Rongeurs

Une souris qui perd plus de 15 % de son poids ou dont la température corporelle chute de plus de quatre degrés est mise à mort, et aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne peut être administré, ces molécules faussant les réponses immunitaires étudiées. 490 souris vont être utilisées sur cette base, toutes tuées à l'issue pour analyse de leur système immunitaire et des atteintes d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un gavage, une injection, une infection bactérienne et deux prélèvements de sang sous anesthésie. Sur la réduction, le porteur écrit en une phrase que "des tests statistiques stringents" ajustent le nombre d'animaux, sans donner le moindre détail pour ces 490 souris.

Objectifs

Les mitochondries, des organelles bioénergétiques fondamentales, émergent comme des régulateurs importants pour la mise en place des réponses immunitaires. En particulier, un enzyme liée au métabolisme cellulaire et localisée dans les mitochondries semble représenter un point critique de régulation par les mitochondries. Notre projet consiste à explorer et déterminer le rôle de cette enzyme dans a mise en place de réponses immunitaires antibactériennes. Afin de valider nos découvertes obtenues in vitro dans un environnement immunitiaire complexe, nous devons effectuer différentes analyses dans des modèles d’infections bactériennes chez le petit animal (souris).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, la description de nouveaux mécanismes immunitaires nouveaux liant métabolisme mitochondrial et régulation des réponses immunitaires. D’autre part, la description de ces mécanismes permettra le développement de nouveaux outils thérapeutiques dans les pathologies liées aux infections microbiennes.

Procédures

Sur l'ensemble de l'étude et pour chaque animal, il est prévu: un gavage (intervention de 1 minutes), une injection (intervention de 1 minute), deux prélèvements sur animaux anesthésiés (prise de sang, intervention de 3 minutes) suivis d'une injection (intervention de 1 minute) .

Impact sur les animaux

Les injections sur animal vigil peuvent entraîner une legère gène de courte durée. Les infections bactériennes peuvent également occasionner une gène pour l'animal. Une légère gène peut-être occasionée par l'anesthésie et le prélèvement sanguin.

Devenir

Les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasiés afin de permettre d'une part une analyse détaillée du système immunitaire et évaluer l'inflammation ainsi que les atteintes d'organes.

Remplacement

La réponse immunitaire fait appel à une très grande variété de cellules immunitaires qui interagissent entre elles et avec les pathogènes. Il n'existe donc pas de modèle in vitro permettant d'évaluer globalement ces processus. Néanmoins, une large phase d'expérimentation in vitro nous permettra de diminuer au maximum le nombre d'animaux, notamment en ciblant nos expériences sur les souches bactériennes les plus pertinentes.

Réduction

Des tests statistiques stringents sont utilisés afin d'ajuster le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Le principe de raffinement décrit au second alinéa de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime sera appliqué. Le bien-être des souris sera pris en compte tout au long de la procédure expérimentale. Le bien-être animal sera évalué en utilisant des points limites décrits et gradés dans les procédures. Les souris seront hébergées dans des cages de 2 L, à raison de 5 animaux par cage. Chaque cage recevra un enrichissement du milieu. Pour réduire la douleur et la souffrance, les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel habilité et chevronné. Les injections intrapéritonéales seront effectuées selon les directives officielles du IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee). L'état des animaux sera évalué tout au long de leur vie selon une grille d'évaluation de l'état des animaux spécifique de l'animalerie, assez large pour détecter toute détresse ou stress. De plus, tout au long des procédures, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement par le personnel de l'animalerie. Il est admis que si l’animal perd plus de 15% du poids du corps ou si la température corporelle diminue de plus de 4 degrés, il doit être euthanasié. L'utilisation d'analgésiques ou de molécules anti-inflammatoires est impossible ici car ces molécules influencent les réponse immunitaires.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative pour l'objectif de ce projet (évaluation de la réponse anti-microbienne suite à une altération du métabolisme cellulaire via la déficience d'une enzyme ou de la dynamique mitochondriale). Un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculiare de notre objet d'étude n'existe pas. Il est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude, sans l'utilisation de lignée de souris (sources bibliographiques consultées). Le modèle souris est un modèle privilègié car il présente de grandes similarités avec l'homme, en particulier en ce qui concerne le système immunitaire. La littérature abondante concernant les fonctions du système immunitaire et du métabolisme basée sur des études chez la souris permettra d'ajuster nos approches et de limiter l'utilisation d'animaux au strict minimum. Les animaux utilisés seront à minima de jeunes souris adultes totalement matures du l'âge varie entre 10 et 25 semaines.

Fournir à des clients des lots de souris homogènes, environ 1 100 prestations sur cinq ans, suppose ici 11 260 souris, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle pour produire un maximum d'embryons, les mâles subissent une vasectomie par ouverture de l'abdomen et cautérisation de l'épididyme, et les femelles receveuses une implantation d'embryons par la même voie. Les superovulées sont tuées pour récupérer les embryons, les receveuses mettent bas, élèvent et sèvrent les petits avant d'être autopsiées pour contrôle sanitaire, et les mâles vasectomisés sont utilisés dix-huit mois, au-delà desquels leur "efficacité" s'affaiblit. Le porteur attribue une part de la réduction du nombre d'animaux au fait d'avoir "éduqué" ses clients.

Objectifs

La reproduction assistée est utilisée chez la souris pour produire des modèles murins utilisables par la communauté scientifique dans les domaines de la recherche fondamentale, bio-médicale, pharmaceutique, pré-clinique… Afin d’assurer la reproductibilité des études et garantir les résultats obtenus, il est indispensable d’utiliser des modèles génétiquements contrôlés et aux statuts sanitaires conformes aux standards européens (Exempts d’Organismes Pathogène Spécifiés voire Exempts d’Organismes Opportunistes et Pathogènes Spécifiés). La reproduction assistée est également utilisée dans les élevages pour synchroniser les naissances dans le but d’obtenir des lots d’animaux génétiquement identiques et au même âge (cohortes) pour des besoins expérimentaux ou réguler la production en programmant les naissances au moment où elles sont nécessaires pour les chercheurs.

Bénéfices attendus

La reproduction assistée permet l’obtention de lots d’animaux aux statuts sanitaires et génétiques souhaités. Ceci permet aux chercheurs d’utiliser des animaux en bonne santé et génétiquements contrôlés dans le but d’assurer la reproductibilité et la fiabilité de leurs études. De plus, cette technique permet d'éviter la génération de nombreux animaux par des accouplements classiques nécessaires pour obtenir une cohorte homogène.

Procédures

Injection sur animaux vigiles: 1 injection d'anesthésique ou 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle ou 1 injection de buprénorphine si besoin après la chirurgie. Injections sur animaux anesthésiés: 1 injection d'anesthésique local plus une injection de buprénorphine Chirurgie ne dépassant pas 15min par animal: vasectomie (laparotomie et cautérisation épididyme) , implantation embryonnaire (laparotomie et implantation infundibulaire)

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables sont liés essentiellement aux injections ou à la chirurgie: douleur ou rougeur au lieu d'injection ou d'incision/suture, douleur abdominale suite à la chirurgie, mortalité pendant l'anesthésie. Ce projet étant un renouvellement d'un précédent projet, notre expérience sur le précédent projet a montré que nos mesures de raffinement et nos pratiques ont eu un effet bénéfique en réduisant les nuisances à moins de 2% des animaux utilisés (essentiellement mortalité en cours d'anesthésie). Certaines prestations pourront impliquer l'utilisation d'animaux à phénotype potentiellement dommageable ou induire la naissance d'animaux à phénotype dommageable.

Devenir

L'ensemble des animaux issus des 3 procédures de ce projet seront mis à mort à la fin de la réalisation de chaque procédure. Les mâles vasectomisés seront utilisés pendant 18 mois pour générer des femelles pseudogestantes. Au delà de cet âge, leur "efficacité" s'affaiblit. Les femelles super-ovulées sont mise à mort afin de récupérer les embryons d'intérêt. Les femelles receveuses sont laissées en vie après la chirurgie implantatoire pour donner naissance aux petits, les élever et les sevrer. Ces femelles sont ensuite adressées au sevice de diagnostic microbiologique afin d'effectuer une autopsie et vérifer la conformité sanitaire des petits avant leur utilisation pour des projets de recherche.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant la production de lots d’animaux pour divers projets de recherche, il est donc impossible, dans ce projet, de remplacer les animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu à été calculé afin de pouvoir réaliser l'ensemble de nos prestations (1100 environ sur 5 ans) en utilisant le nombre d'animaux maximum nécessaire. L’utilisation de lots d’animaux homogènes (âge, génotype et statut sanitaire) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés et optimise les résultats obtenus (éviter les répétitions notamment). La super-ovulation (stimulation de production des embryons par une femelle) permet d’obtenir un maximum d’embryons en réduisant le nombre de femelles utilisées. La technique de transferts d’embryons permet de sélectionner les embryons réimplantés pour obtenir directement les animaux d’intérêts. Pour les cryopreservations de lignées, dès que les caracteristiques génétiques de la lignée le permettent, une congélation de sperme (plus rapide et nécessitant 1 ou 2 mâles maximum) est privilégiée plutôt qu'une cryopreservation d'embryons (besoin de 3-4 femelles minimum) afin de reduire le nombre d'animaux. Ce projet étant un renouvellement d'un projet précédent, nous avons optimisé nos pratiques et "éduqué" nos clients pour réduire au maximum l'utilisation d'animaux tout en maintenant la qualité de nos prestations.

Raffinement

Les animaux sont hébergés sous statut sanitaire contrôlé en accord avec la règlementation. Autant que possible, les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les animaux ont un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 10h/14h pendant toute la durée de l’expérimentation. Pour les microchirurgies, le bien-être animal est assuré pendant et après l’opération. Au vu de la douleur évaluée (modérée, incision lombaire

Choix des espèces

La souris est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique. Elle est l’espèce utilisée par l’ensemble de nos utilisateurs en recherche fondamentale ou préclinique. Les animaux sont utilisés à partir de 3 semaines pour les femelles pré-pubères (super ovulation). Les mâles vasectomisés doivent être matures sexuellement (7-8 semaines) pour les accouplements contrôlés, ainsi que les femelles pseudo gestantes réimplantées.

À un ou deux jours de vie, des souriceaux sont séparés de leur mère jusqu'à dix minutes pour recevoir une injection, un geste qui peut les faire saigner. Une partie d'entre eux est tuée à neuf jours pour enregistrer l'activité de leurs neurones, les autres subissent à vingt-trois jours un prélèvement de queue pour génotypage et la pose d'une puce sous la peau, puis huit tests comportementaux entre trente et quarante-quatre jours mesurant l'anxiété, les comportements répétitifs et la mémoire. 558 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie portant les mutations observées chez des enfants atteints de troubles neurodéveloppementaux graves, les autres utilisées comme témoins. Le cerveau est prélevé sur chacune après sa mise à mort.

Objectifs

Les canaux sodiques (protéines qui transportent des ions sodium) sont essentiels pour les activités électriques des neurones, base du fonctionnement du cerveau. De nombreuses mutations de canaux sodium causent des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance", apparaissant entre 3 mois et quelques années. Des études fonctionnelles des mutations humaines ont proposé que les mutations induisent une réduction de la fonction d'un canal sodique particulier (50% de diminution d'activité). Un nouveau mécanisme pathologique pour les mutations causant des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance" a été montré : elles diminuent la fonction des canaux mutés, mais il y a aussi un effet d'inhibition des canaux mutés sur les canaux non mutés (dominance négative). Cela entraîne une réduction de l'activité des canaux anormalement supérieure à 50 %. Il n’existe pas de traitement efficace pour ces troubles. Aucun médicament activateur de l'activité de canaux sodiques n’est disponible. Dans ce projet, nous testerons une nouvelle molécule qui bloque l'inhibition des canaux mutés sur les non mutés. L'effet attendu est que cette molécule puisse restaurer la fonction des canaux sodiques, améliorer le fonctionnement des neurones et donc atténuer les troubles observés sur les animaux. Nous utilisons des souris porteuses des mêmes mutations génétiques que celles observées chez les enfants atteints. Des enregistrements sur neurones permettent d'étudier en détail l'activité des canaux sodiques présents dans les neurones. Plusieurs tests comportementaux permettent de mesurer les troubles induits par la mutation (anxiété, comportement répétitif, mémoire, interaction sociale, …). Nous allons par conséquent injecter les animaux avec la molécule décrite ci-dessus et étudierons ensuite les conséquences sur l'activité électrique des neurones et sur le comportement. En cas de succès, ce serait la première molécule améliorant l'activité de ce type de canal et utilisable comme médicament. Cette stratégie serait aussi applicable à d'autres maladies dont le mécanisme est dû à un effet de dominance négative.

Bénéfices attendus

Nos résultats peuvent fournir des informations importantes sur les mécanismes des troubles neurodéveloppementaux en général, et notre stratégie thérapeutique pourrait également être utilisés pour des études sur d’autres pathologies impliquant des dominances négatives. Les maladies liées aux canaux sodiques qui nous intéressent sont considérées comme des maladies orphelines pour lesquelles aucune solution thérapeutique satisfaisante n’est disponible. Ici, nous avons défini une stratégie qui peut aider à réduire l’impact sévère de ces mutations sur les caractéristiques du système nerveux central. Il est important de souligner que l’utilisation d’une molécule bloquant la dominance négative d’un canal muté sur un canal non muté peut avoir la capacité de traiter des dysfonctionnements de canaux indépendamment de la nature de la mutation génétique et peut représenter une solution uniforme pour un ensemble de symptômes et de patients divers.

Procédures

Tous les animaux âgés de 1 ou 2 jours subiront une injection (15 sec environ). Dans une procédure, les animaux subiront à l'âge de 23 jours un prélèvement sur la queue pour génotypage (2 sec) et la pose d'une puce nécessaire à un test (5 sec) puis 8 tests comportementaux (durées allant de 6 à 40 min, âge 30-44 jours) afin de mesurer leur niveau d'anxiété, d'éventuels comportements répétitifs, leur mémoire.

Impact sur les animaux

Dans toutes les procédures, l'injection peut induire un saignement et nécessite une séparation maternelle pendant un maximum de 10 minutes, cela peut induire un stress léger pour la mère et le petit. Dans toutes les procédures les prélèvements pour génotypage peuvent provoquer un saignement. Dans une procédure l'implantation sous-cutanée d’une puce, peuvent induire une légère douleur passagère et une gêne. Un test comportemental peut induire un stress léger.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélever le cerveau.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences sur des cellules exprimant les canaux sodium mutés d'intérêt et démontré les effets du peptide d’intérêt. Les modèles animaux sont maintenant essentiels pour ce projet car ils permettront d’étudier les effets du peptide appliqué sur un organisme entier et faire preuve de concept pour une utilisation thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser a été calculé par une analyse de puissance statistique. Nous utiliserons les souris mâles et femelles et les souris mutantes et non-mutantes de chaque portée, soit la quasi-totalité des animaux sauf pour une procédure ou la fenêtre d'âge utilisable est très restreinte d'ou l'utilisation de 1 à 3 souriceaux par portée (cela concerne 28+7=29 portées au maximum et 10 au minimum).

Raffinement

Une fois sevrés, les animaux seront élevés dans un environnement enrichi : avec matériau de nidification, buchette en bois et igloo en polycarbonate offrant un abri sombre. Les animaux seront régulièrement manipulés pour réduire le stress dû à la présence d’un humain et une grille d'observation sera utilisée pour évaluer les points limites et apporter les réponses adéquates, dont l'injection d'un antalgique en cas de douleur. Des périodes d’habituation seront réalisées pour diminuer le stress provoqué par les appareils.

Choix des espèces

La souris permet un élevage rapide avec une période de gestation de 21 jours et un sevrage également après 21 jours. Nous avons fait la caractérisation phénotypique des 2 lignées, par conséquent nous connaissons bien ce modèle et les résultats attendus lors des tests comportementaux. Pour toutes les procédures, les souriceaux seront injectés à 1 ou 2 jours afin d’agir dès la synthèse des protéines canal. Une procédure nécessite de mettre à mort les animaux à 9 jours pour pouvoir enregistrer l'activité des neurones. L'autre procédure commence après le sevrage (23 jours) et les tests comportementaux entre 30 et 44 jours car après les problèmes comportementaux observés sont moins marqués.

46 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever et analyser leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection d'antibiotique dans la veine de la queue, puis subit sous anesthésie une ponction de liquide cérébrospinal et un prélèvement de sang, après quatre séances d'habituation au tube de contention. Le porteur signale que l'injection provoque une perte d'équilibre et une attitude prostrée. Tout tient à une mesure de concentration, et les résultats attendus "constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement" de l'antibiotique, formule qui tient le bénéfice pour les patients à bonne distance.

Objectifs

Les infections neuroméningées sont difficiles à traiter de par la présence de barrières physiologiques dans l'organisme protégeant le cerveau. De plus, l'émergence de résistance aux antibiotiques actuels accentuent cette problématique. La recherche de nouveaux antibiotiques pouvant traiter ces infections devient donc un enjeu majeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer la capacité d'un nouvel antibiotique à passer la barrière qui protège le cerveau et à pénétrer dans le liquide cérébrospinal et dans le cerveau. L'antibiotique choisit a fait ses preuves dans des infections rénales ou pulmonaires compliquées.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de cette étude chez l'animal constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement de cet antibiotique dans l’indication des infections neuro-méningées chez l'homme.

Procédures

Tous les animaux recevront au cours du projet une injection d'antibiotique de 30 secondes environ, et 2 prélévements (liquide cérébrospinal et sang) seront réalisés sous anesthésie. La durée de l'anesthésie sera de 5 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Injection caudale :légère douleur, brève et transitoire. Injection antibiotique : Perte d'équilibre et attitude prostrée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse de cerveaux

Remplacement

Dans les premières phases de développement d'un médicament à visée cérébrale, il est possible d'utiliser des cultures de cellules. Cependant ces cultures ne reproduisent pas la complexité des barrières protégeant le cerveau et elles ne prennent pas en compte l'existence d'autres organes dans lequel le médicament se distribue via la circulation sanguine. Les modèles animaux restent donc nécessaires avant de tester le médicament chez l'Homme.

Réduction

L'étude sera faite en deux étapes ; la première permettra de trouver les conditions optimales d'administration sur un rat par condition. Les résultats seront confirmés dans la seconde étape sur des lots de plusieurs d'animaux. En se basant sur des données de la littérature, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux par lot permettant d'obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 10 jours. Une habituation au tube de contention qui permettra l'injection est prévue : 4 séances de 5 min sur 4 jours différents précédents l’administration . Les prélèvements seront faits sur des animaux anesthésiés sous couverture antalgique. Des points limites gradés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations ce qui permettra d'agir sans délai.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé en pharmacologie. Il s’agit d'une lignée consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique observée dans les concentrations d'antibiotiques dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie générale, puis jusqu'à neuf injections hebdomadaires sur animal vigile, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse ou par imagerie tous les trois jours. Le composé testé a déjà montré une forte activité antitumorale, y compris sur une xénogreffe de cancer du poumon, ce qui l'oriente selon le porteur vers des essais cliniques. Il écrit qu'il est "absolument indispensable" de passer par un modèle vivant pour confirmer que cette efficacité passe par le système immunitaire.

Objectifs

Les microtubules sont les composants majeurs du cytosquelette de la cellule et sont composés d’un seul type de protéine : la tubuline. Ils sont impliqués notamment dans la division cellulaire et la vascularisation tumorale. C’est pourquoi, en chimiothérapie antitumorale, cibler les microtubules est la stratégie thérapeutique à large spectre la plus efficace. Des petites molécules appelées agents ciblant les microtubules sont responsables de la régulation de la tubuline. Une société a développé un nouvel agent synthétique capable de réduler la tubuline et montrant une forte activité antitumorale ainsi que la capacité à outrepasser les mécanismes de résistance habituels. De plus, cette forte activité est également observée dans un modèle de xénogreffe de cancer du poumon non à petites cellules, orientant ainsi ce composé vers des essais cliniques en tant que nouveau médicament anticancéreux prometteur. Nos résultats in vitro (données non publiées) nous ont aussi permis d’observer que ce composé active la mort cellulaire immunogène, c’est-à-dire que le système immunitaire se retrouve activé par la mort des cellules tumorales. C’est pourquoi, nous souhaitons confirmer in vivo que l’efficacité antitumoral de ce composé synthétique est lié à l’activation du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Notre composé a déjà démontré un fort potentiel in vitro pour le traitement du cancer du poumon. Cette étude in vivo explore le potentiel immunogène et l'efficacité d'un schéma thérapeutique combiné à une immunothérapie conventionnelle par blocage des points de contrôle immunitaire. Ainsi, cette étude préclinique ouvrira la voie à des essais cliniques ultérieurs et à une éventuelle homologation clinique.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis deux injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peuvent apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs après traitement, post-mortem.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif de tester si notre nouveau composé synthétique induit une réduction de la croissance tumorale avec une activation du système immunitaire, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument indispensable pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux par groupe statistiquement nécessaire afin de réaliser notre étude. Nous aurons donc 9 animaux par groupe. Une souris supplémentaire a été ajoutée par groupe (soit un total de 9+1 souris par groupe) pour prendre en compte d’éventuelles exclusions d’animaux dans l’étude, telles que des tumeurs hétérogènes au moment du traitement, des problèmes comportementaux, l’atteint précoce d’un point limite, où la mort pendant l’expérimentation. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si l’hypothèse initiale n’est pas validée lors des premières procédures, les procédures suivantes ne seront pas entreprises. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements. Nous enrichirons le milieu à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ce qui nous permet un contrôle précis de nos expérimentations. Ensuite, la souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Et pour finir, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une grande pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une restriction alimentaire de trois à six semaines, la pose de canules cérébrales ou d'une pompe osmotique sous la peau lors d'une chirurgie de 45 minutes à une heure, huit injections directement dans le cerveau et des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'anorexie mentale persiste chez les patientes, en affamant des souris jusqu'à reproduire leur état de dénutrition. Un amendement ajoute des souris supplémentaires pour "confirmer et valider" des résultats déjà obtenus, et le porteur écrit que des explorations comportementales complexes sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.

Objectifs

L’anorexie mentale est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et à une détérioration de la santé physique et mentale. Elle a le taux de mortalité le plus élevé de tous les troubles psychiatriques et il n’existe, à ce jour, aucun traitement pharmacologique efficace. D’autre part, les taux de rechute sont importants (>40%) et la pathologieévolue souvent de façon chronique. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’anorexie mentale et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené dans un modèle murin qui mime l’état de dénutrition des patientes, est de déterminer le rôle de facteurs sanguins qui sont dérégulés au cours de la dénutrition chronique, dans la persistance et l’aggravation des symptômes de l’anorexie et qui pourraient expliquer la chronicité de cette pathologie. AMENDEMENT 1: Ajout de souris supplémentaires pour confirmer et valider nos résultats et modification d'une étape du projet pour inclure l'implantation d'une mini-pompe sous la peau qui permet l'administration en continue des molécules mimant les facteurs sanguins dérégulés dans la pathologie humaine et ainsi éviter des administrations répétées.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle murin innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale.

Procédures

Pose de canules cérébrales et/ou pompe osmotique sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques croisées souscutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Injections pharmacologiques croisées intra-cérébrales: 8 injections, durée 5 minutes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de restriction alimentaire entraine une perte de poids et une baisse de la glycémie. Les prélèvements sanguins à la queue peuvent provoquer une irritation locale et un stress. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés à chaque procédure. L’utilisation d’un protocole de pharmacologie qui permet de tester l'effet de différents traitements chez le même animal permet de réduire de façon importante le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement par un personnel compétent pour vérifier leur état physique et comportemental et leur poids est mesuré au moins 3 fois par semaine au cours de la restriction alimentaire. Pour réduire le stress lié à l’isolement ponctuel pour la mesure individuelle du comportement alimentaire, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie est effectuée sous analgésie et anesthésie générale. D’autre part, des grilles de points limites gradés et un arbre décisionnel adaptés à chaque procédure sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit l’arrêt de l’expérience.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements motivés permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études comparatives entre les observations faites chez la souris et certains aspects de la pathologie humaine. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont initiées aux stades équivalents chez la souris.