les troubles psychiatriques, l’anorexie mentale a le taux de mortalité le plus élevé et la compréhension de cette maladie ainsi que son évolution représente un enjeu de santé publique. On retrouve dans l’anorexie mentale un taux de rechute important notamment parce qu’elle implique des comportements de restriction alimentaire et d’hyperactivité physique compulsifs similaires aux comportements addictifs. L’objectif de ce projet, mené chez le modèle souris, est de mieux comprendre le rôle de la ghréline, une hormone digestive, et de son antagoniste, découvert récemment, le LEAP-2 (Liver Expressed Anti-microbial peptide-2) sur le cerveau. Tandis que la ghréline favorise l’initiation des comportements alimentaires et contrôle les aspects motivationnels et renforçateurs de l’alimentation, ses concentrations sanguines sont élevées dans l’anorexie mentale. Notre hypothèse est que le LEAP-2 pourrait avoir un effet inverse à la ghréline et inhiber la prise alimentaire dans l’anorexie mentale. Pour cela, nous allons tester dans quelle mesure la régulation des taux de ghréline et de LEAP-2 pourraient améliorer les symptômes de l’anorexie. Bien qu'il n'y ait pas de modèle parfait d'anorexie chez la souris, nous utilisons un protocole de restriction alimentaire mimant certaines caractéristiques de la pathologie. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques impliqués dans l’anorexie et d’amener des pistes de traitement pour cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle souris innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale. L'objectif à plus long terme de ce projet est d'identifier des biomarqueurs pertinents liés aux anomalies de la récompense, pouvant servir d'outils diagnostiques ou pronostiques en clinique. Il permettra également d'approfondir la compréhension du dialogue entre le métabolisme et les anomalies des processus de récompense dans l'anorexie, afin de fournir des connaissances utiles pour envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Biopsie de la queue pour génotypage (1 fois durée 5 secondes). Pose d'implants pour l'imagerie ou la délivrance de composés pharmacologiques sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques sous-cutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines. Isolement dans des cages métaboliques (2 fois 5 jours).
Impact sur les animaux
Les animaux seront génotypés à l'aide d'une biopsie de queue faite vers 6 jours ce qui peut entraîner une légère douleur de courte durée. Les prises de glycémies basales sont effectuées en réalisant une petite incision au niveau de la queue pour prélever une goutte de sang, ce qui entraîne un stress transitoire chez les animaux. Le protocole de restriction alimentaire nécéssite un isolement des animaux pendant 3 semaines qui induit un stress. Ce protocole entraine également une perte de poids et une baisse de la glycémie. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer une douleur et des problèmes de récupération. Le scan de la graisse corporelle est réalisée dans une machine IRM dans laquelle les souris doivent être immobilisées par contention pendant 2 à 5 minutes ce qui provoque un stress.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Les animaux non utilisés à l'issue du génotypage seront proposés au don. Lors du prélèvement des tissus, certains tissus non utilisés pourront être récupérés par d'autres membres du laboratoire.
Raffinement
Pour réduire le stress lié à l’isolement des animaux, ils sont hébergés en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie s’effectue sur un coussin chauffant et une sonde permet de monitorer la température de ce dernier pour préserver l’animal de l’hypothermie. Lors de la chirurgie, des analgésiques sont utilisés en pré-opératoire et postopératoire pour limiter la douleur de l’animal. Au cours de la chirurgie, une solution est appliquée sur les yeux de l’animal pour les protéger de l’assèchement. Une injection sous cutanée de solution saline est effectuée en fin de chirurgie pour palier à la déshydratation de l’animal. A la fin de la chirurgie, les animaux sont placés sur un coussin chauffant jusqu’à leur réveil complet puis replacés avec leurs congénères en cage collective avec nourriture et eau à volonté. Pendant les 3 jours suivant la chirurgie les animaux sont surveillés journalièrement. Les animaux ont à disposition dans leur cage des aliments humidifiés pour facilité leur ingestion en cas de douleur. D’autre part, des grilles de points limites sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements dirigés vers un but permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. Notre objectif ici n'est pas de reproduire les aspects multifactoriels de l'anorexie nerveuse dans un modèle murin, car cela serait impossible. Au lieu de cela, notre but est de disséquer un circuit neural spécifique (lié aux anomalies des voies de la récompense) qui pourrait expliquer une dimension particulière de la pathologie. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont réalisées chez des souris adolescentes ou adulte entre l'âge de 6 et 20 semaines.
Caractérisation de l’effet prébiotique et nutrigénomique des produits alimentaires d’origine végétale
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.
Bénéfices attendus
Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.
Procédures
Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.
Devenir
A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.
Remplacement
Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.
Réduction
Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.
Raffinement des méthodes d’administration, de prélèvement et des techniques chirurgicales chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 3303
Cochons d'Inde : 1353
Former et entretenir les gestes techniques du personnel d'un laboratoire conduit à utiliser 3 499 souris, 3 303 rats et 1 353 cochons d'Inde, soit 8 155 animaux. 1 499 sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 5 862 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 794 un niveau sévère. 1 950 sont réutilisés, selon un barème où une procédure modérée vaut quatre points et où le cumul s'arrête à huit, ce qui autorise deux passages avant la mise à mort. Le porteur indique avoir envisagé les mannequins, la 3D et l'entraînement sur animal mort, avant de conclure que le geste sur animal vivant "reste un passage obligatoire", parce qu'il faut vérifier la réussite de la technique sur l'animal réveillé.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’assurer la formation et le maintien des compétences du personnel, en conformité avec les articles 5, 23 et 24 de la Directive 2010/63/UE du Parlement Européen et du conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, afin de garantir la qualité des procédures expérimentales et le respect des principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement). Cette formation régulière est essentielle pour maîtriser les techniques expérimentales (administrations, prélèvements, interventions chirurgicales) et réduire les impacts sur les animaux. Elle repose sur l’utilisation d’un nombre limité d’animaux, conformément aux exigences réglementaires, et contribue directement à diminuer les erreurs, à raffiner les méthodes et à limiter l’utilisation d’animaux dans les phases principales des études. En parallèle, ce projet intègre une démarche continue de raffinement des procédures expérimentales, en veillant à améliorer les pratiques déjà mises en place. Ces améliorations sont basées sur une veille scientifique constante et visent à minimiser le stress et la douleur des animaux, tout en augmentant la fiabilité des résultats obtenus. Ce projet répond aux exigences des agences réglementaires (OCDE, EMA, ANSM) et s’inscrit pleinement dans le cadre légal européen visant à protéger les animaux utilisés à des fins scientifiques. Il garantit que chaque intervention soit effectuée par un personnel formé, compétent et conscient des enjeux éthiques. Ce projet associe formation obligatoire, maintien des compétences et amélioration des pratiques expérimentales, tout en répondant aux attentes réglementaires et en renforçant le bien-être animal dans les travaux de recherche préclinique
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont en lien avec l'amélioration du confort des animaux, la limitation des potentielles souffrances induites par les techniques mises en oeuvre (administrations, prélèvements, chirurgies) et la réduction du nombre global d'animaux utilisés en recherche grâce à l'application de ces techniques par un personnel maitrisant les gestes et formés à raffiner au quotidien leurs pratiques. Un technicien formé qui réalise des administrations de manière précise et avec plus de confiance qu'un technicien peu expérimenté, contribuera à diminuer les possibles erreurs et augmentera la qualité des administrations lors des études réalisées au sein du laboratoire. A la suite de ce projet, il en découlera une diminution du nombre d’animaux, un stress moindre ainsi qu'une baisse du niveau de douleur pour l’animal dans l'ensemble des projets appliqués dans l'établissement utilisateur. La formation du personnel est indispensable pour maîtriser les actes techniques, éviter la souffrance animale, limiter le risque d'erreur dans les procédures et l'utilisation d'animaux. Ainsi, une bonne maîtrise de l'acte permet le respect de la règle des 3R.
Procédures
Les techniques chirurgicales sont réalisées exclusivement sous anesthésie associée à un ou des composés antalgiques/analgésiques. La durée moyenne d'un acte chirurgical est comprise entre 5 et 90 minutes. Un seul acte chirurgical sera dispensé par animal. Les prélèvements de fluides pourront être effectués sur animal vigile ou sur un animal anesthésié selon la technique utilisée qui durera entre 1 et 10 minutes par animal. Le raffinement des techniques et la formation aux administrations sont effectués principalement sur animaux vigiles ou bien anesthésiés. Aussi bien pour les prélèvements que les administrations, chaque animal ne recevra pas plus de 8 actes classés Léger, ou 2 actes classés en modéré. A la suite de certaines techniques chirurgicales des observations comportementales peuvent être réalisées à une seule occasion, de 1 à 4 semaines après la chirurgie, sur une durée de 60 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les administrations, les prélèvements et les techniques chirurgicales entraînent un stress temporaire chez l'animal. Cet inconfort peut apparaitre lors des répétitions de prélèvements. Dans le cas des procédures chirurgicales, la technique réalisée entraine une sensibilité voire une douleur au niveau du site d'implantation, du site de lésion ou sur le trajet du cathéter, malgré la prise en charge péri-opératoire.
Devenir
Un suivi de l’utilisation des animaux est mis en place au sein de l’entreprise, et un score est établi afin d’empêcher une réutilisation excessive, notamment dans des procédures de sévérité modérée. A la suite des procédures modérées précitées, les scores de réutilisation s’incrémentent à chaque procédure appliquée à l’animal (procédure modérée : 4 points). La réutilisation est possible tant que le score cumulé est inférieur à 8 points (une procédure sévère est représentée par un score de 8 points) et que l'animal ne présente aucun signe de mal-être. La décision de la réutilisation revient aux vétérinaires. Au-delà, les animaux sont mis à mort. Les animaux soumis à des actes classifiés sans réveil (notamment car nécessitant une euthanasie de l'animal pour vérifier des repères anatomiques) ou à des chirurgies lourdes ayant un impact sur leur maintien en vie dans de bonnes conditions seront euthanasiés sous anesthésie sans retour à l'état conscient. Les animaux ayant subi une procédure de catégorie sévère sont euthanasiés, car leur maintien en vie dans de bonnes conditions n'est pas possible.
Remplacement
L'ensemble des projets du laboratoire rend incontournable le recours à l'utilisation d'animaux utiles à des fins scientifiques. Toutes les mesures de remplacement ont été envisagées dans le cadre de la formation (mannequins, 3D, bibliographie scientifique, geste technique approché sur animal mort issu d'une procédure expérimentale antérieure) qui reste un passage obligatoire. La mise en œuvre d'une administration, d'un prélèvement ou d’une technique chirurgicale passe nécessairement par une étape sur animal vivant (par exemple la formation aux prélèvements sanguins exige de vérifier la capacité à prélever sans hémolyse ; la formation à la chirurgie touchant aux vaisseaux exige l'entraînement sur animaux vivants pour apprendre le geste sur des vaisseaux non collapsés et vérifier la réussite de la technique sur l'animal réveillé).
Réduction
L'utilisation d'animaux n'aura lieu qu'en cas de nécessité (formation de nouveaux techniciens, reformation après une longue période sans réalisation de la technique). Par ailleurs, la formation utilisera dès que possible des animaux ayant déjà été soumis à une procédure légère ou modérée dans le cadre d'un autre projet scientifique (de façon à réduire l'utilisation d'animaux naïfs). Le nombre d'animaux sélectionnés sera déterminé afin de garantir une performance permettant de raffiner de manière globale les procédures mises en oeuvre sur les animaux dans l'EU, tous projets confondus. Ce projet s'inscrit dans un objectif de réduction du nombre total d'animaux utilisés dans l'ensemble des projets de l'établissement utilisateur, via une formation adéquate, un raffinement permettant de répondre aux questions en utilisant moins d'animaux et une réflexion sur les volumes minimum pertinents pour les analyses. Dans le cas des méthodes nouvelles, la faisabilité et l'impact seront évalués dès les premiers animaux au regard de l'attendu bibliographique.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en une veille constante de la littérature permettant de s'assurer de la qualité de nos méthodes grâce aux connaissances scientifiques acquises en continu. Par ailleurs, un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à chaque procédure permet de stopper l'étude et/ou de décider la mise à mort de façon précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, une observation clinique quotidienne, un avis vétérinaire spécifique si nécessaire). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux. Celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou d'air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/postopératoires complets.
Choix des espèces
Ces espèces sont les espèces cibles des premières études précliniques. Elles sont requises par les principes fondamentaux de l'ICH (M3(R2) Études de sécurité non clinique pour la conduite des essais cliniques chez l'homme et l'autorisation de mise sur le marché des produits pharmaceutiques) et la nécessité scientifique/physiologique. La pertinence du choix des espèces animales est basée sur des caractéristiques anatomiques, physiologiques, ou pathophysiologiques et chaque espèce a ses avantages et inconvénients. Le choix final est basé sur un examen critique des données disponibles et des considérations éthiques. 90% des méthodes s’appliquent à l'animal adulte entre 6 semaines et 20 semaines de vie. Certaines méthodes s'appliquent à l'animal âgé ou jeune en raison de la taille de ces animaux pour être le plus représentatifs possibles des situations rencontrées en recherche animale (certains modèles nécessitant des études sur animaux de la période péri-natale jusqu'à un âge avancé).
Étude de l’impact de l’inflammation sur la sévérité du trouble du spectre autistique (TSA) chez des souris SHANK3 : Effet du LPS et intervention anti-inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatre injections d'un agent inflammatoire pour 315 souriceaux, huit jours de gavage pour 180 autres, trois jours de test comportemental de dix minutes, puis l'exsanguination à quatorze ou trente-cinq jours de vie. 495 souris porteuses d'une mutation du gène SHANK3 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 315 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si des anti-inflammatoires atténuent les symptômes comportementaux associés à l'autisme dans ce modèle, mesurés par un test que le porteur ne nomme pas. Aucune souris ne dépasse cinq semaines de vie.
Objectifs
Le trouble du spectre autistique (TSA) est une pathologie neurodéveloppementale qui provoque des déficiences dans l’interaction sociale et des comportements répétitifs. En Europe, la prévalence des TSA est en augmentation, avec environ 1 enfant sur 100 recevant un diagnostic. Cette augmentation a des répercussions sociétales et financières majeures, le coût annuel des TSA dans l’Union européenne étant estimé à 258 milliards d’euros. Les programmes de santé européens, ainsi que des initiatives telles qu’ERA-NET et EURAS, mettent un fort accent sur le traitement des TSA. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement neurophysiologique et à la physiopathologie des TSA est l’objectif principal du projet pour ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En premier lieu on souhaite étudier les effets protecteurs des anti-inflammatoires dans un contexte pathologique, l’autisme. L’étude cherchera à savoir dans un deuxième temps si ces traitements anti-inflammatoires peuvent atténuer les symptômes comportementaux induits par l’inflammation comme l'autisme Cette étude permettra non seulement de tester une approche préventive contre l’aggravation des symptômes liés à l’autisme, mais aussi d'identifier les mécanismes par lesquels la modulation de la réponse inflammatoire peut corriger ou réduire les anomalies synaptiques et comportementales. Des mesures seront effectuées pour suivre l'évolution des marqueurs inflammatoires cérébraux et étudier la physiologie des neurones avec des mutations identifié dans le trouble du spectre de l'autisme
Bénéfices attendus
Le développement de modèles expérimentaux, tels que les souris portant des modifications génétiques SHANK3, pour tester l'effet des anti-inflammatoires, apporte des retombées significatives tant sur le plan scientifique que sur celui de la santé publique. Sur le plan scientifique, ces modèles permettent de mieux comprendre comment la modulation de l'inflammation peut influencer les symptômes associés à des mutations génétiques spécifiques. Les résultats de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les processus inflammatoires, avec un potentiel pour améliorer les traitements existants pour les patients atteints de troubles du spectre autistique (TSA). Ces avancées pourraient mener au développement d'interventions pharmacologiques innovantes, offrant des options supplémentaires, particulièrement pour les patients dont les symptômes sont exacerbés par l'inflammation. En matière de santé publique, l'amélioration de l'efficacité des traitements pourrait réduire les coûts de prise en charge des TSA en diminuant la nécessité de soins intensifs et en améliorant la qualité de vie des patients. Une meilleure gestion des symptômes permettrait également de soulager considérablement les aidants qui s'occupent quotidiennement des patients atteints de TSA, réduisant leur charge mentale et physique, et contribuant ainsi à un mieux-être global, tant pour les patients que pour leurs familles. Ces progrès entraîneraient des économies substantielles pour les systèmes de santé.
Procédures
315 souriceaux auront 4 injections et 180 souriceaux auront 8 jours de Gavage (10 secondes par injection/gavage). Le test comportementale dure 3 jours avec un essai de 10 min par jour. Tous les animaux seront prélevés après exsanguination pour les études sur tranches aigues ou histologiques soit à P14 ou P35.
Impact sur les animaux
Les étapes du gavage et l'induction de l'inflammation par injection entraînent des effets indésirables sur les animaux : douleurs, inflammation du site d'injection. Le test comportemental chez la souris induit un peu de stress lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel parfois renforcé par la présence d’odeurs et de signaux sociaux. Les nuisances sont réduites grâce l’habituation et des conditions expérimentales adaptées qui sont mises en place
Devenir
Euthanasie pour étude histologique ou electrophysiologique
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations synaptiques sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. Ce choix permet une analyse statistique robuste et adaptée à la complexité du plan expérimental. Le nombre d’animaux (n = 14–16 par condition expérimentale, en moyenne n=15) est basé sur des études antérieures de l’équipe montrant que ce nombre permet de détecter des différences d’au moins 20 % avec une puissance statistique ≥ 80 % et un seuil α = 0,05. Cette estimation tient compte de la variabilité biologique attendue dans les enregistrements électrophysiologiques et/ou les mesures comportementales. (3)Les deux sexes sont inclus pour assurer une meilleure représentativité biologique des résultats. Chaque groupe expérimental comprendra 7 à 8 mâles et 7 à 8 femelles, analysés séparément puis comparés pour évaluer les interactions liées au sexe
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur. Des critères de bien-être seront évalués : maternal care, état des souriceaux allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures d'injection/gavage seront décrits dans les procédures. Si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous-cutanée une injection quotidienne d’Inflacam ou morphenique jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale dans un contexte pathologique. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux durant le développement et à l'age adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Mesures métaboliques (test de sensibilité à l’insuline et dosages lipidiques) chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Une souris par binôme et par procédure, pour quarante étudiants de master : le projet est un travail pratique de physiologie animale. 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Les étudiants apprennent le prélèvement de sang à la queue sur animal vigile et l'injection intrapéritonéale d'insuline, qui expose les souris à un risque d'hypoglycémie. Le porteur affirme que le remplacement est impossible parce que l'objectif du travail pratique est justement de confronter les étudiants "à la manipulation d'animal vigile", et juge essentiel de les sensibiliser tôt aux 3R.
Objectifs
L'objectif du projet est de réaliser un TP dans le cadre d'enseignement de physiologie animale. Ce TP comportent différets tests métaboliques qui sont 1_ la mesure de sensibilité à l'insuline sur échantillons sanguins et 2_ des dosages lipidiques plasmatiques. Il s’agit d’un TP dans le cadre d’un module obligatoire d'ateliers pratiques où la pratique en laboratoire est développée. Comme ce TP s'adresse à des niveaux Master 1, cette expérience pratique peut influencer positivement leurs choix ultérieurs de cursus et de stage en Master 2.
Bénéfices attendus
Les étudiants seront formés au prélèvement sanguin caudal, aux prélèvements tissulaires ainsi qu'à l'analyse de résultats expérimentaux autour du métabolisme des lipides chez la souris. D'autre part, les étudiants seront sensibilisés à l'expérimentation animale et à l'intérêt du bien être et du respect de l'animal dans ces conditions. Etant donné qu'il s'agit d'étudiants intégrés dans un cursus de physiologie animale, il semble essentiel de les confronter très tôt aux notions des 3R.
Procédures
prélèvement de sang caudal sur animal vigile pour les deux procédures. Injection intrapéritonéale d'insuline.
Impact sur les animaux
La nuisance attendue sur les animaux peut être le stress lié à la manipulation et à l'injection d'insuline. Un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline est possible dans l'ITT.
Devenir
Quelle que soit la procédure, tous les animaux sont mis à mort pour prélèvements d'organes
Remplacement
l’objectif du TP est d'étudier une grande fonction physiologique de l'organisme et de confronter les étudiants à la manipulation d’animal vigile. On ne peut par conséquent pas le remplacer par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour un groupe de TP (40 étudiants) nous envisageons 1 souris par binome et par procédure.
Raffinement
Peu de manipulation seront réalisées sur les animaux. Seules les injections d’insuline et la mise à mort peuvent induire du stress lors de la contention. Il est donc nécessaire que l’ensemble de ces deux gestes soit réalisé par un manipulateur expérimenté. Les prélèvements de sang ne nécessitent pas de contention. Les étudiants vont apprendre en procédure 1 un geste de prélevement de sang caudale qui va leur servir en procédure 2. D'autre part afin d'éviter toute souffrance inutile de l'animal, nous appliquerons un antalgique local au bout de la queue 10 min avant incision.
Choix des espèces
Les paramètres métaboliques mesurés par les étudiants seront confrontés à des données bibliographiques issus d'études réalisées sur des souris adultes. Ainsi il est nécessaire de réaliser ces mesures sur ce modèle animal. Les souris utilisées seront des souris de 3 à 6 mois.
Modèles aigus et chroniques d’insuffisance rénale induite par ischémie-reperfusion chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 936
Chaque animal subit une ou deux opérations sous anesthésie pour bloquer puis rétablir la circulation sanguine dans le rein, avec incision de la peau et du muscle, et reçoit des composés tous les jours pendant trois jours à quatre semaines. 3 186 souris et 936 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 836 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur énumère parmi les effets attendus la perte de poids, la déshydratation, l'inflammation de la suture, la prostration et les tremblements, puis écrit que l'ensemble de ces procédures "vise à garantir la fiabilité des modèles expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal". Il justifie l'effectif de quinze animaux par groupe par "le risque de perte lors de la procédure chirurgicale".
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique. Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes du tissu rénal conduisant à la perte de fonction de l’organe. Il a été démontré que les problèmes cardiovasculaires et métaboliques, tels que l’hypertension et le diabète, mais également la prise de médicaments, accélère le développement d’insuffisance rénale à la suite de lésions aigües de l’organe. Ceci peut aboutir à des décès prématurés des patients atteints, nécessitant un traitement par dialyse et/ou greffe de rein. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi, les tests précliniques d’efficacité de nouveaux médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.
Procédures
Le projet se déroulera en deux phases. La première, dite de validation, impliquera un nombre restreint d’animaux afin de mettre en place les conditions expérimentales basées sur des protocoles d’ischémie-reperfusion référencés dans la littérature. La seconde phase, consacrée aux tests, visera à évaluer l’efficacité de candidats médicaments par an. Tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant toute intervention. Selon les procédures, ils recevront différentes interventions et traitements : - Administrations de médicaments sur animaux vigiles par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire ou orale durant toute la période expérimentale (pouvant aller de trois jours à quatre semaines) - Des prélèvements sanguins et d'urine pourront être réalisés au moins une fois par semaine p - Chaque animal subira une ou deux interventions sous anesthésie et analgésie. Ils seront surveillés deux fois par jour post-opératoire jusqu’à la fin de l’expérimentation. - La fonction rénale pourra être évaluer, soit par la mesure de la production urinaire sur 24 h en cage métabolique, soit par la mesure de la filtration. - A la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie et des prélèvements (tissus et de fluides biologiques) seront réalisés pour analyses complémentaires. L’ensemble de ces procédures vise à garantir la fiabilité des modèles expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont les suivants : - Stress à la contention, au traitement, au cage métabolique ; - Douleur légère et de courte de durée lors de l’injection de médicament ; - Perte de la fonction de rénale entrainant une réduction diminution de la tonicité et des problèmes urinaires ; - Douleurs post-opératoires en raison de l’incision cutanée et musculaire, mais aussi de l’acte chirurgical ; - Les effets indésirables en post-opératoire tels que la perte de poids, des démangaïsons, de l’inflammation au niveau de la suture, une déshydratation, une diminution de la locomotion, une prostration et tremblements.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de fluides biologiques et de tissus seront réalisés pour des analyses complémentaires.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rat, souris), nous travaillons sur le développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Le nombre d’animaux par groupe sera réduit au maximum, permettant d’anticiper les différences interindividuelles et de réaliser des analyses descriptives et quantitatives. Pour la première phase de ce projet, concernant la validation des modèles et la mise en place des conditions expérimentales basées sur la littérature, un nombre restreint d'animaux (n=18) par procédure pour les deux espèces, si l’on considère trois groupes de 3 animaux (groupe contrôle, groupe opérée, groupe traité avec une molécule de référence). Un total de 72 animaux sera utilisé pour la première partie. Cette première phase permet également de s’assurer de la robustesse de la procédure et de l’habituation des manipulateurs, afin de s’assurer de la réussite des gestes pour la réalisation des procédures chirurgicales par la suite et donc de limiter le nombre d’animaux. Sur la deuxième phase de test de mécidaments, un nombre de 15 animaux par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les animaux seront également randomisés afin d’éviter les biais. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures rigoureuses seront mises en place pour assurer le bien-être des animaux utilisés. Le personnel en charge rendra visite aux animaux durant leur période d’acclimatation afin de les habituer à la présence humaine et à la manipulation, réduisant ainsi leur stress. Les animaux seront logés en groupes sociaux stables de 2 à 5 individus, conformément à l’espèce et à la réglementation en vigueur. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et analgésie pour limiter douleur et inconfort, accompagnée de sérum physiologique pour l’hydratation. Pendant la chirurgie, les paramètres physiologiques (température, fréquence cardiaque, respiratoire, muqueuses) seront surveillés. Les animaux seront installés sur un tapis chauffant pendant et après l’intervention pour prévenir l’hypothermie. Un suivi clinique sera réalisé 2 à 3 fois par jour après la chirurgie. La buprénorphine pourra être administrée par injection ou dans l’eau de boisson pendant les jours suivant l’opération, afin d’atténuer d’éventuelles douleurs. Pour favoriser l’alimentation, des aliments facilement accessibles (croquettes mouillées, gel) seront placés au fond des cages afin de limiter les mouvements post-opératoires. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être administrée si nécessaire. Un système de scoring des signes cliniques et points limites spécifiques aux procédures sera appliqué. Les conditions d’hébergement respecteront les standards de bien-être : propreté des cages, accès libre à l’eau et à la nourriture, et enrichissement (igloo, safe crinklets, batonnet). De l’enrichissement supplémentaires pourra être ajouté (sopalin, croquette en fond de cage). Durant le traitement avec les candidats médicaments, une attention particulière sera portée au suivi de la masse corporelle et de l’état général (sutures, pelage, respiration, locomotion…).
Choix des espèces
Dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion, les rongeurs sont largement utilisés par la communauté scientifique. Un des avantages de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. Les animaux utilisés auront atteint l'âge adulte, c'est à dire plus de 8 semaines. Le choix de cet âge est basé sur les données de la littérature, qui ont identifié que 8 semaines représentent l'âge optimal pour la réussite de cette procédure chirurgicale.
Impact de la mutation du gène responsable de la maladie rare de l’aniridie sur la cornée
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une éraflure volontaire de la cornée, que le porteur compare à un grain de sable dans l'œil, attend une partie des souris de ce projet. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, l'autre modérée. Elles portent une mutation qui les prive d'iris ou leur donne des yeux anormalement petits, et dont la cornée s'opacifie avec l'âge, pour étudier une maladie humaine qui touche une personne sur 100 000. Le porteur conclut qu'"aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l'animal", tout en décrivant des douleurs passagères après l'abrasion et l'administration systématique d'antidouleurs.
Objectifs
L’aniridie est une maladie génétique très rare qui touche environ 1 personne sur 100 000. Une des caractéristiques principales de la maladie est l’absence partielle ou totale de l’iris, la partie colorée de l’œil. Elle peut aussi entraîner une sécheresse oculaire et une opacification progressive de la cornée, la couche transparente à l’avant de l’œil. Cela peut provoquer une baisse importante de la vision au fil du temps. Chez les personnes atteintes d’aniridie, la cornée est souvent plus fine, moins bien protégée et moins bien "innervée", c’est-à-dire moins bien reliée aux nerfs. Cela peut entraîner une perte de sensibilité et, dans les cas avancés, une opacification qui rend la vision floue. Beaucoup de patients deviennent malvoyants à partir de la soixantaine, même s’ils gardent souvent une perception de la lumière et des couleurs. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de traitement pour guérir cette maladie. C’est pourquoi il est important de mieux comprendre comment cette mutation affecte l’œil, en particulier la cornée et son environnement. Dans notre laboratoire, nous étudions l’aniridie à l’aide d’un modèle animal (la souris) mimant ou reproduisant la maladie humaine. Nous allons analyser différents éléments de l’œil de ces souris : la composition des larmes, la pression à l’intérieur de l’œil, et l’état des fibres nerveuses de la cornée. Ces analyses nous aideront à mieux comprendre comment l’aniridie perturbe le fonctionnement normal de l’œil et à identifier, à terme, de nouvelles pistes de traitement.
Bénéfices attendus
Dans l’aniridie, la perte de vision s’aggrave lentement au fil du temps. Cela donne une chance précieuse d’intervenir avant que les dégâts ne deviennent irréversibles. Malheureusement, les traitements disponibles aujourd’hui sont très limités. À un stade précoce, certains collyres (gouttes pour les yeux) peuvent soulager les symptômes. Mais lorsque la maladie est plus avancée, la seule option est souvent une greffe de cornée. Or, cette opération est lourde, comporte des risques de rejet, et n’apporte parfois qu’un soulagement temporaire. Face à ce manque de solutions, notre projet de recherche a pour but de mieux comprendre ce qui ne fonctionne pas dans la cornée dans le cadre de cette maladie. Ainsi, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour développer des traitements innovants, plus efficaces et moins invasifs. Nous cherchons notamment à comprendre en détail les réactions en chaîne, au niveau moléculaire, qui mènent à la dégradation de la cornée. Ce travail devrait aussi donner lieu à des publications scientifiques, et peut-être à des dépôts de brevets, contribuant ainsi à faire avancer la recherche dans ce domaine encore peu exploré.
Procédures
Les souris seront manipulées pour permettre la mesure de certains paramètres importants, comme la sensibilité de la cornée ou la pression à l’intérieur de l’œil. Ces examens sont similaires à ceux réalisés régulièrement chez l’humain lors de consultations ophtalmologiques. Nous effectuerons une éraflure volontaire et contrôlée de la cornée, dans le but d’étudier l’étape de cicatrisation chez les souris malades. Cette blessure est légère, équivalente à un grain de sable dans l’œil, et guérit spontanément en trois jours. Durant toute cette période, les animaux sont suivis, et des antidouleurs leur sont administrés en cas de nécessité afin de garantir leur bien-être.
Impact sur les animaux
L’aniridie est une maladie génétique rare qui touche principalement les yeux. Pour mieux l’étudier, nous utilisons un modèle animal (la souris) qui mime cette maladie. Elle est caractérisée par une absence de l’iris, la partie colorée de l’œil et/ou par des yeux d’un volume anormalement petit. Ces animaux développent progressivement une opacification de la cornée due à la maladie, entraînant une diminution de leur acuité visuelle. Cela n’impacte pas leur comportement ni leur espérance de vie. Tout comme les patients, ces animaux ne présentent pas de signes de douleur liés à la maladie. Pendant les expériences, certaines manipulations sont nécessaires, comme mesurer la sensibilité de la cornée ou réaliser une blessure sur celle-ci. Cette blessure, appelée abrasion cornéenne, est faite sous anesthésie générale. Chez l’Homme, l’abrasion de la cornée est la première étape des traitements de la myopie au laser. L’abrasion est un modèle de blessure pouvant induire des douleurs passagères équivalente à une irritation dû à un grain de sable dans l’œil. Elle est superficielle et guérit spontanément en trois jours. Des médicaments antidouleur sont systématiquement administrés après chaque intervention, pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les souris seront manipulées par les expérimentateurs, ce qui pourra générer du stress. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie générale répétée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’effet de la maladie sur les structures de l’œil : la cornée, les larmes, l’iris et le cristallin.
Remplacement
Les méthodes en laboratoire sur des cellules seules ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organe entier comme l’œil, avec toutes ses parties et son fonctionnement. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle animal, en particulier des souris porteuses d’une maladie rare comme l’aniridie. Ce modèle nous aide à mieux comprendre la maladie et ses effets sur l’ensemble de l’œil, un organe complexe.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à cette étude a été rigoureusement déterminé à l’aide de logiciel permettant de calculer statistiquement le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Sur l’ensemble de la durée du projet (5 ans), un maximum de 252 souris sera utilisé. Parmi les animaux utilisés, la moitié sera porteuse de la maladie et l’autre moitié sera saine afin de comparer les résultats.
Raffinement
Pendant la période d'acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiennes par les soigneurs, hébergement en groupe de 2 individus minimum, environnement adapté et enrichi. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’intervention, avec l’utilisation d’antidouleurs et anesthésiques adaptés. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal.
Choix des espèces
Le système visuel de la souris ressemble beaucoup à celui de l’humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier l’aniridie, une maladie rare de l’œil. Nous travaillons sur des souris adultes de 12 semaines, âge auquel l’œil a fini de se développer. Pour compléter, nous étudions aussi l’impact de la maladie au cours du développement, donc sur des souris plus jeunes : de 2, 3 et 4 semaines.
Etude d’une protéine impliquée dans l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin pour que leur cerveau soit prélevé, 774 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 346 d'entre elles inhalent un agent convulsivant cinq jours de suite, 146 reçoivent des injections pendant cinq jours, l'ensemble servant à créer deux lignées génétiquement modifiées pour étudier une protéine liée à l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'accompagne les crises, par analogie avec la perte de conscience décrite chez l'humain, tout en signalant que les souris épileptiques meurent subitement dans moins de 5 % des cas et que les crises provoquées pourraient augmenter cette fréquence. Il conclut que le recours à des animaux vivants est "absolument nécessaire".
Objectifs
L’épilepsie est une maladie cérébrale qui se manifeste par des crises soudaines et répétées. Ces crises sont causées par une activité électrique anormale dans les neurones. L’objectif de ce projet est de générer deux modèles de souris génétiquement modifiée afin d’étudier les mécanismes neuronaux impliqués dans cette pathologie à différents moments de la vie et lors des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Cette recherche pourrait aider à mieux comprendre les causes de l’épilepsie afin de développer de nouveaux traitements qui restaureraient l'excitabilité neuronale normale et atténueraient l'activité épileptique.
Procédures
Une injection sera faite pendant 5 jours sur 146 animaux. 346 animaux seront soumis à l’exposition répétée (5jours consécutifs) à un agent convulsivant par inhalation.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée et de faible intensité peut survenir au moment du prélèvement de la biopsie au niveau de la queue. Les injections peuvent entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Aucune douleur n’est associée aux crises d’épilepsie qui se traduisent par une « extinction » de la conscience chez les humains, ce qui est très probablement la même chose chez les souris. Les crises induites artificiellement et les crises spontanées apparaissant chez les animaux devenus épileptique sont absolument de même nature, elles ont une durée inférieure à 1 minute, suivi d'une période d’immobilité d’environ 1 minute. Les animaux épileptiques ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement avec une fréquence faible (moins de 5%). Les inductions artificielles de crises pourraient augmenter la fréquence des morts soudaines. Aucun autre comportement ou effet indésirable n’est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, et seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place (épileptogenèse) peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardio-vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes cellulaire et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. En effet, il n'a pas été constaté de différences entre les sexes concernant les troubles épileptiques dans les modèles murins d'épilepsie. Les schémas d’accouplement ont été optimisés afin que la quasi-totalité des animaux à phénotype dommageable produits soient utilisés dans les procédures expérimentales ; Le nombre minimum d’animaux nécessaires a été calculé pour utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique.
Raffinement
Les animaux seront stabulées avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permette des activités variées et éviter toute souffrance ou inconfort. Une grille d'observation est utilisée par le personnel pour surveiller attentivement l'état des animaux pendant l'expérimentation. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement est notée. Les animaux concernés sont alors suivis chaque jour et peuvent recevoir un traitement contre la douleur si nécessaire. Si certains signes de mal-être persistent plus de 48 heures, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies dont l’épilepsie. Les crises peuvent être induite sans limite à partir du 19eme jour postnatal jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage à l’âge de 3 semaines pour avoir des animaux assez robustes et mimer l’apparition des crises chez les jeunes ainsi qu’a l’âge adulte.
Drogues agissant sur le système nerveux central et comportement chez le rat
- Enseignement supérieur
Deux injections de psychotropes à une semaine d'intervalle, puis quatre tests comportementaux choisis parmi neuf, de deux à cent vingt minutes, pour mesurer motricité, anxiété, motivation et état dépressif. 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, manipulés par des groupes de cinq à sept étudiants encadrés par un tuteur. Les rats témoins d'une session deviennent les rats traités de la suivante, et une à deux semaines plus tard ils servent à former d'autres étudiants aux prélèvements de sang et de cerveau. Le porteur indique que les étudiants auront travaillé en amont sur la règle des 3R et la diminution de la douleur, dans un module dont la finalité est de les familiariser à la manipulation de rats de laboratoire.
Objectifs
Tous les ans, dans le cadre d'un tutorat, 4 groupes de 5 à 7 étudiants auront à établir et mettre en œuvre un protocole qui leur permettra de tester au cours d’une session d’expérimentation l’effet comportemental de l’injection aiguë d’une substance pharmacologique (un psychotrope et son véhicule): deux drogues agissant sur le système nerveux central pour 2 groupes d’étudiants lors d’une première session, puis deux autres drogues agissant sur le système nerveux central pour les 2 autres groupes d’étudiants lors d’une deuxième session la semaine suivante. Les aspects concernant le respect des règles d’éthique (règle des 3R, diminution de la douleur, du stress, …) auront été vus en amont au cours de séances de travaux dirigés et de tutorats leur permettant de réfléchir à l’établissement de leur protocole. Les 4 groupes d’étudiants auront à disposition un seul et même lot d'animaux. Ces animaux seront donc soumis à l’injection de 2 de ces 4 molécules, réalisées successivement à une semaine d’intervalle. Les animaux contrôles lors de la première session d’expérimentation deviendront les animaux traités lors de la seconde et vice versa. Pour chacune des molécules à tester, les groupes d’étudiants auront la possibilité de réaliser 4 tests comportementaux parmi les 9 proposés, permettant de tester les capacités motrices, l’anxiété, la motivation et l’état dépressif. Le protocole qu’ils testeront, basé sur une recherche bibliographique, aura été validé par leur tuteur, ayant une bonne connaissance des locaux, des effets des molécules et des tests proposés, qui veillera ainsi à la pertinence et la bonne réalisation du protocole proposé. Par ailleurs, durant toute durée de la session d’expérimentation, chaque groupe sera encadré par son tuteur afin de limiter au maximum toute forme de stress ou de douleur pour les animaux. Au moins une semaine avant les tests, les étudiants seront préalablement formés à la manipulation des animaux avec lesquels ils auront à travailler. Le jour de la session d’expérimentation ils seront également préalablement formés aux injections sur rats. Une à deux semaines après la seconde session d’expérimentation, les animaux seront utilisés pour former d’autres étudiants (du laboratoire, en stage en deuxième année de Master, en thèse ou post-doctorat) à des prélèvements sanguins dans la veine de la queue et des prélèvements de cerveaux.
Bénéfices attendus
Ce projet se place dans le cadre d’un module d’enseignement proposé par l’Université qui sert à la formation des étudiants, et dont l’objectif pédagogique vise des étudiants qui veulent se spécialiser en neurosciences. Il permettra à de petits groupes d’étudiants, chacun encadré et suivi par un tuteur, de se former à la conception et la rédaction d’un protocole de recherche avant de le mettre en application. Ils auront ainsi la possibilité de se familiariser à la manipulation de rats de laboratoire, d’être formés à la réalisation d’injections et à l’utilisation de tests comportementaux courants pour la réalisation d’expériences en neurosciences. Enfin ces expérimentations leurs permettront d’être sensibilisés aux méthodes d’anesthésie volatile, de prélèvements sanguins et de prélèvement de cerveaux.
Procédures
Les animaux seront manipulés préalablement aux sessions d’expérimentations par les étudiants. Ils seront soumis à 2 injections à une semaine d’intervalle. Ils subiront après injection, à deux reprises, à une semaine d’intervalle, 4 tests comportementaux choisis parmi un panel de 9, dont la durée pour chacun va de 2 à 120 minutes au maximum. L’objectif de ces tests comportementaux est de caractériser les effets de drogues agissant sur le cerveau. Une à deux semaines à l’issue de la seconde session expérimentale, ils subiront jusqu’à deux prélèvements de sang sous anesthésie générale avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent induire chez les animaux une douleur légère et transitoire. L’ensemble des tests comportementaux pourra également induire une nuisance légère et transitoire due au stress généré par la manipulation des animaux par les expérimentateurs. Enfin, une souffrance légère pourra être liée aux deux prélèvements sanguins sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale.
Devenir
A l’issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leur cerveau prélevé pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Ce projet portant sur des comportements complexes, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette procédure a été déterminé grâce à un test statistique appliqué pour chaque expérience et permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. D’autre part, il sera possible de réaliser différents traitements sur les mêmes animaux sans interférer avec les résultats de l’expérience et le bien-être de l’animal, ce qui permet de diminuer d’autant le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Afin de réduire le plus possible toute douleur ou angoisse que les animaux pourraient ressentir, les étudiants seront formés en amont à la manipulation des animaux et aux injections. De plus, les étudiants travailleront sous la supervision d’encadrants expérimentés et compétents impliqués dans la réalisation des procédures expérimentales et/ou dans l’application de ces procédures et/ou dans les soins aux animaux. Une échelle de cotation de signes cliniques basée sur des signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Les animaux seront également hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1erfévrier 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Le rat nous semble être l’espèce adéquate pour réaliser ce projet car il est le mammifère pour lequel il existe un degré de similitude avec le cerveau humain, suffisant pour l’étude des effets comportementaux des substances pharmacologiques étudiées. Les rats seront de jeunes adultes (6-8 semaines, 180-220 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales.
Rôle de l’inflammation microcristalline dans l’athérosclérose expérimentale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois millilitres d'air injectés sous la peau du dos pour former une poche, puis des cristaux injectés dans cette poche, subissent l'ablation de la rate au cours d'une opération de trente minutes, jusqu'à vingt-huit gavages quotidiens et huit semaines de régime gras. Le porteur annonce l'identification, "à moyen terme", de cibles thérapeutiques contre les lésions cardiovasculaires liées à la goutte et à la chondrocalcinose, et une amélioration des soins "à long terme". Sur le remplacement, il décrit des tests sur lignées cellulaires qui servent à caler les doses avant le passage aux souris.
Objectifs
Les maladies à dépôts de microcristaux de pyrophosphate de calcium (PPC) et d’urate de sodium (UMS) sont les rhumatismes inflammatoires les plus fréquents de l’adultes, responsables respectivement de la chondrocalcinose et de la goutte. Ces cristaux déclenchent des arthrites aiguës récidivantes qui dépendent de médiateurs inflammatoires comme l'interleukine (IL)-1β. Les crises inflammatoires déclenchées par ces 2 types de cristaux sont associées à un risque accru d’événements et d’accidents cardiovasculaires (CV). L’élévation persistante de l’urate sanguin et l’inflammation modifient la réponse immunitaire et stimulent des changements des précurseurs des cellules immunitaires dans la moelle osseuse en stimulant la formation de cellules plus inflammatoires. Cette modification de la réponse immunitaire, appelée immunité innée entraînée peut accélérer l’athérosclérose et contribuer à l’augmentation du risque CV observée chez des patients goutteux ou souffrant de la maladie à dépôts de cristaux de PPC. Dans les modèles expérimentaux d’athérosclérose, un régime riche en gras en alternance accélère les lésions vasculaires et favorise les ruptures de plaque qui dépendent de l'IL-1β, cytokine clé de l’inflammation microcristalline. Les objectifs de ce projet sont, d'une part, de caractériser l’impact des crises inflammatoires microcristallines dans le changement des cellules immunitaire de la moelle, d'autre part, d'étudier l’implication de cette mémoire entrainée sur le développement de l’athérosclérose expérimentale, et enfin, d’en identifier les mécanismes physiopathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à moyen terme : 1. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour réduire les lésions d'athérosclérose liées aux crises inflammatoires microcristallines, 2. L'identification de cibles thérapeutiques pour prévenir les lésions cardiovasculaires, 3. L'identification des mécanismes de régulation épigénétique et métabolique liés aux crises inflammatoires microcristallines et 4. L'identification des mécanismes de régulation inflammatoire par l'urate soluble. A long terme, il permettra l'amélioration des soins chez des patients en identifiant des cibles thérapeutiques permettant de mieux contrôler les conséquences de l'inflammation microcristalline et de réduire les risques cardiovasculaires et donc la mortalité.
Procédures
Création d'une poche à air par injection dans la région dorsale de 3 ml d'air sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 2 fois, 30 secondes par geste. Injection dans la poche à air de cristaux sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 1 fois, 30 secondes. Injection d'agent pharmacologique sur animaux vigiles: 1 fois, 30 secondes. Prélèvement sanguin sur animal endormi : 1 à 4 fois, 1 minute ; Splénectomie sur animaux anesthésiés : 30 minutes. Gavage quotidien pendant 1 à 4 semaines. Un gavage par jour, nombre de gavage maximal par animal: 28. Régime riche en graisse pendant 8 semaines
Impact sur les animaux
Dans le modèle de splénectomie des douleurs sont attendues durant au maximun 3 jours avec possiblement une perte de poids et une réduction de l'activité. De plus, la répétition de manipulation des animaux peut engendrer un stress notamment pour les injections répétées d’anticorps. Les injections et prélèvements pourraient également entrainer des douleurs locales très légères. La technique de gavage pourrait également entrainer une gêne chez l’animal du fait d’une contention serrée durant le passage de la canule
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. L'évaluation finale nécessite la mise à mort de l'animal car les analyses sont effectuées sur des tissus de plusieurs compartiments
Remplacement
Des tests in vitro seront utilisés au maximum pour déterminer les conditions optimales des études in vivo : tests sur des lignées cellulaires pour déterminer la dose thérapeutique efficace d'un agent pharmacologique avant son utilisation chez l'animal; tests in vitro pour identifier le meilleur modulateur de l'immunité entraînée avant de l'étudier chez l'animal : blocage de médiateurs inflammatoires par exemple et tests in vitro pour valider les mécanismes cellulaires avant validation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses de l’inflammation dans les liquides de lavage des poches à air, analyses anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et composition cellulaire de l’aorte, analyses métabolomiques dans le sang et transcriptomes des cellules de la moelle.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages enrichies en cotons, maisons, bois, papiers dans les conditions standardisées d'hébergement et d'élevage. Pour limiter la souffrance et l’angoisse, une surveillance quotidienne et/ou hebdomadaire sera mise en place. La réalisation de la splénectomie sera effectuée en plaçant les animaux sur une plaque chauffante thermorégulée à 37°C après anesthésie générale. Les animaux recevront deux doses d’analgésique en pré (30 min) et post opératoire (6 heures). Une 3ème injection peut être réalisée le lendemain si l'animal est douloureux. Une anesthésie locorégionale sera réalisée en péri-opératoire sur les plans cutanés et musculaire . Une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place après les injections, le gavage et la splénectomie. Pour toutes les procédures, des points limites spécifiques ont été établis et en cas de douleur ou comportements anormaux les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous sédation préalable.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux reproduisent les maladies humaines et sont reconnus sur le plan international : modèle de poche à air pour étudier l’inflammation, modèle génétiquement modifié et régime WD pour étudier l’athérosclérose Les souris génétiquement modifiées développent, sous régime riche en matières grasses, des lésions d’athérosclérose similaires aux plaques d’athérosclérose humaines. Ces souris développent sous régime riche en matières grasses une hypercholestérolémie principalement sur la fraction des LDL, comme chez l’homme. Ces 2 modèles (inflammation dans poche à air et athérosclérose chez souris génétiquement modifiées) sont nécessaires dans l’exploration des mécanismes physiopathologies impliqués dans le développement de l’athérosclérose lié à l’inflammation microcristalline. Les souris génétiquement modifiées (Gain ou perte de fonction) sont d’une aide précieuse pour étudier les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires. Jeune adulte entre 2 et 5 mois permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent.