Rongeurs
Prévention de la bactériémie et endotoxémie dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 905 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection d'endotoxine bactérienne ou de bactéries vivantes pour déclencher un sepsis, précédée pour certaines de cinq injections quotidiennes sur une semaine ou de quatre injections hebdomadaires sur un mois, et suivie pour d'autres de dix injections en sept jours. Le porteur énumère les atteintes attendues : inflammation systémique sévère, défaillance du foie, des reins, du cœur et des poumons, troubles de la coagulation, hypotension, hypothermie ou fièvre. Il écrit qu'aucun modèle in vitro ne reproduit cette complexité et qu'il reste attentif aux avancées qui pourraient un jour limiter le recours aux animaux, tout en programmant l'induction d'un choc septique chez près de trois mille souris.
Objectifs
Le sepsis est une complication très grave des infections bactériennes et virales. Il peut apparaître de manière soudaine et imprévisible. Cette maladie survient lorsque le système immunitaire, censé protéger l’organisme contre les infections, s’emballe et déclenche une inflammation excessive, appelée choc cytokinique. Cette réaction incontrôlée peut entraîner un dysfonctionnement des organes et, dans les cas les plus graves, une défaillance généralisée (Source : Ministère des Solidarités et de la Santé). Des recherches récentes ont mis en évidence l’existence de certaines molécules jouant un rôle clé dans la régulation du métabolisme et du comportement alimentaire. Ces molécules sont naturellement produites par les cellules et les organes. Chez la souris, leur inhibition entraîne une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids. De plus, leur neutralisation active un mécanisme biologique appelé autophagie, qui permet aux cellules d’éliminer leurs composants endommagés et de mieux résister aux agressions, notamment dans certaines maladies du foie. Sur la base de ces découvertes, ce projet de recherche vise à déterminer si la modulation de l’autophagie pourrait aider à prévenir le choc septique. Pour cela, deux modèles expérimentaux seront étudiés sur des souris : Un modèle d’endotoxémie, où une toxine bactérienne est injectée pour déclencher une forte réaction inflammatoire. Un modèle de bactériémie, où des bactéries vivantes sont injectées afin de reproduire une infection généralisée plus proche des cas observés chez l’humain. L’objectif de cette recherche est d’explorer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l’inflammation excessive et améliorer la prise en charge du sepsis, une condition qui reste à ce jour un défi médical majeur.
Bénéfices attendus
Le sepsis représente un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Chaque année, il affecte près de 50 millions de personnes, avec une mortalité particulièrement élevée chez les enfants de moins de 5 ans, qui représentent plus de 40 pour cent des cas. Cette pathologie touche de manière disproportionnée les pays à faibles et moyens revenus, mais reste également l’une des principales causes de décès dans les pays développés. Globalement, le sepsis est responsable de plus de 11 millions de décès annuels, alors que beaucoup de ces décès pourraient être évités grâce à une prise en charge rapide et efficace. En Europe, le sepsis est à l’origine de près de 700 000 décès chaque année, dont environ 57 000 en France, soulignant l’urgence d’améliorer les stratégies de prévention et de traitement. Ce projet vise à valider une nouvelle approche thérapeutique contre la septicémie, en testant l’activation du flux autophagique dans un modèle préclinique approprié et représentatif de l’évolution clinique de la maladie. L’objectif est double : Évaluer l’efficacité et la pertinence de cette stratégie thérapeutique dans un cadre expérimental rigoureux, permettant d’identifier une nouvelle cible pour limiter l’hyper-inflammation et améliorer la survie des patients atteints de sepsis. Mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents au sepsis, qui restent encore insuffisamment caractérisés, notamment en ce qui concerne l’impact du métabolisme cellulaire et de l’autophagie dans la réponse inflammatoire systémique. En apportant de nouvelles connaissances sur ces mécanismes et en ouvrant des perspectives thérapeutiques innovantes, ce projet pourrait contribuer à la réduction de la mortalité associée au sepsis et à l’amélioration des stratégies de prise en charge clinique.
Procédures
La mise en place des modèles murins de sepsis implique plusieurs types d'interventions. Celles-ci comprennent des injections ainsi que des procédures de suivi et d'analyse. Avant de déclencher le sepsis, certaines souris recevront 5 injections quotidiennes sur une semaine (traitement par une molécule pour l’induction de la délétion génique). Certaines souris recevront 4 injections hebdomadaires sur 4 semaines. Chaque injection dure quelques secondes et est réalisée sur animal vigile. Enfin, certaines souris ne recevront aucune injection préalable. Pour la mise en place du sepsis, toutes les souris recevront une injection unique (quelques secondes) sur animal vigile. Après le déclenchement de la maladie, certains animaux recevront 10 injections sur 7 jours en fonction des groupes expérimentaux sur animal vigile. Chaque injection dure quelques secondes. Chaque pesée dure également quelques secondes. L'examen non invasif de la pression artérielle sera effectué sans anesthésie et durera environ 15 minutes. L'échocardiographie nécessite une anesthésie légère et dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus dans ce projet sont principalement liés à l’induction de l’endotoxémie et de la bactériémie. Les effets indésirables attendus sont ceux classiquement associés à l’induction du sepsis expérimental, sans effets additionnels imprévus. Les principales nuisances incluent : Inflammation systémique sévère, associée à une production excessive de cytokines pro-inflammatoires. Dysfonction d’organes (foie, reins, cœur, poumons), due à l’hypoperfusion tissulaire et au stress oxydatif. Altération de la coagulation, avec un risque accru de thromboses ou d’hémorragies. Hypotension, résultant d’une vasodilatation excessive et d’une augmentation de la perméabilité vasculaire. Altération de la barrière intestinale, favorisant la translocation bactérienne. Dysfonction immunitaire, avec une phase initiale d’hyperactivation suivie d’une immunosuppression secondaire. Altération de la thermorégulation, pouvant entraîner hypothermie ou fièvre. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress temporaire, lié à la contention des animaux, une douleur locale transitoire au point d’injection, une inflammation locale (rougeur, œdème), un risque d’infection au site d’injection, notamment dans le modèle de bactériémie. Les effets liés aux interventions pharmacologiques pourraient induire des perturbations du métabolisme énergétique et modifications du poids corporel. Les mesures de pression artérielle non invasives peuvent induire un stress lié à la contention, malgré l’habituation préalable des animaux. L’échocardiographie nécessite une anesthésie, qui peut provoquer une hypothermie transitoire, et une récupération retardée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.
Remplacement
Le sepsis résulte d’une réponse immunitaire incontrôlée à une infection, impliquant une activation excessive des cellules immunitaires, la libération massive de cytokines, l’activation des voies de coagulation et un dysfonctionnement vasculaire, conduisant à une défaillance multi-organes. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité du sepsis, notamment les interactions dynamiques entre le système immunitaire, les organes vitaux et le microbiote. Bien que des alternatives comme les cultures cellulaires et les organoïdes permettent d’étudier certains mécanismes isolés, elles ne remplacent pas l’étude sur organisme entier. L’expérimentation animale reste donc nécessaire à ce stade, mais nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à terme, proposer des alternatives fiables permettant de limiter davantage le recours aux animaux.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2880 souris, avec une optimisation des expérimentations pour réduire le nombre d’animaux témoins. Ce nombre a été rigoureusement déterminé à l’aide d’une analyse statistique préalable, incluant des calculs de puissance fondés sur les effets observés dans des études préliminaires et des données publiées dans des travaux similaires. L’étude sera interrompue si la première série d’expériences invalide l’hypothèse de travail, afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Afin de maximiser l’exploitation des données, plusieurs tissus seront prélevés (analyses immunologiques, histologiques, biologie cellulaire et moléculaire). Ces échantillons seront partagés avec nos collaborateurs, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés dans des études complémentaires.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes aux réglementations en vigueur et adaptées en collaboration avec le personnel de l’animalerie. Les animaux auront un accès libre à une alimentation équilibrée et à de l’eau ad libitum. Leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification et des structures adaptées (tunnels en carton, morceaux de bois) afin de favoriser leurs comportements naturels et réduire le stress. En cas de difficulté alimentaire, un gel nutritif sera placé dans les cages pour faciliter l’accès à une nutrition adaptée et prévenir toute perte de poids excessive. Toutes les manipulations expérimentales seront réalisées en veillant à minimiser l’inconfort et la souffrance des animaux. Un suivi rigoureux sera mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter toute anomalie. Le personnel impliqué dans ce projet est hautement qualifié et bénéficie d’une formation continue aux bonnes pratiques d’expérimentation animale. Toutes les procédures seront réalisées avec du matériel approprié pour réduire la douleur et le stress, notamment : L’utilisation d’aiguilles de petit calibre pour minimiser la douleur des injections. Le recours à des anesthésiques adaptés lorsque nécessaire. Les sites d’injection feront l’objet d’une surveillance rigoureuse afin de détecter toute inflammation ou infection. En cas de complication, des interventions appropriées seront réalisées, notamment l’application d’antiseptiques. Si des comportements agressifs ou des blessures sont observés chez les mâles, ils seront placés en hébergement individuel, avec un enrichissement adapté (coton de nidification, morceaux de bois) pour maintenir leur bien-être. Toute blessure sera immédiatement prise en charge.
Choix des espèces
Le choix des souris comme modèle animal se justifie par plusieurs raisons scientifiques. Elles représentent le modèle de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de s'appuyer sur une vaste expertise en élevage, manipulation expérimentale et suivi vétérinaire. Les lignées de souris offrent l’avantage de disposer de modèles génétiquement modifiés spécifiques de nos protéines d’intérêt. Les lignées choisies sont immunocompétentes et ne présentent pas de phénotypes préjudiciables. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, afin de disposer d’un organisme dont le développement est achevé.
Traçage des cellules progénitrices rénales au cours de la régénération des podocytes induite par la télomérase chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
2 400 souris vont être utilisées pour que 264 d'entre elles portent le génotype recherché, les autres naissant, se faisant couper un bout d'oreille pour génotypage, puis étant tuées faute d'avoir hérité de la bonne combinaison génétique. Les 264 retenues subissent trois injections intrapéritonéales, trois semaines de croquettes additionnées d'un composé de marquage, puis un traitement oral de quinze à vingt jours qui perturbe volontairement leur fonction rénale. Le porteur indique interrompre ce traitement dès détection d'une protéinurie, et déclare un niveau de souffrance modéré pour ces 264 animaux, léger pour les 2 136 autres. L'élevage revient ainsi à huit souris tuées pour une souris étudiée.
Objectifs
Le rein est un organe jouant un rôle fondamental dans la filtration du sang et l’élimination des déchets via l’urine. Ce processus de filtration dépend essentiellement de la bonne santé de cellules du rein appelées podocytes, qui permettent de trier les toxines contenues dans le sang pour les éliminer tout en conservant les éléments sanguins bénéfiques pour le corps. Les podocytes sont endommagés dans 90% des cas de maladies rénales chroniques, et la faible capacité du rein à remplacer ces cellules blessées conduit à une défaillance rénale qui est actuellement incurable. Cependant, des recherches récentes montrent que la régénération des podocytes peut être stimulée de manière efficace. Le renouvellement des podocytes est assuré par des cellules souches adultes qui présentent un marqueur spécifique. Dans ce projet, nous allons utiliser ce marqueur afin de suivre les cellules souches au cours de la régénération des podocytes et d'identifier les facteurs permettant de contrôler l’activation de ces cellules. Ce travail permettra à terme de développer des approches thérapeutiques innovantes afin de traiter les patients souffrants de maladies rénales chroniques. Les effectifs ont été dimensionnés en utilisant G*Power. Pour réaliser l’étude, nous devons produire 264 souris issues de croisements où seul 12,5% des souriceaux présenteront le bon génotype (expérimentaux et témoins). Il faut donc produire 2112 souris pour obtenir les 264 souris nécessaires. En tenant compte des pertes liées à la mortalité juvénile et aux aléas de la génétique mendélienne nous appliquons une marge d’environ 15% amenant à 2400 souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes régulant les cellules souches des podocytes dans le rein adulte. Ce travail ouvre la voie pour de nouvelles approches thérapeutiques visant à stimuler ou à restaurer la fonction de ces cellules souches des podocytes lorsque les reins sont endommagés.
Procédures
-Prélèvement à l'oreille (génotypage). Durée du prélèvement à l'oreille : 1 seconde. -Trois injections intrapéritonéales (marquage des cellules souches des podocytes). Durée des injections intrapéritonéales : environ 3 secondes. -Alimentation enrichie (croquettes) avec le composé pendant 3 semaines permettant de marquer les cellules souches associée à un supplément appétant dans l’eau de boisson. -Traitement oral (eau de boisson) de 15 à 20 jours pour stimuler la régénération. -Collectes d’urines (suivi de la fonction rénale) par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.
Impact sur les animaux
Le traitement oral permettant de stimuler la régénération va entrainer une perturbation de la fonction rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Toutefois, ce traitement sera interrompu dès détection d’une protéinurie. Les trois injections intrapéritonéales peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les contentions pour injection et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress. Le prélèvement à l'oreille peut entrainer une nuissance légère.
Devenir
Etude 1 : élevage de souris pour la production des animaux nécessaires aux études 2/3 et génotypage, 12,5% des souris seront incluses en étude 2 ou 3 et le reste des animaux, ne comportant pas le génotype adéquat pour l’étude, sera euthanasié, directement après génotypage ou à la fin de la phase de reproduction. Etudes 2 et 3 : tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques et moléculaires de leurs reins.
Remplacement
La complexité des processus responsable de la régénération des podocytes rénaux ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs. La réalisation de ce projet nécessite donc le recours à l’expérimentation animale afin de comprendre les dynamiques de régénération et ainsi de permettre d’envisager des stratégies thérapeutiques innovantes transposables sur l’être humain.
Réduction
Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultats pertinents biologiquement tout en minimisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement des animaux. Les urines, collectées après miction spontanée lors de la préhension des souris pendant les examens cliniques, seront analysée afin de suivre l'évolution de la fonction rénale. Les animaux sont hébergés dans un milieu enrichi en portoirs ventilés avec un suivi journalier.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes régulant la régénération des podocytes dans le rein adulte. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal associé à une régénération efficace des podocytes.
Evaluation préliminaire d’un nouveau traceur pour le diagnostic de tumeurs cérébrales en imagerie TEP.
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 6
Une injection de cellules tumorales sous l'omoplate, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie dont une de deux heures : six souris ouvrent ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite six rats, opérés une heure sous anesthésie pour qu'on leur greffe une tumeur dans le cerveau, puis passés trois fois à l'imagerie. Les douze animaux, tous immunodéficients pour accepter les cellules humaines, sont tués à la fin pour vérifier où le traceur radioactif s'est fixé dans leur corps. Le porteur annonce commencer par trois mâles et n'inclure les trois femelles, puis la phase chez le rat, que si les résultats sont concluants, ce qui pourrait ramener le total à trois animaux.
Objectifs
Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus graves chez l’adulte. Ils sont très difficiles à soigner, car certaines cellules résistent aux traitements et provoquent souvent des rechutes. Pour mieux lutter contre ces cellules résistantes, il est nécessaire de les repérer plus précisément. Une des méthodes actuelles utilise des anticorps, qui sont des composés capables de reconnaître les cellules cancéreuses. Mais ces anticorps sont souvent trop gros pour passer la barrière naturelle qui protège le cerveau. Cela limite leur efficacité. Ce projet s’intéresse à une version plus petite de ces anticorps, appelée fragment d’anticorps, qui pourrait mieux atteindre les cellules malades. En y ajoutant un élément radioactif, ces fragments peuvent être utilisés pour les rendre visibles grâce à une technique d’imagerie médicale appelée TEP (Tomographie par Émission de Positons). L’objectif est de tester ce nouveau fragment pour voir s’il permet de mieux détecter les cellules cancéreuses résistantes dans les glioblastomes. Si cela fonctionne, cela pourrait aider les médecins à suivre plus précisément l’évolution de la maladie et à adapter les traitements à chaque patient. À long terme, cela pourrait améliorer la prise en charge et les chances de survie des personnes atteintes de ce cancer.
Bénéfices attendus
En permettant une détection plus précoce et plus précise des cellules cancéreuses résistantes, les agents d’imagerie développés en amont de ce projet pourraient aider à mieux évaluer la progression de la maladie et à adapter les traitements de manière plus ciblée. À terme, cela pourrait contribuer à une prise en charge plus personnalisée des patients et à une amélioration de leur pronostic.
Procédures
Une injection sous-cutanée de cellules tumorale pour les souris (5min). Une chirurgie de greffe tumorale intracérébrale pour les rats (1h). / 2 examens d'imageries de 10min et 2h pour chaque souris et 3 examens d'imagerie de 15min, 20min et 2h pour chaque rat, sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Chez la souris, la tumeur implantée sur l’omoplate peut gêner légèrement la locomotion. La mesure de la taille de la tumeur sur animal vigile peut induire un stress modéré. Le jeûne avant l'esamen d'imagerie peut entraîner une hypoglycémie. Les examens d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées, de durée variable selon le protocole. Chez le rat, l'implantation de la tumeur peut entraîner des effets secondaires, notamment neurologiques. Les anesthésies seront également répétées et plus longues que chez la souris. Chez les deux espèces, les injections répétées dans la veine caudale peuvent provoquer une inflammation locale, une douleur transitoire.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés afin d'évaluer la fixation du fragment d'anticorps radioactif (diagnostic) dans le corps entier de l'animal.
Remplacement
Des études de biologie cellulaire en laboratoire ont été réalisées au laboratoire et ont montré des résultats prometteurs, néanmoins l’évaluation dans l'organisme du devenir du fragment d'anticorps reste indispensable. En effet, les modèles cellulaires actuellement disponibles ne reflètent pas fidèlement la distribution observée dans un organisme entier. Il est crucial de vérifier que ce produit se fixe bien sur la tumeur, sans accumulation dans d’autres organes, à l’exception de ceux impliqués dans son élimination (comme les reins). Par ailleurs, nos modèles de cellules sont enrichis en cellules souches cancéreuses. Cependant, la proportion de ces cellules varie considérablement d’une tumeur à l’autre. Ainsi, seule une évaluation dans un organisme vivant permet de juger de manière fiable le comportement et la spécificité du composé. De plus, pour savoir si le composé expérimental peut traverser la barrière protectrice du cerveau, il est indispensable d’utiliser un modèle animal de tumeur intracérébrale.
Réduction
Cette étude est conçue comme une étude exploratoire, en 2 phases, visant à évaluer le potentiel de fixation du fragment d'anticorps radioactif au niveau de la tumeur sous-cutanée puis intra-cérébrale. Phase 1 : Tumeur sous-cutanée chez la souris. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six souris nude (trois mâles et trois femelles). Toutefois, seuls les mâles seront utilisés dans un premier temps (car le glioblastome a une prévalence masculine). Si les résultats obtenus sur les mâles sont concluants, les femelles seront incluses. Dans le cas contraire, les femelles ne seront pas testées et l'étude s'arrêtera, réduisant le nombre d’animaux à 3 au lieu de 6. Phase 2 : Tumeur intracérébrale chez le rat. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six rats (trois mâles et trois femelles). Cependant, l’utilisation de ces animaux dépendra des résultats obtenus durant la phase 1. Si les résultats de la phase 1 ne sont pas concluants, la phase 2 ne sera pas initiée et les 6 rats nude ne seront donc pas utilisés. Cette approche progressive,permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des données préliminaires essentielles pour orienter les étapes expérimentales ultérieures. Chaque animal sera son propre contrôle car le côté controlatéral pourra être utilisé comme référence de tissu sain.
Raffinement
Le transport des rats entre l’animalerie et le site d’imagerie, situé à proximité de la plateforme, sans passage à l’extérieur, sera réalisé en maintenant une température optimale par l’intermédiaire de bouillotes chauffantes placées sous les cages. Un suivi quotidien sera assuré pour tous les animaux, avec une attention particulière portée à l’état général, au comportement, à la mobilité et à l’alimentation-hydratation ainsi qu’à la vérification du bon état de la plaie. Des points limites précoces ont été fixés (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement), afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Toute altération du bien-être entraînera une prise en charge adaptée ou une euthanasie anticipée si nécessaire. Toutes les manipulations potentiellement stressantes ou douloureuses (injection du composé radioactif, imageries) seront réalisées sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur et de stress. Les animaux seront sous anesthésie générale de l’injection du composé radioactif et lors des examens d'imagerie, les animaux sont placés dans un lit chauffant avec surveillance respiratoire et cardiaque et le niveau d’anesthésie sera surveillé et adapté si besoin pour garantir un état stable et sécurisé des animaux. Leur réveil se fera dans un environnement calme et sous surveillance. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté.
Choix des espèces
Souris : Au cours de projet, il est indispensable de travailler avec des souris immunodéficientes pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Rats : Il est indispensable de travailler avec des rats immunodéficients pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Ce choix est également motivé par la limite de la résolution des appareils d'imagerie, qui ne permettrait pas d’obtenir une qualité d’image suffisante, pour analyser correctement les lésions tumorales intracérébrales (la tumeur ayant un volume plus réduit en intracérébral) sur des animaux plus petits comme les souris. Phase 1 : Des souris de 6 semaines (stade adulte) à leur arrivée seront utilisées. Elles auront 7 semaines lors de l’implantation des cellules tumorales et entre 8-9 semaines au moment des imageries. Phase 2 : Des rats âgés de 7 semaines au moment de la greffe (6 semaines à la réception) seront utilisées à un stade où la croissance crânienne est achevée.
Etude du rôle du microbiote intestinal dans la colonisation bactérienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un gavage par jour pendant huit semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins, des antibiotiques dans l'eau de boisson et deux mois d'isolement en cage individuelle : 1 872 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour qu'on analyse la répartition du microbiote dans leur intestin. L'objectif déclaré est de comprendre comment les bactéries colonisent l'intestin selon le profil du microbiote, avec l'espoir affiché de pouvoir un jour manipuler le microbiote humain. Le résumé tient en quelques lignes sur les procédures comme sur le raffinement, et ne détaille ni les points limites qu'il dit "stricts", ni le calcul qui mène à 1 872 animaux.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation des bactéries. Les souris seront utilisées comme modèle pour divers profils de microbiotes intestinaux qui seront colonisés par des bactéries. Des thérapies distinctes seront également utilisées pour étudier les dynamiques de colonisation en réponse à ces thérapies. Ce projet fournira des informations essentielles sur le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation bactérienne et la réussite des thérapies.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront non seulement d'améliorer la compréhension fondamentale des interactions entre l'hôte et les bactéries, mais aussi d'obtenir des informations mécanistiques essentielles qui pourront être exploitées pour manipuler le microbiote intestinal humain de manière à promouvoir et à préserver la santé humaine.
Procédures
Gavage: durée 5s ; un seul gavage ou un gavage par jour pendant 8 semaines en fonction de la procédure. Prélevement du sang: durée 30s ; fréquence 3 fois max pour 8 semaines. Antibiotique: ajouté une fois à l'eau de boisson tous les trois jours pour une durée allant de 1 à 5 jours. Hébergement individuel: une fois pour 2 mois.
Impact sur les animaux
La contention cause un stress de courte durée. Prélèvement de sang et gavages causent un stress et des douleurs légères de courte durée. Certains antibiotiques peuvent causer des perturbations intestinales. L'isolement des animaux peut causer du stress.
Devenir
1872 souris seront mises à mort pour analyser la composition spatiale du microbiote intestinal.
Remplacement
Des modèles de microbiote in vitro ont été utilisés pour étudier les interactions au sein des communautés bactériennes. Cependant, certains aspects de ces interactions complexes impliquant des cellules immunitaires et non immunitaires ne peuvent être étudiés que chez l'animal.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe pour assurer la reproductibilité des expériences et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites stricts, spécifiques au projet, seront appliqués.
Choix des espèces
Dans l'étude des interactions hôte / microbiote, la souris est un modèle de choix, notamment car cette espèce est la plus facile à manipuler génétiquement et à obtenir en conditions germ-free (animaux sans microbiote). L'ensemble du project utilisera des souris après sevrage et âgées de 4 à 20 semaines,chez lesquelles le système digestif est arrivé à maturité.
IMPLICATION DES CANAUX IONIQUES DANS LE DEVELOPPEMENT TUMORAL ET LA MISE EN PLACE DE LA DOULEUR DANS LE CANCER DE LA PROSTATE, DU PANCREAS ET DANS LEUR TRAITEMENT
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Quatorze injections et deux chirurgies pour un même animal en deux à trois mois : 4 210 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les expérimentateurs leur injectent des cellules cancéreuses sous la peau, dans le cœur, dans une veine, dans le tibia ou dans le pancréas, et certaines développent des tumeurs pendant sept mois. Le porteur décrit des douleurs abdominales, une lyse osseuse en cas de métastases et une hypersensibilité thermique et mécanique aux pattes et à la bouche provoquée par les chimiothérapies, hypersensibilité que le projet cherche précisément à reproduire pour en comprendre le mécanisme. Il emploie des souris nude de cinq semaines, immunodéficientes pour accepter les cellules humaines, et précise que les tumeurs prennent mal chez des animaux plus âgés.
Objectifs
Ce projet à pour objet l’amélioration des traitements des cancers pancréatique et prostatique. Trois objectifs distincts sont définis : (1) l’amélioration d’un traitement existant, (2) la compréhension des mécanismes de résistance aux chimiothérapies, et (3) l’identification des interactions potentielles entre effet secondaires des chimiothérapies et développement du cancer. (1) Nous avons précédemment montré le rôle in vivo de la protéine TRPV6 dans le développement tumoral et métastatique du cancer de la prostate. De plus, nous avons développé un anticorps capable de cibler spécifiquement cette protéine afin d'inhiber son activité et réduire ainsi significativement la croissance tumorale. Enfin, nous avons montré in vitro que l'inhibition simultanée de TRPV6 et d’un récepteur membranaire impliqué dans la métastase permettait de potentialiser la réduction de la croissance cellulaire de manière synergique. L’objectif de cet axe est de déterminer si l’inhibition conjointe de ces deux protéines augmente l’efficacité de notre anticorps à réduire la croissance tumorale. (2) Malgré l'efficacité des chimiothérapies actuelles, certaines cellules cancéreuses survivent et provoquent la récidive tumorale chez le patient. Un des objectifs du projet est de préciser le rôle de protéines clés dans la mise en place de cette résistance afin de pouvoir les cibler pour augmenter la réponse aux traitements. (3) Certains composés utilisés en chimiothérapie ont aussi comme effet secondaire le développement d’une neuropathie périphérique. La manière dont la chimiothérapie interagit avec le contexte cancéreux pour déclencher des douleurs neuropathiques est inconnu. L’objectif principal de cet axe est de préciser les mécanismes reliant certaines protéines connues pour être impliquées dans la thermoception et la nociception aux hypersensibilités thermiques déclenchées par la chimiothérapie dans le cadre du cancer du pancréas.
Bénéfices attendus
(1) Cet axe permettra potentiellement une amélioration significative de l'efficacité d'un traitement du cancer de la prostate par anticorps. Ces études sont cruciales pour potentialiser les effets de ce traitement sur le développement tumoral et métastatique. (2) Démontrer le rôle et l’implication de certaines protéines clés dans les mécanismes induisant la chimiorésistance dans le cancer du pancréas permettra de corréler la présence de ces protéines et de les proposer comme potentiel outil en clinique. (3) La neuropathie périphérique qui résulte des chimiothérapies d’intérêt mène chez certains patients à l’arrêt du traitement. A long terme, la prévention de ces symptômes pourrait donc permettre une meilleure prise en charge de la tumeur et une meilleure observance du traitement, menant à un taux d’échec moins important. Enfin, déterminer les mécanismes à l’origine des hypersensibilités douloureuses induites par la chimiothérapie dans un contexte de cancer permettra une meilleure sélection des molécules candidates à l’établissement de traitements visant à réduire ces douleurs chez le patient.
Procédures
Les animaux se verront injecter des cellules cancéreuses (voie souscutanée, intracardiaque, intraveineuse, intratibiale ou intrapancréatique) sous anesthésie gazeuse (environ 2-3 minutes d'anesthésie gazeuse avant l'injection des cellules qui prendra quelques secondes) afin de créer différents modèles permettant de visualiser le développement tumoral à tous les stades de la maladie. Les animaux seront par la suite traités (quelques secondes seront nécessaires pour les injections intrapéritonéales, 2 fois par semaine) avec divers composés ciblant des protéines clés afin de mesurer l'impact de ces composés sur le développement tumoral, et/ou avec des composés utilisés en chimiothérapie. Certains animaux seront injectés avec un traceur (quelques secondes nécessaires pour l'injection sous-cutanée) permettant de localiser les cellules d’intérêt. Enfin, une partie des animaux passeront des tests comportementaux d’hypersensibilité (qui peuvent durer jusque 2-3min maximum). Dans certains cas, ces 5 interventions auront lieu chez un même animal. La durée des expérimentations peut varier suivant la vitesse de développement tumoral allant jusque 3 mois maximum pour les animaux greffés directement avec des cellules cancéreuses et jusque 7 mois pour les animaux développant spontanément des tumeurs pour mimer au plus près ce qui se passe chez le patient. Au maximum, un même animal recevra 14 injections et 2 chirurgies en 2 à 3 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront des tumeurs, ce qui peut engendrer des signes de stress tels qu’une prostration ou une perte de poids. De plus, les animaux modèles de cancer du pancréas peuvent présenter des douleurs abdominales liées à ce type de tumeurs. Dans certaines procédures, ces tumeurs seront prises en charge par des chimiothérapies induisant une hypersensibilité thermique et mécanique (retrouvée principalement au niveau des pattes et de la bouche), ce qui peut constituer une autre nuisance pour l’animal. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse. L’anesthésie gazeuse ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant en quelques dizaines de secondes.
Devenir
Afin de mettre fin à la souffrance des animaux qui présenteront des tumeurs, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit dans la pathologie humaine. De plus, le guidage et l’installation des cellules cancéreuses vers un organe cible comme l'os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro. Enfin, il est obligatoire pour une partie du projet de regarder l'effet d'une hypersensibilité induite par des chimiothérapies dont aucun modèle n'existe in vitro.
Réduction
Un logiciel statistique a été utilisé afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, entre 10 et 20 souris par groupe expérimental seront nécessaires pour ce type d’étude. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale des anticorps, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux. Dans certains cas, certaines souris pourront être réutilisés (notamment les souris de groupes contrôles) pour limiter le nombre d'animaux utilisés et suivant les résultats obtenus (si négatifs notamment), certains groupes ne seront pas réalisés. Egalement, pour certains protocoles nécessitant des gestes techniques précis, des entrainements seront réalisés sur des souris ayant été euthanasiés dans d'autres protocoles pour limiter le taux d'échec au moment des injections.
Raffinement
Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi avec tunnel en papier, bâton à ronger, papier kraft et coton pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques. Afin de réduire le stress des animaux, seules les manipulations nécessaires aux différentes procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés et expérimentés à la manipulation des animaux. La durée des manipulations ainsi que leurs fréquences seront réduites au strict minimum afin de limiter le stress associé. Des mesures spécifiques comme une surveillance accrue, des soins postopératoires ainsi que la gestion de la douleur seront prises en relation avec les procédures pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux . Pour cela, dans les différentes procédures, une grille d’évaluation du bien-être, des points limites adaptés, un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance sont mis en place. Pendant toute la durée des procédures, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés afin d’éviter la douleur pendant mais aussi après les procédures. En cas de signes graves de stress associé à un de nos points limites, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et ainsi reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T (permettant d'éviter le rejet de greffe), mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines, le développement des tumeurs humaines étant très faible chez les animaux plus âgés.
Bioréacteur pancréatique implantable
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Quarante-cinq rats seront anesthésiés puis tués sans reprise de conscience pour qu'on leur prélève les îlots pancréatiques destinés à la greffe. 55 autres reçoivent une ou deux injections d'une molécule qui les rend diabétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et 10 servent de témoins, pour un total de 110 rats dont 90 seront tués et 20 réutilisés. Les rats diabétiques subissent 28 mesures de glycémie la première semaine, puis un suivi quotidien pendant huit semaines, une chirurgie dorsale de trente minutes pour implanter un pancréas bio-artificiel, onze prélèvements sanguins et un test de tolérance au glucose de deux heures avec treize gouttes de sang. Le porteur prévoit qu'un quart des rats ne développeront pas le diabète : ceux-là, comme les surnuméraires, sont versés aux travaux pratiques de formation du laboratoire.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si un pancréas bio-artificiel (encapsulation de cellules sécrétrices d'insuline dans une matrice de composition standardisée) améliore l'efficacité de la greffe d'îlots pancréatiques en vue de la mise en place d'essais cliniques.
Bénéfices attendus
Si les résultats sont positifs et mettent en évidence un avantage thérapeutique de la greffe d'îlots dans la matrice, nous prévoyons de proposer une suite au projet à travers la continuité de tests précliniques ainsi que des validations réglementaires en vue d’un essai clinique (first in man), pour évaluer la sécurité et la fiabilité de cette approche thérapeutique innovante. Le développement d'un tel dispositif permettrait d'améliorer considérablement la prise en charge du diabète de type I en augmentant le nombre de patients éligibles à une greffe d'ilots de Langerhans. De plus, les dispositifs testés pourraient permettre de réduire voir d'arrêter la prise d'immunosuppresseurs des patients ainsi greffés, ce qui participerait à une augmentation de leur qualité de vie et à une diminution des risques induits par ces traitement (e.g. cancers, insuffisance rénale,..).
Procédures
55 rats seront recevront 1 ou 2 injections d’une molécule les rendant diabétiques (30 sec). Afin de suivre leur glycémie et donc leur état diabétique, une goutte de sang sera prélevée de façon bi-quotidienne la première semaine puis tous les jours pendant 2 semaines, soit 28 prélèvements sanguins d’une durée de 1 minute chacun. Lors de la greffe d’îlots, des animaux considérés comme "donneurs" seront euthanasiés afin de fournir les cellules sécrétrices d'insuline aux animaux diabétiques. Les animaux diabétiques seront ensuite anesthésiés, recevront un analgésique par injection, et auront une chirurgie dorsale (30 min) pour implanter les pancréas bio-artificiels qui contiendront les cellules sécrétrices d'insuline. La glycémie continuera d'être suivie quotidiennement jusqu'au sacrifice des animaux (8 semaines post-greffe). 10 gouttes de sang seront prélevées toutes les semaines pendant 11 semaines, soit 11 prélèvements sanguins d’une durée de 3 minutes chacun. Un test de tolérance au glucose sera réalisé durant 120 minutes à 35 jours post-greffe. Cela consiste à faire ingérer du glucose par gavage oral (30 sec) puis à mesurer la glycémie à différents temps (13 gouttes de sang prélevées durant les 120 minutes du test). A l'issue de l'étude, les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie afin d'etre euthanasiés (durée totale de la procédure 20 minutes).
Impact sur les animaux
Les inconforts prévisibles liés à la technique d'induction du diabète sont i) le risque d’hypoglycémie pouvant survenir dans les 48h suivant l’injection de la molécule et ii) un risque d'hyperglycémie apparaissant une fois les que les animaux ont développé le diabéte de type I. De plus ce modèle d'induction du diabète est à l'origine de pertubations de la prise alimentaire qui peut entrainer une perte de poids des animaux. La greffe d'ilots en sous-cutanée peut aussi être à l'origine d'une gêne pour les animaux au niveau de l'incision dorsale, un traitement antalgique sera utilisé pour éviter cela.
Devenir
Les rats non répondant à l'injection de la molécule induisant le diabète ne seront pas considérés comme naïfs, ils permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale. Les 50 animaux ayant suivi l'étude (10 contrôles, 10 diabétiques, 10 diabétiques greffés d'îlots, 10 diabétiques greffés avec le pancréas bio-artificiel 1 et 10 diabétiques greffés avec le pancréas bio-artificiel 2) seront mis à mort à la fin de celle-ci pour prélever les organes et faire des analyses moléculaires. Les rats inclus dans la procédure d'isolement d'ilots seront euthanasiés lors du prélèvement jusqu'à l'obtention des 40 000 ilots équivalents nécessaires à cette étude. Si nous obtenons le nombre d'ilots nécessaire avant l'utilisation des 45 animaux prévus, ils seront considérés comme naïfs et permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale.
Remplacement
Les tests ont été préalablement faits sur des lignées cellulaires et îlots isolés avant l'approche in vivo. Cette étape est essentielle après le test sur les lignées et avant la clinique (îlots humains). Cela représente le modèle le plus fiable avant la clinique. Il est nécessaire de pouvoir étudier l'effet de la greffe d'îlots dans cette matrice sur un organisme entier et pas uniquement sur des cellules isolées avant l'utilisation chez l'humain.
Réduction
Pour ce projet, nous prévoyons d'utiliser 50 animaux qui nous permettrons de constituer les 5 groupes nécessaire pour tester l'efficacité de nos pancréas bio-artificiels. Chaque groupe sera constitué de 10 animaux comme cela est classiquement utilisé dans la littérature pour obtenir la puissance statistique recherchée pour détecter une restauration de la régulation de la glycémique par la greffe d’ilots. Au total ce projet nécessite l'usage de 110 rats qui correspondront à : 1) isolement d'îlots (n=45); 2) le groupe contrôle (n=10) ; 3) l'obtention des 4 groupes de rats diabétiques (n=55 pour en obtenir minimum 40, en prévoyant une efficacité de 75% de l'injection de la molécule inductrice du diabiète en rapport avec notre expérience et les données de la littérature). Grace à l'optimisation du protocole d'induction du diabète de type I l'efficacité est de 75% de réussite ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux 55. De plus, nous stopperons la procédure d'induction du diabète lorsque les 40 animaux nécessaires à ce projet seront atteints et les rats surnuméraires (non injectés) seront affectés à un autre projet (notamment enseignements pratiques nécessitant l'utilisation d'animaux).
Raffinement
Dans un objectif de raffinement, plusieurs mesures seront mises en place: 1) Amélioration de l’hébergement des animaux par un milieu enrichi; 2) Observation quotidienne (pesée, glycémie, comportement, aspect, détection de toute souffrance) durant toute la période d'hebergement des animaux leur état général sera évalué selon des critères précis et adaptés qui nous permettrons de determiner si les animaux atteignent des points limites gradés qui correspondent à un critère d'arret de l'étude; 3) Dans les 48h suivant les injections de la molécule inductrice du diabète nous mettrons à disposition de l'eau avec 10% de sucre pour réduire le risque d'hypoglycémie; 4) Suivi régulier de la glycémie des animaux diabétiques et injection d'une unité d'insuline rapide si celle-ci dépasse les 3g/L; 5) Change fréquent des animaux diabétiques car celui-ci augmente la diurèse (toutes les 48h ou plus si nécessaire); 6) La chirurgie sera faite sous anesthésie volatile en association à une analgésie préopératoire, du gel occulaire pour réduire le dessèchement de la cornée, et les animaux seront placés sur un tapis thermostaté afin d'éviter tout risque d'hypothermie; 8) Lors du suivi post-opératoire, les animaux seront maintenus sous lampe chaude jusqu'à leur réveil complet, de la nourriture semi-liquide sera mise à leur disposition et nous utiliserons une litière en cellulose pour plus de propreté; 9) Une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée par injection toutes les 12h durant 48h.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser un modèle de rats car celui-ci est classiquement utilisé pour l'isolement d'ilots pancréatiques, ainsi que pour étudier le diabète de type I. L'utilisation de ce modèle nous permettra donc de comparer nos résultats aux données de la littérature ainsi qu'aux résultats antérieurs obtenus au sein du laboratoire d'accueil. La souche de rats choisie est non-consanguine ce qui nous permettra d'étudier l'efficacité des pancréas bio-artificiels à isoler les ilots de Langerhans greffés de la réponse inflammatoire des receveurs. Enfin la souche de rats choisie est classiquement utilisée dans les projets ayant attraits à des tests de greffe ainsi que des protocoles d'études pré-cliniques ciblant les maladies métaboliques, ce qui correspond exactement à l'objectif de ce projet. Les animaux utilisés pour l'isolement des ilots de Langherans et l'induction du diabète auront un poids corporel compris en 300-350g (age: 50-60 jours) ce qui correspond a un stade post-pubertaire à partir duquel toutes les grandes fonctions de l'organisme sont matures.
THERAPIE GENIQUE DANS UN MODELE MURIN DE LA MALADIE DE GAUCHER
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
Tester une thérapie génique contre les formes neurologiques de la maladie de Gaucher : 488 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Les unes servent de donneuses et reçoivent cinq injections quotidiennes destinées à enrichir leur moelle en cellules souches sanguines. Les autres en reçoivent quinze, réparties en trois séries de cinq jours, plus une greffe sous anesthésie et jusqu'à trois prélèvements sanguins à l'œil. Le porteur décrit une fatigue et une perte de poids qui durent de quinze jours à trois semaines, et précise que les souris porteuses de la mutation "restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves", précisément ce que le projet vise à traiter.
Objectifs
La maladie de Gaucher est la plus fréquente des maladies dites "lysosomales". Elle touche environ une personne sur 50 000 dans le monde. Ces maladies se caractérisent par un problème dans le fonctionnement de cellules, qui n’arrivent plus à éliminer certaines substances. Ces substances s’accumulent alors et peuvent provoquer des dégâts, en particulier dans des organes comme le foie, la rate ou les os. Dans la maladie de Gaucher, ce dysfonctionnement est causé par la mutation du gène responsable de la fabrication d’une enzyme impliquée dans la dégradation des lipides. Quand cette enzyme ne fonctionne pas bien, les lipides s’accumulent dans certaines cellules. Il existe plusieurs formes de la maladie. La forme la plus courante, le type 1, touche surtout les organes internes et les os. D’autres formes, plus rares, comme les types 2 et 3, affectent aussi le cerveau. Le type 2 provoque des troubles neurologiques graves dès la naissance, et le type 3 entraîne des problèmes progressifs chez l’enfant ou l’adulte. Malheureusement, les traitements actuels ne parviennent pas à soigner ces troubles du cerveau. Ce projet vise à tester dans un modèle murin, un nouveau traitement pour les formes neurologiques de la maladie, en particulier la forme de type 3. L’idée est d’utiliser une approche de thérapie génique : on prélève des cellules souches du sang, on les modifie en laboratoire pour qu’elles produisent une version efficace de l’enzyme, puis on les réinjecte dans l’organisme. Les cellules corrigées pourront se rendre jusque dans le cerveau et y apporter l’enzyme manquante. Cela permettrait non seulement de traiter les symptômes dans les organes et les os, mais aussi d’agir sur les atteintes du cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de la thérapie génique à corriger les défauts neuronaux dans la maladie de Gaucher en restaurant l’activité enzymatique déficiente dans les cellules cérébrales. Cette approche thérapeutique pourra être ensuite appliqués à l’Humain.
Procédures
Animaux donneurs des cellules souches sanguines : - Injection en vigile (souris éveillée) une fois par jour (quelques secondes) durant 5 jours d’une molécule permettant d’enrichir la moelle en cellules souches sanguines. Animaux receveurs des greffes de cellules souches sanguines : - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne prise de greffe des cellules souches sanguines. - Greffe des cellules souches du sang : 1 injection qui ne dure que quelques secondes et qui est réalisée sous anesthésie et analgésie. - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne colonisation du système nerveux central par les cellules greffées. - 3 prélèvements sanguins maximum (quelques secondes)
Impact sur les animaux
Injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central : ces injections provoquent une brève douleur ainsi qu’un stress dû à la manipulation des animaux. Par ailleurs, ils peuvent entrainer une perte de poids et provoquer une fatigue des animaux entre15 jours et 3 semaines après l’injection. Intervention pour enrichir la moelle en cellules souches sanguines: L’injection durant 4 jours provoque du stress et une douleur au moment de l’injection (quelques secondes). Injection des cellules souches sanguines : L’injection intra-veineuse de cellules souches du sang dure quelques secondes, et se fait sous anesthésie générale. Cependant, il y a un risque d’infection. Expression de l’enzyme : l’expression de l’enzyme devrait avoir un effet bénéfique. En revanche, on ne peut exclure qu’elle produise des effets secondaires non prévisibles. Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin entraine un stress dû à la contention, une brève douleur à l’œil ainsi qu’un risque d’infection.
Devenir
Il est prévu d’euthanasier tous les animaux afin de pouvoir analyser différents organes et quantifier l’activité de l’enzyme étudiée et de ses substrats.
Remplacement
La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines ainsi que la colonisation du cerveau par certaines cellules transplantées sont des phénomènes complexes. Il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer ces phénomènes et les processus physiologiques mis en jeu lors de l’’implantation, de la survie, de la différenciation et de la colonisation des cellules. La transplantation chez un modèle animal est la seule façon aujourd’hui d’évaluer la capacité des cellules souches sanguines modifiées à se loger dans la moelle osseuse, reconstituer le système sanguin à long terme, atteindre le cerveau des receveurs et exprimer la molécule thérapeutique.
Réduction
Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des vecteurs de thérapie génique exprimant l’enzyme étudiée dans des systèmes de culture in vitro. Seuls les vecteurs permettant la sécrétion par les cellules modifiées de cette enzyme capable d’être réabsorbée par des neurones et ne générant pas de toxicité cellulaire seront évalués in vivo. Afin que les résultats soient statistiquement significatifs tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée, les logiciels ainsi que notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines montre que le nombre d’animaux minimum requis est de 8 par groupe.
Raffinement
Pour limiter au maximum les nuisances sur les animaux, la greffe de cellules souches du sang sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Suite aux injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central et à la greffe cellulaire, les souris seront examinées quotidiennement et une grille de d’évaluation sera remplie. Des points limites adaptés ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Au bout d’un mois, les souris continueront d’être observées une fois par semaine en plus de la visite journalière des animaliers afin de continuer à remplir la grille d’évaluation et de pouvoir intervenir en cas d’effet inattendu.
Choix des espèces
Les souris ont un système sanguin très proche de celui de l’être humain. C’est pourquoi elles sont souvent utilisées pour tester des greffes de cellules souches sanguines et pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches de thérapie génique. Dans ce projet, on utilise des souris porteuses d’une mutation qui imite la maladie de Gaucher. Elles ont un déficit de l’enzyme, comme les patients, mais elles restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves. Elles nous permettront d’évaluer si les vecteurs de thérapie génique permettent aux cellules modifiées de produire suffisamment d’enzyme, vérifier si elle est bien sécrétée, et voir si cela permet de diminuer les substances anormales qui s’accumulent dans le cerveau et les autres organes. Les expériences seront faites chez de jeunes souris adultes, afin d’être dans des conditions où la prise de greffe est optimale.
Sécurité des Thérapies cellulaires par transfert de gène : preuve de concept dans des modèles cancer chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
4 038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales par voie sous-cutanée, intraveineuse, intracardiaque ou directement dans un organe après ouverture chirurgicale, puis sept à dix séances d'imagerie sous anesthésie, cinq à huit prélèvements sanguins après quatre à six heures de jeûne, et des pesées quotidiennes. Une partie est immunodéficiente, donc vulnérable aux infections, et le porteur prévoit une perte de poids pouvant dépasser 15 %. Les bénéfices annoncés pour les patients, une immunothérapie plus sûre et modulable, restent au conditionnel, quand le porteur écrit que la nature des prélèvements d'organes "ne permet pas la survie des animaux".
Objectifs
Les thérapies géniques et cellulaires représentent une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies, notamment les cancers. Grâce à des technologies innovantes comme les cellules génétiquement modifiées, il devient possible de modifier certaines cellules pour qu’elles reconnaissent et éliminent des cellules malades dans l’organisme. Après des résultats prometteurs dans les cancers diffus, notamment certaines leucémies, ces approches sont désormais autorisées pour le traitement de cancers solides tels que le mélanome. Elles marquent ainsi une véritable révolution en immunothérapie. Malgré leur efficacité, ces thérapies ne sont pas sans risques. Leur action prolongée dans l’organisme et leur caractères difficilement réversible peuvent entrainer des effets secondaires graves. Le plus fréquent est une réaction immunitaire excessive, pouvant provoquer des troubles neurologiques voire dans de rares cas la formation de cancers secondaires liés aux cellules modifiées. Pour faire face à ces risques, des systèmes de sécurité sont actuellement en cours de développement. L’objectif est de pouvoir activer ou désactiver précisément ces traitements de façon ciblée dans le temps et dans le corps. Ces systèmes permettraient de mieux contrôler l’effet des thérapies géniques et cellulaires afin d’offrir des thérapies plus sûres aux patients.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie représente une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies graves, notamment certains cancers et maladies auto-immunes. Mais ce type de traitement n’est pas sans risque. En stimulant fortement les défenses du corps, il peut entrainer des réactions indésirables parfois sévères. Il devient donc essentiel de pouvoir en contrôler précisément l’intensité et la durée. Des stratégies récentes cherchent à rendre l’immunothérapie plus sûre et plus modulable. L’une d’entre elles repose sur la thérapie génique. Elle consiste à insérer un gène dans les cellules du patient à l’aide de transporteurs, appelés vecteurs souvent des virus modifiés. Ce gène agit comme un interrupteur, permettant ainsi d’activer ou de d’arrêter le traitement si des effets secondaires apparaissent. Ces systèmes offrent un véritable progrès en matière de sécurité. Avant d’être utilisés chez l’Humain, ces dispositifs doivent être testés sur des modèles biologiques complets comme la souris. Cela permet de vérifier à la fois leur efficacité et l’absence d’effets indésirables majeurs dans un organisme vivant. A terme, ce type d’approche pourrait améliorer la prise en charge de nombreux patients pour lesquels les traitements actuels restent insuffisants. C’est le cas de certains cancers très résistants, comme le cas du cancer du foie dont le taux de survie à 5 ans est d’environ 18 pour cent. En rendant ces traitements plus contrôlables, ces avancées ouvrent la voie à une immunothérapie plus personnalisée, mieux tolérée et potentiellement accessible à un plus grand nombre de patients.
Procédures
Dans ce projet de recherche, des souris sont utilisées pour évaluer l'efficacité, la distribution et la tolérance de traitements innovants dans l'organisme en conditions saines ou pathologiques. Les animaux suivent différentes étapes expérimentales. Certains reçoivent une seule injection d'un des deux produits thérapeutiques sur souris soit vigile soit anesthésiées d'une durée inférieure à 30 secondes. Pour créer des modèles tumoraux, plusieurs méthodes sont utilisées: une injection unique de cellules tumorales disséminées (sous anesthésie, 30 secondes), injection de cellules tumorales solides (1 fois, sous anesthésie, 45 secondes) ou injection directe dans un organe (1 chirurgie par souris, moins de 20 minutes, sous anesthésie générale avec une analgésie préventive et post opératoire pendant 3 jours). Les traitements expérimentaux comprennent l'injection de cellules thérapeutiques (1 fois, sous anesthésie, 30 secondes), de vecteurs viraux (1 fois, sur souris vigile, 30 secondes) et de médicaments complémentaires (1 fois par jour pendant 3 à 5 jours, sur animal vigile, 30 secondes). Le suivi de la tumeur repose sur des mesures manuelles (1 à 2 fois par semaines, 2 minutes sur animal vigile), de l'imagerie par bioluminescence (1 à 2 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines, soit 7 à 10 fois par animal, anesthésie légère 10 minutes accompagné de l'injection d'un agent de contraste 30 secondes et de l'échographie (1 fois, 15 minutes, sous anesthésie). Les souris subissent aussi des prélèvements sanguins hebdomadaires (5 à 8 fois sur animal vigile à jeun 4 à 6heures, 30 secondes, une pesée quotidienne (contention 30 secondes) réalisée à la suite de l'implantation tumorale (de J0 à J4 soit 4 pesées) puis tous les 2 à 3 jours (soit 2 à 3 pesées par semaine) dont la fréquence est réaugmentée à un rythme quotidien si l'état général des animaux le justifie. Une observation clinique quotidienne est également maintenue tout au long du protocole. A la fin de l'étude, les animaux reçoivent une anesthésie avec une analgésie préventive (1 injection de 30 secondes, 30 minutes avant l'anesthésie) puis le prélèvement sanguin suivi de l'euthanasie est réalisé sous anesthésie en 10 minutes. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé dans le respect de la réglementation avec une prise en compte du bien-être de l'animal à chaque étape.
Impact sur les animaux
(i)Nuisance physiologique. Une mise à jeun de 4 à 6 heures peut être appliquée dans le cadre des modèles développés dans ce projet et est susceptible de provoquer une sensation de faim légère. L’induction des vecteurs ainsi que la progression tumorale dans certains modèles peut entrainer une perte de poids réelle supérieure à 15%. (ii)Nuisance comportementale. Les phases de contention (pesée, injection, prélevement sanguin, mesure du volume tumoral) peuvent générer un stress ponctuel ainsi qu'une douleur légère et transitoire généralement inférieur de 30 secondes. L'anesthésie gazeuse utilisée dans certaines procédures peuvent accentuer l'anxiété et provoquer une perte transitoire de chaleur corporelle. (iii)Nuisance liée au statut immunodéficient. Les souris immunodéficientes présentent une vulnérabilité accrue aux infections. (iv)Nuisance liée au développement tumoral. Le développement tumoral peut conduire à l'apparition de lésions cutanées au point d'injection ainsi qu'à des altérations du bien-être notamment au niveau du toilettage, la mobilité ou l'alimentation. (v)Nuisance liée aux interventions chirurgicales. L'anesthésie gazeuse prolongée utilisée dans certaines procédures peut entrainer une perte transitoire de chaleur corporelle. La suture peut occasionner une réaction inflammatoire locale transitoire au niveau de la cicatrice.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales sont euthanasiés en fin d’étude. Cette euthanasie est scientifiquement indispensable car elle permet la réalisation de prélèvements d’organes et de tissus nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Plus précisément, les tumeurs sont prélevées pour des analyses histopathologiques. Le sang et la rate sont recueillis pour l’analyse phénotypique des cellules thérapeutiques administrées. Les organes sont prélevés dans leur totalité afin de permettre la validation du ciblage tissulaire spécifique des vecteurs de thérapie génique. La nature des prélèvements ne permet pas la survie des animaux. Ainsi aucun animal n’est conservé après les procédures, l’ensemble des animaux est euthanasié de manière programmée et encadrée conformément aux règles en vigueur.
Remplacement
Les thérapies géniques et cellulaires offrent des pistes très prometteuses pour soigner certaines maladies, mais elles doivent être rigoureusement contrôlées avant de pouvoir être utilisées chez l’humain. Il est notamment essentiel de vérifier si elles ciblent bien la zone souhaitée comme une tumeur ou un organe précis et de s’assurer qu’elles n’agissent pas par erreur sur d’autres parties du corps. Des premiers tests ont déjà été réalisés en laboratoire sur des cellules. Ces expérimentations ont permis d’évaluer l’expression du transgène, la viabilité cellulaire. Elles fournissent des données essentielles pour comprendre le fonctionnement initial du traitement. Cependant, ces vérifications ne peuvent pas se limiter aux expériences sur cellules. Les études réalisées chez l’animal sont indispensables pour observer la diffusion et l’action du traitement dans un organisme complet et ainsi recueillir les informations nécessaires pour juger de sa sécurité et de son efficacité avant toute application chez l’humain.
Réduction
Conformément au principe des 3R, ce projet repose sur plusieurs approches concrètes visant à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique. Trois principaux leviers sont mobilisés pour optimiser la conception expérimentale et limiter l’impact sur les animaux. L’étude prend en compte les 2 sexes (mâles et femelles) afin d’inclure la variable sexe dans le plan expérimental, ce qui augmente la portée statistique et réduit les biais d’interprétation. Ne pas considérer cette variable peut conduire à des résultats non reproductibles ou non généralisables. Les différences de pharmacocinétique entre les mâles et les femelles peuvent également fausser des conclusions lorsqu’elles sont extrapolées d’un sexe à l’autre. Bien que cela soit contre intuitif, l’intégration des 2 sexes apporte une valeur scientifique renforcée aux données recueillies. Grâce à l’imagerie in vivo, chaque animal est utilisé de façon optimale afin d’obtenir un maximum d’informations. Les groupes expérimentaux sont conduits en parallèle, ce qui limite le recours aux groupes témoins. Chaque individu fait l’objet d’un protocole d’analyse complet permettant de rassembler un grand nombre de données tout en réduisant le nombre total d’animaux mobilisés. Ainsi 4038 animaux sont utilisés dans le cadre de ce projet.
Raffinement
Des mesures précises et rigoureuses seront mises en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. (i) Les points limites sont définis suivant une observation de signes cliniques dictant un arbre décisionnel. Les signes cliniques sont ceux altérant l’apparence physique, le poids et le comportement qui dictent l’intervention à tenir allant du soin à l’euthanasie. (ii) La gestion de la douleur se fait par administration d’analgésiques en cas de souffrance détectée. (iii) Le suivi rigoureux et proactif des animaux se fait par une surveillance quotidienne des animaux par un personnel qualifié, formé aux procédures, qui prend en charge conformément aux protocoles établis et à la grille de suivi garantissant une réponse rapide et adaptée. (iv) Dans un environnement enrichi, l’hébergement (de 2 à 5 individus par cage) en groupes sociaux compatibles des animaux favorise les comportements exploratoires et réduit ainsi le stress avec une période d’acclimatation de 10 jours avant les procédures. (v) L'anesthésie gazeuse utilisée pour certaines procédures provoque une perte transitoire de chaleur corporelle compensée par l'installation de l'animal sur un plateau chauffant pendant l'intervention puis par un réveil en cage thermostatée. (vi) Les souris immunodéficientes sont maintenues dans des conditions strictes d'hébergement et de manipulation afin de limiter les risques d'exposition aux agents infectieux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier la formation tumorale grâce son taux élevé de prise de greffe et à sa petite taille qui facilite la manipulation. La disponibilité de diverses lignées immunodéficientes permet d’utiliser des greffes d'une autre espèce sans risque de rejet tandis que les lignées dépourvues de poils facilitent le suivi visuel de la croissance tumorale. De plus, le vaste éventail de modèles génétiquement modifiés et la connaissance approfondie du génome murin permettent d’étudier en détail les mécanismes moléculaires du cancer. Le cycle de vie court de la souris favorise la constitution de cohortes pour garantir une bonne puissance statistique, et l’existence de nombreux protocoles standardisés simplifie la comparaison des résultats entre études. Enfin le comportement bien documenté des souris permet d’identifier rapidement les signes de souffrance évaluable assurant ainsi une prise en charge efficace. Les souris utilisées seront des jeunes adultes sexuellement matures âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix correspond à une période où les fonctions physiologiques, notamment immunitaires et métaboliques, sont pleinement développées, tout en restant stables et homogènes d’un individu à l’autre. A cet âge, les animaux présentent également un comportement plus stable, ce qui réduit la variabilité expérimentale et les réactions excessives liées au stress. L’utilisation de cette tranche d’âge permet donc à la fois de garantir la maturité biologique, de limiter les biais comportementaux liés à l’anxiété et de favoriser la robustesse des résultats.
Evaluation non-invasive par Résonance Magnétique Nucléaire des altérations histopathologiques des muscles squelettiques dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les expérimentateurs provoquent une lésion musculaire sur une patte arrière des souris d'un lot, et posent chez celles d'un autre lot un plâtre laissé jusqu'à un mois sur ce même membre. 120 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune passant deux à trois examens d'IRM d'environ deux heures sous anesthésie générale. Le porteur qualifie cet examen de "totalement indolore et non invasif", et décrit par ailleurs une douleur de quatre à sept jours après la lésion, une atrophie musculaire sous le plâtre, des irritations cutanées et un stress lié à la restriction des mouvements. Toutes sont tuées à la fin du dernier examen pour que leurs muscles postérieurs soient prélevés.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin critique en médecine : disposer de mesures objectives pour suivre la progression des maladies neuromusculaires (NMDs) et fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques. Bien que les biopsies musculaires soient largement utilisées pour la caractérisation des NMDs, elles sont invasives, non répétables en clinique et limitées par l’hétérogénéité de l’atteinte musculaire dans ces maladies. Dans ce contexte, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) offre un moyen non invasif d’évaluer régulièrement l’état des muscles dans leur ensemble. Plus spécifiquement, pour les études cliniques, l’IRM de la fraction de graisse est devenue un biomarqueur incontournable pour caractériser l’évolution de la dégénérescence musculaire et son remplacement par du tissu graisseux. Cependant, il existe un besoin urgent de développer une mesure plus anticipative, capable d’évaluer les modifications tissulaires précoces précédant le remplacement graisseux.
Bénéfices attendus
Les maladies neuromusculaires (NMDs) et la sarcopénie sont des affections gravement débilitantes qui impactent profondément la qualité de vie des patients et de leurs proches, tout en imposant un lourd fardeau au système de santé publique. L'absence de mesures objectives permettant de suivre la progression naturelle de ces maladies et de fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques freine le développement thérapeutique. Le développement d'une méthode alternative à la biopsie musculaire, capable de caractériser les altérations microstructurales des muscles dans leur intégralité et de manière répétée, représenterait une avancée significative. Une telle approche améliorerait considérablement la compréhension de la progression des maladies et renforcerait notre capacité à évaluer l'efficacité des traitements. Cette innovation mènerait à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents au développement des maladies, à des stratégies thérapeutiques optimisées et, in fine, à une amélioration notable des soins et de la qualité de vie des patients.
Procédures
Trois lots de souris subiront plusieurs examens identiques d’IRM des membres postérieurs. Chaque examen a une durée maximale d’environ 2 heures. Au terme de leur dernier examen, chaque animal sera euthanasié afin de permettre des prélèvements histologiques musculaires sur les membres postérieurs. Le premier lot servira à établir les valeurs de référence et la précision des différentes métriques d’IRM et d’histologie. Les souris de ce lot subiront trois examens d’IRM espacés d’au moins une semaine. Pendant chaque examen, les souris seront anesthésiées avec un gaz afin d’éviter tout stress ou mouvement, et de garantir leur confort. Leur respiration sera surveillée en continu, et des soins seront apportés pour éviter tout dessèchement oculaire lié à l’anesthésie. Les animaux seront installés confortablement sur le dos, les pattes maintenues délicatement pour assurer des images de bonne qualité. L’examen est totalement indolore et non invasif. Il permet de collecter des données précises sur les muscles des pattes arrière, sans aucune chirurgie. Le deuxième lot de souris, réparties en six groupes, subira deux examens d’IRM. Après le premier examen, qui servira de valeur de référence (Baseline), une lésion musculaire localisée sera induite, sous anesthésie, sur l’un des membres postérieurs. Cette intervention dure moins de 15 minutes. Un analgésique prophylactique sera administré avant la lésion afin de minimiser la douleur et l’inconfort des animaux après l’intervention. Ensuite, chacun des six groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle différent après lésion (24 heures, 48 heures, 4 jours, 7 jours, 12 jours et 1 mois). Le troisième lot de souris, réparties en cinq groupes, subira également deux examens d’IRM. Après le premier examen de référence, un des membres postérieurs de chaque souris sera immobilisé à l’aide d’un plâtre, sous anesthésie. Cette intervention dure moins de 20 minutes. Ensuite, chacun des cinq groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle post-immobilisation différent (4 jours, 7 jours, 10 jours, 14 jours et 21 jours). Le plâtre sera retiré avant l’examen. De manière générale, pour les groupes soumis à une immobilisation prolongée, le plâtre sera retiré périodiquement, sous anesthésie, pour inspection, hygiène et, si nécessaire, soins du membre immobilisé, puis remis immédiatement. En cas de signes de douleur, un analgésique sera administré une fois par jour.
Impact sur les animaux
Un examen d’imagerie par resonance magnétique (IRM) in vivo nécessite l’immobilisation du sujet pendant la durée de l’examen. Dans ce projet, cela est accompli en réalisant les examens sous anesthésie générale. Cet examen est non-invasif, atraumatique et sans douleurs. La seule nuisance associée à cette procédure une légère diminution du rythme respiratoire, accompagnée d’une légère baisse de la température corporelle pendant la durée de l’examen (moins de 2 heures), attribuable à l’anesthésie. Dans un lot de souris, une lésion musculaire unilatérale sera induite sous anesthésie dans un des membres postérieurs des animaux. Cette lésion peut provoquer de la douleur et une légère réduction de la mobilité pendant les 4-7 jours suivant la lésion, avec un pic inflammatoire observé autour du 4ᵉ jour. Une régénération complète du muscle est prévue un mois après la lésion. Dans un autre lot de souris, l’immobilisation d’un des membres postérieurs à l’aide d’un plâtre entraînera une diminution modérée de la mobilité. Cette immobilisation sera réalisée sous anesthésie générale et induira un processus d’atrophie musculaire dans le membre concerné. Les souris pourraient également ressentir du stress en raison de l’inconfort causé par le plâtre et par la restriction de leurs mouvements naturels. De plus, une irritation cutanée sous le plâtre pourrait survenir.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale afin de permettre des prélèvements musculaires sur les membres postérieurs pour des analyses histologiques.
Remplacement
Les techniques développées dans ce projet ont pour objectif final l’imagerie quantitative in vivo. Des processus physiologiques tels que les échanges compartimentaux (intracellulaire, interstitiel, vasculaire) et la perfusion tissulaire influencent significativement le signal de RMN et, par conséquent, le modèle biophysique à établir. À ce jour, aucun substitut synthétique ne permet de reproduire fidèlement les caractéristiques du tissu musculaire vivant, ce qui nous contraint à recourir à l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.
Réduction
L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir de nombreuses informations différentes sur les muscles, à partir d’un seul examen. Comme cet examen est non invasif et sans douleur, il peut être répété plusieurs fois sur le même animal sans effet nocif. Cela permet de suivre l’évolution des tissus dans le temps tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Pour cette étude, un total de 120 animaux sera utilisé, répartis en 12 groupes de 10 souris. Ce nombre a été déterminé grâce à un calcul préalable (calcul de puissance) afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables et statistiquement significatifs. En effet, il est important d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour pouvoir identifier clairement les effets étudiés, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Des analyses statistiques seront nécessaires pour interpréter correctement les résultats. Elles permettront notamment d’évaluer la fiabilité des mesures IRM, de déterminer si les changements observés dans les muscles sont significatifs, et de comparer les résultats obtenus par IRM avec ceux observés au microscope après prélèvement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, de fond plat avec de la litière de contact et bénéficiant d’un environnement enrichi avec du papier absorbant et des tubes en carton pour la construction de nids. Les animaux bénéficiéront également d’une période d’acclimatation d’au moins 10 jours. Les examens IRM se dérouleront sous anesthésie générale afin de garantir l’immobilité des animaux pendant les acquisitions et de minimiser leur stress. Afin de prévenir le dessèchement de la cornée et d’assurer le bien-être des animaux pendant les examens prolongés sous anesthésie, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des souris dès l’induction de l’anesthésie. La température corporelle sera maintenue à environ 38 degrés Celsius à l’aide d’un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire surveillée en continu. Pour le lot de souris subissant une lésion musculaire localisé, un analgésique prophylactique sera administré pour minimiser la douleur et l’inconfort post-lésion. Les animaux dont un membre postérieur est immobilisé par un plâtre seront surveillés quotidiennement. Le plâtre sera conçu de manière à laisser les orteils de la patte immobilisée visibles, permettant ainsi de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Une attention particulière sera portée aux signes tels qu’un grattage excessif du membre immobilisé, des irritations cutanées, des blessures dans la partie proximale du membre, ou une coloration anormale des orteils. Le plâtre sera retiré au moins une fois à chaque 7 jours, sous anesthésie, afin de garantir l’hygiène de la patte et d’évaluer son état. En cas de blessure superficielle, la zone sera désinfectée et un pansement appliqué. Si des signes de douleur sont observés, un analgésique sera administré. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Toute modification significative et persistante du comportement, qui puisse suggérer un signe de douleur excessive constituera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’euthanasie de l’animal sera réalisée conformément aux protocoles éthiques en vigueur.
Choix des espèces
En raison de leur petite taille et de la facilité avec laquelle elles peuvent être hébergées, les souris constituent un modèle animal pratique à manipuler. Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche biomédicale et a été développé pour étudier un large éventail de pathologies humaines, en particulier les maladies Neuromusculaires. Par ailleurs, notre laboratoire a développé de nombreux outils dédiés à l’imagerie et à la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, spécifiquement adaptés à l’étude du muscle squelettique chez les souris. Du point de vue technique, la petite taille des souris est aussi compatible à l’étude par RMN dans des machines d’IRM considérablement plus petites et moins couteuses, même si à haut champ magnétique. Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux adultes jeunes (12 à 16 semaines). Ce choix permet de s’affranchir des variations liées au développement/maturation tissulaire qui peuvent avoir un impact significatif sur les mesures. Cet intervalle d’âges inclut les différents points temporels décrits dans les procédures expérimentales.
Impact des médiateurs lipidiques de la résolution de l’inflammation (SPM) sur l’inflammation pulmonaire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, cessent de se toiletter ou bougent à peine seront mises à mort. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs poumons. Elles reçoivent des traitements par gavage, par injection dans la veine de la queue et par instillation de gouttes dans le nez sous anesthésie, ainsi qu'une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation pulmonaire. Une partie appartient à la lignée Scnn1b, modifiée pour reproduire l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose. Le porteur écrit n'attendre "aucune douleur importante ou stress fort", et renvoie au long terme les retombées annoncées pour les patients.
Objectifs
La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induit une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de lipides aidant à résoudre l’inflammation, aussi appelés SPMs. A l’heure actuelle, nous ne comprenons pas encore pourquoi les patients produisent moins de SPMs. Nous étudierons la production de ces SPMs en mimant une infection du poumon. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Le projet sera utilisé pour définir les protocoles permettant l’étude de ces SPMs dans le contexte d’une inflammation du poumon. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées. A terme ce projet servira aussi à étudier l’inflammation du poumon après avoir été exposé à la pollution de l’air.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - le développement d’un modèle plus simple, moins contraignant et moins douloureux pour étudier l’inflammation des poumons chez la souris - l’identification de la meilleure façon d’utiliser les SPM pour traiter l’inflammation des poumons. - la compréhension du rôle du système immunitaire et des raisons pour lesquelles les souris atteintes d’une forme proche de la mucoviscidose ne produisent pas assez de SPM. - La description des différences entre animaux mâles et femelles l’inflammation du poumon - L’utilisation des connaissances collectées pour un projet de plus grande ampleur sur l’impact de la pollution de l’air sur la santé du poumon. A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouveau traitement de l’inflammation des poumons chez les patients vivant avec la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations de traitement en solution soit par gavage, soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, les deux premiers traitements seront administrés sur souris éveillées, pour le dernier, les souris seront anesthésiées. Ces administrations durent moins de 30 secondes pour le gavage et l'injection dans la veine de la queue et autour de 30 secondes (moins d'une minute) pour l'aspiration de gouttes par le nez.
Impact sur les animaux
Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris quand elles en ont reçues. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Devenir
Les animaux utilisés ici seront mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement des organes et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.
Remplacement
Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments.
Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons lu les études préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence relevante entre nos groupes de souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fourni dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés lorsqu'il devront recevoir des traitements par dépot de gouttes sur le nez. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Ces observations sur le poids, le comportement et la mobilité des souris, permettront le calcul d'un score clinique spécifique au projet présenté en Annexe 1. Si ce score clinique est élevé les souris des mesure spécifiques au projet seront mises en oeuvre : - Si besoin (faible diminution de la mobilité, perte de poids supérieure à 10%, manque de toilettage) de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris - Si un animal se trouve dans un état grave imprévu (perte de poids supérieure à 20%, forte diminution de la mobilité, absence de toilettage) , celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : 1. Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. 2. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. 3. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. 4. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. 5. Cette lignée de souris génétiquement modifiées (appelée Scnn1b) est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose. 6. L'utilisation d'animaux de 8 semaines dans ce projet permet de s'assurer que les défenses immunitaires de l'animal sont complètement développées.
Etude de l’immunogénicité et de l’efficacité de vaccins sous-unitaires protéiques contre le virus cowpox dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par le virus cowpox après sédation et anesthésie, 68 des 194 souris de ce projet subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 126 autres un niveau léger, et toutes sont tuées pour qu'on prélève leurs organes. Le porteur décrit chez les animaux infectés une perte de poids, de la prostration, un affaissement de la paupière, des difficultés respiratoires, des lésions cutanées, et une mort qui survient en général entre le septième et le neuvième jour. Une partie du protocole consiste à établir la dose létale 50, soit la quantité de virus qui tue la moitié de l'effectif, afin de calibrer l'épreuve infectieuse des futurs candidats vaccins contre la variole et le Mpox. Le même document qualifie les interventions de "légères".
Objectifs
La variole, l’un des plus gros fléaux qu’ait connu l’humanité, est causée par le virus de la variole (VARV), un virus du genre Orthopoxvirus (OPXV). Déclarée éradiquée par l’OMS en 1980 après des campagnes de vaccination massives, on craint sa résurgence, naturelle (fonte du permafrost) ou d’origine intentionnelle. Un autre OPXV, le Monkeypox virus (MPXV), constitue également une menace. Depuis 2022, des épidémies de MPXV ont sévit en Europe et dans les Amériques, avec une mortalité entre 0,03 et 6 % selon les souches. Les vaccins antivarioliques dits de 1re génération protègent également contre le MPXV (à 85%), mais leurs effets secondaires importants les rendent inadaptés aux patients fragiles. Ceux de 3e génération sont plus sûrs et confèrent une immunité protectrice certaine contre le Mpox mais la durée de l’efficacité reste inconnue. L’objectif est de concevoir des vaccins innovants basées sur des fragments du virus (antigènes). Ces antigènes peuvent être présentés sous forme de protéine, d’ARN messager ou intégrés dans un vecteur viral inoffensif, comme le vaccin contre la rougeole. Des essais préliminaires sont nécessaires pour identifier les antigènes à incorporer dans ces différents vaccins pour conférer une immunité protectrice contre une infection par un OPXV. Pour identifier la meilleure combinaison d’antigènes qui protège contre les OPXV, nous aurons recours à un modèle murin infecté par le virus Cowpox (CPXV), comme modèle d’infection expérimental des OPXV. Ce dernier peut induire une pathologie chez la souris similaire à celle observé chez un patient ayant contracté la variole, ce qui en fait un bon modèle pour tester l’efficacité des vaccins. L’objectif est d’identifier la combinaison d’antigènes la plus efficace contre le CPXV. Pour cela, trois étapes sont prévues : 1) Sélectionner les antigènes OPXV induisant une réponse immunitaire plus élevée par rapport au vaccin de référence utilisé depuis 2022. 2) Valider la dose létale pour 50 % de l’effectif infecté (DL 50) du CPXV chez des rongeurs 3) D’identifier la meilleure association d’antigènes conférant une protection contre une épreuve infectieuse par le CPXV.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra : 1) De valider les antigènes qui seront inclus dans ces différentes technologies vaccinales. 2) D’optimiser les méthodes nécessaires pour l’analyse des réponses immunitaires spécifiques contre les OPXV au sein du laboratoire. 3) De valider un modèle murin pouvant être utilisé dans le cadre d’essai vaccinal préclinique pour les candidats vaccins contre l’infection par le MPXV et le VARV. 4) D’acquérir de nouvelles données faisant le lien entre la mortalité induite par l’infection de la souche de CPXV et la dissémination et la quantification du virus dans les organes. Les retombées de ce projet permettront à terme d’évaluer l’efficacité de candidats vaccins de 4e génération contre les OPXV dans un modèle préclinique.
Procédures
Pour les immunisations et les prélèvements sanguins, les interventions sont légères : -Les animaux seront sédatés puis immunisés avec une ou deux injections espacés de trois semaines. L’ensemble des interventions dureront maximum 5 minutes par animal. Les animaux seront suivis pendant trois semaines après une immunisation ou six semaines après deux immunisations. -Un ou deux prélèvements de sang espacés de trois semaines seront réalisés sur animaux sédatés dans les veines. L’ensemble des interventions dureront maximum 5 minutes par animal. Pour les infections par le CPXV, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées. Ils seront sédatés puis anesthésiés avant l’inoculation d’une solution contenant une souche de CPXV. L’ensemble des interventions dureront maximum 10 minutes par animal. En fin de procédure, ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Le modèle d’infection CPXV dans le modèle murin a été établi précédemment dans la littérature et a permis l’évaluation de candidats vaccins antivarioliques. L’inoculation d’une solution (milieu de culture ou suspension virale) entraîne une gêne des voies aériennes non douloureuse et très passagère (quelques secondes). Les animaux infectés par le CPXV peuvent présenter une perte de poids, une baisse de l’activité, de la prostration ainsi qu’un affaissement de la paupière (ptosis). On peut également observer des difficultés respiratoires et des lésions cutanées. L’infection par cette souche virale peut également entraîner la mort de l’animal (généralement entre le 7e et 9e jour post-infection).
Devenir
Les procédures comprennent des prélèvements post mortem de plusieurs organes pour conduire des analyses des réponses cellulaires et de titre viral. À l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort en fin d’étude pour réaliser ces prélèvements.
Remplacement
L’évaluation de l’immunogénicité et de l’efficacité d’un vaccin dans un modèle préclinique est une étape incontournable dans le processus de développement d’un vaccin. A ce jour, il n’existe pas de modèle de cultures cellulaires in vitro permettant de récapituler à l’échelle d’un organisme entier les réponses immunitaires et la protection face à une infection virale. Concernant l’épreuve infectieuse, le bon déroulé de cette étape repose notamment sur la connaissance de la dose létale causant la mort de 50 % de l’effectif (DL50) de l’agent utilisé pour évaluer l’efficacité d’un vaccin. La DL50 doit faire l’objet d’un contrôle si l’utilisation d’un nouveau lot de virus est envisagée. Afin de prendre en compte cette spécificité, un lot conséquent de CPXV est en cours de production afin de limiter au maximum le renouvellement de cette étude.
Réduction
Avec l’appui des données dans la littérature utilisant un vaccin à base d’antigènes sous la forme de protéine, le nombre d’animaux nécessaires par groupe est calculé pour avoir un effectif minimum suffisant permettant une analyse statistique significative entre deux traitements différents. Pour les tests d’immunogénicité et d’efficacité face à une épreuve infectieuse, il nous faudrait disposer d’au moins 6 animaux par groupe. Déterminer la dose létale et la dose létale 50 d’une souche de CPXV sur modèle murin demande de pouvoir observer une différence statistique significative entre deux groupes. Il nous faudrait disposer d’au moins 7 animaux par groupe pour que les résultats soient valorisables. Compte tenu du risque de mortalité lié à des aléas extérieurs, nous estimons nécessaire d’augmenter les effectifs de chaque groupe infecté 1 individu.
Raffinement
À leur arrivée, les souris passeront par une phase d’acclimatation d’une semaine. Elles seront identifiées par des dispositifs d’identification (boucles auriculaires ou puces électroniques) . Les animaux identifiés par puces seront observés pendant une semaine supplémentaire. Tous les animaux d’une même cage seront traités de la même manière au même moment. Avant chaque intervention, une sédation sera appliquée. Une anesthésie locale sera appliquée en complément pour certaines procédures. La pommade sera appliquée au niveau de la zone concernée pour la pose de boucles auriculaires et les prélèvements veineux. Une injection d’analgésique sera réalisée à l’endroit de l’implantation de la puce. Une injection d’anesthésique sera réalisée avant l’inoculation du CPXV. Après anesthésie, le réveil des animaux sera contrôlé et ils seront replacés dans les cages uniquement lorsqu’ils seront parfaitement réveillés et mobiles. Des grilles d’évaluation permettront d’évaluer cliniquement l’état de l’animal tout au long des protocoles expérimentaux et de définir la démarche à suivre pour circonscrire toutes éventuelles altérations de celui-ci. Une évaluation éthique rétrospective de ce travail sera réalisée à l’issue du projet.
Choix des espèces
L’évaluation d’un nouveau vaccin antivariolique ne peut pas être prouvée chez l’homme par des études cliniques en raison de l’éradication de la variole. Pour évaluer l’efficacité d’un vaccin antivariolique à spectre large contre les OPXV, l’infection expérimentale par un virus de la famille du genre Orthopoxvirus dans un modèle mammifère est le seul moyen permettant d’évaluer la protection conférée par un vaccin à l’échelle d’un organisme entier. La souris est un modèle pertinent pour évaluer les réponses immunitaires et l’efficacité conférées des vaccins antivarioliques. En effet, celle-ci est sensible à l’infection par le virus cowpox, un orthopoxvirus, et récapitule certains signes cliniques et symptômes observés chez des patients infectés par le virus de la variole. De plus, les réponses immunes spécifiques suite à l’infection par le virus cowpox par voie intranasal ont été caractérisées. Ainsi, le même modèle murin sera employé pour réaliser les essais dans ce projet. Les procédures de vaccination avec deux doses espacées de trois semaines sont longues, ce qui justifie de démarrer à un âge jeune, le vieillissement étant connu pour impacter la réponse immunitaire. Cependant, il est important d’attendre 6 semaines d’âge minimum pour avoir un système immunitaire mature chez la souris.
Evaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques dans le modèle expérimental de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 836 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune peut recevoir jusqu'à 700 injections ou administrations de composés et subir jusqu'à 50 prélèvements de sang sur animal vigile, sans que le résumé explique d'où viennent ces plafonds. Les expérimentateurs leur provoquent une stéatose du foie par un agent chimique ou un régime gras, avec des douleurs inflammatoires que le porteur dit quantifier par un score quotidien, pour tester des candidats médicaments avant une éventuelle phase clinique. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ni aucune modélisation informatique n'est à même de remplacer "l'animal entier".
Objectifs
La NAFLD (stéatose hépatique non alcoolique) est une maladie chronique du foie qui est due à l’accumulation anormale de graisses dans les cellules du foie. Cette maladie survient chez des patients ayant un ou plusieurs facteurs de risque parmi les suivants : surpoids ou obésité, diabète de type 2, hypertension artérielle, dyslipidémie (augmentation du cholestérol ou triglycérides) ou syndrome d‘apnée du sommeil. Elle survient également en absence d’une consommation excessive d’alcool. D’abord silencieuse, la maladie évolue défavorablement en l’absence de mesures hygiéno-diététiques rectificatives. Quand l’accumulation de graisses est trop importante au niveau du foie, cela engendre une inflammation chronique et la destruction des cellules hépatiques : c’est la NASH (stéatohépatite non alcoolique). La destruction des cellules engendre, elle, la formation de tissus cicatriciels fibreux non fonctionnels : c’est la fibrose également appelée cirrhose, à son stade ultime. Les mécanismes impliqués dans cette évolution sévère sont encore mal clarifiés. En raison de sa prévalence mondiale croissante, divers modèles animaux reflétant à la fois la physiopathologie et l’histopathologie de chaque stade de la NAFLD/NASH sont disponibles. Ceci est essentiel pour déterminer la progression de la maladie et aide également à évaluer différentes approches thérapeutiques pour le traitement de stades spécifiques de la NAFLD. Ce projet a donc pour but de tester de nouveaux candidats médicaments anti-fibrotiques et anti-inflammatoires dans un modèle de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) induite par un agent chimique ou un régime alimentaire gras particulier. Nous nous attendons donc à une amélioration de la pathologie pour les groupes traités.
Bénéfices attendus
D’abord silencieuse, la maladie évolue défavorablement en l’absence de mesures hygiéno-diététiques rectificatives. Une caractéristique des maladies chroniques du foie est une inflammation persistante qui contribue à leur progression vers des stades plus sévères, et notamment l’évolution vers la fibrose et son stade ultime, la cirrhose. Le seul traitement est la transplantation de foie, le but est ici d'étudier d’autres pistes thérapeutiques. Nous nous attendons dans ce projet à une amélioration de la pathologie pour les groupes traités qui consiste à une diminution de l’inflammation ainsi que de la fibrose.
Procédures
Maximum 50 prélèvements de sang sur animaux vigiles durant l'étude et un prélèvement terminal sous anesthésie (30 secondes/prélèvement). Maximum 700 injections/administrations de composés par animal (30 secondes/injection).
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids et être quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques, ainsi de valider notre modèle et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation, fibrose du foie chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, test nécessaire avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - Notre localisation nous donne de nombreux avantages en termes d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale, de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux - Animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, notamment dans les modèles de fibrose hépatique. Les animaux sont utilisés au stade adulte et âgés de 7 à 12 semaines à l'arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).