Rongeurs

Cinquante injections dans le ventre pour cent d'entre elles, vingt-trois pour cent autres, neuf pour les trente-six dernières : les 236 souris de ce projet reçoivent d'abord toutes une greffe de peau, un morceau de dos de la taille d'une demi-pièce d'un centime prélevé sur une congénère. La chirurgie dure trente minutes sous anesthésie et le pansement reste sept jours, gênant les déplacements et l'alimentation. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur sang, la zone greffée et leur tube digestif. Le porteur cherche à savoir si une molécule produite par le microbiote intestinal protège du rejet de greffe, et compte parmi les retombées possibles le dépôt d'un brevet.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment éviter les rejets de greffe qui peuvent survenir dans les premiers mois suivant une transplantation. Le rejet est une réaction du système immunitaire du patient, qui considère l’organe greffé comme un corps étranger et essaie de le détruire. Cette réponse peut entraîner une dégradation rapide du greffon et compromettre la réussite de la greffe. Le traitement étudié dans ce projet est un médicament immunosuppresseur appelé CTLA4-Ig, déjà utilisé chez certains patients. Il a l’avantage de provoquer moins d’effets secondaires que les traitements traditionnels, mais il semble que chez certains patients, il ne soit pas suffisant pour empêcher un rejet aigu, surtout dans les premières semaines après la greffe. Nos recherches ont montré que le microbiote intestinal (les bactéries naturellement présentes dans notre tube digestif) pourrait influencer cette réaction de rejet. En effet, dans une étude portant sur 60 patients, ceux qui ne faisaient pas de rejet présentaient dans leur sang des traces de bactéries spécifiques et un niveau plus élevé d’une molécule produite par l’intestin. Nous avons testé cette molécule chez la souris, dans un modèle de greffe de peau. Les résultats ont montré que cette molécule pouvait prolonger la survie de la greffe lorsqu’elle était utilisée seule. En revanche, lorsque cette molécule était utilisée en même temps que le traitement immunosuppresseur, il n’y avait pas d’effet protecteur supplémentaire. Nous supposons que le modèle utilisé provoquait une réaction immunitaire trop intense. Dans ce projet, nous allons approfondir ces résultats en utilisant des souris génétiquement modifiées qui ne répondent pas à cette molécule, ainsi que différents types de greffes, déclenchant des réponses immunitaires plus ou moins fortes. L’objectif est de mieux comprendre comment adapter les traitements pour améliorer la tolérance des greffes.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous aideront à comprendre comment les molécules associées au microbiote peuvent influencer la survie des greffes. Nous pourrions ainsi prouver que des niveaux élevés de ces molécules sont liés à l'absence de rejet chez les patients traités avec une immunothérapie. Cela permettrait de prévoir le risque de rejet chez ces patients, ce qui aiderait à mieux évaluer si l'immunothérapie est bénéfique ou risqué pour chaque patient. Ces découvertes pourraient aussi soutenir le dépôt d'un brevet. Ces résultats aideront à comprendre le mode de fonctionnement des molécules associées au microbiote et comment elles agissent pour bloquer le système immunitaire. À long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de traitements qui modifient le microbiote ou utilisent des molécules du microbiote pour prévenir le rejet des greffes.

Procédures

Nous réaliserons une greffe de peau sur 236 souris, la chirurgie durera 30 min par animal sous anesthésie. Le jour précédant cette greffe, 100 animaux recevront une injection. Après la chirurgie, ces animaux recevront des injections tous les deux jours dans l’abdomen. Les injections dureront 2 à 3 minutes. Deux jours avant la chirurgie, un prélèvement de sang à la joue sera réalisé sur ces mêmes animaux, sous anesthésie. Un prélèvement durera 5 minutes et sera répété deux fois par mois, soit 4 prélèvements par animal. Après la chirurgie, 136 animaux recevront une injection, dans l’abdomen, tous les deux jours pendant 8 jours puis deux fois par semaine. En résumé : 100 animaux auront une greffe de peau, 50 injections et 4 prélèvements ; 100 animaux auront une greffe de peau et 23 injections ; 36 animaux auront une greffe de peau et 9 injections.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, une opération sera réalisée sur des souris : un morceau de peau du dos de la souris, de la taille d’une demi pièce d’un centime, sera retiré et remplacé par un morceau de peau d’une autre souris. Les animaux seront anesthésiés pendant l’intervention, c’est-à-dire endormis, ce qui peut être stressant pour eux au réveil. Comme pour toute opération, cela peut provoquer une gène pendant quelques jours (2 à 4 jours) à cause de la cicatrisation. Un pansement sera mis en place pour protéger la greffe. Ce pansement aide à la guérison, mais il peut gêner les mouvements et l’alimentation, ce qui peut faire que les animaux prennent un peu moins de poids que d’habitude. Il est retiré après 7 jours. Après l’opération, certaines souris recevront un ou deux traitements pour empêcher leur corps de rejeter la greffe. Ces traitements seront injectés dans le ventre plusieurs fois par semaine. Ces piqûres ne sont pas très douloureuses, mais comme elles sont répétées au même endroit, elles peuvent devenir gênantes pour l’animal. La dose de traitement ne provoque pas d’effets secondaires connus. Si le corps de la souris rejette la greffe, cela peut aussi causer de la douleur, qui sera surveillée et soulagée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience afin de réaliser les prélèvements terminaux. Du sang sera prélevé pour étudier les molécules en lien avec l'immunité. Nous analyserons les cellules immunitaires de la zone de la greffe et du tube digéstif. Enfin, les organes contenant un grand nombre de cellules immunitaires seront prélevés afin d'analyser ces cellules. Ces prélèvements sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Nous avons jusqu'alors utilisé des échantillons provenant des patients traités contre le rejet après une greffe. Nos précédentes études utilisaient des cellules humaines issus de ces échantillons. L'utilisation de souris nous aidera à confirmer nos observations dans un contexte où la greffe interagit avec les molécules produites par l'ensemble des cellules de l'organisme. Une étude en laboratoire (in vitro) ne reproduit pas cette interaction complexe et ne permet pas d'étudier toutes les connexions entre le traitement, les cellules et le rejet de greffe. De plus, la dose de traitement anti-rejet est similaire à celle donnée aux patients transplantés, à la fois au site de la greffe et dans les ganglions voisins.

Réduction

Nous nous sommes attachés à réduire le nombre d'animaux dans cette expérimentation. Nous avons utilisé des méthodes statistiques, nos précédents résultats et la littérature scientifique afin de déterminer un nombre d'animaux par groupe permettant de répondre à notre question scientifique. Dès que possible les groupes d'animaux contrôles ont été réduit ou mis en commun pour réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Les greffes seront réalisées sous anesthésie générale, ce qui signifie que les souris seront complètement endormies pendant l’opération et ne ressentiront aucune douleur. Pour leur confort, elles seront placées sur un tapis chauffant pendant toute la durée de l’intervention et jusqu’à leur réveil, afin de maintenir leur température corporelle. Un traitement contre la douleur sera donné avant et après l'opération. Les souris recevront également une nourriture adaptée, posée au sol, surtout si elles ont du mal à se déplacer. Le bien-être des animaux sera contrôlé tous les jours pendant la première semaine, puis au moins trois fois par semaine par la suite. Une grille d’évaluation spécifique sera utilisée pour repérer les signes de douleur ou d’inconfort. En fonction du score obtenu, des soins ou un traitement contre la douleur seront apportés.

Choix des espèces

Le modèle souris est essentiel pour cette étude, car il permet de bien contrôler les conditions de l’expérience. On peut choisir avec précision les différences entre la souris qui reçoit la greffe et celle qui la donne, notamment au niveau du système immunitaire. Cela permet de mieux comprendre comment le corps réagit contre la greffe. Les autres méthodes, comme les tests sur des cellules en laboratoire, ne permettent pas de reproduire toutes les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire, ni leurs déplacements dans le corps. Enfin, les animaux non mammifères n’ont pas un système immunitaire comparable à celui de l’humain. La souris est donc le modèle le plus adapté pour répondre aux questions de cette recherche. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois, au stade de jeune adulte. En effet, le traitement anti-rejet est plus efficace sur des animaux jeunes.

Deux semaines d'acclimatation, puis une chirurgie du crâne sous anesthésie pour injecter un virus dans le cerveau et poser une fenêtre crânienne ou un implant. Trois à quatre semaines de récupération, un déménagement vers un second établissement, sept jours pour s'y faire, une nouvelle anesthésie pour fixer une barre en titane sur la tête. Vient enfin le contrôle hydrique, un à deux mois de restriction d'eau pendant lesquels les 750 souris, la tête immobilisée, travaillent jusqu'à une heure par jour à une tâche de choix, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite tuées pour qu'on vérifie au microscope si les injections avaient bien atteint les coordonnées visées.

Objectifs

La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-àdir l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un noeud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs vise donc à éclairer le rôle du cortex moteur secondaire pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.

Bénéfices attendus

Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants. Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux comme la schizophrénie, les troubles de l’attention et de l’hyperactivité et la depression. En conséquence, ces patients présente moins de flexibilité d’apprentissage, s’adaptent moins aux nouveaux environnements, utilisent des strategies habituelles et présentent une extinction plus rapide des apprentissages. Notre projet permet d’étudier ces paramètres chez l’animal lors d’une tâche comportementale pour comprendre le rôle des régions cérébrales impliquées.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 semaines. Puis les animaux seront soumis à une chirurgie avec injection d’un virus puis pose d’une fenêtre crânienne ou pose d’un implant. Ces chirurgies se feront sous anesthésie, tous les animaux auront une injection de virus, 250 animaux auront une chirurgie avec pose d’une fenêtre crânienne et 500 animaux la pose d’un implant. Après 3 à 4 semaines de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 7 jours. Ensuite, les animaux auront une anesthésie pour permettre la pose d’une barre en titane nécessaire au comportement qui se fait en « tête restreinte », ils seront soumis à contrôle hydrique qui durera entre 1 et 2 mois. Pendant cette période, les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (7 jours), l’apprentissage (10 jours) et le contrôle (au minimum 1 mois). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 20 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront au maximum une session d’une heure par jour.Les chirurgies pour l'injection du virus puis la pose d'une fenêtre crânienne ou la pose d'un implant se feront dans le premier établissement utilisateur. La pose de la barre en titane, le contrôle hydrique ainsi que le comportement auront lieu dans le second établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux : ● Le risque de douleur durant la chirurgie● Le risque de douleur aiguë liée à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le contrôle hydrique ● Contention « tête-restreinte »

Devenir

A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.

Remplacement

L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.

Réduction

La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certaines tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groups expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique grâce à la buprénorphine injectée avant et après la chirurgie. Une injection de Mélloxicam en sous cutanée sera réalisée après la chirurgie pour augmenter la durée de la couverture analgésique. La couverture antalgique agira dès le réveil de l’animal et sera maintenue avec une injection de Buprénorphine et de Méloxicam24h post chirurgie. Si l’animal montre des signes de souffrance de nouvelles injections seront réalisées toutes les 24h. La procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase sombre, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après le contrôle hydrique. Les animaux sont transférés entre les deux EU qui sont situés dans le même bâtiments dans leurs cages d'hébergement avec des chariots spécifiques. Les cages sont placées dans des sacs en kraft pour les isoler de la lumière et de tout contact visuel.Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Aucune souris ne sera gardée vivante au-delà de quatre-vingts jours après l'injection des cellules leucémiques, ni si son état atteint un point limite. 166 souris privées d'une partie de leur système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une irradiation du corps entier, puis des cellules leucémiques humaines dans la veine, une injection hebdomadaire dans le ventre et, pour 130 d'entre elles, trois prises de sang étalées sur neuf semaines, en restant éveillées à chaque fois. Le porteur attend une perte de poids et des tumeurs abdominales, et cherche à montrer qu'un type de cellules immunitaires modifiées s'épuise moins vite qu'un autre, une comparaison dont il renvoie les retombées cliniques à un second temps.

Objectifs

Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.

Procédures

-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.

Impact sur les animaux

La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.

Provoquer une arthrite chez des rongeurs pour voir si un vaccin l'empêche : 300 souris et 100 rats vont être utilisés dans ce but, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyse de leurs tissus. Les souris reçoivent deux doses de vaccin sous la peau, les rats une administration sous-cutanée et nasale, avec des prélèvements de sang et de salive sous anesthésie à trois reprises en un mois. Les rats sont ensuite exposés par la bouche à une bactérie, quatre jours sur sept pendant un mois, jusqu'à développer une inflammation articulaire que le porteur prévoit de traiter par anti-inflammatoires. Cette bactérie n'est jamais nommée, désignée d'un bout à l'autre du résumé par les seuls mots "cette bactérie".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : -Determiner le meilleur schéma d’immunisation ainsi que la voie d’administration adaptée chez le rat et la souris -Determiner les conséquences cliniques de l’immunisation sur la survenue d’arthrites chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

L’impact fondamental de notre étude est de montrer qu’une immunisation contre cette bactérie présente un avantage majeure dans la prévention des maladies articulaires inflammatoires via une vaccination anti-bactétien et une alternative aux biothérapies.

Procédures

Vaccination sous cutannée Prélèvements sanguins et t salivaires: J0, J15, J30 Les prélèvements sanguins et salivaires sont réalisés sous anesthésie 2 doses vaccinales seront effectués chez la souris sous cutané + intre nasale chez le rats 2 doses de vaccin, la voie sera determiné en fonction des résultats chez la souris. La durée des prelèvements salivaire est de 5 à 10 minutes maximum. L'administration des vaccins chez la souris et le rat dure pour chaque animal environ 1 minute. L'exposition à cette bactérie chez le rat est de 1 mois, il s'agit d'une administration orale (le rat lèche une solution contenant cette bactérie), le rat est exposé 4 jours sur 7 pendant 1 mois. La durée d'exposition quotidienne est d'environ 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Effet indésirable : douleur lors de la réalisation des prélèvements sanguin et des vaccinations sous cutané : à cet effet une analagésie efficace sera mis en place lors de l’expérimentation En cas de survenue d'arthrite, une analgésie par anti inflammatoire non stéroidien (AINS) connus pour leurs effets efficaces sur les arthrites inflammatoires sera mis en place.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour prélèvement de tissus afin d’effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet est une étude préclinique visant à évaluer l’efficacité vaccinale muqueuse et sous cutanée d’une nouvelle stratégie. Ces modèles animaux sont les modèles de référence pour l’évaluation de stratégies vaccinales anti-bactérienne. Ils sont l’étape indispensable avant le passage chez l'Homme. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier la réponse immunitaire induite par un vaccin.

Réduction

Ce nombre a été déterminé en tenant compte des différentes voies d’administrations des vaccins, en tenant compte du nombre de vaccins à tester (5 vaccins différents) et des groupes à tester. Nous avons utilisé le minimum possible par groupe afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives éventuelles. Nous avons aussi tenu compte du nombre de fois nécéssaire à répéter l’expérience afin de montrer que la mise en évidence d’un quelconque effet ne soit pas lié au hasard

Raffinement

Les animaux seront suivis régulièrement pendant toute la durée du projet (l’ensemble des éléments contenus dans la grille de scoring seront intégrés dans les points limites : -Des mesures en amont seront pris pour la douleur comme une analgésie et une sédation efficace, une surveillance accrue lors de la phase de réveil post prélèvement, ainsi qu’une surveillance du comportement et une analyse par echelle visuelle analogique, une surveillance pondérale sera effectuée les jours suivants et durant la permanance des animaux à l’animalerie. -Les éventuels effet indésirable des vaccins chez les animaux sains seront monitorés et si ces effets conduisent à un état douloureux important, une analgésie adéquate sera effectuée. Les différents modèles animaux sont par ailleurs connus pour developper une inflammation articulaire importante lors de l’exposition bactérienne. Une surveillance biologique et par imagerie régulière sera effectuée afin de détecter rapidement la survenue d’arthrite et de prendre en charge par des moyens thérapeutiques (exemple des analgésies) - Les animaux seront manipulés sans stress, par des personnes compétentes. Surveillance adaptée des animaux. Naturellement nous avons introduits dans ce projet une grille de points limites qui seront surveillés strictement dans la réalisation de notre expérimentation .

Choix des espèces

Les animaux choisis dans ce projet sont les modèles les mieux adaptés pour le développement de modèles immunologiques. Nous avons sélectionné ces deux espèces pour étudier l’immunogénicité des stratégies vaccinales (procédure expérimentale). En effet la souris représente le modèle idéal d'étude des schémas d'immunisation avec les différents voies d'administration, la production d'anticorps neutralisant et les différents vaccins contre cette bactérie. Après validation du schéma vaccinal et d'immunisation chez la souris, on passera à l'étude chez le rat, il présente la caractéristique intéressante de présenter une arthrite strictement inflammatoire, proche des arthrites inflammatoires humaines, quelques mois exposition gingivale à cette bactérie ainsi la réalisation d'un vaccin de vaccin sur la survenue de la maladie. Age souris 8 semaines - rats 4 semaines:il s’agit de modèle d’arthrite survenant précocement d’où l’intérèt d’un modèle immunisant juvénile.

Irradiées éveillées pendant cinq minutes, puis injectées dans la veine de la queue avec des cellules leucémiques, 410 souris subissent ensuite une prise de sang à la joue chaque semaine pendant un mois et, si la maladie ne se voit pas dans le sang, une ponction d'aiguille dans le fémur. Certaines reçoivent en plus une à deux injections dans le ventre par jour pendant cinq jours. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le développement attendu de la leucémie comprend un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, une prostration, une déshydratation et une hypothermie. Toutes les souris sont tuées à la fin pour prélever leur moelle osseuse et leur rate, où logent les cellules leucémiques.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) à core-binding factor (CBF) sont un type particulier de cancer du sang qui est difficile à soigner. Des chercheurs ont remarqué que la façon dont les cellules cancéreuses s’organisent entre elles pourrait avoir un lien avec la façon dont les patients réagissent aux traitements. Mais on ne comprend pas encore très bien ce lien. Peut-être que cette organisation aide certaines cellules à résister aux médicaments, ou bien qu’elle montre juste qu’un autre problème plus profond est à l’origine de cette résistance. Dans notre laboratoire, on utilise des souris particulières pour essayer de mieux comprendre ce qui se passe. On veut vérifier si les changements dans les gènes des cellules cancéreuses sont bien responsables de la manière dont les cellules s’organisent entre elles et si cela les rend plus résistantes à la chimiothérapie (un traitement contre le cancer).

Bénéfices attendus

Les résultats de notre étude vont nous aider à confirmer s’il y a bien un lien entre l’état des cellules cancéreuses et la façon dont elles s’organisent dans ce type de leucémie. Plus largement, cela nous aidera à mieux comprendre comment le cancer se forme et pourquoi il peut résister aux traitements.

Procédures

Les souris, qui ne sont pas endormis au début, seront d’abord exposées à de faibles radiations pendant 5 minutes. Cela permet aux cellules cancéreuses qu’on leur injecte dans la veine de la queue de s’installer dans leur moelle osseuse. L’injection dure moins de 20 secondes. Ensuite, on leur prélèvera un peu de sang, au maximum une fois par semaine, en piquant une petite veine de la joue. Chaque prise de sang dure moins d’une minute et sera faite toutes les semaines, pendant 4 semaines. Cela nous permet de de voir si la maladie progresse et de récupérer du matériel pour faire des analyses plus tard. Si on ne trouve pas de cellules cancéreuses dans le sang, on ira en chercher dans l’os de la cuisse (le fémur) avec une petite aiguille. Pour cela, la souris sera endormie et ne ressentira pas de douleur. Cette opération dure moins de 5 minutes. Quand on est sûr que les cellules cancéreuses se développent, certaines souris recevront un traitement tous les jours pendant 5 jours. On leur fera une injection dans le ventre. Si on teste plusieurs médicaments en même temps, il peut y avoir deux injections par jour.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec les différentes molécules, greffés avec des cellules leucémiques ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre le développement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal de se déplacer et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas d’introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition d’amas de cellules cancéreuses forment une masse, dans diverses localisations (organes, tête).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour prélever la moelle osseuse et la rate, deux organes où se localisent les cellules leucémiques. Cela permettra d'étudier finement leurs caractéristiques.

Remplacement

Bien que certains modèles cellulaires in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de caractérisation de réponse aux traitements, ils ne sont pas suffisants car ils ne permettent pas de résumer toutes les conditions de développement de la leucémie observée chez l’homme. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles de souris.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés. Nous utiliserons un groupe contrôle pour différentes expériences.

Raffinement

En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort à l’intérieur des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés tous les jours en faisant particulièrement attention aux symptômes et changements de comportement. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des prélèvements de moelle osseuse car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis d’identifier les points limites qui, seuls ou cumulés, vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide sera prise pour éviter toute souffrance animale excessive. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal. Si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une euthanasie de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé dans ce projet est déjà validé pour l’étude des mécanismes impliqués dans la leucémie aigüe myéloïde. Ce modèle présente une forte transposabilité aux données humaines en raison de la conservation des voies moléculaires clés entre la souris et l’homme. Son utilisation se justifie également par la robustesse des résultats préliminaires obtenus in vitro, qui nécessitent désormais une validation fonctionnelle in vivo dans un système pertinent et contrôlé. Ces modèles préalablement décrits utilisent des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines, âge pour lequel la prise de greffe des cellules cancéreuses est optimal.

Une neurotoxine leur est injectée dans le cerveau au cours d'une chirurgie d'une trentaine de minutes, pour détruire les neurones qui produisent la dopamine. 2 625 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé. Certains reçoivent une seconde chirurgie d'implantation de pompe sous la peau, puis un traitement quotidien pendant six semaines, des prises de sang à la queue sur animal éveillé et un prélèvement de liquide céphalorachidien. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention, répétés jusqu'à trois fois, sans dire lesquels, et prévoit d'écarter les 20 % de rats dont la lésion cérébrale se révélera insuffisante.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est, par sa prévalence de 1,5 pour mille, la plus fréquente des pathologies neurodégénératives, après la maladie d’Alzheimer. Elle touche environ 160 000 personnes en France. La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique neuropathologique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones en charge de la coordination des mouvements et qui produisent la dopamine. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones dans le cerveau) par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme son efficacité s’atténue et des effets secondaires très invalidants (troubles moteurs, digestifs,cardiovasculaires, comportementaux, somnolence,…). Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses alternatives sont en cours de développement et visent soit à retarder la prise de cette molécule soit à l’associer avec d’autres composés. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité antiparkinsonienne de nouveaux médicaments sur trois modèles précliniques de la maladie de Parkinson chez le rat. Ces modèles reposent sur une injection de toxines dans le système nerveux central en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer l’efficacité antiparkinsonienne des traitements testés. L’efficacité du nouveau médicament sera comparée aux médicaments actuels représentant le traitement de référence.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester l’effet antiparkinsonien des composés candidats pouvant avoir des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le système nerveux central (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Des administrations quotidiennes de candidat médicament ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (6 semaines au maximum). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement en fin de protocole effectués sous contention par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à trois fois au cours du protocole. Un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie pourra être réalisé. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du nouveau médicament et des molécules de référence. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut-être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau d'une toxine nécessitant une chirurgie réalisée sous anesthésie gazeuse. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie minorées par des antalgiques. La peau du crâne sera ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation,un risque de retrait du point par l'animal et un risque rare d'infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse, avec une ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil -Les animaux réaliseront des tests de comportements nécessitant des contentions et des isolements courts dans des espaces restreints pouvant générer du stress. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention, impliquant parfois des piqures dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet antiparkinsonien du composé sur le comportement de l’animal, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux déficits parkinsoniens ni d’évaluer la présence du composé dans les organes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson induite par l’injection de toxines dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine (n=15 dont n=12 inclus dans l’analyse finale). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère (

Raffinement

Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Après chaque prélèvement de sang, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte du volume sanguin. Les chirurgies intracérébrales seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Par ailleurs, les animaux seront habitués aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela.

Choix des espèces

Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et de l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Les modèles de lésion induite par l'injection dans le cerveau de toxines se sont rapidement imposés comme des modèles précliniques de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de lésion dopaminergique seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.

Une partie des souris utilisées est dépourvue de système immunitaire, donc exposée aux infections, et une autre partie est castrée avant même sa maturité sexuelle. 3 720 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des tumeurs de mélanome ou de cancer du sein, un implant sous la peau, des injections jusqu'à trois fois par semaine, une prise de sang hebdomadaire et deux séances d'irradiation, la croissance des tumeurs pouvant gêner leurs déplacements, se nécroser et gagner les poumons. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, l'objet déclaré étant de comprendre pourquoi les femmes résistent mieux au cancer que les hommes.

Objectifs

En France, les cancers sont non seulement plus fréquents mais aussi plus mortels chez les hommes que chez les femmes. Les mécanismes responsables de ces différences liées au sexe dans les cancers sont peu documentés et probablement complexes. A côté du mode de vie (consommation d'alcool, de tabac ...) qui peut varier entre les hommes et les femmes, nous pensons que des facteurs biologiques qui sont différents en fonction du sexe tels que les hormones sexuelles (estrogènes, androgènes) ou encore des facteurs génétiques (gènes du chromosome X ou du chromosome Y) pourraient aussi contribuer à expliquer la meilleure résistance des femmes au cancer en augmentant leur réponse immune anti-tumorale. Les grands objectifs de notre projet sont doubles. D’une part, nous identifierons si des facteurs génétiques liés au sexe contribuent aux meilleures réponses anti-tumorales chez les femelles et influencent leur réponse aux immunothérapies. D’autre part, nous évaluerons si les hormones sexuelles féminines (estrogènes) participent aux meilleures réponses immunitaires chez les femelles.

Bénéfices attendus

Bien qu'observables pour la plupart des cancers, les mécanismes à l'origine des différences dans le cancer entre les hommes et les femmes sont encore très peu explorés et largement négligés dans le diagnostic et la prise en charge thérapeutique. Il est en effet admis que la plupart des cancers se déclarent non seulement plus tôt chez les hommes mais que leur incidence et leur taux de mortalité associée sont plus élevés chez les hommes en comparaison aux femmes, supposant de meilleures réponses immunes antitumorales chez les femmes. Notre projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de ce dimorphisme sexuel dans l'immunité anti-tumorale. Ces mécanismes pourraient être exploités pour les thérapies de nouvelle génération et la gestion du cancer en fonction du sexe.

Procédures

Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris mâle ou femelle - Implant sous la peau réalisée sous anesthésie générale ( 30 sec), dure moins de 5 min - - des injections sous-cutanées et intraveineuses (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure - deux irradiations de moins de 4 minutes chacune

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées que nous utiliserons, et dont nous disposons d’ores et déjà au laboratoire dans ce projet n’ont pas de phénotype dommageable hormis les souris immunodéficientes. Ces souris dépourvues de système immunitaire sont plus sujettes aux infections. Une partie des animaux sera ovariectomisée ou castrée. Les animaux récupèrent parfaitement de ces opérations. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. La croissance des tumeurs primaires de mélanome et de cancer du sein peut induire des difficultés de déplacement. La croissance tumorale peut aussi être associée au développement de nécrose. Le lieu préférentiel de métastase du mélanome est le poumon et peut donc être accompagnée de troubles respiratoires. Globalement, la pousse tumorale et le développement de métastases peuvent être associés à une altération de l’état général (absence de nidification, absence de toilettage, asthénie, léthargie, tremblement, dos arqué) et à une perte de poids. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections et de la mesure du volume tumoral). Une grille de scoring decrit avec précision les actions à mener.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les réponses immunes anti-tumorales misent en place pour l’élimination efficace des cancers sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (site tumoral, site de dissémination métastatique, ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées in vitro.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons aussi interrogé des chercheurs maitrisant ces modèles et leur robustesse. Nous en avons conclu que le nombre minimal d’animaux est de 10 par groupe. Le calcul d'effectif a été réalisé en utilisant un test non paramétrique de rang. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal : étude longitudinale de mesure de la pousse tumorale et étude cytométrique/transcriptomique/histologique sur les tissus post-mortem.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, en particulier les animaux immunodéficients, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloos, sizzelnest pour la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du serum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Un collyre anésthésiant sera appliqué sur l'oeil avant les injections en retro-orbitaire. L’ovariectomie, la castration et l’implantation des cellules tumorales mammaires sera réalisée sous anesthésie générale. Un anesthésique local sera administrée au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures. Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les acteurs de la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site tumoral ou dans les organes lymphoïdes). Une partie des souris devra être castrée avant maturité sexuelle (4-6 semaines), donc avant toute sécrétion d'hormones sexuelles. Toutes les autres procédures seront réalisées sur des animaux agés de 8-30 semaines. Cet âge correspond à l'âge adulte chez la souris, période durant laquelle nous souhaitons étudier l'impact des facteurs liés au sexe sur la réponse immune anti-tumorale.

Les femelles sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les embryons pour qu'on prélève leur cerveau. 964 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 164 femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie, jusqu'à quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage de une heure à une semaine, et 800 embryons reçoivent dans le cerveau, à travers un capillaire de verre, une injection que le porteur qualifie lui-même de douleur aiguë et modérée. Sur ce total, 20 femelles et 160 embryons servent à former de nouveaux intervenants aux gestes.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude des maladies du développement du cerveau d’origine génétique. En particulier, l’objectif principal de notre travail est de mieux comprendre, au cours de ce processus complexe de développement, les mécanismes nécessaires à la maturation des cellules souches neuronales en neurones. Ici nous souhaitons comprendre comment le contrôle de la synthèse protéique participe au développement du cerveau. Nous avons récemment mis en évidence un rôle clé des acides ribonucléiques de transfert qui sont des petites molécules adaptatrices de la traduction protéique. Cependant, il reste à étudier comment les voies moléculaires liées à ces molécules adaptatrices contribuent à la génération des neurones. Nous souhaitons donc étudier la teneur en molécules adaptatrices dans les cellules souches neuronales et les neurones à différents stades du développement du cerveau in vivo chez la souris. Pour isoler les différentes populations cellulaires présentes à des stades clés, nous nous appuyons sur une technologie dite FlashTag qui consiste en l’injection, dans les cerveaux d’embryon de souris, d’une molécule fluorescente. En mettant à mort les animaux à des temps variés après injection nous pouvons marquer différentes populations cellulaires dont la date de naissance correspond au stade auquel l’injection a eu lieu. En combinant FlashTag et le tri de cellules basé sur la fluorescence (FACS) , nous souhaitons isoler des populations pures de cellules à différents stades du développement sur lesquelles nous réaliserons un séquençage des acides nucléiques de transfert. Nous avons 3 objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient Au total, un nombre de 144 souris gestantes, soit environ 640 embryons (+512 embryons de stade inférieur aux 2/3 de gestation) seront utilisés dans cette étude. Nous ajouterons 20 femelles et 160 embryons pour la formation de nouveaux intervenants

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du contrôle de la synthèse protéique dans le développement du cerveau.

Procédures

164 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) unique, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La durée totale de la chirurgie n'excèdera pas 45 minutes. La cicatrisation peut induire une douleur modérée et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles, mais auront toujours un contact visuel et auditif avec leurs congénères pour des durées variant entre 1 h et 1 semaine selon l’objectif visé. Les souriceaux (n=640) vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 5 secondes) entrainant une douleur aigue et modérée.

Impact sur les animaux

La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits, il en résulte une douleur modérée lors de la cicatrisation et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles et de ce fait privées de congénère pendant quelques jours de convalescence, en gardant un contact visuel et auditif, induisant un stress léger. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires (E12, E13, E14, E15, E16 et E17), entrainant une douleur aigue et modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou après la collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour prélever les cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer les stades du développement auxquels nous intervenons.

Réduction

Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique avec le test adéquat. De plus, certaines expériences seront utilisées dans 2 objectifs : nous pourrons utiliser les données de l’objectif 1 dans l’objectif 2.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. L’intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. La cicatrice au niveau du ventre de la mère et le site d’injection sont surveillés et en cas d’infections importantes à ce niveau, ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement. Des points limites ont été déterminés et seront appliqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour comprendre la fonction du contrôle de la synthèse des protéines dans le développement du cerveau. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de déterminer les stades auxquels nous intervenons. La chirurgie pratiquée dans ce projet est réalisée en routine au laboratoire sur cet animal. Les femelles gestantes seront utilisées à maturité sexuelle car elles doivent être gravides. Les embryons seront injectés à différents stades du développement du cerveau avec une molécule fluorescente. Ils seront mis à mort à des stades précis, et les cellules fluorescentes triées pour répondre aux questions des différents objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient

Les ovaires de 1 200 souris leur sont retirés en dix à vingt minutes, avant la pose sous la peau d'une capsule diffusant des hormones. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour prélever leurs tissus. L'objet est de comprendre pourquoi les plaques d'athérome évoluent différemment selon le sexe et de mesurer l'effet des œstrogènes sur ce processus, y compris chez des souris privées du récepteur qui les reconnaît. La liste des procédures ne mentionne que la chirurgie et la capsule, alors que les effets attendus décrivent aussi un régime obésogène capable de faire dépasser 40 grammes aux animaux et de gêner leurs déplacements.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité en France chez les femmes, pourtant, elles restent encore sous-estimées. Les femmes présentent souvent des symptômes atypiques, un diagnostic et une prise en charge plus tardive et des différences dans l'évolution clinique des pathologies cardiovasculaires par rapport aux hommes. Les hormones sexuelles peuvent expliquer en partie ces différences, notamment les œstrogènes chez les femmes. En effet, au-delà de leur rôle majeur dans les fonctions de reproduction, leurs actions s’étendent également aux tissus non reproducteurs et en particulier aux artères. Chez la femme en période d’activité génitale, le 17β-estradiol (E2), produit par les ovaires, est l’œstrogène majoritaire. Durant cette période, ces hormones confèrent une protection artérielle à l’origine du moindre risque cardiovasculaire de femmes par rapport aux hommes. Au moment de la ménopause, qui correspond à l’arrêt de la production d’œstrogènes et qui survient en moyenne entre 49 et 52 ans chez la femme, la protection diminue considérablement ce qui entraine une augmentation significative du risque cardiovasculaire à partir de cette période. Le but de ce projet est de comprendre le dimorphisme sexuel dans l’évolution des plaques d’athérome (à l’origine de la plupart des maladies cardiovasculaires) et d’étudier l’impact des œstrogènes dans ce processus. Enfin nous évaluerons les mécanismes d’actions des œstrogènes en utilisant des souris déficientes pour leur récepteur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur la santé humaine et plus particulièrement la santé féminine. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle des hormones féminines dans les pathologies cardiovasculaires, en particulier chez la femme au moment de la ménopause. En effet les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité chez la femme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 1200 animaux 2-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 1200 animaux

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’ovariectomie ou la pose de pellet peuvent engendrer une douleur, une légère perte de poids et un stress en post-opératoire durant les premières 24 à 48h. Le régime obésogène provoque une prise de poids qui peut engendrer une gêne de mobilité chez la souris (si le poids de la souris dépasse 40g de poids corporel).

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

L’évaluation des plaques d’athérome dans la paroi des vaisseaux est un phénomène complexe qui ne peut pas être mimé in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentent dans le vaisseau « perdent » l’expression du récepteur des œstrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 10 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à un dépôt de plaque dans les artères. Ces souris sont un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge (après pic de croissance et puberté).

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des ingrédients d'origine végétale censés réduire l'anxiété. Elles reçoivent le produit par la bouche une à deux fois par jour pendant quinze jours, puis passent une fois un test d'enfouissement défensif de vingt minutes, où l'anxiété se mesure à la façon dont l'animal enfouit un objet qu'il perçoit comme menaçant. Le porteur écrit qu'"aucune procédure n'engendrera de douleur", tout en déclarant l'ensemble du projet en souffrance modérée. Celles qui le peuvent seront réutilisées pour l'apprentissage des gestes techniques dans l'établissement, les autres tuées, au service de ce que le porteur décrit comme "un enjeu sociétal et économique majeur".

Objectifs

Les troubles anxieux et liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Selon l'American Institute of Stress, ce problème est à l'origine de 75 à 90% des nouvelles consultations médicales et de 60 à 80% des accidents de travail. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. Dans le cas de stress chronique, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente donc un enjeu sociétal et économique majeur.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans la lutte contre le stress et l’anxiété qui pourront être développés pour une utilisation chez l’Homme.

Procédures

Dans cette étude, un traitement sera administré une à deux fois par jour sur les 240 animaux vigiles (éveillés) par voie orale et ce jusqu'à 15 jours maximum. Un test comportemental sera réalisé une fois pendant 20 minutes sur ces 240 animaux pour évaluer les effets des traitements sur le stress et l'anxiété. Aucune procédure n’engendrera de douleur.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés par voie orale s’effectueront sur animal vigile, l’administration ne prend pas plus de 15 secondes par animal et ne nécessitent pas une anesthésie. De plus, l’administration orale sur animaux vigiles limite le risque de fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, n’est nécessaire et ne sera donc utilisée. Le test comportemental s’effectuera sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, pour ne pas perturber l’activité des animaux.

Devenir

Lorsque cela sera possible, les animaux seront réutilisés pour la formation aux gestes pratiques au sein de l’établissement. Tous les animaux non réutilisés seront mis à mort dans des conditions éthiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet, les études in silico (modélisation informatique) ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets sur l’anxiété d’un traitement. Le modèle rongeur est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre ces pathologies. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rongeur. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.

Raffinement

Les animaux auront dans leur cage d'hébergement plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la phase de test comportementale. Les expérimentateurs sont formés et habitués aux évaluations comportementales et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celle-ci. Les souris seront observées tout au long de la réalisation du test comportemental. Les traitements seront effectués sur animaux vigiles par du personnel entrainé ayant les compétences requises pour effectuer ces gestes et une observation régulière des animaux sera effectuée après la réalisation de chaque traitement. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons l'atteinte d’un de ces points limites, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé dans les tests défensifs visant à étudier les comportements de type anxieux. Dans cette étude afin d’être le plus représentatif possible nous utiliserons des souris des deux sexes. Les animaux utilisés seront des souris mâles de 10 semaines à l’arrivée au laboratoire et des femelles d'âge équivalent. Nous effectuerons notre modèle sur des souris adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles.