Rongeurs
Impact des macrophages sur la matrice extracellulaire tumorale et la réponse immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une tumeur greffée sous la peau du flanc, puis mesurée tous les deux jours pendant treize jours, 1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyses post-mortem, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 188 un niveau modéré. Selon les groupes, elles reçoivent jusqu'à trois injections d'un agent qui détruit leurs macrophages, ou cinq injections d'immunothérapie, et le porteur signale diarrhées, déshydratation et perte de poids pendant six jours dans un des modèles, ainsi qu'une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience. Le projet cherche à comprendre comment les macrophages modifient la matrice qui entoure la tumeur et gêne l'entrée des cellules immunitaires. Les souris employées sont génétiquement modifiées et les tumeurs greffées choisies pour leur résistance variable aux immunothérapies, le porteur jugeant la similitude des systèmes immunitaires humain et murin suffisante pour parler de modèle "idéal".
Objectifs
Au cours de la tumorigénèse, la matrice extracellulaire, qui constitue l’architecture de tout tissu, est profondément modifiée, contribuant à la progression tumorale en limitant l’accès des cellules immunitaires à l’intérieur de la tumeur, et en favorisant les métastases. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui peuvent avoir des effets pro- ou anti-tumoraux, et sont capables de modifier la matrice extracellulaire. Notre projet étudie dans un premier temps le rôle des macrophages dans la modification de la matrice tumorale, pour évaluer, à terme, leurs effets sur la réponse immunitaire naturelle et sous immunothérapie. En particulier, notre projet vise à comprendre comment les propriétés physiques de la matrice influencent l’infiltration des cellules immunitaires, et le rôle que jouent les macrophages dans ce processus.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à une meilleure compréhension du dialogue entre cellules tumorales, cellules immunitaires et matrice extracellulaire, 3 acteurs centraux de la tumorigénèse. Les modèles expérimentaux choisis permettront d’obtenir des connaissances fondamentales sur les tumeurs solides et la réponse immunitaire contre celles-ci. Ce projet pourrait permettre à terme d’améliorer les stratégies d’immunothérapies par anticorps ou cellules CAR-T.
Procédures
1-Greffe de cellules tumorales: 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis suivi de la croissance tumorale pendant 13 jours maximum (J3-5-7-9-11-13), sur maximum 1108 animaux 2- Injections d’un agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, 3 injections à J3-5-7 ou 9-11-13, sur maximum 458 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 3- Traitement par un autre agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, une injection à J3 ou à J9, sur maximum 96 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 4-Traitement d’immunothérapie (ou contrôle), non douloureux : une injection à J10-13-16-19-22 sur 160 animaux. 5-Traitement (ou contrôle), non douloureux, sous anesthésie générale : une injection à J10-11-12-13 sur 192 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes).
Impact sur les animaux
Nous injectons au niveau du flanc des souris des tumeurs sous-cutanées plus ou moins résistantes aux immunothérapies, puis déplétons ou non les macrophages. L’expérience dure entre 9 et 15 jours. Nos observations se font à des temps précoces de la tumorigénèse, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Le traitement pour la déplétion des macrophages peut provoquer des diarrhées et une déshydratation, pouvant entrainer une perte de poids pendant la durée de la déplétion dans un des modèles (6 jours)
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des études in vitro ont montré l’importance de la matrice extracellulaire dans la tumorigénèse. Afin d’évaluer l’effet des macrophages et de la matrice extracellulaire sur la réponse immunitaire, nous avons besoin impérativement de réaliser des expériences in vivo pour avoir une tumeur, un stroma et un système immunitaire complets.
Réduction
Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également de corréler les résultats des différentes analyses pour chaque tumeur et de pouvoir mieux analyser les raisons potentielles d’hétérogénéité inter-souris. Par ailleurs, certaines expériences ne seront réalisées que si les expériences précédentes donnent des résultats intéressants (différences de matrice extracellulaire et / ou d’infiltrat immunitaire).
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les animaux seront sacrifiés en cas d’atteinte des points limites. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. En cas d’inflammation cutanée ou de nécrose superficielle des tumeurs, de la crème hydratante et cicatrisante sera appliquée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et recherche en thérapeutique anti-cancéreuse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.
Evaluation de la tolérance induite par des antigènes en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins pour la prévention des troubles allergiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Sensibilisées à un allergène par doses répétées puis soumises à une épreuve allergique par voie orale, respiratoire ou cutanée, 5 000 souris vont être utilisées et toutes tuées après l'épreuve. 2 000 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 2 000 d'un niveau modéré, 1 000 d'un niveau léger. Le porteur décrit les effets attendus de l'induction de l'allergie, poils hérissés, baisse d'activité, hyperthermie ou hypothermie, signes neurologiques, troubles respiratoires et perte de poids. Il attend de ces candidats vaccins qu'ils permettent de "sauver des vies humaines dans le monde", et affirme que la tolérance induite ne s'évalue que sur un "organisme entier".
Objectifs
Les allergies sont des réactions d’hypersensibilité à des substances, appelées allergènes, présentes dans l’environnement et qui sont normalement inoffensives car tolérés par le système immunitaire. Les réactions peuvent être diverses, des plus bénignes aux plus sévères. Les allergies correspondent à une perte de tolérance envers ces substances. La tolérance immunitaire se définit par la capacité du système immunitaire à ne pas manifester de réaction agressive vis-à-vis de certains antigènes avec lesquels il a été au préalable en contact. Le projet s’organise en 2 étapes, le développement des modèles d’allergie et l’évaluation, sur l’animal, de l’efficacité d’un candidat vaccin contre les troubles allergiques alimentaires connues chez l’homme. 1/Mise en place des modèles d’allergie alimentaire dit de sensibilisation à l’allergènes : dans un premier temps des études seront réalisées pour établir les modèles animaux afin de représenter la maladie d’intérêt dite « allergique » par exemple l’allergie aux arachides. Ces études permettront de définir entre autres les doses d’allergène générant d’une part la sensibilisation à l’allergène et d’autre part la réaction d’hypersensibilité qui seront inoculées chez l’animal ou encore la voie d’administration. 2/ étude d’évaluation des vaccins anti-allergies Une fois ces modèles d’allergies établies, des études d’évaluation de la capacité d’un vaccin à restaurer la tolérance contre ces allergènes alimentaires seront effectuées. Pour cela, les animaux recevront le candidat vaccin dont l’efficacité sera mesurée par le degré d’efficacité induit contre l’inoculation de l’allergène.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont l’utilisation en essai clinique, et éventuellement la mise sur le marché, de différentes préparations vaccinales permettant de protéger efficacement les patients contre les troubles allergiques alimentaires et répondre aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin anti allergiques. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire dans le cadre d’hypersensibilité. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre les phénomènes croissants d’allergie alimentaire et de sauver des vies humaines dans le monde.
Procédures
Les études de tolérance consistent à administrer des vaccins dont la dose peut être unique ou multiple (un à six fois) sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve d’hypersensiblité par un allergène. La sensibilisation à l’allergène se fait par des doses répétées (deux à quatre fois). L'épreuve allergique est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve allergique en fonction du type d’allergie (orale, topique, respiratoire) peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). Dans le cas de l’induction de l’allergie, en fonction du protocole appliqué, les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyper/hypothermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%). Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après épreuve allergique afin d’évaluer la réponse immune. Les volumes sanguins prélevés nécessaires ou le prélèvement d’organes ne permettant pas le maintien en survie des animaux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques la réponse immunitaire ainsi que l'effet tolérogène doivent être évalués sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un traitement anti-allergique à induire une tolérance contre un allergène, et reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un allergène. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élaborent le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction de l’allergène, une grille d'évaluation des signes cliniques post-induction sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques de l’allergène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur décrites dans le module interne de formation aux manipulations. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés.
Choix des espèces
La souris est sélectionnée du fait des modèles d’allergie décrits dans la littérature et des connaissances scientifiques. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux, disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…).
Tests de molécules sur un modèle souris du syndrome d’Ondine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Les souris utilisées portent une modification génétique qui reproduit le syndrome d'Ondine et les empêche de respirer normalement, ce qui les expose à des épisodes d'hypoxie dès les premiers jours de vie. 2 028 souris vont être utilisées, 1 008 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 020 un niveau léger. Les nouveau-nés sont anesthésiés sur de la glace, séparés de leur mère, injectés, puis placés deux fois par semaine trente minutes dans une enceinte où l'air est enrichi en dioxyde de carbone, et les femelles gestantes reçoivent une injection. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme de tests portant sur cinq molécules mises au point par une société privée.
Objectifs
Dans le syndrome d’Ondine (encore appelé syndrome d’hypoventilation centrale congénitale), les patients présentent un dysfonctionnement central du contrôle nerveux responsable de la respiration automatique. Cela se traduit notamment par leur incapacité à respirer de façon autonome notamment durant les périodes de sommeil, nécessitant une assistance ventilatoire qui leur est vitale. Nommée en référence à la nymphe d’Ondine de la mythologie grecque, le syndrome d’Ondine est une maladie génétique rare dont l’incidence est de 1 pour 200 000 naissances vivantes en France et la prévalence estimée à 1/550 000. La caractérisation d'un nouveau modèle murin du syndrome d'Ondine a été réalisée sous une précédente autorisation de projet. Sa proximité physiopathologique avec l’Homme nous permet maintenant de l'utiliser comme un modèle préclinique en collaboration avec une société qui développe des traitements novateurs pour des patients souffrant de maladies neurologiques sévères. Notre expérimentation consistera à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules candidates mises au point en s’appuyant sur l'analyse de la survie et la comparaison de paramètres respiratoires entre deux lots d'animaux : animaux modèles du syndrome d'Ondine traités ou non
Bénéfices attendus
Les souris modèles du syndrome d’Ondine récaptitulent le phénotype des patients. La stimulation pharmacologique, via les molécules candidates, pourrait potentiellement améliorer la respiration de ces souris nouveau-nés, juvéniles ou adultes en restaurant une réponse à l’hypercapnie. Si une molécule candidate est efficace, nous souhaitons décrypter son mécanisme d’action au niveau de la commande centrale respiratoire. Nous souhaitons également investiguer ce mécanisme selon l’âge car certaines souris modèles du syndrome d’Ondine survivent et récupèrent naturellement une faible réponse à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre la pathologie et son mode d’action. Les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient constituer un socle de connaissances pour aider à la prise en charge de patients atteints du syndrome d’Ondine.
Procédures
Les nouveaux nés seront soumis à une anesthésie sur glace (1 fois, environ 5 min), des injections (une ou plusieurs fois, à déterminer selon l'effet des molécules), - les enregistrements respiratoire en condition normales ou d'air enrichi en CO2 (30 min, 2 fois par semaine), - Les femelles gestantes recevront une injection intra péritonéale ou sous cutanée (une seule fois, moins d'une minute)
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les P0-P5 sont : -hypoxie du au phenotype dommageable - du stress lié à la séparation de la mère, à l'induction de l'anesthésie, aux injections et aux enregistrements pléthysmographiques - de la douleur légère et ponctuelle liée aux injections Les nuisances pour les adultes sont un stress et une douleur légers et ponctuels liés aux injections.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet consiste en l’étude de traitements pharmacologiques sur une pathologie néonatale qui ne peut être reproduit en culture cellulaire car nous travaillons sur le système respiratoire. L’effet ainsi que la toxicité des molecules a déjà été vérifié au niveau cellulaire et doit maintenant être testé sur un système complexe vivant.
Réduction
Notre projet testera l'efficacité de 5 molécules prometteuses, sélectionnées parmi plusieurs molécules candidates. Nous avons choisi la technique d'analyse de la respiration permettant d’enregistrer les animaux longitudinallement et donc de réduire le nombre d’animaux. Par ailleurs, nous avons utilisé une approche statistique pour définir le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cagescomprenant 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. Après injection, un suivi rigoureux et précis sera réalisé, les nouveau-nés injectés seront mis sur un tapis chauffant et seront séparés le moins de temps possible de leur mère. Les femelles gestantes seront manipulées avec douceur seront prises à l’aide de leur enrichissement et non par prise physique directe. Des points limites précoces avec un arbre décisionnel ont été établis.
Choix des espèces
Les rongeurs sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire. Les modèles de souris génétiquement modifiés permettent de modéliser les variants rencontrés chez les patients. Le modèle murin est donc actuellement le modèle le plus adapté à l’étude de cette pathologie. Dans la grande majorité des cas, le syndrome d’Ondine se révèle dès la naissance. Le diagnostic est réalisé chez le nouveau-né, dès ses premiers jours de vie. Nous souhaitons donc utiliser les souris modèles du syndrome d'Ondine dès la naissance. En effet, si une molécule candidate est efficace, notre approche sera transférable à l'homme.
Induction de la production d’anticorps après immunisation chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Troubles immunitaires
2 100 souris vont être utilisées, chacune recevant cinq injections d'un fragment de protéine avec adjuvant puis dix prélèvements de sang sous anesthésie, sous la mâchoire ou derrière l'œil. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer environ 1 millilitre de sang, volume que le porteur juge nécessaire à ses tests. L'adjuvant peut provoquer des abcès au point d'injection, et les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Sur le nombre d'animaux, le porteur écrit seulement que "les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés", sans donner le calcul qui conduit à 2 100.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'identifier des fragments de protéines dont l'expression est impliquée dans des maladies inflammatoires chroniques et/ou la progression de certains cancers. Nous espérons identifier des fragments de protéines induisant la production d'anticorps dans le but, par la suite, de tester leur efficacité dans des modèles animaux de maladies inflammatoires chroniques ou de cancers ce qui entrainerait à terme un élargissement de l'offre thérapeutique pour les patients.
Bénéfices attendus
Élargissement de l'arsenal thérapeutique des patients dans les maladies inflammatoires chroniques et/ou la progression de certains cancers.
Procédures
Tous les animaux subiront 5 injections d'une durée inférieure à 1 minute (contention + piqure), réalisées sur animaux vigiles. Dix prélèvements sanguins (sub-jugulaires et rétro-orbitaires) seront réalisées sous anesthésie générale. L'anesthésie sera de courte durée (anesthésie + prélèvement sanguin, temps inférieur à 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des injections pouvant causer un stress et une douleur légère de courte durée. L’utilisation de l’adjuvant peut entrainer la formation d’abcès au point d’injection. Afin de réaliser les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress et une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer une quantité de sang d'environ 1 mL, volume nécessaire à l'ensemble des tests prévus.
Remplacement
Les fragments de protéines sont sélectionnés en amont par le biais d'outils informatiques adaptés avant toutes expérimentations chez l'animal.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnemen enrichi. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été déterminés. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Afin de développer des vaccins thérapeutiques contre les maladies inflammatoires chroniques et/ou la progression du cancer chez l'Homme, les traitements développés doivent préalablement être validés chez l'animal. La souris est un mammifère de choix classiquement utilisé dans la littérature pour les études de production d'anticorps. Il est nécessaire que l'animal soit adulte (âge supérieur à 5 semaines) afin que le système immunitaire soit mature.
Evaluation d’une nouvelle génération de microbulles pour la délivrance de médicaments dans le cerveau de rat par sonoporation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, chaque animal étant tué avant tout réveil. Chacun reçoit cinq injections, dont celles de microbulles de gaz et d'un colorant, avant une exposition du cerveau aux ultrasons de trente secondes, et il est tué une heure plus tard pour mesurer la quantité de colorant passée dans le tissu cérébral et l'étendue des microhémorragies. Le projet compare quatre solutions de bulles de taille unique, l'application aux tumeurs cérébrales et aux maladies neurodégénératives restant une perspective. Le porteur décrit des mesures acoustiques et un modèle cérébral en trois dimensions déjà réalisés, et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du système cérébrovasculaire.
Objectifs
A ce jour, la délivrance de médicament dans le cerveau par ultrasons exploite principalement des solutions de bulles de gaz de taille très hétérogène. Lorsque nous appliquons une séquence ultrasonore donnée sur une telle population de bulles, nous constatons que nous activons seulement une fraction de ces bulles, limitant ainsi l’efficacité de la délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons. De plus, leur utilisation ne nous permet clairement pas de distinguer les deux principaux régimes ultrasonores responsable de la perméabilisation des tissus, à savoir celui qui est considérée comme le plus sûre pour les tissus et le régime, qui endommagerait les tissus. Dans ce contexte, nous proposons d’exploiter des bulles de taille unique. En effet, nos données préliminaires in-vitro ont montré qu’utiliser de telles bulles permet de solliciter l’ensemble de la population de bulles et de mieux contrôler les deux régimes ultrasonores précédemment cités. Ce projet vise à : Objectif 1 - Évaluer 4 solutions de bulles de taille unique à perméabiliser efficicament le tissu cérébral, en mesurant l’accumulation d’un colorant par histologie, et sans induire des dommages tissulaires (microhémorragies tissulaires), qui seront analysés en histologie, 1 heure après traitement. Objectif 2 - Comparer cette efficacité et cette inocuité à celle d’une solution de bulles de taille très hétérogène.
Bénéfices attendus
Les ultrasons ont émergé comme une stratégie prometteuse de délivrance intracérébrale de médicaments. Cependant, l’utilisation de bulles de gaz de différentes tailles ne permet pas de toutes les activer dans un régime ultrasonore pour assurer une délivrance sûre et efficace de médicaments par ultrasons. L’exploitation de bulles de taille unique pourrait ainsi permettre de contourner les limitations des bulles de différentes tailles et de développer ainsi des protocoles de délivrance sûre et efficace de médicaments dans le cerveau par ultrasons pour le traitement de tumeurs cérébrales et de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Procédures
• Injection de la solution anesthésique, de la solution analgésique, du liquide physiologique, de bulles de gaz, de colorant – 5 injections - 2 min • Exposition du cerveau aux ultrasons – 30 s
Impact sur les animaux
Nuisance 1 – Manipulation des animaux est une source de stress. Nuisance 2 – Positionnement des animaux dans le cadre d'expérimentation est une source de stress. Nuisance 3 – Le point d’injection de la solution d’anesthésie est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 4 – Le point d’injection du liquide physiologique, de bulles de gaz et du colorant est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 5 – Perméabilisation du tissu cérébral est une source de stress. Nuisance 6 – Le point d’injection de la solution d’analgésie est susceptible d'être douloureuse.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort 1h post-injection de la solution de colorant afin de quantifier le colorant dans le tissu cérébral et de mesurer la présence de dommages tissulaires.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons caractérisé et comparé des solutions de bulles de gaz de taille unique et de taille hétérogène sur des bancs de mesures acoustiques. Nous avons ensuite validé leurs propriétés à perméabiliser le tissu cérébral sur un modèle 3D in-vitro. Ces deux approches ont permis de réduire le nombre de paramètres acoustiques et la concentration et la taille de bulles. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer la perméabilisation du tissu cérébrale par ultrasons en exploitant des bulles de taille unique in-vivo. Par conséquent, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d’étude in-vitro ou in-silico car à ce jour, aucun modèle d’étude in-vitro ou in-silico ne peut reproduire la complexité d’un système cérébrovasculaire in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures, cette étude nécessite 96 rats. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer l’efficacité de la délivrance intracérébrale de colorant et l’innocuité de la procédure. Par rapport au groupe contrôle, il sera considéré comme significatif : 1) Une augmentation de 20% de la quantité de colorant dans le tissu cérébral et 2) Une augmentation de 10% de la quantité de dommages tissulaires (microhémorragies cérébrales).
Raffinement
Le stress des animaux est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Lors de la semaine d’acclimatation, l’habituation à la préhension/contention en renforçant nos actes sera réalisée par l’administration de friandises. Ils seront hébergés en groupe (2/cage) avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant). Les animaux seront observés une fois pour jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soins seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Après une semaine d’acclimatation, les rats seront anesthésiés par une injection d’une solution d’anesthésie et placés dans une boîte pendant 5 min. Dès que les rats auront des signes d’endormissement, ils seront sortis de la boîte et placés sur une couverture chauffante dans un cadre d'expérimentation. Une protection occulaire sera appliquée. La respiration (capteur électronique), la température (sonde endorectale) et le poids (balance) seront mesurés pendant les procédures. Sous anesthésie générale, les animaux seront mis à mort par injection d’un agent euthanasiant vétérinaire.
Choix des espèces
Dans la littérature et dans notre laboraoire, les rats âgés de 6 semaines, physiologiquement mâture sont couramment utilisés pour le développement de protocole de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons en raison de l’existence de modèles rongeurs de cancers cérébraux, de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Formation réglementaire à la Chirurgie Expérimentale appliquée aux rongeurs
- Formation professionnelle
Tuées par injection létale à la fin du second geste chirurgical, sans avoir été réveillées, 260 souris de réforme vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une biopsie de peau de 4 millimètres avec deux points de suture, se réveille, puis retourne sur la table moins de vingt-quatre heures plus tard pour l'ablation de la rate ou la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, gestes exécutés par des stagiaires. Le porteur qualifie les effets indésirables attendus de "très limités" et les ramène à l'inconfort d'une plaie de petite taille si les sutures lâchent. La finalité tient à l'obligation réglementaire de former les personnels, formation agréée par le ministère de l'Agriculture dont une partie des exercices se fait sur cuisse de poulet.
Objectifs
La réglementation encadrant l'utilisation des animaux à des fins scientifiques impose la formation de tous les personnels impliqués avec une formation spécifique en chirurgie pour les personnels concevant ou réalisant des procédures chirurgicales. Ce projet répond aux exigences réglementaires de formation des personnels et a reçu un agrément du Ministère de l'Agriculture. Elle vise à initier les personnels aux bases de la chirurgie.
Bénéfices attendus
Etre sensibilisé et initié aux bonnes pratiques chirurgicales est essentiel, et obligatoire d'un point de vue réglementaire, pour concevoir ou mettre en oeuvre des actes de chirurgicaux dans le cadre de projets utilisant des animaux à des fins scientifiques ou éducatives. Cette initiation passe par une formation réalisée par des experts (vétérinaires et ingénieurs/techniciens compétents) et doit être complétée ensuite par un encadrement adapté pour la mise en oeuvre d'une procédure chirurgicale en particulier dans le cadre d'un projet autorisé. Cette formation n’a pas vocation à transformer les stagiaires en chirurgiens accomplis mais doit leur permettre d'acquérir les notions élémentaires et les gestes de base fondamentaux pour réaliser une procédure chirurgicale et une prise en charge per-opératoire adaptées. Les bénéfices attendus de ce projet sont ceux découlant des objectifs de toute formation en chirurgie : éduquer et former sur les bases fondamentales en chirurgie et sur la prise en charge per-opératoire afin de minimiser les risques de douleur, inconfort ou souffrance des opérés. Cette formation participe à la bien- taitance des animaux utilisés à des fins scientifiques.
Procédures
Les ateliers proposés dans cette formation sont l’anesthésie, l’analgésie, l'asepsie, les points de suture et sont mis en application à travers une expérience chirurgicale simple et peu invasive : la réalisation d'une biopsie cutanée de 4 mm2 sur animal anesthésié (anesthésie générale et locale associée à une analgésie) avec réveil de l'animal. L'intervention chirurgicale dure environ un quart d’heure. La majeure partie du temps de cette procédure est consacrée à la préparation de l'animal (Anesthésie, tonte, désinfection, préparation du chirurgien et du matériel). Dans les 24 heures suivant le réveil, une deuxième chirurgie plus invasive (ablation de la rate ou la pose d'un cathéter à la veine jugulaire qui est une veine superficielle) est réalisée sous anesthésie générale et analgésie appropriée (temps chirurgical estimé à une demi heure ) sans réveil de l'animal qui reçoit une injection létale en fin de chirurgie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress léger lié à la préhension /contention et à l'injection pour l'administration de l'anesthésie .Les effets indésirables attendus sur les animaux sont légers et liés à la biopsie cutanée. Le choix des gestes mis en oeuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) et en minimisant l'impact pour les animaux. C'est pour cela qu'une biopsie cutanée est proposée (degré de contrainte léger attendu, pas d'ouverture de cavité abdominale ou thoracique) avec réveil des animaux puis le lendemain réalisation d'une intervention sans réveil : avec une incision latérale mineure pour l'ablation de la rate ou d'une intervention sans ouverture de cavité anatomique pour la pose de cathéter à la veine jugulaire, avec suivi de l'anesthésie et analgésie adaptée et sans réveil des animaux. Les effets indésirables attendus sont donc très limités et pourraient correspondre à l'inconfort d'une éventuelle plaie cutanée de petite taille (4 mm de diamètre) si les 2 points de sutures réalisés par les stagiaires lachaient dans les 24 heures suivant l'intervention. Le protocole anesthésie pour l'ablation de la rate ou la mise en place du cathéter comporte un antalgique et la dose d'anesthésique est adaptée pour la durée de l'intervention attendue qui dure moins d'une heure.
Devenir
Les interventions réalisées sur les animaux par des personnels en formation ne permet pas de garantir un confort de vie aux animaux. Le choix d’euthanasier les animaux encore anesthésiés à la fin d'un geste opératoire est donc fait pour éviter tout risque d'inconfort post-chirurgical. De plus les animaux utilisés dans cette formation sont des animaux de réforme de l'animalerie, c'est-à-dire ne pouvant pas être utilisés dans un projet ou replacés.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux et une mise en situation des participants sont attendues pour l'agrément des formations à la chirurgie expérimentale. Une partie des travaux pratiques est réalisée sur supports inertes (blanc ou cuisse de poulet) et préalablement aux interventions réalisées sur animaux anesthésiés. Il y a donc un remplacement "partiel" de l'animal avec ces étapes pratiques préalables qui permettent aux stagiaires d'acquérir une certaine assurance et automatisme des gestes avant leur mise en oeuvre sur animaux vivants et anesthésiés, limitant ainsi la contrainte pour l'animal qui serait liée à un geste technique mal exécuté. Cette étape permet à la fois un remplacement, une réduction du nombre total d'animaux utilisés et une réduction des contraintes pour les animaux.
Réduction
L'entrainement aux gestes de suture se fait sur matière inerte afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et pour limiter les contraintes imposées aux animaux pendant la formation. C'est pour cela qu'une intervention mineure est réalisée (punch biopsie cutanée) avec un réveil, suivi d'une intervention plus invasive sur le même animal qui ne sera pas réveillé à la suite de cette deuxième intervention. Ainsi un seul animal par expérimentateur sera utilisé, sachant que ces animaux sont des animaux de réforme de l’animalerie n’ayant subi aucune procédure autre qu'une identification et génotypage. Au total 260 souris seront utilisées.
Raffinement
Comme tous les autres animaux de l’animalerie ils sont suivis quotidiennement pour évaluer leur comportement général. Le choix des gestes mis en œuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) tout en minimisant l'impact pour les animaux. Les actes chirurgicaux réalisés sont peu invasifs: une biopsie cutanée associée à deux points de suture et une chirurgie simple d'ablation de la rate avec une incision cutanée de petite taille et sont réalisés sous anesthésie générale et locale en associant un antalgique. Ils sont maintenus sur un tapis chauffant thermostaté pendant toute la durée de l'anesthésie afin de limiter le risque d'hypothermie lié à l'anesthésie. Les animaux sont réveillés uniquement après la biopsie cutanée et sont suivis pendant leur réveil. Ils sont maintenus réveillés moins de 24 heures avant d’être de nouveau anesthésiés pour un deuxième acte chirurgical plus technique (ablation la rate ou mise en place d'un cathéter sur la veine jugulaire qui est superficielle) sans réveil cette fois. La deuxième intervention étant réalisée dans les 24 heures suivant la biopsie cutanée, la durée d'un inconfort potentiel post-opératoire reste limitée en intensite et en durée et les animaux ne sont pas réveillés à l'issue de la deuxième chirurgie. Les chirurgies sont réalisées sur les animaux après un entraînement des stagiaires leur permettant d'acquérir une assurance dans la maitrise de leurs gestes avant de les appliquer sur l'animal anesthésié. Cet apprentissage est encadré par des vétérinaires.
Choix des espèces
La souris représente l'espèce la plus utilisée à des fins scientifiques (68 pour cent des animaux selon les statistiques Ministère de la Recherche en France). La mise en application des gestes basiques de chirurgie sur la souris correspond à la majorité des situations rencontrées par les expérimentateurs qui réaliseront des actes de chirurgie dans leurs projets. Nous utiliserons des souris adultes de 6 à 8 semaines d'âge. Le stade de développement de ces animaux est largement utilisé dans la recherche in vivo et leur taille, à ce stade, est optimale pour la réalisation des gestes chirurgicaux décrits dans les procédures de ce projet.
Étude du rôle du système neurovasculaire méningé sur la clairance cérébrale dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 310 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement des tissus, dont 810 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les lots, elles subissent une chirurgie du cou pour boucher des veines, une ou deux injections dans une zone précise du cerveau, et jusqu'à trois heures d'anesthésie par intervention, avec des risques de lésions de la cornée et de chute de température. Le porteur compte dans cet effectif les souris consacrées à l'entraînement des opérateurs. Il affirme que les organoïdes ne reproduisent ni la régulation du flux veino-lymphatique ni les réponses physiologiques globales, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans l’enveloppe la plus externe du cerveau, appelée dure-mère. Ils sont aujourd’hui considérés comme jouant un rôle important dans certaines maladies neurologiques. Situés en dehors du tissu cérébral, ces vaisseaux suivent le trajet de certains vaisseaux sanguins dans cette enveloppe. Des études ont montré que la circulation sanguine dans le cerveau peut influencer leur bon fonctionnement ainsi que l’élimination des liquides présents autour du cerveau. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces vaisseaux lymphatiques et de la circulation sanguine dans l’élimination de certaines substances produites par le cerveau, dont l’accumulation est impliquée dans plusieurs maladies dégénératives. Pour cela, deux approches seront mises en œuvre chez la souris : -Une première approche consistera à modifier l’activité des vaisseaux lymphatiques en injectant une substance dans le liquide entourant le cerveau. -La seconde approche visera à réduire le flux sanguin du cerveau en occluant certains vaisseaux veineux du cou. Ces modèles permettront d’étudier l’élimination des déchets cérébraux en utilisant des traceurs injectés soit dans le liquide qui entoure le cerveau soit directement dans le cerveau. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ce système d’élimination et leur lien possible avec les maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Le drainage des fluides cérébraux joue un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en permettant l’élimination de substances qui, si elles s’accumulent, peuvent devenir nocives. Ce processus contribue notamment à limiter l’apparition de certaines maladies liées au vieillissement. Des structures situées autour du cerveau, comme certains vaisseaux sanguins et lymphatiques, participent activement à ce mécanisme de nettoyage. Bien que leur implication ait déjà été mise en évidence, les interactions précises entre ces systèmes restent encore mal comprises. En étudiant plus en détail leur rôle, ce projet vise à mieux comprendre les processus d’élimination cérébrale et à explorer de nouvelles pistes pour améliorer ce mécanisme. À terme, cela pourrait ouvrir la voie à des approches innovantes pour retarder ou limiter le développement de certaines pathologies neurologiques.
Procédures
Un premier lot d’animaux aura une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum) puis recevront ensuite une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau (une fois, 3h d’anesthésie maximum). Un deuxième lot aura une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum). Un troisième lot aura deux injections avec un intervalle de 4 semaines, au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 ou 3 heures d’anesthésie maximum par intervention). Un quatrième lot aura deux injections avec un intervalle de 16 jours au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum, réalisée 2 fois), et dans l’intervalle une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une ou plusieurs interventions chirurgicales au niveau du cou ou du cerveau qui peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires chez les animaux, notamment dans les deux jours suivant l’opération. Des signes comportementaux inhabituels tels que l’agitation, la prostration ou une mobilité réduite peuvent être observés à court terme. Il est également possible d’observer des effets secondaires oculaires : gêne oculaire, lésions de la cornée. Enfin, il existe des risques liés à l’anesthésie générale tels que la baisse de température corporelle, sécheresse oculaire ou rares réactions cardio-respiratoires.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet. L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire et le drainage des fluides cérébraux, nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques globales à une altération fonctionnelle. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
Pour répondre aux exigences du plan expérimental, un total de 1310 souris sera nécessaire. Ce nombre prend en compte plusieurs facteurs, notamment les différentes procédures à réaliser, les analyses post-mortem, les risques de perte liés aux chirurgies, ainsi que les souris requises pour l'entraînement et la formation des opérateurs afin de garantir des interventions standardisées et maîtrisées. Un calcul de puissance statistique rigoureux a été effectué pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires par groupe, en tenant compte des variations expérimentales attendues et des hypothèses formulées. Ce calcul vise à minimiser autant que possible le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus. Ainsi a été défini qu’un nombre minimal de 10 à 15 souris par groupe serait nécessaire pour chaque condition ou type d’analyse. Par ailleurs, ce nombre pourra être ajusté en fonction des résultats intermédiaires obtenus au cours de l’étude. Ces analyses intermédiaires permettront d’évaluer la nécessité de poursuivre certains volets expérimentaux ou, au contraire, de réduire le nombre d’animaux requis, en optimisant les procédures en fonction des données déjà collectées. Pour l’analyse des données, nous utiliserons des tests diagnostiques adaptés aux caractéristiques des échantillons et à leur distribution statistique, afin d’assurer une interprétation précise et rigoureuse des résultats. Cette approche garantit une utilisation raisonnée et éthique des modèles animaux tout en maximisant la qualité scientifique des conclusions.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée, en groupe et avec un accès à un enrichissement de leur environnement (matériaux de nidification et bâtonnets de bois à ronger). Les paramètres environnementaux, tels que la lumière, la température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Ils auront un accès permanent à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Ils seront observés quotidiennement et toute anomalie sera consignée et transmise à l’équipe de recherche, au vétérinaire et à la structure chargée du bien-être animal pour la mise en place d’une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Nous maintiendrons la température des animaux tout au long de leur anesthésie et appliquerons un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Une injection de sérum physiologique sera également réalisée pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Nous assurerons une surveillance renforcée dans la période post-opératoire ou après les prélèvements sanguins afin de nous assurer de la bonne récupération des animaux. En post-opératoire nous utiliserons un cahier opératoire qui sera rempli le jour de l’intervention, consignant les observations per-opératoires et post-opératoires immédiates, ainsi que les suivis à un, deux et huit jours après la chirurgie. Nous utiliserons également une grille de surveillance pour évaluer la douleur et détecter toute atteinte de points limites. Ce suivi permettra de détecter tout signe de stress ou de douleur
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent au nettoyage naturel du cerveau, en éliminant certains composés qui peuvent s’y accumuler. Pour cela, un modèle animal est nécessaire. Des souris seront utilisées, car ce modèle est bien adapté à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral y sont maîtrisées. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures expérimentales seront menées sur des souris adultes âgées de 2 mois à 1 an, une période durant laquelle la croissance de la boîte crânienne est achevée, permettant une précision optimale lors des interventions, et où la taille corporelle favorise de bonnes conditions opératoires. Cet âge garantit également que certaines structures impliquées dans la circulation des fluides cérébraux sont encore pleinement fonctionnelles. Tous les animaux seront identifiés par tatouage (au niveau des phalanges) dès leur arrivée au laboratoire, à un âge minimal de 6 semaines.
Effet de deux mutations dans un gène impliqué dans le développement cérébral chez la souris EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie pendant une trentaine de minutes pour une électroporation in utero qui modifie le cerveau des embryons qu'elles portent. 288 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées, les souriceaux pour prélèvement de tissus, les femelles opérées parce que le porteur écarte une seconde intervention "pour raison éthique", les reproducteurs âgés faute de possibilité de replacement. Deux mutations d'un gène du développement cérébral produisent chez ces souris des défauts de comportement social que le porteur rapproche des troubles du spectre autistique. Il indique que les tests de comportement social sont bien établis dans cette espèce, sans nommer un seul de ceux qu'il emploiera.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris. Le projet nécessite une prolongation dans son exécution sans ajout d’animaux et un changement des deux Etablissements Utilisateurs (MODIFICATION).
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.
Comparaison de deux méthodes pour étudier la fonction gastro-intestinale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Le gavage par sonde gastrique remplacé par une bille sucrée à avaler seule, 48 souris vont être utilisées pour comparer les deux méthodes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chacune est mise à jeun douze heures à deux reprises, isolée six heures à deux reprises, contentionnée et gavée, et subit une biopsie de l'oreille. Toutes sont tuées à la fin pour prélèvement d'organes. Le porteur inscrit ce travail dans une démarche d'amélioration du bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'il est "indispensable" de décrire au préalable la méthode la moins invasive.
Objectifs
La motilité gastro-intestinale (GI) est un processus physiologique complexe permettant la progression des aliments dans le tube digestif. Ce mécanisme est essentiel pour assurer les fonctions GI. Des perturbations de cette motilité sont fréquemment observées dans les maladies GI mais pas seulement. Actuellement, les expériences de mesure du transit intestinal chez les souris de laboratoire constituent le principal modèle d’étude pré-clinique pour la motilité intestinale. Ces études se basent sur des expériences au cours desquelles les animaux ingèrent un composant coloré, puis sont observés jusqu’à obtention de la première fécès colorée. Dans la majorité des cas, l’ingestion du composant coloré se fait par gavage à l’aide d’une sonde gastrique. Cela nécessite de contentionner correctement l’animal et de maitriser le geste nécessaire à l’insertion de la sonde. Ces manipulations sont généralement sources de stress pour l’animal et pour l’expérimentateur. Il semble cependant possible de s’affranchir de ces contraintes, en fabriquant (à partir de rouge carmin, d’agar et de sucrose) des croquettes que les souris vont manger spontanément. L’objectif du projet est de comparer les résultats obtenus et leur reproductibilité en fonction de la méthode utilisée (gavage gastrique ou prise spontanée), et de déterminer si la prise spontanée peut se substituer au gavage par sonde.
Bénéfices attendus
Si les données en prises spontanées sont fiables et reproductibles, ce projet permettra de s’affranchir des contraintes liées au gavage gastrique par la suite. Ce projet s’inscrit dans la démarche d’amélioration du bien-être animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à: mise à jeun (2 fois, 12h) ; contention et gavage (1 fois, moins d'une minute) ; un isolement (deux fois, 6h). La biopsie est un geste qui consiste à prélever un petit morceau de tissu, ici au niveau de l’oreille.
Impact sur les animaux
Risque (faible) l'inflammation/infection consécutif à la biopsie : traitement local Risque de fausse route lors du gavage : mise à mort immédiate de l'animal Stress lié à la contention et à l'isolement Perte de poids lié à la mise à jeun
Devenir
A l'issue de projet, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
De nombreuses pathologies présentent des deficits au niveau du transit intestinal. Les modèles de ces pathologies sont majoritairements des modèles souris. C’est pourquoi afin d’utiliser ce symptome comme marqueur d’efficacité dans les traitements pré-cliniques il est indispensable d’en d’écrire au préalable la méthodologie la plus appropriée et la moins invasive pour aller mesurer la durée du transit.
Réduction
Les animaux utilisés pour ce projet sont issus du surplu d’animaux sains obtenus dans les croisements nécessaires à l’obtention d’animaux expérimentaux dans d’autres projets menés. Afin de diviser par deux notre nombre d’animaux nécessaire nous avons choisis de mesurer la durée du transit avec les deux méthodes pour chaque animal. Les données obtenues feront l’objet d’une évaluation statistique préliminaire. A ce moment là, si la différence est suffisament importante et montre une différence statistique nous n’augmenteront pas le nombre d’animaux à passer en expérimentation.
Raffinement
L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit. La manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress. Une période d’habituation à l’expérimentateur est prévue. En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Le rouge carmin est un colorant non toxique utilisé chez l’homme pour étudier la durée du transit intestinal en médical. Nous avons mis au point un système de vidéo pour surveiller les animaux à distance sans avoir à les déranger lors de l’expérimentation. Suite à la restriction de nourriture durant 12h, une attention particulière sera portée sur le poids des animaux dans les jours qui suivent la session de mesure du transit. Pour ce projet, des points limites stricts et spécifiques ont été définis. En cas de besoin, des antalgiques de type anti inflammatoires pourront être administrés aux animaux.
Choix des espèces
De nombreuses pathologies présentent des deficits au niveau du transit intestinal. Les modèles d’études de ces pathologies sont souvent des modèles souris. C’est pourquoi afin d’utiliser ce symptome comme marqueur d’efficacité dans les traitements pré-cliniques il est indispensable d’en d’écrire au préalable la méthodologie la plus approprié pour aller mesurer la durée du transit. Aucun modèle in vitro ne permet de décrire la motilité intestinale dans sa physiologie complète. Les animaux seront utilisés à 50 jours de vie et à 100 jours de vie. Nous avons opté pour un stade juvénile et un stade adulte car la physiologie animale change entre ces deux périodes de vie et il est possible que nous observions des différences. De plus les symptômes gastro-intestinaux ne s’exprimment à différents stades suivant la pathologie. De ce fait, nous choisissons de couvrir les deux stades majeurs.
Maintien et caractérisation de souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle de l’inflammation dans un modèle de pathologie de la prostate. 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Issues de l'élevage de lignées génétiquement modifiées réparti sur deux établissements, 6 336 souris vont être utilisées, 280 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 6 056 d'un niveau léger. Tous les nouveau-nés subissent une biopsie de la queue pour le génotypage, et une partie reçoit des injections dans le ventre tous les dix jours pendant huit semaines, ou un gavage quotidien pendant vingt-huit jours, geste dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage. Seuls les mâles entrent en procédure, les femelles qui ne servent pas à la reproduction étant tuées, comme les animaux dont le génotype ne présente pas d'intérêt pour l'étude. Le porteur affirme qu'aucun système ne reproduit l'hyperplasie de la prostate ni la dynamique des cellules immunitaires dans l'organe, et juge le recours à la souris "indispensable" après des essais préliminaires sur cellules.
Objectifs
L’hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) est une maladie touchant un homme sur deux à l’âge de 50 ans et près de 100% à 80 ans. Le nombre de patient est destinée à augmenter avec le vieillissement de la population. Malgré sa fréquence, cette maladie inflammatoire reste méconnue et peu de traitements sont actuellement disponible. Récemment, il a été montré qu’une molécule était impliqué dans le développement de cette maladie et qu’elle était associée à l’inflammation. Cette étude a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’inhibition de différents composants de l’inflammation et de cette molécule en comparaison avec le traitement actuel. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Afin de trouver de nouvelles approches thérapeutiques, il est nécessaire d’identifier les facteurs impliqués dans le développement de la maladie. Ce projet permettrait de définir, in vivo, chez la souris, si l’inhibition de ce facteur ou de composants de l’inflammation limiterait le développement de la maladie. Dans un second temps, nous comparerons ces approches thérapeutiques au traitement actuel donné aux patients. Enfin, si les résultats sont positifs, nous mesurons le potentiel effet bénéfique d’une approche combinée de nos candidats avec le traitement actuel.
Procédures
Dans les deux établissements utilisateurs, tous les nouveau-nés subiront une biopsie caudale de 1 à 2 millimètres. Une partie des animaux subiront soit des injections intra-péritonéales (de quelques secondes) tous les dix jours durant 8 semaines ou quotidiennement durant 28 jours ; soit des traitements par gavage (de quelques secondes) tous les jours pendant 28 jours.
Impact sur les animaux
Certaines souris sont immunodéficientes et ont un risque infectieux plus élevé. La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une légère souffrance chez l’animal. Les injections intra-péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Le gavage répété comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivé de la solution dans le poumon entrainant des signes de détresse respiratoire.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort. Quelques femelles seront utilisées pour les accouplements puis mises à mort. Les autres femelles non gardées seront mises à mort. Parmi les animaux générés, seuls les mâles iront en procédure. Au sein des mâles, chaque animal sera mis à mort suite à un génotypage ne présentant pas d’intérêt pour l’étude, à des prélèvements post-mortem, à un score supérieur ou égal à 4 de la grille de score de points limites, un score maximal dans un seul des points limites, à la fin de la durée de traitement prévue.
Remplacement
Selon le principe du Remplacement, des études préliminaires ont été menées sur des modèles cellulaires in vitro afin d’évaluer la pertinence et la durée des traitements choisis. Pour répondre à nos questions, l’utilisation de modèles de souris est indispensable car aucun système ne permet de reproduire le développement de l’hyperplasie bégnine de la prostate ni les interactions avec les différentes cellules immunitaires qui ont une grande dynamique au sein d’un même organe et dans le corps.
Réduction
Selon le principe de réduction, le nombre d’animaux utilisé a été calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes.
Raffinement
Tous les animaux sont maintenus en groupe sociaux dans un environnement enrichi. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis selon des grilles de score. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologies. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests sur modèles cellulaires et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car il reproduit fidèlement la pathologie étudiée et nous permet d’essayer de la traiter.
Infestation expérimentale de souris par la forme larvaire d’Echinococcus multilocularis
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
Identifiées par une puce sous la peau, anesthésiées, puis infestées dans l'abdomen par la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, 500 souris voient la masse parasitaire grossir pendant cinq mois au moins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées chaque mois puis chaque semaine jusqu'à un poids limite de 65 grammes, et le porteur indique que la masse abdominale finit par gêner leur locomotion. Une ulcération de la peau du ventre frottant contre la cage entraîne la mise à mort immédiate. Les autres sont tuées pour récolter le parasite, qui servira à infester des renards en captivité et à produire des œufs.
Objectifs
L’échinococcose alvéolaire due à une infection par le parasite Echinococcus multilocularis est une maladie rare en France. Cependant, elle est fatale si non traitée et nécessite un traitement quotidien à vie qui peut entrainer des effets secondaires importants. La longue période asymptomatique (5-10 ans) rend extrêmement difficile l’identification des sources de contamination (contact avec carnivore, sol, aliments souillés, …) par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques excrétés dans l’environnement par les carnivores infestés. La disponibilité de matériel biologique du stade larvaire du parasite permet notamment l’infestation de renards. La production de fèces de renards contenant des œufs est indispensable pour la mise au point, validation et matériel de référence pour la réalisation d’analyses de diagnostic chez l’animal dans le cadre de la surveillance du parasite mais aussi la détection de la contamination environnementale et alimentaire ainsi que l’évaluation de la viabilité des œufs dans ces matrices ou le test de molécules en vue d’améliorer le traitement chez l’humain. L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat du parasite Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires afin de pouvoir disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire des larves parasitaires pour les infestations de renards (hôtes définitifs).
Bénéfices attendus
L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à la contamination de l’homme par ce parasite. Les larves de parasite produits permettront de compléter, suite à l’infestation des renards en captivité, le cycle parasitaire d’Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.
Procédures
identification par puce sur animaux anesthésiés par voie sous-cutanée :
Impact sur les animaux
L'infection par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. En cas d’ulcération cutanée lié aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage les animaux seront immédiatement mis à mort.
Devenir
L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la masse parasitaire.
Remplacement
Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour produire des protoscolex en laboratoire, en dehors de l’infestation des hôtes intermédiaires.
Réduction
Le projet utilisera environ 100 souris par an, soit 500 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de développement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de larves parasitaires qui est d’environ 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des trois souches larvaires de répéter l’infestation tous les trois/quatre mois sur des lots d’environ 15 souris. Aucune analyse statistique n'est prévue.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois dans les cages... Les animaux sont surveillées tous les jours et seront pesés mensuellement jusqu’à 3 mois, puis à partir du 4eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 65 gr. De la nourriture et de l'hydrogel seront disposés au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Une anesthésie par isoflurane est assurée pour les infestations par voie intra-péritonéale. Une grille de score est mise en place pour vérifier l'atteinte des points limites définis dans le projet, et l'atteinte d’un score supérieur ou égal à 60, entrainera l’administration d’un analgésique dans l’eau de boisson.
Choix des espèces
Les hôtes intermédiaires du parasite Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement les campagnols. Comme il n'existe pas de méthode alternative pour produire des parasites, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le développement de la forme larvaire. Les animaux seront commandés au stade adulte et au poids de 30-35 gr.
Etude du rôle de la protéine auxiliaire β3 des canaux sodium dépendant du potentiel (NaVβ3) dans la réponse aux variations de pression et de flux (modification 2 )
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une grille de score des points limites accompagne chaque étape, avec une surveillance renforcée jusqu'au troisième jour parce que la ligature de deux artères du ventre peut provoquer une occlusion intestinale. 876 souris vont être utilisées, toutes tuées pour l'examen de leurs vaisseaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 540 d'entre elles et modéré pour 336. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage, puis selon les groupes l'implantation d'une minipompe délivrant de l'angiotensine II pour provoquer une hypertension, une ouverture de l'abdomen avec ligature d'artères, un régime enrichi en graisses ou une mesure quotidienne de pression de quinze minutes sous contention. Le porteur affirme avoir réduit l'effectif au minimum et estime que 876 animaux "au maximum" seront nécessaires, sans détailler le calcul qui aboutit à ce nombre.
Objectifs
Les canaux sodium dépendant du potentiel (canaux NaV) sont des déterminants moléculaires majeurs de l'excitabilité cellulaire et sont impliqués dans la genèse et la propagation des potentiels d’action et le couplage excitation-contraction au niveau cardiaque. Ils sont composés de deux sous-unités, une sous-unité α formant le pore et une sous-unité β, auxiliaire, impliquée dans la régulation de l’activité du canal. Ils sont aussi exprimés dans des cellules dites non excitables comme les cellules vasculaires où leur rôle n’a pas encore été bien caractérisé. Récemment, nous avons montré que la dilatation-flux dépendante des artères de résistance de souris était potentialisée lors d’un traitement avec le bloqueur des canaux NaV, la tétrodotoxine. Ces résultats suggèrent que les canaux NaV vasculaires seraient impliqués dans la perception et la transduction du flux vasculaire. Nos travaux in vitro ont pu mettre évidence que la sous-unité auxiliaire des canaux NaV, NaVβ3, voit son expression augmentée dans la cellule endothéliale en réponse à un flux laminaire physiologique et non lors d’un flux oscillatoire perturbé pathologique, propice à un environnement inflammatoire et au développement de plaques d’athérome. Dans l’objectif de valider le rôle fonctionnel de NaVβ3 dans la mécanotransduction et la vasculoprotection, nous souhaiterons utiliser le modèle KO pour Scn3b (qui code pour la protéine NaVβ3) chez la souris et explorer si une délétion de NaVβ3 entraîne une modification dans la réponse à une augmentation de pression ou à une variation de flux et de dépôt de plaques d’athérome induite par le flux. (modification 2) De plus, des mutations dans le gène codant pour SCN3B chez l’homme entraine des arythmies cardiaques (syndrome de Brugada), Nous souhaiterions donc également mesurer si les souris déficientes pour Scn3b présentent un défaut de la fonction cardiaque.
Bénéfices attendus
Si NaVβ3 a un impact sur la physiopathologie de l’HTA ou de l’athérosclérose, alors il pourra être alors identifié comme une cible thérapeutique comme les canaux NaV le sont déjà dans certaines formes d’épilepsie et d’arythmie. Nous souhaitons inclure non pas que des mâles dans nos procédures mais également des femelles .
Procédures
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. L’ensemble des animaux seront génotypés suite à la biopsie d'oreille obtenu lors du marquage international. Ce marquage induit une douleur légère et de courte durée. Pour l’ensemble des animaux qui subissent une chirurgie, celle-ci est réalisée sous anesthésie générale en présence d’analgésique. Pour le modèle d’hypertension artériel, 432 animaux subiront une chirurgie légère consistant à une implantation de minipompe osmotique avec de l’angiotensine II pour 216 animaux, soit des animaux subissant la même chirurgie mais sans implantation de pompe pour les 216 autres animaux. L’intervention chirurgicale dure en moyenne 10 minutes et chaque souris ne la subit qu’une fois. L’ensemble des 432 animaux auront une mesure de la pression artérielle par pléthysmographie. Les mesures sont débutées 2 semaines avant le début de l’induction de l’hypertension. La première semaine est une semaine de socialisation et d’habituation au système. Ensuite les séries de mesure seront analysées et permettront d’obtenir une pression basale 7 jours avant la chirurgie puis 14 ou 28 jours après la chirurgie. La prise de pression est répétée chaque jour et dure 15 minutes. Pour le modèle de ligature d’artères mésentériques, l’ensemble des 300 animaux subiront une chirurgie modérée. Les animaux sont placés sur le dos, l’abdomen est ouvert et deux artères sont ligaturées. L’artère intermédiaire adapte son flux et l’augmentera. Après chaque chirurgie, les souris sont surveillées à l’aide de la grille d’évaluation et si besoin une nouvelle injection d’antalgique sera réalisée. Pour la mise en place du modèle d’athérosclérose, l’ensemble des 108 animaux subiront un régime avec une nourriture Western Diet indiqué dans la formation des plaques d’athérome chez les souris KO pour le récepteur aux LDL sous forme de granulés ad libitum pendant 16 semaines. Cette procédure est non invasive et indolore pour l’animal. (modification 2) L’évaluation de la fonction cardiaque, nécéssite l'ajout de 36 animaux qui subiront une chirurgie modérée. Une incision cutanée sera réalisée sur la partie abdominale, et une poche sous- cutanée sera créée à l'aide de ciseaux à bouts ronds, afin d'accueillir le transmetteur télémétrique. La mesure de l’électrocardiogramme sera réalisée 7 jours après la chirurgie sur une durée de 24 heures puis 10 minutes pendant le test de stress (nage).
Impact sur les animaux
Pour le génotypage, les animaux sont conventionnés et la perforation de l'oreille pour le marquage international est réalisé et dure maximum 5 minutes. La gène est une douleur légère et de courte durée. Une chirurgie légère ou modérée n’entraine que tres peu de douleur car ces procédures sont accompagnés d’une analgésie pré et post opération par l’injection de buprénorphine. Les animaux sont surveillés au réveil , dans les premières heures suivant l’opération puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à la grille de score des points limites . La procédure 2 pouvant engendrer un risque d’occlusion intestinale jusqu’à J3, Une attention plus particulière sera portée sur ces animaux grâce à la grille de score des points limites. Les modèles d’hypertension artérielle et d’athérosclérose ayant pour but de créer un modèle pathologique non sévère, les animaux seront également surveillés mais d’après notre expérience, peu ou pas de signes de mal être sont associés et seront dans tous les cas évalués. Enfin, la prise de pression artérielle par pléthysmographie engendrant un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.Pour la télémétrie, les souris subiront une chirurgie modérée sous anesthésique et avec antalgique, placées sur un tapis chauffant à 37°C pour éviter l’hypothermie. 7 jours de récupération après opération avec un suivi de poids sera réalisé. La mesure de l’ECG pendant 24 heures n’entraine pas d’inconfort chez l’animal. Lors du test de stress, les souris seront retirées au moindre signe d’inconfort.
Devenir
Mise à mort des animaux de toutes les procédures en vue de l’exploration des vaisseaux : Réactivité vasculaire et histomorphologie et étude transcrits et protéines .
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de Scn3b dans la physiopathologie vasculaire et la fonction cardiaque. En effet, la physiologie et physiopathologie du vaisseau ainsi que la physiologie cardiaquemet en jeu les systèmes immunitaire et nerveux. Les modèles cellulaires ne permettent en physiologie vasculaire que d’évaluer le mode d’action au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe voire à l’organisme. De plus, il n’existe pas de modélisation mathématique dans ce domaine.
Réduction
Nous avons reduit au minimum le nombre d'animaux pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Nous avons estimé que 876 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animau , enrichies par des jouets (rouleau de sopalin, maison). Les animaux sont surveillés au quotidien par le personnel de l'animalerie. Le poids des animaux est suivi en fonction de leur croissance et des procédures opératoires. Pendant tout le protocole, la douleur générée par les gestes chirurgicaux et/ou le stress sera evaluée et prise en charge etla mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, une partie de ce projet utilisera des souris génétiquement modifiées pour Scn3b et Ldlr (KO). La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle bien décrit, bien documenté et utilisé dans le monde entier. Ainsi, les résultats peuvent être comparés d’un laboratoire à un autre. Enfin, les modèles d’HTA et d’athérosclérose chez la souris sont proches de la pathologie développée chez l’homme (augmentation de la pression artérielle, hypertrophie cardiaque, remodelage structurel et fonctionnel des artères pour l’HTA, dépôt de plaque d’athérome pour l’athérosclérose). Enfin, au laboratoire, nous avons un excellent recul sur ces modèles. Les souris C57BL/6N mâles et femelles seront âgés de 3 à 5 mois puisque nous avons déterminé au laboratoire que l’étude des artères doit se faire sur des animaux adultes et matures, d’âge moyen de 3 à 5 mois.