Rongeurs

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, chacun passant trois fois par la même séquence de dix minutes de test moteur, une heure de second test et un prélèvement sanguin sous anesthésie. Entre la première séquence et les suivantes, une chirurgie du cerveau de quarante-cinq minutes leur induit la maladie de Parkinson, selon deux modèles distincts. Le porteur indique que les animaux mimant la phase avancée peuvent avoir des difficultés à se déplacer et à se nourrir, avec une perte de poids. Les bénéfices annoncés, des marqueurs de diagnostic précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques, restent une perspective, quand la chirurgie et ses douleurs post-opératoires sont, elles, programmées.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les modifications précoces qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson dans deux modèles animaux complémentaires, chacun mimant des caractéristiques pathologiques et des stades différents de la maladie. MODIFICATION: l'augmentation de la durée du projet sans ajout d’animaux nécessite une nouvelle autorisation

Bénéfices attendus

Outre une meilleure connaissance des modifications comportementales et du métabolisme (ensemble des transformations chimiques et biologiques qui s'accomplissent dans l'organisme) qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson, cette étude permettra l’identification de composés biologiques qui serviront de marqueurs de la pathologie et favoriseront le diagnostic précoce de la maladie pour une prise en charge optimale des patients, mais également l’identification de composés biologiques qui pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux tests moteurs (l’un de 10 minutes le premier jour, l’autre d’une heure le deuxième jour) et un prélèvement sanguin (le 3ème jour, sous anesthésie générale, durée de 5 minutes) avant induction de la maladie par chirurgie du cerveau (durée de la chirurgie : 45 minutes). Puis les animaux seront à nouveau soumis à ces mêmes tests moteurs et prélèvement à deux temps différents à distance de la chirurgie (une et quatre semaines pour un modèle et trois et dix semaines après pour l’autre modèle).

Impact sur les animaux

Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ils sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront un à trois mois.

Nés avec un déficit de poids d'environ 20 %, stériles chez les mâles, les souris modèles du syndrome de Barth ne représentent que 10 % des portées au lieu des 25 % attendus. 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur tapis roulant et sur roue en rotation, subissent des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, une IRM d'une heure trente, une échocardiographie, et un gavage quotidien pendant trois mois si le traitement dans l'eau de boisson ne suffit pas. Le porteur indique qu'une fausse route lors du gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et prévoit des transferts en voiture entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélever leur sang et leurs organes.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.

Les souris qui atteignent un point limite de la grille de score sont mises à mort avant la fin. 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 d'entre elles réutilisées ensuite. Elles reçoivent un candidat médicament puis subissent des prélèvements sanguins répétés, veine caudale, saphène ou sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal de grand volume qui peut provoquer un arrêt cardiaque. Le projet mesure le devenir sanguin de composés anticancéreux, afin de caler les doses des futurs essais chez l'humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole sont "reformées" vers l'entraînement aux gestes techniques, puis mises à mort.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de caractériser les paramètres pharmacocinétiques (PK), c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme et son temps de demi-vie dans la circulation sanguine. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), une stratégie d’échantillonnage ainsi que des groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) optimisés seront mis en œuvre. Celle-ci permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe pour un suivi PK à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance ainsi qu'à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : #Lors de l’injection par intraveineuse ou par d’autres voies d’administration (par exemple : intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, per os…) des candidats médicaments (t-0). # Lors de chacun des prélèvements sanguins. Pour tous les types de prélèvements envisagés (e.g. veine caudale, saphène, submandibulaire, Sinus rétro orbital (SRO)…), l'anesthésie générale n'est pas nécessaire, mais une contention efficace est requise, excepté pour les prélèvements SRO. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, ou surdosage d’anesthésique (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) éventuelles anesthésies (fixe ou gazeuse s'il y a lieu pour prélèvement terminal). # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection des candidats médicaments et (2) de chacun des prélèvements sanguins aux différent temps (par exemple, 10 minutes, J1, J7, J14, J21 et /ou J28 post traitement). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. Ici, des volumes toujours inférieurs à 7,5% du volume sanguin circulant sur une semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes pourront ainsi être prélevé en toute sécurité pour l‘animal. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation) avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie (données générées in vitro, propriétés physico-chimiques), permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux a été choisi en fonction des statistiques adaptées au petit nombre ainsi que de nos connaissances sur la classe thérapeutique de ces candidats médicaments, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés (micro-échantillonnage ou volumes standards dans la limite des 7,5 % hebdomadaires, ou 10% sur deux semaines glissantes), ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions aseptiques. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période minimale de 5 jours dans le but de limiter leur stress. Afin de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque prélèvement. Les animaux seront également pesés avant chaque manipulation ainsi qu’au minimum deux fois par semaine en suivi régulier. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Pour le prélèvement à l’œil une anesthésie gazeuse ainsi qu’une crème anesthésique locale permettra de diminuer la douleur liée au prélèvement. En fonction des besoins, une exsanguination terminale pourra être effectuée (en fin d’expérience ou en cas d’atteinte de point limite), par ponction intracardiaque ou incision sous-claviculaire de l’artère subclavière ou prélèvement à l'oeil, sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. A la fin du prélèvement, la mort sera assurée par dislocation cervicale ou surdosage d’anesthésique afin de conserver les organes intacts en cas de besoin. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation ainsi qu’en cas d’atteinte des points limites. Les analyses statistiques seront appliquées sur l’ensemble de la courbe et non uniquement sur chaque temps indépendamment, augmentant ainsi considérablement la robustesse de ces statistiques. Les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement à des gestes (DAP_FormationHabilitation) permettant la formation du personnel. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (abacs permettant une allométrie comparative de ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Nous utiliserons préférentiellement la souche CD-1, plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Cependant d’autres souches de souris (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) pourront être utilisées en fonction des modèles utilisés lors des études d’efficacité anticancéreuse, ainsi qu’en fonction de la structure et du profil des candidats médicament qui seront testés. Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Les souris CD1 seront préférentiellement utilisées. A titre d’exemple le poids de ces animaux sera compris entre 30 g et 37 g au moment de l’inclusion. Cette échelle de poids permet un prélèvement sanguin compris entre 157 µL et 222 µL par semaine (soit un maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pouvant être prélevé en toute sécurité par semaine glissante). Si d’autres souches (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) sont utilisées, le volume de sang prélevé sera toujours déterminé selon les recommandations internationales.

Quatre prélèvements sanguins sur animal vigile, à six, huit, dix et douze semaines d'âge, attendent chaque souris de ce projet. 46 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour observer les effets d'une mutation reproduite d'après le cas d'un nourrisson de sept jours atteint d'un déficit immunitaire. Le texte des objectifs annonce 32 souris "nécessaires pour obtenir des résultats fiables", quand le tableau des dommages attendus en déclare 46. Le porteur reconnaît qu'une partie de la caractérisation du gène se fait sans animaux vivants, sur des lignées cellulaires, puis conclut que la souris reste "indispensable" pour l'"organisme entier". Toutes sont tuées à la fin, pour collecter leurs organes.

Objectifs

Notre recherche porte sur une protéine présente dans les cellules, qui joue un rôle important dans la régulation du calcium. Ce calcium est essentiel à de nombreuses fonctions du corps : il participe à la croissance, à la production d’énergie, au bon fonctionnement des cellules et même à leur disparition quand cela est nécessaire. Cette protéine semble donc impliquée dans plusieurs mécanismes clés, bien que son rôle exact ne soit pas encore totalement compris. Un cas particulier nous a récemment interpellés : un bébé de 7 jours souffrant d’un trouble rare du système immunitaire. Il présente une anomalie génétique inhabituelle, jamais décrite auparavant et portant sur la protéine mentionnée ci-dessus, qui pourrait être liée à son déficit en cellules immunitaires. Ce lien possible a poussé notre équipe à explorer cette piste plus en détail. Pour mieux comprendre les effets de cette anomalie, nous avons mis au point un modèle animal, en modifiant le patrimoine génétique de souris grâce à une technique de pointe. Le but est d’observer les conséquences de cette modification, en particulier sur le sang et le système immunitaire. L’étude prévoit d’analyser deux groupes de souris : celles qui portent la modification, et celles qui ne l’ont pas. Des prélèvements sanguins seront effectués pour comparer leur état de santé et leur fonctionnement immunitaire. Au total, 32 souris seront nécessaires pour obtenir des résultats fiables.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet est l'étude du système immunitaire, nous souhaiterons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation du gène d'intérêt et son effet sur l'immunité des souris.

Procédures

Dans le cadre de cette procédure, quatre prélèvements de sang seront réalisés sur chaque animal à 6 semaines, 8 semaines, 10 semaines et 12 semaines d'âges. Pour compenser la perte de volémie, la quantité de sang prélevé sera équilibré par une injection sous-cutanée de sérum physiologique d’un volume équivalent. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction immunitaire, un faible risque de faiblesse immunitaire pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes. Le prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile pouvant induire un stress.

Devenir

En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte de différents organes afin de les analyser.

Remplacement

Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Vu l'expérience que nous avons sur l'étude de mutation génétique notamment au sein de consortiums, des groupes de 8 animaux par sexe sont nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Durant cette étude nous allons générer des données (analyses sanguines, caractérisation des populations cellulaires du système immunitaire) qui seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, posture, présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est nécessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intérêt à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique. Le modèle de souris est très étudié pour les fonctions immunitaires. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous possédons des techniques éprouvées pour obtenir une lignée génétiquement modifiée. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Les prélèvements commenceront sur les animaux à 6 semaines car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses, mais aussi un âge où le système immunitaire est développé et permet une analyse fonctionnelle. Les prélèvements sont échelonnés sur quelques semaines pour permettre d'observer une modification du système immunitaire si la modification devait apparaitre plus tardivement. Les prélèvements s'arrêteront au plus tard à 12 semaines d'âge. Sur le temps des prélèvements, les résultats nous permettront de déterminer l'intérêt de ce gène. Si les résultats devaient montrer une modification importante des paramètres immunitaires, les animaux pourraient être sacrifiés avant pour prélèvement des organes.

436 souris transgéniques humanisées vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à douze prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis une à quatre injections d'un anticorps couplé à une chimiothérapie, censé tuer les lymphocytes régulateurs installés dans la tumeur. Le porteur prévoit une gêne modérée, douleur et perte d'appétit, en fin de procédure pour les souris chez qui le traitement n'aura pas fonctionné, et retient un taux de prise de greffe de 80 % pour dimensionner l'effectif. Toutes sont tuées à l'issue, porteuses de tumeurs, pour des analyses sur tissus, tandis que les bénéfices annoncés restent au conditionnel, un traitement qui "pourrait" être plus efficace, moins toxique et "changer la vie de nombreux malades".

Objectifs

Une immunothérapie est actuellement approuvée pour le traitement de nombreux cancers localisés et métastatiques. Certaines cellules jouent un rôle clé dans la prévention des maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, leur accumulation au sein des tumeurs inhibe l'immunité anti-tumorale, exerçant ainsi un effet délétère sur le traitement des cancers. L'objectif de notre projet est de démontrer qu'un ciblage thérapeutique ciblant et tuant spécifiquement ces cellules intratumorales permettrait de développer des réponses immunitaires anti-tumorales plus spécifiques contre le cancer et moins toxiques pour les tissus sains. Pour cibler ces cellules, nous avons développé une construction comprenant un anticorps (ciblant une protéine spécifiquement exprimé par les cellules immunitaires activées) relié à une molécule de chimiothérapie. Ce médicament pénétrera dans la cellule cible, libérera la chimiothérapie à l'intérieur de celle-ci et induira sa mort. Nous avons développé un tel médicament dans le but de cibler et d'éliminer spécifiquement les cellules d'intérêt. L'objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité de notre médicament injecté par voie intraveineuse pour réduire la tumeur, d'identifier la combinaison optimale d'anticorps et de molécule de chimiothérapie, de déterminer la dose minimale efficace, et d'étudier les toxicités associées dans un modèle murin transgénique humanisé. Nous procéderons également à une comparaison de notre médicament avec le traitement actuellement utilisé en clinique

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité d’un nouveau médicament contre le cancer. En conjuguant un médicament d'immunothérapie à une chimiothérapie, une amélioration du traitement est attendue tout en limitant les effets secondaires. Ce nouveau traitement pourrait être plus efficace et moins toxique que les traitements conventionnels actuels. Par conséquent, les bénéfices attendus sont importants car ce nouveau traitement pourrait avoir un impact significatif sur la vie de nombreux patients. En effet, étant donné que ce nouveau médicament agit sur des cellules immunitaires potentiellement présentes dans tous les types de cancer, il pourrait être utilisé dans de nombreuses indications et changer la vie de nombreux malades.

Procédures

Injection de cellules tumorales, 1 par souris, durée 30 secondes, sous anesthésie locale. Traitement sous anesthésie locale et de 4 à 1 injections/souris en fonction des procédures et des groupes. L'injection dure moins d'1 min. Prélèvements de sang sous anesthésie locale, nombre maximal de 12, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections de cellules tumorales et les traitements entraîneront un stress physique et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légère et transitoire lors de l’injection du produit. Les injections se feront sous anesthésie locale ou générale en fonction du type d'injection. Les tumeurs peuvent entraîner une gène légère pour les souris recevant des traitements et une gêne modérée (douleur modérée, perte d'appétit potentielle) en fin de procédure si le traitement est inefficace. Une toxicité modérée du traitement pourrait être observée (fatigue accrue, douleurs).

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et les organes seront utilisés pour faire des analyses sur tissus post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires ou de modélisation mathématique substitutifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité notamment dans le cadre d’injection de traitement ciblant des populations cellulaires immunitaires du microenvironnement tumoral. L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Les modèles animaux décrits vont permettre d'étudier une nouvelle stratégie de traitement ciblant des populations immunitaires immunosuppressives. Des analyses in vitro ont déjà eu lieu sur un modèle cellulaire. Egalement, le choix du composé a été basé en partie sur les résultats de nos études in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, d'après les données bibliographiques et nos connaissances sur ces types cellulaires, le taux de prise de ces lignées est estimé à 80%. Cette valeur pourra être affinée lors des premières étapes du projet, pour diminuer le nombre d'animaux utilisés. Compte tenu de la prise de greffe, des critères objectifs d'efficacité de traitement ont été définis. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale. Les administrations intratumorales seront réalisées sous anesthésie générale et les injections intraveineuses sous anesthésie locale. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleur sont détectés, un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie. Leur système immunitaire a été très largement caractérisé. L'utilisation d'une souche transgénique pour la protéine d'intérêt permettra de tester notre candidat médicament (composé de l’anticorps humain) sur lequel nous avons déjà fait des études in vitro et de réutiliser ces données dans le cadre d’études in vivo. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit 6-8 semaines, correspondant à un développement optimal du système immunitaire.

Les souris utilisées sont diabétiques par construction génétique, nourries d'un régime riche en graisses et rendues hypertendues par une molécule administrée en continu, ce qui les affaiblit et allonge leurs délais de cicatrisation. 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever cœur, foie, poumons et rate. Elles passent deux ou trois échocardiographies de vingt minutes sous anesthésie gazeuse et reçoivent trois injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire, l'anesthésie répétée pouvant provoquer une hypothermie. Le porteur a ajouté 30 % d'animaux à son effectif pour anticiper la mortalité prématurée qu'il attend de ce modèle, sans indiquer combien de souris devraient mourir avant la fin du protocole.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) est une forme particulière d’insuffisance cardiaque dans laquelle le cœur pompe normalement, mais se remplit mal. Elle représente environ la moitié des cas d’insuffisance cardiaque et touche de plus en plus de personnes, notamment en lien avec le diabète et l’obésité. Les traitements restent encore peu efficaces et les modèles expérimentaux sont limités. Dans cette étude, nous testons de nouvelles pistes thérapeutiques basées sur de petites structures libérées naturellement par les cellules cardiaques issues de cellules souches. Ces structures, appelées vésicules extracellulaires, pourraient aider à réparer le cœur grâce à leurs effets protecteurs. Nous utilisons pour cela un modèle de souris conçu pour reproduire les principaux signes de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet atteindra deux objectifs clés : 1. Cette étude a pour objectif de développer un modèle murin pertinent pour l’évaluation de traitements ciblant l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. 2. Nous visons à démontrer que les vésicules extracellulaires représentent une stratégie thérapeutique prometteuse pour améliorer la fonction cardiaque diastolique et réduire la fibrose et l'inflammation dans un modèle de souris d'insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée.

Procédures

Les souris subiront des échocardiographies d’une durée d’environ 20 minutes chacune. Dans la première procédure, deux échocardiographies seront réalisées (aux semaines 6 et 12), tandis que dans la deuxième procédure, trois échocardiographies seront effectuées (aux semaines 6, 12 et 15). Dans la deuxième procédure, les animaux recevront trois injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire, administrées sur une période de deux semaines, aux jours 0, 5 et 10 après la semaine 12. Toutes les interventions (échocardiographies, injections et prélèvements d’organes) seront réalisées sous anesthésie gazeuse anesthésie. L’anesthésie sera induite pendant environ 3 minutes, jusqu’à l’absence de réponse au test de pincement (pinch test). Une fois l’animal profondément anesthésié, il sera placé sous masque facial avec un maintien de l’anesthésie gazeuse à tout au long des procédures : environ 20 minutes pour les échocardiographies, 5 minutes pour le prélèvement cardiaque, et 5 minutes pour les injections.

Impact sur les animaux

Le diabète induit, l'obésité et l'hypertension peuvent être des sources de douleur pour la souris. De plus, les animaux peuvent présenter des signes de stress lors de l'anesthésie, ainsi qu'une douleur légère et de brève durée au point d'injection intraveineuse (rétro-orbitaire). L’anesthésie générale utilisée pour les échocardiographies peut entraîner une hypothermie. Le modèle db/db peut induire un affaiblissement général et un allongement des temps de cicatrisation.

Devenir

Pour évaluer la distribution dans le cœur et d'autres organes (foie, poumons, rate) à une échelle microscopique, ces tissus doivent être prélevés pour une analyse, ce qui nécessite la mise à mort des animaux à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les vésicules extracellulaires ne seront injectées par voie intraveineuse (rétro-orbitaire) chez les souris qu’après validation de leur fonctionnalité et de leur bioactivité par des tests sur cellules humaines, incluant notamment des essais de viabilité cellulaire et d’angiogenèse. Les études sur des souris vivantes sont essentielles dans ce projet, car elles visent à évaluer le potentiel thérapeutique des vésicules extracellulaires dans l’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée, un syndrome systémique complexe. En effet, cette pathologie ne peut être modélisée de façon pertinente sans recourir à un modèle animal, un système cellulaire ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, notamment en ce qui concerne le système immunitaire fonctionnel et la signalisation neurohormonale. Par ailleurs, la visualisation de la biodistribution des vésicules extracellulaires après injection intraveineuse est également cruciale. Ces expériences constituent une étape préclinique indispensable avant toute application clinique.

Réduction

Les données seront analysées à l’aide d’un logiciel statistique afin de comparer les différences entre les groupes expérimentaux. Le nombre de souris a été déterminé en collaboration avec un biostatisticien. Une marge supplémentaire de 30% a été intégrée pour anticiper la mortalité prématurée et les pertes de données attendues, en lien avec la complexité du modèle de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Ce modèle associe des souris diabétiques, un régime alimentaire riche en graisses et l’administration d’une molécule conçue pour provoquer de l’hypertension, créant ainsi un stress métabolique et cardiovasculaire systémique susceptible d'augmenter la mortalité. Utiliser un nombre insuffisant d’animaux augmenterait le risque de résultats faussement négatifs ou non concluants, en particulier compte tenu de la variabilité biologique du modèle. Cette stratégie permet de garantir le maintien d’une puissance statistique adéquate tout au long de l’étude, même en cas de pertes imprévues

Raffinement

Les examens d’imagerie médicale sont non invasifs. Tout au long du protocole, la consommation d’eau et la glycosurie (présence anormale de sucre dans l’urine) seront étroitement surveillées chez les souris diabétiques. La glycosurie sera mesurée chaque semaine à l’aide de bandelettes urinaires, afin de suivre l’évolution du diabète. Les animaux seront régulièrement observés afin d’évaluer leur comportement, leur état général, ainsi que tout signe de douleur ou de détresse. Les animaux étant diabétiques, une attention particulière sera portée sur la consommation d’eau. En cas de signes persistants de souffrance ou d’inconfort malgré les mesures de soulagement, les procédures seront interrompues et les animaux seront mis à mort conformément aux points limites prédéfinis (cf. 4.2). L’usage de techniques de raffinement est prévu, notamment l’utilisation d’aiguilles fines pour les injections, afin de minimiser la douleur. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse associée à une injection d’un anti-douleur pour l’analgésie. Des groupes sociaux seront formés dans un environnement enrichi afin de favoriser leur bien-être tout au long de l’étude.

Choix des espèces

L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire, car cette étude vise à évaluer le potentiel thérapeutique de petites structures libérées par les cellules, connues pour transporter des messages biologiques, et leurs effets sur la fonction cardiaque. Les souris ont été choisies pour cette expérience car elles constituent un modèle bien établi et largement accepté pour étudier la physiopathologie de l'insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée, en raison de leurs similarités physiologiques avec les humains en ce qui concerne la fonction cardiovasculaire. Il s'agit d'une étape préclinique nécessaire avant de passer aux applications cliniques. Les animaux arriveront à environ 7 semaines d'âge et resteront dans l’animalerie pendant une semaine pour l'acclimatation. Nous utiliserons des souris jeunes adultes pour nos manipulations entre 8 et 10 semaines, car : 1. À cet âge, les cœurs des souris sont bien formés et peuvent supporter l'induction du modèle. 2. Le cœur possède des capacités de régénération spontanée limitées, ce qui n'est pas le cas pour les cœurs des très jeunes souris.