Rongeurs
Efficacité de traitements innovants sur un modèle murin de fibrose rénale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Une injection déclenche une fibrose rénale, puis deux à six injections ou gavages de molécules suivent, avec des collectes d'urine obtenues par contention. 280 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage et les injections enflammer le site de piqûre, alors que le porteur écrit que ces souris "ne présentent aucun phénotype dommageable". Sur la réduction, il indique avoir dimensionné les groupes avec un plan d'expérimentation, sans donner un seul chiffre justifiant les 280 animaux.
Objectifs
La fibrose est une augmentation anormale de la quantité de tissu conjonctif fibreux dans un tissu ou un organe. Cette fibrose entraine des défauts d'organes puisque les cellules spécialisées de l'organe sont remplacées par des fibres non fonctionnelles d’où le nom de fibrose. Les maladies fibrotiques, telles que la fibrose rénale associée à l’insuffisance rénale chronique (IRC), constituent des enjeux thérapeutiques majeurs en raison de l’absence de traitements curatifs. Des résultats récents suggèrent que des récepteurs cellulaires de molécules présentes dans le rein lors de l'IRC jouent un rôle prépondérant dans l’initiation et la progression de la fibrose rénale. Dans ce projet, nous allons tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant ces facteurs pro-fibrotiques dans un modèle murin de fibrose rénale. L’évaluation du degré de fibrose rénale après traitement avec les molécules innovantes permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces molécules pour traiter les patients atteints de fibrose rénale.
Bénéfices attendus
Les résultats générés par ce projet permettront d’envisager la mise en place en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la fibrose rénale et ainsi d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’insuffisance rénale chronique.
Procédures
Les animaux recevront une injection pour induire la fibrose rénale. Les molécules thérapeutiques seront ensuite administrées par injections (2 à 6 maximum) ou par gavage. Durée des injections : 3 à 5 secondes. Durée des gavages : environ 10 secondes. Les collectes d’urines permettant de suivre la fonction rénale se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. Le produit injecté en début d'étude va entrainer une fibrose rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Les injections répétées des produits thérapeutiques peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les gavages répétés peuvent induire une gêne et une irritation de l’œsophage. Les contentions pour traitement et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques de leurs reins.
Remplacement
Les composés thérapeutiques innovants que nous testerons dans ce projet on fait l’objet d’études in vitro préliminaires. Néanmoins, le but de ce projet est de définir le potentiel thérapeutique de ces molécules dans l’apparition de la fibrose rénale. La complexité des processus cellulaires responsables de la fibrose ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs.
Réduction
Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultat pertinents biologiquement et exploitable tout en minimisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Ainsi nous accélèrerons la fréquence de suivi de animaux et de pesé dès la deuxième semaine après traitement afin de s’adapter à la cinétique réelle d’apparition de la maladie. Un examen clinique sera réalisé 2 à 3 fois par semaine dès le début des études et le remplissage d'une grille de score lors de ces examens cliniques permettra de déterminer de façon objective le devenir de l'animal.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant la fibrose rénale. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.
Étude du rôle du récepteur plaquettaire GPIb dans les premières étapes de la dissémination métastatique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue en raison du volume de sang prélevé ou de l'injection de cellules tumorales. Selon la procédure, chacune reçoit une injection éveillée et une ou trois autres sous anesthésie, puis une prise de sang de 20 minutes au plus sous anesthésie, ou la pose d'un cathéter intraveineux et une chirurgie qui peut durer 3 h 30 avec l'observation au microscope. Sous anesthésie, leur respiration peut devenir irrégulière ou marquer des apnées, et les molécules antiplaquettaires injectées peuvent provoquer des saignements. L'objectif est de savoir si le blocage du récepteur plaquettaire GPIb, avec deux agents conçus par l'équipe et des souris mutées qui expriment ce récepteur sous sa forme humaine ou en sont dépourvues, réduit les interactions entre plaquettes et cellules tumorales aux premières étapes de la formation de métastases. Le porteur affirme que "les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués" pour reproduire ce processus, puis annonce des études in vitro préalables sur des plaquettes et des cellules tumorales humaines.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont également impliquées dans diverses pathologies, notamment la thrombose artérielle, les processus inflammatoires et les cancers. Il est connu que les plaquettes favorisent le développement de métastases. Malgré l’implication des plaquettes, les traitements anti-plaquettaires actuels ne peuvent pas être utilisés en clinique chez des patients présentant un cancer en raison du risque de saignement qui y est associé. Le récepteur plaquettaire GPIb assure l’interaction entre les plaquettes et le facteur Willebrand conduisant à l’arrêt du saignement. Il est également une cible antithrombotique connue de par son rôle important dans la croissance du caillot. Nous avons généré 2 agents ciblant ce récepteur et bloquant son interaction avec le facteur Willebrand. Leur effet sur la thrombose a préalablement été validé, tout comme l’absence d’induction de saignement. Il a été montré dans la littérature que la GPIb plaquettaire serait impliquée dans la formation de métastases. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle de la GPIb dans la formation de métastases afin d’identifier une nouvelle cible pour réduire les interactions plaquettes – cellules tumorales et potentiellement réduire le développement de métastases dans le cadre de cancers du poumon, du sein et de la peau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’éventuelle observation d’une réduction de l’interaction des cellules tumorales avec les plaquettes lorsque le récepteur GPIb est inactif. Un effet attendu serait également une réduction de la formation des métastases. L’identification d’un tel effet pourrait mener au développement d’un nouveau traitement permettant de réduire la formation de métastases et donc mener à une meilleure prise en charge des patients atteints de cancer.
Procédures
Pour la première procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et une injection sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié est réalisé (maximum 20 min). Pour la seconde procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et 3 injections sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un cathéter intraveineux est mis en place et une procédure chirurgicale est réalisée (maximum 3h30, observation au microscope comprises).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendue est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). On pourra également observer une douleur localisée de courte durée après les injections. On pourra observer d’éventuels saignements dus à la nature antiplaquettaire des molécules injectées.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort car la quantité de sang prélevée n’est pas compatible avec un maintien en vie des animaux. De même, l’injection de cellules tumorales ne permet pas un maintien en vie des animaux pour réutilisation dans une procédure ultérieure.
Remplacement
Le processus de formation de métastases étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types de cellules (plaquettes, globules blancs, cellules endothéliales, cellules tumorales etc), l’environnement de la tumeur ainsi que les conditions de flux sanguin (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. Nous disposons néamoins de modèles in vitro qui permettront d’étudier au préalable ce processus avec des plaquettes et des cellules tumorales humaines.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Ces effectifs permettent l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: •Par l’hébergement en groupes sociaux. •Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures. •Par l’injection d’antalgique et d’analgésiant aux site d’incisions et application d’anesthésique local sur l’oeil •Contre la déshydratation, une injection de sérum physiologique est réalisée avant la procédure. •Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de cancer. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant un récepteur humain permettant d’étudier l’effet de nouveaux traitements ciblant ce récepteur. De même, cela a permis la génération de souris déficientes pour ce récepteur. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois pour toutes les procédures. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU1/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris de lignées génétiquement modifiées subissent vers six jours de vie une biopsie pour leur génotypage, éveillées, ou à défaut sous anesthésie après douze jours. Une partie passe ensuite une chirurgie d'au plus 1 h 30 ou 4 heures et jusqu'à 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes, répartis sur 20 semaines. 996 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou sévère, ou menées sous anesthésie sans réveil, et les séances d'IRM, deux examens de deux heures au plus sous anesthésie, ajoutent 40 souris à l'effectif. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une structure cérébrale qui contrôle les neurones dopaminergiques soulage des symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs provoqués par des lésions de ces neurones, dont des altérations des seuils de douleur que le porteur dit ne pas pouvoir soulager "car c'est l'objet de l'étude". Il ne nomme ni la méthode employée pour léser les neurones dopaminergiques, ni aucun des 36 tests comportementaux.
Objectifs
MODIFICATION: La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2. La nécessité de procéder à des séances d'imagerie par IRM conduit à l'ajout de 40 animaux .
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
MODIFICATION Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
MODIFICATION Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
MODIFICATION Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
MODIFICATION Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Évaluation de candidats médicaments sur des modèles de d’inflammation du péritoine et de septicémie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un score de 4 sur un seul critère clinique déclenche l'arrêt immédiat de l'expérience, et aucun anti-inflammatoire ni analgésique n'est administré, ces traitements interférant avec les voies inflammatoires étudiées. 7 680 souris vont être utilisées sur cette base, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La péritonite est provoquée par ligature et perforation du cæcum sous anesthésie, ou par injection dans l'abdomen de contenu cæcal sur des animaux vigiles sans anesthésie, suivie d'administrations répétées et de prélèvements de sang pouvant atteindre 12 % du volume sanguin total. Les composés testés sont ceux de clients et le nombre de prises de sang est laissé "à l'appréciation du client", ce qui fait de ces 7 680 souris le support d'une activité de prestation.
Objectifs
La péritonite, ou inflammation du péritoine, est une infection assez grave qui peut amener au développement d’une septicémie voire à la mort si elle n’est pas traitée rapidement. Durant ces dernières années, la proportion des péritonites a considérablement augmenté et la prise en charge thérapeutique a évolué en combinant à la fois une prise en charge chirurgicale et médicamenteuse par un traitement antibiotique. Cependant, l’antibiothérapie n’est pas toujours efficace et suffisante et peut ainsi induire un délai dans la prise en charge des patients pouvant amener à la persistance de l’infection voire au décès. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un meilleur suivi des patients et d’aboutir à une rémission complète. L'objectif scientifique de l'étude est d'évaluer l’impact de nouvelles molécules thérapeutiques sur la capacité de récupération des souris suite à l’induction d’une péritonite ou une septicémie. La péritonite sera induite par l'injection de différents composés. Ainsi, l’agent inducteur utilisé va permettre de cibler différentes voies de l’immunité et donc de proposer différents modèles de péritonite. La septicémie sera induite par différentes techniques couramment utilisées chez la souris. Nous étudierons, à différents temps, l'infiltration des cellules dans le péritoine, signe d’une réponse immunitaire. Le sang et d'autres organes seront également prélevés en fonction des demandes du client pour évaluer l’état inflammatoire des animaux.
Bénéfices attendus
Depuis ces dernières années, la prise en charge thérapeutique de la péritonite a considérablement évolué en combinant à la fois une prise en charge chirurgicale et médicamenteuse par un traitement antibiotique. Cependant, l’antibiothérapie n’est pas toujours efficace et suffisante et peut ainsi induire un délai dans la prise en charge des patients pouvant amener à la persistance de l’infection voire au décès. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un meilleur suivi des patients et d’aboutir à une rémission complète. Ce projet permettra donc de tester l’efficacité et de mieux définir les fenêtres d’action thérapeutiques (doses, période optimale de traitement...) de différents candidats médicaments dans le développement de la péritonite et de la septicémie. De manière plus générale, les résultats obtenus permettront d’étayer les mécanises cellulaires et moléculaires fins contrôlant l’inflammation et sa résolution en mettant en avant de nouveaux effecteurs potentiels dans le déclenchement de la pathologie.
Procédures
Plusieurs interventions pourront être mises en place sur les animaux : i) Induction de la pathologie : a) Par chirurgie (une seule fois par animal) : les souris seront anesthésiées (5minutes) et subiront une ligation et perforation du caecum (10minutes). OU b) Par injection intrapéritonéale de contenu caecal ou d’inducteurs d’une péritonite (une seule fois par animal) : administration sur animaux vigiles sans anesthésie (1 minute maximum : saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). ii) Administrations répétées de composés client : les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront environ une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). iii) Prélèvement de sang : A l’appréciation du client, un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal. Exemple de différents prélèvements qui pourront être effectués sur un animal de 25g. - Veine de la queue sur animal vigile : 10 μL – à la joue sur animal vigile : 135 μL - sinus retro-orbital sur animal anesthésie : 135 μL Les différents modes de prélèvements dureront maximum 1 minutes.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus suite au développement d'une péritonite et/ou d’une septicémie sont une perte de poids et une baisse de la température corporelle. Le développement d'une telle infection chez les animaux va entrainer une réponse immunitaire importante afin d’éliminer l'infection. Dans un premier temps, les animaux vont présenter une baisse de leur température corporelle ainsi que la présence de fécès de moindre consistance (fécès mous voire liquides), entrainant une perte de poids, un manque de toilette (poils ébouriffés), et un comportement non provoqué altéré (vivacité réduite, prostration). La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra également générer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.
Remplacement
Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux ne pourra pas être éviter. En effet, les modifications physiopathologiques liées à la péritonite et à la septicémie sont très complexes et nécessitent la mobilisation de nombreux effecteurs cellulaires et moléculaires ainsi que la rupture dans la coordination de leur intervention au niveau systémique. Par ailleurs, la péritonite est une maladie évolutive qui, une fois déclenchée, s’aggrave progressivement et peut aboutir à une septicémie ou à une rémission avec mise en place d’un processus de résolution de l’inflammation. De plus, l’analyse de l’efficacité d’un candidat médicament nécessite de prendre en compte le caractère systémique afin d’appréhender son action sur les différentes complications dont la contribution dans la pathologie peut influencer positivement ou négativement l’impact thérapeutique. Nous devons être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.
Réduction
Au sein de cette étude, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum pour une étude statistique soit 10 animaux par groupes au début de l'étude. Nous souhaitons atteindre au moins 80% de survie chez les animaux au cours du protocole, les analyses statistiques réalisées doivent donc comprendre un nombre d'animaux d'au moins 8 à la fin de l'étude. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, lorsque cela est possible, l’impact in-vitro ou ex-vivo des candidats médicaments sera initialement évalué en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, une analyse sur des groupes de 8 animaux sera nécessaire.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, en limitant douleur, souffrance et stress, selon des points limites définis. Les souris seront hébergées conformément à la réglementation, avec enrichissement (igloo, ouate). Après induction de la pathologie (péritonite ou septicémie), un suivi régulier sera mis en place : toutes les 2h pendant 8h post-induction, puis 2 fois/jour pendant 2 jours, puis quotidiennement jusqu’à la fin de la procédure. Température corporelle et poids seront mesurés chaque jour durant les 3 premiers jours, puis hebdomadairement. L’état de santé général sera évalué quotidiennement selon un score comportemental et physique. Un score de 4 pour un seul critère entraînera l’arrêt immédiat de l’expérimentation. L’administration d’anti-inflammatoires ou d’analgésiques n’est pas possible, ces traitements interférant avec les voies inflammatoires cibles de l’étude, le comportement, l’état physique et la molécule testée. Les animaux seront néanmoins surveillés de manière rapprochée, et les expérimentateurs utiliseront une grille de score pour identifier les points limites et décider, si nécessaire, de la mise à mort. Les manipulations répétées (prélèvements, administrations) pouvant générer du stress, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage (igloo, ouate, buchettes si besoin). Les aiguilles et sondes seront adaptées au poids et à la voie d’administration. Un antalgique sera injecté avant l’anesthésie. Pendant la chirurgie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. La température corporelle sera maintenue via un tapis chauffant. Le niveau d’anesthésie sera vérifié (absence de réflexe au pincement). Après l’intervention, 1 mL de sérum physiologique chauffé à 37 °C sera injecté pour réhydrater l’animal. Il sera ensuite placé 30 min sur un tapis chauffant sous lampe UV, puis transféré en cage.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement de maladies inflammatoires et infectieuses du péritoine telles que la péritonite et la septicémie compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de l’inflammation. Par ailleurs, ce projet basé sur l'étude de l'inflammation nécessite l'utilisation d'animaux dont le système immunitaire est mature, c'est à dire âgés de 7 et 20 semaines.
Test de nouveaux adjuvants de vaccins protéiques chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 150
1 200 souris et 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections de vaccin sous anesthésie, espacées de quinze jours sur soixante jours, et subit cinq prélèvements de sang, avec une fièvre, une perte d'appétit et un gonflement au point d'injection attendus pendant un à deux jours. Il s'agit de tester de nouveaux adjuvants censés déclencher une réponse cellulaire cytotoxique que les adjuvants autorisés chez l'humain n'obtiennent pas. Le porteur écrit vouloir démontrer que ses modèles cellulaires pourraient à terme remplacer les animaux, et tire de cette comparaison même la "nécessité de l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques".
Objectifs
Les vaccins protéiques sont une classe de vaccins qui utilisent des protéines spécifiques de pathogènes pour stimuler une réponse immunitaire protectrice chez l'organisme. A cette composante protéique est ajouté un adjuvant afin d’obtenir une réponse immunitaire capable de protéger contre le pathogène ciblé. A ce jour, les adjuvants acceptés chez l’homme induisent de bonne réponses anticorps, mais la réponse cellulaire cytotoxique est très faible. Ces vaccins protéiques sont donc à ce jour peu efficaces pour protéger des infections virales. Nous avons développé de nouveaux adjuvants dans le but d’augmenter fortement cette réponse cellulaire cytotoxique. Nous avons développé de plus des stratégies pour limiter les effets secondaires tel que fièvre, inflammation locale… Nous nous proposons maintenant de tester ces candidats adjuvants chez le rongeur sur un modèle de vaccination très classique nous permettant d’évaluer la réponse immunitaire ainsi que vérifier l’absence d’effets secondaires importants.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but premier de trouver de nouveaux adjuvants pour des vaccins protéiques capable d’induire une bonne réponse immunitaire humorale et cellulaire importante sans générer d’effets secondaires importants. Il est important de noter qu’à ce jour il n’y a pas d’adjuvants réellement efficaces pour les vaccins protéiques qui permettent d’obtenir une bonne protection contre les pathogènes viraux. Ce projet pourrait permettre de mettre au point des vaccins contre des maladies virales pour lesquelles il n’existe aucun vaccin efficace à ce jour.
Procédures
Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins (temps injection 1 min max) espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal (temps prèlèvement 1 min maximum) et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.
Remplacement
Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et la réactogenicité de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires ainsi que nos modèles de diffusion /relarguage in vitro pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 8 groupes de 6 souris. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminer une ou 2 formulations vaccinales optimisées qui seront ensuite testées chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de garder suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Une réaction locale au niveau du site d’injection ou de la fièvre peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Une grille de « scoring » permettra de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. A l’aide de cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude est le modèle immunologique de référence chez la souris. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.
Mise au point du modèle de sclérose dermique induite par HOCl chez la souris C57 BL/6 et traitement avec les candidats
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à trente injections intradermiques d'acide hypochloreux. Le produit épaissit et durcit la peau du flanc, provoque des croûtes et une inflammation chronique, avec des léchages et des grattages excessifs, une perte de poids et une altération du pelage. Six injections intraveineuses et sept prises de sang par animal s'y ajoutent, pour tester des anticorps censés traiter la sclérodermie. Les anticorps ne seront testés que si la première partie du projet parvient d'abord à installer la maladie chez la souris, ce qui range les bénéfices annoncés derrière une condition quand les lésions cutanées, elles, sont programmées.
Objectifs
La sclérose dermique, maladie auto-immune, plus connue sous le nom de sclérodermie, est une maladie rare où la peau devient anormalement dure et épaisse. Cette maladie est due à une surproduction de collagène, une protéine qui rend normalement la peau souple, mais qui, en excès, la rend rigide et moins fonctionnelle. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en place ce modèle sur des souris (première partie du projet) pour ensuite tester nos différents anticorps candidats ciblant une protéine membranaire pour traiter cette maladie (deuxième partie du projet).
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif de la sclérose dermique. Les approches thérapeutiques visent à ralentir la progression de la maladie, à soulager les symptômes et à améliorer la qualité de vie. Le traitement est adapté selon la forme de la maladie et les organes atteints. C’est pourquoi le développement de nouveaux traitements est à ce jour nécessaire.
Procédures
Pesées : 8 pesées x 30 sec = 4 min Injections intradermales : 30 injections x 30 sec = 15 min Injection intraveineuses : 6 injections x 1 min = 6 min Prélèvements de sang : 7 prélèvements x 1 min = 7 min
Impact sur les animaux
Douleur et inconfort localisés : L’injection intradermique peut provoquer une légère douleur au point d’injection, avec un risque d’inflammation locale, d’œdème, de rougeur et de sensibilité accrue de la zone traitée. Développement de lésions cutanées : Les souris développent un épaississement local de la peau, une induration, ou des croûtes, pouvant gêner la mobilité ou entraîner des comportements de léchage ou de grattage excessifs. Inflammation et stress : L’administration répétée de d'acide hypocloreux induit une inflammation chronique locale, source d’inconfort, de stress pour l’animal. Altération de l’état général : Si la réaction inflammatoire est importante ou si les lésions sont étendues, on peut observer une baisse d’activité, une perte de poids ou une altération du pelage, signes d’une souffrance plus globale.
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, les organes et sites d’injections sont prélevés pour analyse
Remplacement
Il existe à ce jour des méthodes in vitro permettant de reproduire au mieux de manière limité l’induction de la sclérose dermique comme par exemple l’utilisation de cultures de cellules humaines ou de tissus reconstruits, tels que la peau artificielle ou des organoïdes cutanés. Ces modèles permettent d’étudier les mécanismes de la fibrose, de tester des molécules et d’observer les effets sur des tissus humains. Cependant il est toujours impossible de reproduire l’effet biologique et physiologique de l’organisme tout entier. Ainsi, les constructions testées dans ce modèle ont d’abord été validées par test in vitro, notamment pour tester leur efficacité sur la cible mais aussi leur tolérance
Réduction
Nous utiliserons donc un nombre minimal d’animaux par groupe : induction de la maladie chez 12 souris pour une inclusion dans les procédures de 10 souris par groupe minimum à la fin de l’expérience (le taux de réussite de l’induction de la sclérose dermique est de 80-90% selon la littérature). Ce nombre nous permettra d’arriver à des résultats statistiquement significatifs. Lors de la première partie du projet, nous développerons le modèle avant de tester dans une seconde partie nos candidats. Par conséquent, si le modèle n’est pas validé en première partie, les anticorps ne seront pas testés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 avec enrichissement du milieu (tunnel et fristotis en carton), et surveillés quotidiennement. Les injections intradermiques sur le flanc (induction) ainsi que les injections intraveineuses (traitement) sont réalisées par un expérimentateur entraîné, et réalisées sous anesthésie (lidcoaine au point d'injection). Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient les plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6 présentent une réponse inflammatoire marquée, ce qui les rend particulièrement adaptées à l’étude des maladies auto-immunes et inflammatoires comme la sclérodermie. Elles permettent de reproduire de façon fiable les mécanismes de fibrose et de vasculopathie observés chez l’humain. Elles sont sensibles au développement de la fibrose cutanée, notamment lors de l’administration de substances comme l'acide hypochloreux. Ce profil permet de modéliser efficacement les différentes phases de la maladie et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements Nous utiliserons des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début du protocole (20-25g). Cet âge permet d’assurer une bonne santé générale, une réponse immunitaire stable et une croissance terminée, ce qui est crucial pour la reproductibilité et l’interprétation des résultats. En fin d’expérience les animaux seront âgés de 12-17semaines (30-40g).
Prélèvement de tissus pour génotypage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un morceau d'oreille de 2 mm est découpé sur des souriceaux de 21 à 28 jours, sous anesthésie, au moment du sevrage. 2 500 souris génétiquement modifiées vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, et aucune n'est tuée dans le cadre de ce projet. L'établissement décrit le prélèvement de poils, non invasif, comme sa méthode courante et la biopsie d'oreille comme un recours quand le résultat n'est pas concluant, tout en en programmant 2 500. Les souris porteuses du génotype recherché partent vers les projets de recherche du laboratoire ou vers des prélèvements post-mortem, les autres pouvant être réutilisées pour "la formation du personnel".
Objectifs
Les souris génétiquement modifiées génotypées lors de ce projet seront utilisées dans les différents projets autorisés de notre établissement portant principalement sur la production de plaquettes et les fonctions plaquettaires. Les souris génétiquement modifiées doivent être identifiées individuellement pour faire correspondre chaque animal à un génotype spécifique. L’identification est réalisée par tatouage à l’encre aux doigts des souris. Le génotypage se fait de manière générale par prélèvement de poils (non invasif), cependant pour certaines lignées, il peut arriver que le génotypage poils donne des résultats non concluant. Il est alors nécessaire de réaliser une biopsie à l’oreille pour obtenir un génotypage fiable. L’objectif de ce projet est de prélever un bout d’oreille nécessaire à la bonne caractérisation génétique des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir fournir des animaux du génotype souhaité pour les projets autorisés et les prélèvements post-mortem. De plus, ce projet permet de caractériser génétiquement les animaux servant au maintien et à l’optimisation de la gestion d’élevage.
Procédures
Les souris anesthésiées sont soumises à un prélèvement de tissus à l’oreille (2 mm) qui dure 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont un stress pour les animaux. Une douleur légère et de courte durée peut être ressentie après le prélèvement prélèvement.
Devenir
Les animaux génotypés présentant le génotype souhaité iront en utilisation continue dans les projets de recherche autorisés dans notre laboratoire, pour des prélèvements de tissus post-mortem et pour le maintien de l’élevage. Les animaux ne présentant pas le génotype souhaité pourront être réutilisés pour le formation du personnel.
Remplacement
Les souris de ce projet seront utilisées dans des projets autorisés de notre laboratoire lorsqu’elles ont le génotype attendu. Les alternatives non animales et l’impossibilité de les utiliser sont détaillées dans les projets concernés. Il est indispensable de connaitre le génotype des animaux afin de les utiliser dans les projets autorisés. Il n’est donc pas possible de remplacer les animaux ici.
Réduction
Le nombre d’animaux génétiquement modifiés pour lesquels un prélèvement à l’oreille pour le génotypage sera fait est calculé en fonction des besoins expérimentaux. Les élevages sont optimisés pour produire un maximum d’animaux ayant le génotype d’intérêt pour les projets autorisés. Les animaux surnuméraires ou ne possédant pas le génotype d’intérêt peuvent être utilisés pour la formation du personnel. Le nombre d’animaux concernés par ce prélèvement de tissu invasif est réduit au maximum par la mise en place dans notre établissement de prélèvement de poils (méthode non invasive) pour la réalisation des génotypages. Cependant, cette méthode peut parfois conduire à un génotype non concluant et nécessiter un génotypage invasif par prélèvement à l’oreille.
Raffinement
Pour réduire le nombre de manipulations, la biopsie à l’oreille est réalisé au même moment que le sevrage des souriceaux. La biopsie est réalisée sous anesthésie par un personnel expérimenté et n’excède pas 5 minutes par animal. Les animaux sont surveillés sur 3 jours après le prélèvement.
Choix des espèces
Les modifications génétiques des souris produites et élevées dans notre établissement permettent de réaliser des projets de recherche autorisés et de répondre à des questions scientifiques concernant la production de plaquettes et les fonctions plaquettaires. La souris est un modèle largement connu d’un point de vu génétique, permettant de générer différentes modifications génétiques. Ses mécanismes physiologiques proches de ceux de l’Homme en font un très bon modèle d’étude pour les différents projets de notre laboratoire. Les souris seront prélevées à l’oreille entre 21 et 28 jours. La procédure de génotypage est réalisée à ce stade car elles doivent être utilisées dès l’âge adulte dans les projets autorisés ou pour des prélèvements de tissus post-mortem. Cela permet également de connaitre le génotype des animaux suffisamment tôt pour effectuer le maintien de l’élevage.
Développement d’un vaccin dirigé contre les flavivirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vérifier si une émulsion de gouttelettes lipidiques chargées de protéines virales déclenche une production d'anticorps : 180 souris vont être utilisées pour cette seule question, toutes tuées à l'issue pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections espacées de deux semaines, quatre prises de sang sur animal vigile, et sont manipulées chaque jour pour la pesée et la prise de température. Le porteur reconnaît que ces manipulations quotidiennes induisent du stress, que la piqûre provoque de la douleur et que l'émulsion peut enflammer le site d'injection. Il annonce poser "les bases d'une future formule vaccinale novatrice", à partir de groupes de cinq souris dimensionnés sur un effet statistique attendu élevé.
Objectifs
Les gouttelettes lipidiques sont de petites structures présentes dans nos cellules qui servent à stocker des graisses. Depuis quelques années, il a été découvert qu’elles jouent aussi un rôle important dans certaines infections par des virus. En effet, certains virus utilisent ces réserves de graisses à leur avantage : ils modifient leur fonctionnement pour se reproduire plus efficacement. Certains virus s’en servent même comme « plate-forme » pour fabriquer de nouvelles copies d’eux-mêmes avant de sortir de la cellule. Pour cette raison, l'interaction de protéines virale et de gouttelettes lipidiques émerge comme une cible pertinente pour des stratégies thérapeutiques chez l'homme et l'animal. Ces interactions ont été mises en évidence pour le virus de l'hépatite C mais également pour le virus de la Dengue et le Zika. Ce mécanisme de détournement de la gouttelette lipidique semble donc être une généralité pour les virus de la famille du virus de l’hépatite C , dont certains sont également à l'origine de zoonoses préoccupantes, avec un impact économique important sur les élevages (ex. Tembusu du canard). Dans ce projet, nous allons utiliser notre expertise pour fabriquer et purifier des protéines virales associées aux gouttelettes lipidiques. Ces gouttelettes seront utilisées pour vacciner des souris. Cette méthode repose sur les propriétés bien connues de ces gouttelettes, en particulier des mélanges d'huile et d'eau, qui sont reconnues pour leur capacité à stimuler efficacement le système immunitaire. Nous espérons par ces expérimentations, identifier les bases d’une future formule vaccinale novatrice.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer si l'immunisation par des émulsions de gouttelettes lipidiques intégrant des protéines virales peut induire une production d'anticorps, posant ainsi les bases d'une approche vaccinale innovante.
Procédures
Les interventions réalisées sur les souris seront les suivantes : Trois injections espacées de 2 semaines sur 180 souris vigiles. Durée de l’intervention :20 secondes. Manipulation et potentielle contention pour pesée et prise de température quotidienne sur 180 souris, durée de l’intervention inférieur à la minute. Quatre prises de sang espacées de 1 à 2 semaines, i.e. contention et prélèvement sur 180 souris vigiles, durée de l’intervention environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Le protocole nécessite de manipuler tous les animaux quotidiennement pour évaluer certaines constantes (poids, température, etc…) donc induction de stress L’immunisation en elle-même nécessite l’injection de l’émulsion, la piqure provoque donc de la douleur, l’exposition à l’émulsion peut également induire une petite inflammation à la zone d’injection. De même, les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur lors de la prise de sang.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leur rate.
Remplacement
Notre thématique de recherche est impossible à mettre en œuvre sans animaux. En effet la mécanistique permettant la production d’anticorps nécessite l’implication dynamique de multiples acteurs cellulaires dans des contextes tissulaires complexes ne pouvant être reproduit par des méthodes alternatives.
Réduction
Notre stratégie de réduction est basée sur l’emploi de tests statistiques nous permettant de valider nos hypothèses scientifiques sur la base de résultats obtenus avec le nombre minimal d’animaux en termes d’effectifs. Les comparaisons inter-groupes seront réalisées au moyen de tests non-paramétriques. Les principales mesures réalisées seront les quantités d’anticorps spécifiques induites par les différentes immunisations. Les tests utilisés sont : Test de Mann-Whitney,ANOVA de Kruskal-Wallis, Analyse en composantes principales. Nous anticipons des différences nettes entre les groupes témoins et les groupes vaccinés lorsque la présentation de l’antigène est efficace. Par ailleurs, nous nous attendons à une variabilité interindividuelle relativement faible. Dans ce contexte, la puissance statistique dépend principalement du rapport entre l'effet attendu et l'écart-type (Différence de Cohen). Un effet ≥ 2 nous permet raisonnablement d’envisager une puissance approchant 80 %, ce qui justifie le choix de groupes de 5 souris.
Raffinement
Des observations quotidiennes seront effectuées afin de s’assurer du bien-être des animaux. Nous surveillerons l’apparition des symptômes suivants : diarrhée, poil hérissé, léthargie, yeux clos et dos courbé. Le cas échéant, l’administration d’analgésique (AINS) pourra être envisagée en concertation avec le personnel de l’animalerie. Nous veillerons également à réduire les sources de stress afin d’augmenter le bien-être animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés avec des micro-aiguilles pour minimiser le saignement et prélever le volume le plus petit possible nécessaire à la sérologie. D’autre part, les administrations de gouttelettes lipidiques seront faites par injections lentes afin de minimiser la douleur et de réduire la variabilité intra et inter-expériences que le stress pourrait engendrer. Les souris seront hébergées dans un local climatisé, dans des cages à couvercle filtrant avec boisson et aliments standard ad libitum (maximum de 5 animaux/cage). Aucun animal ne sera isolé et les souris seront dès leur transfert réparties en groupe de 5 et maintenues au sein du même groupe pendant la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris a été sélectionnée en raison de sa capacité à reproduire de manière pertinente les mécanismes immunitaires spécifiques ciblés par notre protocole vaccinal, notamment la génération de réponses humorales et cellulaires adaptatives comparables à celles observées chez l’humain. De plus, des modèles murins permettent de moduler précisément les conditions expérimentales (ex. lignées transgéniques ou knock-out) pour explorer les voies immunitaires impliquées, ce qui est indispensable à la compréhension fine des mécanismes d’efficacité et de tolérance du vaccin. De plus, le modèle souris dispose d’une richesse incomparable en outils immunologiques. Souris femelles à l’âge de 8 semaines car le système immunitaire est mature.
Génotypage pour maintien de lignée et inclusion en protocole
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Biopsie de l'extrémité de la queue, moins de deux millimètres, pratiquée de préférence dans la première semaine de vie, sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse selon l'âge : 1 250 souris subissent ce geste pour que leur génotype soit identifié, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit préférer l'intervention à une semaine parce que "les circuits de perception de la douleur ne sont pas encore matures à cette âge là", et n'attend qu'une douleur passagère. Les souris porteuses du génotype recherché rejoignent d'autres protocoles de recherche, une partie du reste est gardée pour le renouvellement de l'élevage. Celles qui n'ont pas le bon génotype, ne peuvent être utilisées en nécropsie ou ont dépassé l'âge de la reproduction sont mises à mort.
Objectifs
Afin de déterminer les animaux génétiquement altérés d'intérêt dans les cadre d'élevage et de projet APAFiS, il est nécessaire de réaliser un génotypage des souris présentes en élevage à l'animalerie. Pour ce faire, les souris subiront une biopsie de l'extrémité de la queue.
Bénéfices attendus
L'identification génétique nous permet de sélectionner les animaux à inclure dans les procédures expérimentales de recherche.
Procédures
Les souris subiront une biopsie au niveau de l'extrémité de la queue (≤2mm). Ce prélèvement se fera jusqu'à la 3e semaines de vie. L'opérateur effectuera cette biopsie préférentiellement lors de la première semaine de vie. Selon leur âge et leur capacité à répondre à une anesthésie, le geste pourra être réalisé sur animaux vigiles ou anesthésiés (anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
Une douleur passagère est attendue au moment du prélèvement.
Devenir
Cette procédure vise à définir les animaux d'intérêt pour d'autres protocoles de recherche ou le maintien de la lignée. Outre les animaux d'intérêt, les animaux restants serviront au maintien des lignées et/ou seront proposés en nécropsie. Toutefois, les animaux qui n'auront pas le bon génotype et ne pouvant être utilisés en nécropsie; ou dont l'âge ne permettait plus la reproduction seront mis à mort.
Remplacement
Afin de déterminer les animaux d’intérêt pour des projets scientifiques, il est nécessaire d’effectuer une indentification génétique par un prélèvement au bout de la queue. Ce protocole étant préliminaire à des études autorisées utilisant des animaux transgéniques à des fins scientifiques, il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des souris par une méthode alternatives.
Réduction
La procédure ne sera réalisée que sur des animaux dont le croisement d'origine permet d'obtenir le génotype d'intérêt. La vérification du génotype au cours de l'élevage nous permet de limiter les dérives génétiques. La gestion de l'élevage sera raisonnée en fonction des inclusions à différents projets et du maintien de l'lélevage. Le nombre d'animaux est défni en fonction de notre protocole actuel pour le maintien de l'élevage. Ce nombre sera réduit en fonction des portées obtenues.
Raffinement
Après leur naissance, les animaux resteront hébergés en groupe avec leur mère dans une cage bénéficiant d'un milieu enrichi (coton foisonnant, aspen brick, tube carton et dôme) jusqu'à leur sevrage. Le geste sera réalisé au cours des 2 premières semaines de vie des souriceaux pour limiter la douleur associée à ce geste. Après sevrage, les animaux seront hébergés en groupe et avec un milieu enrichi. Les souris seront vérifiées quotidiennement et différentes mesures seront mises en place pour assurer leur bien-être. Dans le cas où un point limite serait atteint, l'animal concerné sera mis à mort.
Choix des espèces
Nos protocoles d'étude impliquent une vérification du génotype concernant les modèles expérimentaux murins transgéniques. Les souris seront préférentiellement génotypées à une semaine de vie car les circuits de perception de la douleur ne sont pas encore matures à cette âge là. Ainsi le geste ne sera pas traumatique et sera conforme aux bonnes pratiques. En cas de nécessié, le prélèvement sera réalisé avant leur sevrage (maximum 3 semaines).
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU2/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Transportées d'un établissement à l'autre pour y passer deux examens d'IRM de deux heures sous anesthésie, 996 souris vont être utilisées dans ce projet sur la maladie de Parkinson, dont 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 160 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles subissent une biopsie de queue sur animal vigile vers le sixième jour de vie, une chirurgie d'une heure trente à quatre heures, puis jusqu'à trente-six tests comportementaux de dix à quarante-cinq minutes répartis sur vingt semaines, avant d'être toutes mises à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur indique que la lésion dopaminergique entraîne une perte de poids et des déficits moteurs, et que les altérations des seuils de douleur "ne peuvent être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Sur le remplacement, il affirme que la structure cérébrale visée n'a été localisée que chez les mammifères, ce qui exclut selon lui tout autre modèle.
Objectifs
MODIFICATION: La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2. La nécessité de procéder à des séances d'imagerie par IRM conduit à l'ajout de 40 animaux .
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
MODIFICATION Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
MODIFICATION Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
MODIFICATION Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
MODIFICATION Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Contremesures ciblant le botulisme
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Injectées de neurotoxines botuliques avec ou sans sérum de cheval, ou gavées de toxine puis injectées d'anticorps une heure plus tard, des souris de 3 à 5 semaines sont observées pendant quatre jours pour mesurer paralysie et mortalité. 4 692 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie des tests cherche la dilution d'anticorps qui protège la moitié des souris d'un groupe. La toxine provoque une paralysie flasque qui peut aller jusqu'à l'arrêt respiratoire : les souris s'allongent en "taille de guêpe" pour respirer, se refroidissent, s'isolent et peinent à boire et à se nourrir, et le porteur prévoit de les tuer rapidement quand ces signes, combinés, annoncent leur mort. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure, les effets de la toxine étant, écrit-il, "irréversibles après l'injection".
Objectifs
Ce programme de recherche vise à caractériser l’activité neutralisante de produits sériques équins dirigés contre les neurotoxines botuliques (BoNTs). Dans ce programme de recherche, nous utilisons des produits innovants. Il est donc nécessaire de définir l’activité neutralisante des produits sériques équins et d’apporter la preuve que les anticorps dirigés contre chaque BoNT sont capables de protéger contre une intoxication par voie digestive. De larges quantités d’anticorps neutralisants ont été produites pour générer un prototype de traitement. Sur le modèle de ce qui a été mis en place dans l’étude précédente, nous prévoyons de définir des produits équins afin de garantir une couverture de protection plus large. La mesure des titres neutralisants des anticorps sera effectuée à l’aide d’un test de léthalité chez la souris. Ceci nous permettra de définir la dilution d’anticorps protégeant la moitié des souris au sein d’un groupe. Le troisième volet correspond à la mise en œuvre d’une expérience d’ingestion des BoNT par gavage chez la souris, suivie de l’injection à différentes dilutions du mélange d’anticorps correspondant. Ceci nécessitera la production de lots de neurotoxines et la mesure de l’activité toxique de ces lots. Cette étude permettra de démontrer qu’un produit prototype offre une protection contre l’ingestion de neurotoxines et que cette protection est conférée à une dose équivalente de celle requise pour protéger l’Homme. A l’issue du programme, nous aurons donc caractérisé l’activité de différentes BoNT et d’anticorps lyophilisés. Nous prévoyons aussi d’apporter la preuve de concept que le prototype de candidat médicament ciblant certains sérotypes de BoNTs est protecteur dans un modèle d’ingestion de neurotoxine.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de caractériser des produits sériques neutralisants d’origine équine contre les sérotypes de neurotoxines botuliques connus pour être responsables du botulisme chez les patients. Nous montrerons aussi que l’injection d’un produit prototype chez la souris offre une protection contre l’ingestion de neurotoxines (issues de souches isolées des patients). Ce programme contient plusieurs livrables dont la production de différents types de produits « standards » que sont : 1) les lots de neurotoxines et 2) les anticorps équins anti-toxines d’activité neutralisante définie dans ce programme. Nous apporterons aussi la preuve de concept que le produit prototype offre une protection contre l’ingestion de neurotoxines natives que ce produit soit co-injecté mais aussi par voie intraveineuse dans le cas d’une intoxication digestive, qui constitue la voie naturelle du botulisme.
Procédures
Les deux premières procédures consistent à injecter (quelques secondes) aux animaux des neurotoxines avec ou sans produit sérique neutralisant avec un suivi de la paralysie sur quatre jours. La troisième procédure consistera à administrer aux animaux les toxines par voie orale (quelques secondes) puis consistera à injecter une heure après des anticorps (quelques secondes). Un seul prélèvement de sang de quelques secondes sera effectué sur un groupe contrôle pour s’assurer que la toxine est passée dans le compartiment sanguin. Les effets létaux des toxines et de protection des anticorps seront suivis sur une période de 4 jours.
Impact sur les animaux
Le botulisme humain et animal est dû à l’action de neurotoxines qui ciblent la terminaison nerveuse des motoneurones, ce qui entraine un blocage de la transmission neuromusculaire. Il s’ensuit une paralysie flasque progressive allant jusqu’à l’arrêt respiratoire. Au stade intermédiaire les souris adoptent un phénotype caractéristique dit en « taille de guêpe » et présentent une hypothermie. Elles apparaissent très allongées, pour maximiser leur capacité respiratoire. Les souris sont progressivement impactées dans leur liberté de mouvement pour boire et se nourrir et montrent des signes d’hypothermie et d’isolement. C’est l’ensemble de ces symptômes, lorsqu’ils sont combinés, qui permettent de prédire la mort des souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure car les effets de la toxine sont irréversibles après l’injection et ils ne peuvent être ré-utilisés.
Remplacement
Les méthodes alternatives que nous développons pour la détection, la quantification des neurotoxines botuliques (BoNT) et leur sérotypage nécessitent la mise en place et la calibration d’outils « standards », qui font l’objet des procédures 1 et 2 de cette étude. A ce jour, aucun modèle in vitro permet de reproduire la complexité d’une intoxication par la toxine botulique. Les études sur un modèle animal restent donc indispensables pour évaluer l’activité de la toxine botulique ainsi que l’efficacité des traitements développés. Ces études dans un organisme complet permettent de recueillir des données nécessaires à la calibration de standards qui seront utilisés pour le développement de méthodes alternatives et l’évaluation l’efficacité des traitements pour une application chez l’humain. En particulier, un test de dosage enzymatique requérant des fragments d’anticorps standards est mis en place pour remplacer les tests de mesure de létalité chez la souris. Ce test doit permettre, à terme, de définir des titres protecteurs des anticorps obtenus à partir des chevaux hyperimmunisés lors de la phase de production du produit thérapeutique.
Réduction
La méthode de réduction appliquée est l’emploi du plus faible nombre de souris possible afin d’atteindre un coefficient de variation proche de 20% idéalement, avec : 1) des protocoles adaptés, utilisant de groupe de 4 animaux et des tests avec un nombre minimal de dilutions encadrant les doses létales ou de neutralisation mais permettant de définir des intervalles de confiance suffisamment précis. 2) les bonnes pratiques de laboratoire et une gestion des résultats, afin de limiter le nombre d’expériences nécessaires à l’obtention de résultats fiables, en intégrant les recommandations de la Pharmacopée européenne.
Raffinement
La surveillance des souris a été accrue afin de détecter le plus tôt possible les signes cliniques du botulisme. Pour ce faire, les animaux sont observés quotidiennement afin de réduire les risques de souffrance, nous avons identifié des critères précoces notés sur une feuille d’observation, qui nous permettent de prévoir la mortalité des souris et de limiter la souffrance animale par mise à mort rapide. Des mesures d’amélioration des conditions de vie des souris ayant du mal à se déplacer après l’injection ont été mises en place (des gels hydriques imbibés d’eau et de nourriture sont placés dans la cage).
Choix des espèces
Le test de référence de létalité sur souris est la seule méthode reconnue de référence dans la Pharmacopée pour la détection et le dosage des toxines botuliques. Cette méthode doit être réalisée sur un modèle murin afin d’obtenir la meilleure sensibilité de tous les sérotypes connus pour être pathogènes chez l’homme. Souris âgées de 3 à 5 semaines. La sensibilité des souris aux toxines botuliques dépend de leur âge et de leur poids. Le test de référence de létalité sur souris MBA est la seule méthode reconnue dans la Pharmacopée pour la détection et le dosage des toxines botuliques, ainsi que pour la détermination des titres neutralisant de produits sériques anti toxines. Cette mesure doit être réalisée sur la souris car aucune méthode alternative fiable n’existe à ce jour.
Etude de la tolérabilité ou toxicité subaiguë de molécules à potentiel thérapeutique.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 480
Une entreprise évalue sur des rats ou des souris la toxicité de ses propres molécules, administrées de façon répétée, pour écarter tôt celles qui provoquent des effets indésirables. 960 rongeurs, 480 souris et 480 rats adultes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré, tous tués à l'issue pour l'examen histologique de leurs organes. Ils reçoivent un composé une ou deux fois par jour pendant 7, 14 ou 28 jours, surtout par gavage, à des doses aux effets "souvent inconnus", indique le porteur. Il attend des effets indésirables dans le "dernier groupe", comme une prostration, des difficultés à se déplacer ou une modification des expressions faciales, et cite, "dans de rares cas", une perforation de l'œil lors d'une prise de sang rétro-orbitaire. Selon lui, la réglementation exige ces essais sur deux espèces de mammifères dont l'une n'est pas un rongeur, et l'étude sur rats ou souris n'en est que la première.
Objectifs
La mise en place d’un programme d’optimisation de molécules, depuis la synthèse jusqu’à la qualification d’une molécule comme potentiel candidat clinique pouvant entrer dans les phases de test de toxicité et de tolérance chez l’animal, est un long processus avec des coûts très importants. Ce programme consiste en une série d’études obligatoires comprenant notamment des tests de toxicité. Les épreuves de toxicité (tolérabilité) par administrations réitérées ont pour objet de mettre en évidence les modifications physiologiques et anatomopathologiques consécutives aux administrations répétées d’un composé et d'établir les conditions de l'apparition de ces modifications en fonction de la posologie. Ce projet nous permettra d'évaluer la tolérabilité de composés pharmacologiques développés par notre société.
Bénéfices attendus
Grâce à ces études, nous pourrons identifier rapidement les molécules mal tolérées par l'animal et au potentiel toxicologique. Les molécules avec des effets secondaires seront éliminées du processus de développement. Nous limiterons alors le nombre de molécules à développer, le nombre d’études de toxicologie, le nombre d’études in vivo de modèles pathologiques, et réduirons in fine le nombre global d’animaux inclus dans des études précliniques. Cela apportera également de précieuses informations quant à la potentielle toxicité du composé, les organes cibles et son mode d'action in vivo. Ce dernier point nous permettra de modifier la constitution même de la molécule pour adapter les caractéristiques observées à celles attendues pour le développement de molécules efficaces.
Procédures
Les animaux recevront le composé une ou deux fois par jour (selon la demi vie de la molécule), pendant 7, 14 ou 28 jours (selon la phase de developpement de la molécule et l'indication envisagée). L'administration par voie orale dure une dizaine de secondes. D’autres voies alternatives d'administration (sous-cutanée - 10 secondes, intraveineuse - 1 minute, intrapéritonéale - 10 secondes) pourront être utilisées selon les caractéristiques intrinsèques des composés et leur propriétés pharmacologiques. Un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (3 minutes au total) sera fait préalablement au sacrifice afin d’analyser la réponse inflammatoire dans le serum et/ou de doser le composé pharmaceutique dans le plasma (taux d’exposition). Il est possible que plusieurs prélèvements soient réalisés chez le même animal au long de l'étude (1 par semaine maximum).
Impact sur les animaux
Par le choix des doses de composé (aux effets souvent inconnus), il est attendu des effets indésirables sur les animaux du dernier groupe. La douleur ou le mal-être ressentis par les animaux peuvent se manifester, entres autres, par une hypo- ou une hyperactivité, des difficultés à se déplacer, une prostration, une modification des expressions faciales. La douce contention nécessaire pour le traitement par voie orale, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, ne devraient pas imposer de souffrance aux animaux, même si il existe des risques d'hypothermie et de sècheresse oculaire dans ce dernier cas. Ils pourront néanmoins engendrer un stress. Malgré la très bonne formation du personnel, il pourrait dans de rares cas y avoir des conséquences dues aux administrations ou aux prélèvements (par exemples : irritation lors de gavages répétés, hématome lors d'intraveineuse, douleur, perforation de l'oeil lors d'un prélèvement en retro-orbital).
Devenir
La mise à mort de tous les animaux est nécessaire dans la mesure où les organes seront observés et prélevés pour analyse histologique.
Remplacement
En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leur mécanisme d’action et de limiter le nombre de molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Les tests in vitro apportent des renseignements sur la toxicité potentielle des substances, mais ils ne sont pas encore suffisants pour éviter l'expérimentation sur l'animal entier avant l'administration à l'Homme. Un composé qui réussit les premiers tests de sécurité et de toxicologie peut être pris en considération pour les études à doses répétées sur les animaux. Ces études apportent l'essentiel des informations fondamentales sur la façon dont le composé agit sur l'organisme. La relation entre la dose et la réaction de l'animal au composé est étudiée plus en détail et les organes ayant subi d'éventuels effets toxiques sont examinés. Ces premières informations sont essentielles pour évaluer la dose initiale sûre pour les essais cliniques chez l'Homme.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été utilisé par le passé pour obtenir des informations sur la potentielle toxicité des molécules au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux maximum nécessaire pour obtenir des résultats significatifs dans les tests statistiques utilisés.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien Être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés majoritairement par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. D’autres voies alternatives pourront être utilisées selon les caractéristiques intrinsèques des composés et leur propriétés pharmacologiques (voies sous-cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). La formation du personnel, la taille de la sonde et l’adaptation des volumes administrés selon la voie d'administration permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Après réception, les animaux seront placés dans des cages par 4 à 5 souris ou par 2 à 3 rats. Un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager leur comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge pour se cacher, bois à ronger… Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.
Choix des espèces
Selon les textes réglementaires, « les essais de toxicologie par administration réitérée devront être effectués sur deux espèces de mammifères dont l'une ne sera pas un rongeur ». Nous pouvons alors réaliser la première étude sur rongeur. Comme mentionné plus haut, l’espèce de rongeur sera choisie en fonction de la connaissance de la molécule, des études antérieures et préliminaires de pharmacocinétique et de métabolisme. Nous travaillerons avec des rats ou des souris (mâles et femelles), pour suivre les textes réglementaires. Nous utiliserons des animaux adultes de 8 à 10 semaines environ pour les 2 espèces. Il n’est pas justifié d’utiliser des animaux très jeunes ou âgés.