Rongeurs

Le genou de 240 souris est déstabilisé chirurgicalement pour provoquer une arthrose, puis reçoit une ou plusieurs injections dans l'articulation, que le porteur situe lui-même entre la douleur légère et la douleur sévère. Ces souris sont utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes tuées à l'issue. La description des atteintes tient en une ligne, "Dans le modèle d'arthrose de douleur, les animaux développeront une boiterie", quand celle des procédures prévoit des manipulations tous les trois ou quatre jours pendant vingt et un jours pour mesurer la motricité. La mise à mort sert à établir un score histologique du genou, seule façon selon le porteur d'évaluer l'efficacité de l'hydrogel testé.

Objectifs

Chez les patients arthrosiques, on retrouve une destruction du cartilage articulaire. Dans l'arthrose le principal motif de consultation des patients est la douleur articulaire. Ainsi, nous souhaitons évaluer les effets de formulations thérapeutiques à visée anti-arthrosique, sous la forme de gels complexes. Nous avons développé précédemment un produit efficace dans l’arthrose mécanique chez la souris (diminution des dommages sur le cartilage), et sur la douleur dans l’arthrose, quand il est injecté une fois par semaine. Ici, deux gels contenant le produit actif seront testés dans les mêmes modèles d'arthrose. Les gels relargueront le produit actif de façon prolongée et continue, nous vérifierons qu'une seule injection sera efficace pour obtenir un effet anti-arthrosique, comparativement au produit actif seul (injecté toutes les semaines pendant 8 semaines).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont à la fois l'optimisation de la délivrance du produit parmi deux types de gels, mais également la réduction du nombre d'injections de la molécule en vue d'une utilisation en clinique chez l'Homme. Comparativement à l'injection du produit "seul", soit une fois par semaine (8 injections), l'utilisation d'un gel diminuerait ces injections à une seule fois.

Procédures

Dans le modèle chirugical d'arthrose, les souris subiront des manipulations (stress léger), une chirurgie de destabilisation du genou pour induire l'arthrose sous anesthésie (15 minutes, douleur modérée), une ou plusieurs injections intra-articulaires sous anesthésie (5 minutes, douleur légère) Dans le modèle de douleur d'arthrose, les animaux subiront des manipulations fréquentes (5 minutes tous les 3/4 jours pour évaluer leur motricité, stress léger), plusieurs injections intra-articulaires sous anesthésie (5 minutes, douleur légère à sévère)

Impact sur les animaux

Dans le modèle d'arthrose de douleur, les animaux développeront une boiterie.

Devenir

Les animaux sont utilisés dans la cadre de l'évaluation de l'efficacité d'un hydrogel à but anti-arthrosique. L'efficacité ne peut être évaluée qu'avec l'étude d'un score histologique au site affectant la pathologie (genou) représentant les lésions dans l'articulation, nécessitant la mise à mort des animaux impliqués dans cette étude.

Remplacement

Certaines expériences peuvent être menées sur des modèles cellulaires plus ou moins complexe (un ou plusieurs types cellulaires, modèles cellulaires plus ou moins complexe (un ou plusieurs types cellulaires, en 2 ou 3 dimensions) mais l'impact d'un traitement potentiel d'une pathologie complexe comme l'arthrose ou de multiples compartiments sont impliqués (mécanique et douleur, notamment) est difficilement mesurable dans un système simplifié, ainsi le modèle animal est indispensable à la connaissance des effets sur l'articulation dans son intégralité

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum d'après nos résultats précédents, diminuant le nombre de 18 à 12 animaux par groupe.

Raffinement

L’induction de l’arthrose (chirurgie, douleur) ainsi que l’injection des molécules (injection intra-articulaire) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Nous faciliterons l'accès à la nourriture par mise à disposition de croquettes dans la cage, et à la boisson par mise en place d'un biberon à col plus long (évite à l'animal de se lever). Au vu de nos résultats précédents, nous parvenons à réduire la durée du modèle de douleur à 21 jours au lieu de 28. Enfin, seules des personnes expérimentées dans les injections et les chirurgies intra-articulaires participeront à cette étude, améliorant grandement la vitesse d'exécution des gestes et limitant ainsi les suites post-intervention.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus étudié pour l'arthrose. Le modèle de chirurgie du genou est actuellement considéré comme le modèle reproduisant le mieux l'arthrose humaine, en termes de manifestations articulaires et de durée d'installation. Le modèle d'arthrose de douleur est un modèle reconnu comme modèle explorant le compartiment de la douleur dans l'arthrose. Les animaux sont utilisés à partir de 10 semaines d’âge, auquel les articulations sont bien formées. Il a été montré que les études articulaires ne doivent être faites sur des sujets ni trop jeunes ni trop âgés.

Une maladie du greffon contre l'hôte fait partie des effets attendus, avec perte de poids et perte de poils, et l'imagerie sous anesthésie revient deux fois par semaine. 5 238 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères, toutes tuées pour des analyses post mortem sur organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale, puis des monocytes humains modifiés génétiquement pour porter un récepteur CAR, l'objectif étant de mesurer où ces cellules vont, combien de temps elles survivent et quelles toxicités elles provoquent. Le porteur écrit avoir déjà évalué ces approches en coculture 2D et 3D, et conclut que "l'utilisation du modèle animal reste indispensable" parce qu'il faut observer l'interaction dans un "organisme entier".

Objectifs

Le développement constant des immunothérapies contribue fortement à l’amélioration et au progrès liés au traitement des cancers. Nous développons des approches cherchant à mobiliser les cellules myéloïdes (la lignée des cellules myéloïdes est produite dans la moelle osseuse et donne naissance à plusieurs types de cellules sanguines dont les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques) pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et ainsi contrôler le développement de la tumeur. La modification génétique consiste à faire un exprimer un récepteur dénommé CAR spécifique d’une molécule tumorale permettant la reconnaissance des cellules tumorales et l’activation des cellules myéloïdes génétiquement modifiées contre les cellules cancéreuses Nous souhaitons modifier génétiquement les cellules myéloïdes pour augmenter leur capacité à stimuler la réponse immunitaire et évaluer leur efficacité antitumorale dans des modèles de souris portant des tumeurs. Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous avons pour but 1) d’optimiser ce type de traitement en cherchant à déterminer quel est le devenir des cellules myéloïdes modifiés in vivo (localisation, survie, état), 2) déterminer leur mode d’action contre les tumeurs et 3) leur capacité à modifier le microenvironnement tumoral qui est par nature inhibiteur du système immunitaire. Par la mise en place de différents modèles d’injection des cellules tumorales et des CAR, nous étudierons à la fois la capacité des CAR-M à contrôler directement la croissance tumorale en favorisant l’interaction entre les deux types de cellules mais aussi le recrutement des CAR-M au sein de la tumeur et leur action sur la progression tumorale en injectant les CAR-M de manière systémique. Nous pourrons distinguer donc si les CAR-M sont capables de passer d’un compartiment/organe à la tumeur via le système sanguin. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous voulons avant tout acquérir des connaissances importantes qui pourront ensuite être utilisées en clinique pour le traitement du cancer. Les possibilités de traitement d'une tumeur solide sont jusqu'à présent plutôt limitées et parfois moins efficaces. L'approche thérapeutique avec les CAR promet d'être plus efficace tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires et surtout de permettre le traitement de cancers qui étaient jusqu'à présent difficiles ou impossibles à traiter. En effet, nos approches pourraient permettre de réduire certaines toxicités liées à l’utilisation d’autres approches de l’immunothérapie comme des cellules CAR T (lymphocytes T modifiés génétiquement), telles que l’apparition d’une suractivation du système immunitaire appelée orage cytokinique. L'avantage des CAR-M est avant tout qu'ils seront recrutés plus facilement au sein de la tumeur et qu'ils peuvent ainsi interagir directement avec les cellules tumorales mais aussi avec les cellules immunitaires alentour. Les cellules myéloïdes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire. Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces. MODIFICATION La modification proposée permettra de non seulement mieux comprendre les mécanismes d’action de notre thérapie seule ou en combinaison avec d’autres immunothérapies. De plus, l’utilisation d’autres modèles tumoraux permettront d’évaluer l’efficacité de cette thérapie dans plusieurs types de tumeurs solides induisant ou non l’apparition de métastases, plus ou moins résistantes aux traitements déjà mis en place.

Procédures

Pour évaluer la capacité des CAR-M à contrôler la croissance tumorale et en se basant sur des recherches publiées nous injecterons les cellules tumorales et les CAR-M directement dans l’abdomen des souris (voie intrapéritonéale) permettant de suivre via un système d’imagerie le contrôle de la croissance tumorale. Les cellules tumorales injectées exprimant la luciferase, de la luciferin sera injectée par voie intra-péritonéale (1,5mg par souris de 20g). Les souris seront anesthésiées avec de l’Isofluorane (entre 2,5 et 3%) puis imagées via IVIS. L’anesthésie aura une durée de 10 minutes. Les souris seront imagées 2 fois par semaine. Pour évaluer la localisation, la persistance et le recrutement des cellules utilisées comme traitement, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale, intraperitoneale ou intraveineuse. (1 à 4 fois - durée du geste inférieur à 10 sec). Pour évaluer l’effet du traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis les animaux seront traités 1 fois avec des CAR-M injectées par voie intraveineuse. Pour évaluer le traitement dans d’autres modèles de tumeurs, les cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inf à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale ou intraveineuse. Pour comprendre comment fonctionne notre traitement, les animaux seront injectés 1 fois avec les cellules tumorales par voie sous cutanée. Le traitement sera injecté 1 fois par voie intratumorale ou intraveineuse et les cellules effectrices 1 fois par voie intraveineuse (durée de chaque geste inf à 10 sec).

Impact sur les animaux

L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires transplantées attaquent le corps du receveur, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Comme nous avons déjà réalisé ce type d’expérience dans notre laboratoire, nous pouvons bien nous préparer et nous connaissons les signes pour éviter la douleur et la souffrance. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. MODIFICATION Les nuisances attendues lors des différentes injections seront minimes, avec un geste qui dure moins de 10 secondes par souris. Les prélèvements de sang sont effectués par du personnel entraîné dont le geste a été validé par le responsable Bien-Etre Animal.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet avec des cellules modifiées ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroides qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet car il est important de considérer l'interaction des CAR-M avec les cellules tumorales dans un organisme entier et d’évaluer les éventuelles toxicités.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les tumeurs sous-cutanées seront mesurées minimum 2 fois par semaine afin de s’assurer qu’elles ne dépassent pas la taille maximale entrainant le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. L'intervention chirurgicale est réalisée dans des conditions aussi stériles que possible et par un personnel spécialement formé à cet effet. Un traitement anti-douleur standardisé et un contrôle régulier des animaux après l'intervention sont effectués. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score définie pour le projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques ou des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient atteint la maturité sexuelle, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

Trente-six gavages d'alcool, trois par semaine pendant douze semaines, plus quinze semaines d'alimentation riche en graisses : 435 souris vont être utilisées, jusqu'à 65 mères gestantes et jusqu'à 370 de leurs petits, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Les mères sont hébergées seules, reçoivent des antibiotiques dans l'eau de boisson, puis une bactérie badigeonnée sur leur pelage et dans leur cage. Toutes sont tuées, les mères après le sevrage pour prélever foie et intestins, les petits au terme des quinze semaines d'alcool et de régime gras. Le porteur qualifie le projet de "pilote" et annonce que, si son hypothèse se vérifie, des travaux supplémentaires "sur modèles cellulaires, animaux et chez l'Homme pourraient être justifiés".

Objectifs

En dépit d’une diminution de la consommation d’alcool en France ces dernières décennies, cette substance demeure un problème de santé publique majeur en raison de ses propriétés toxiques, cancérigènes et addictives. Une proportion importante de la mortalité liée à l’alcool provient du développement de la Maladie du Foie liée à l’Alcool, qui débute avec la maladie du foie gras, réversible, et qui s’achève avec les formes chroniques de la cirrhose et du cancer du foie. Certains patients atteints peuvent présenter une inflammation, dont la forme sévère peut causer une hépatite, une maladie du foie caractérisée par la survenue brutale d’une jaunisse. La forme sévère de cette hépatite (hépatite alcoolique aigüe sévère) est prise en charge par l’administration d’anti-inflammatoires. Toutefois, ce traitement est inefficace chez 30 % des patients. De plus, il n’existe actuellement aucun autre traitement approuvé pour les patients avec une hépatite alcoolique aigüe sévère, même si d’autres pistes sont explorées, notamment en ciblant le microbiote intestinal. Dans le cadre d’un projet conduit ces dernières années, le microbiote intestinal de patients avec une hépatite alcoolique aigüe sévère a été caractérisé. Un important déséquilibre intestinal a pu être observé, avec une augmentation de certaines bactéries connues pour leur production de petites particules appelées vésicules. Or, ces vésicules sont de plus en plus reconnues comme contribuant à diverses maladies du foie, mais il n’existe actuellement aucune étude les associant à l’hépatite alcoolique aigüe sévère. L’objectif de ce projet est ainsi d’utiliser un modèle de souris afin de vérifier le rôle de ces vésicules produites par des bactéries fécales et l’inflammation du foie. A plus long terme, ces travaux pourraient aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie grave.

Bénéfices attendus

Ce projet est pilote : il s’agit de vérifier une hypothèse de recherche qui n’a jusqu’à présent pas été explorée dans la littérature, c’est-à-dire que les vésicules jouent un rôle clef dans l’hépatite alcoolique aigüe sévère. Si cette hypothèse est vérifiée, des travaux supplémentaires sur modèles cellulaires, animaux et chez l’Homme pourraient être justifiés pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, et à plus long terme proposer de nouveaux traitements.

Procédures

Un total de 2 interventions seront employées dans ce projet. La première intervention consiste en l’introduction de bactéries dans le microbiote intestinal pour jusqu’à 65 mères gestantes. [MODIFICATION 1] [DEBUT] Pour cela, à deux occasions autour de la mise-bas, un liquide contenant la bactérie sera appliqué sur la peau et dans la cage des animaux. [FIN] [MODIFICATION 2] [DEBUT] Cette intervention sera complétée par l’ajout d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant sept jours ou jusqu’à la mise bas pour faciliter l’installation des bactéries. [FIN] La deuxième intervention consiste en la génération d’une maladie du foie pour jusqu’à 370 petits de ces mères. [MODIFICATION 9] [DEBUT] Un gavage initial d’antibiotiques sur animal vigile (quelques secondes) sera nécessaire. [FIN] [MODIFICATIONS 7, 8] [DEBUT] L’alcool sera administré dans l’eau de boisson d’une part, et d’autre part par trois gavages oraux (quelques secondes) par semaine pendant douze semaines, sur animal vigile. [FIN] [MODIFICATION 5] [DEBUT] Ces animaux recevront aussi une alimentation occidentale riche en graisses pour amplifier les effets de l’alcool [FIN]. A la fin de ce protocole, les animaux seront anesthésiés par inhalation de gaz, du sang sera prélevé pendant environ 30 secondes, puis les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Dans la première partie de l’étude, les femelles gestantes seront hébergées individuellement pour contrôler la date de mise bas et prévenir les comportements d’agressivité ou de cannibalisme post-partum. Cet hébergement individuel peut induire un stress modéré durant la période de stabulation. [MODIFICATION 2] [DEBUT] Trois jours après leur arrivée, les femelles recevront des antibiotiques pendant jusqu’à sept jours, susceptibles d’entraîner un léger inconfort transitoire, parfois accompagné de rares épisodes diarrhéiques. [FIN] [MODIFICATION 1] [DEBUT] Les souris recevront ensuite par badigeonnage du pelage et de la cage une bactérie. De possibles épisodes diarrhéiques rares sont anticipés chez les mères et les souriceaux. [FIN] Dans la seconde partie de l’étude, les souriceaux pourront présenter une altération intestinale légère et transitoire durant la stabulation. Le prélèvement de fèces par induction représentera également une nuisance brève et légère. L’exposition des souriceaux à l’alcool dans l’eau de boisson pourrait provoquer des effets nuls à légers sur la durée de l’étude. [MODIFICATION 9] [DEBUT] Un gavage d’antibiotique au moment où l’alcool est introduit occasionnera une gêne légère et brève liée à la contention et à l’introduction de la sonde, et pourrait engendrer de rares épisodes diarrhéiques. [FIN] [MODIFICATION 8] [DEBUT] 36 gavages oraux d’alcool seront réalisés à raison de trois par semaine [FIN]. Ces manipulations entraîneront une gêne légère et passagère, sans douleur persistante. L’alcool administré par gavage pourrait toutefois induire un état transitoire de somnolence ou de prostration, associé à une diminution de la prise alimentaire. Combinée à la consommation d’alcool, cette exposition peut entraîner des atteintes intestinales et hépatiques ainsi qu’un stress physiologique modéré. [MODIFICATION 5] [DEBUT] L’exposition à une alimentation occidentale pendant 15 semaines pourrait générer des effets indésirables modérés sur le poids de l’animal et sa santé cardio-vasculaire. [FIN]

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire dans notre étude afin de pouvoir obtenir des échantillons biologiques indispensables. A l’issue de la première partie de l’étude, qui s’achève avec le sevrage et le sexage des souriceaux, les mères gestantes seront mises à mort afin de récupérer le foie et les intestins. Les souriceaux sevrés seront ensuite utilisés dans la seconde partie de l’étude. Au terme de l’exposition à de l’alcool et à une alimentation occidentale pendant 15 semaines, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le foie et les intestins.

Remplacement

Cette étude vise à mieux comprendre comment l’alcool et certaines bactéries intestinales affectent le foie et l’intestin. Des modèles innovants en laboratoire, appelés « intestin–foie sur puce », permettent déjà d’étudier certaines maladies du foie sans utiliser d’animaux. Cependant, ces systèmes ne reproduisent pas encore toute la complexité du corps vivant, ni les interactions entre l’alcool et les vésicules produites par les bactéries. Pour cette raison, l’utilisation de souris reste nécessaire afin d’étudier de manière fiable les réactions biologiques et immunitaires impliquées dans cette maladie, et ainsi faire progresser les connaissances sur l’hépatite alcoolique.

Réduction

[MODIFICATIONS 3, 4] [DEBUT] Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous avons planifié l’étude avec une approche statistique précise. Au total, jusqu’à 370 souriceaux seront nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Pour atteindre ce nombre, 65 mères gestantes seront nécessaires. [FIN]

Raffinement

Les mères gestantes seront placées, à leur arrivée, dans des cages individuelles enrichies par un dome, du bois pour ronger, des frisottis et cotons pour la nidification. Ces cages sont dans des portoires ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12H/12H. La température et l’humidité sont strictement contrôlées, allant de 20 à 23 °C et de 30 à 60 % respectivement. Les besoins vitaux des animaux seront assurés avec une alimentation standard sous forme de croquettes, et une eau fournie ad libitum. Les mères bénéficieront d’une alimentation spéciale avec des croquettes adaptées à leurs besoins gestationnels. Les souris seront hébergées dans des cages transparentes et pourront voir leurs congénères. Du raffinement supplémentaire sera introduit comme une roue d’activité et des frisottis pour réduire le stress des animaux. Les mêmes conditions seront employées pour héberger les souriceaux une fois le sevrage et sexage réalisé, à raison d’au minimum deux souriceaux et au maximum cinq souriceaux de même sexe par cage. L’hébergement en fratrie permettra ainsi de prévenir le stress de l’isolement en maintenant des interactions sociales. Les animaux seront attentivement surveillés dans les minutes suivant chaque gavage, et mis à mort si une blessure est constatée. Les opérateurs sont régulièrement entraînés à ce geste sur mannequins de souris. Après les gavages d’alcool, les cages seront placées sur des tapis chauffants pour faciliter la récupération. A partir de l’arrivée des mères gestantes dans les installations, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une attention particulière sera portée sur le comportement autour de la naissance. Dès la mise-bas, si certaines mères gestantes ont un comportement anormal (absence de nidification, cannibalisme), il sera envisageable de transférer leurs souriceaux à d’autres mères afin d’assurer la survie des nouveaux-nés. A partir du sevrage et du sexage, et une fois les animaux identifiés, les souriceaux seront inspectés individuellement au moins une fois par jour, et pesés une fois par semaine. D’autres indicateurs de santé de l’animal sevré seront évalués : l’apparence physique, la variation de poids, la déshydratation, et le comportement social. Ces indicateurs sont présentés dans une grille d’évaluation affichée dans les locaux de stabulation et remplie chaque jour après l’inspection de chaque animal. Une grille de points-limites sera mise en place pour prendre en charge les animaux de manière appropriée.

Choix des espèces

Des souris femelles âgées de 10 semaines et à 10 jours de gestation seront utilisées. Il nous est impossible d’utiliser des femelles avec gestation confirmée du fait du besoin de coloniser la mère avant la naissance des souriceaux. Selon notre expérience avec ces souris gestantes, nous avons besoin d’une semaine pour l’antibiothérapie et la colonisation du microbiote intestinal. De plus, nous nous attendons à ce que la déstabilisation du microbiote intestinal à travers l’antibiothérapie combinée à la colonisation bactérienne aboutisse à une atteinte hépatique augmentée. Les souriceaux seront en outre inclus dans la procédure d’alcoolisation seulement une fois sevrés et avec un poids suffisamment élevé, de 20 g pour les mâles et 19 g pour les femelles, au maximum 5 semaines post-naissance selon les courbes de croissance du fournisseur. Des souris aussi jeunes permettent de reproduire le comportement de binge drinking (alcoolisation ponctuelle importante) qui débute chez l’Homme au cours de l’adolescence. Nous nous attendons aussi à une atteinte hépatique plus marquée à un jeune âge suite à la colonisation dès la naissance par la bactérie, et qui serait potentialisée par les effets de l’alcool.

Irradiées puis greffées de moelle osseuse, infectées par une bactérie, ou soumises sous anesthésie à une thrombose déclenchée au laser, 802 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus et organes. Les séances de thrombose et d'inflammation durent quatre et sept heures sans réveil, et d'autres souris subissent une ligature d'un vaisseau sanguin abdominal de quarante minutes, la mise à mort venant quarante-huit heures plus tard. L'objectif déclaré est de comprendre comment une protéine kinase agit sur l'inflammation, la coagulation et la paroi des vaisseaux, le porteur indiquant que cette protéine "pourrait représenter une cible intéressante" pour de futurs traitements. Les atteintes décrites se limitent à une légère perte de poids, un stress bref et une infection "légère à modérée", alors que la déclaration de gravité du même projet comprend le niveau sévère.

Objectifs

Nous avons identifié que l’inhibition d'une protéine diminuait de façon significative la progression des lésions dans un contexte inflammatoire. Dans le but de mieux comprendre le mode d’action de cette protéine sur la progression de ces lésions, nous allons évaluer son impact sur l’inflammation et la fonction de l’endothélium (cellules qui tapissent l’intérieur d’un vaisseau sanguin) grâce à des modèles précliniques d’infection (sepsis), d’inflammation et de thrombose (activation de l’endothélium avec une cytokine inflammatoire ou un laser).

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront d’évaluer, dans un organisme vivant, les effets potentiels de la protéine étudiée sur la formation de caillots sanguins et l’inflammation, ce qui ne peut pas être reproduit en laboratoire sur des cellules isolées. Elles aideront également à déterminer si cette protéine pourrait représenter une cible intéressante pour développer de nouvelles approches thérapeutiques visant à protéger les vaisseaux sanguins contre les dysfonctionnements liés à des processus inflammatoires ou thrombotiques.

Procédures

Trois types d’interventions seront réalisées sur des lots différents d’animaux : 1- Dans le premier ou deuxième établissements utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une irradiation suivie d’une greffe de moelle osseuse (injection des cellules par voie intraveineuse). 2- Dans un troisième établissement utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une infection bactérienne. Une seule prise de sang sera réalisée sur chaque lot à differents temps (au plus tard 96h apres le début de l’infection). Pour cela les souris seront sous anesthésie générale profonde (mélange de Tilétamine, Zolazépam et Xylazine), et seront ensuite euthanasiées. 3- Dans un quatrième établissement utilisateur, les animaux seront hébergés pendant 1 semaine pour acclimatation. 4- Dans le cinquième établissement utilisateur, les animaux seront soumis, sous anesthésie profonde, à un modèle de thrombose (activation des cellules du vaisseau par un laser) ou d’inflammation (activation des cellules du vaisseau par une molécule inflammatoire). Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 heures pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. Pour étudier la thrombose veineuse, des lots différents d’animaux seront exposés à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. - Après l’induction d’une infection (légère à modérée), les effets indésirables attendus dans ce modèle incluent une perte de poids, une diminution de l’activité et de la vitalité. Les souris seront ensuite euthanasiées au plus tard 96h apres le début de l’infection. D’autres expérimentations (modèles de thrombose et d’inflammation) sont conduites sans réveil des animaux. Les souris sont alors maintenues sous anesthésie générale pendant toute la durée des procédures expérimentales. À l’issue des expérimentations, les animaux sont euthanasiés sans reprise de conscience.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus et organes qui seront ensuite analysés. Les animaux seront également euthanasiés si l'un des points limites était atteint.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de souris exprimant la protéine d’intêret inactive. Ainsi, l’utilisation d’animaux vivants constitue une étape nécessaire pour répondre aux objectifs du projet, aucun modèle de remplacement pertinent n’étant actuellement disponible.

Réduction

Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'expérimentations supplémentaires. Dans les expérimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de cinq individus, dans des cages ventilées, avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Si une diminution de l’activité est observée, de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage afin de faciliter l’accès à la nourriture. Du papier sopalin et des cubes de bois seront également rajoutés comme enrichissement environnemental afin de permettre des comportements naturels de nidification et d’exploration, contribuant ainsi à réduire le stress et à améliorer le bien-être des animaux. Une période d’acclimatation de sept jours est respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié à l’environnement. Les transferts entre deux établissements seront réalisés par un transporteur agréé. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation d’une semaine avant toute procédure expérimentale dans l’établissement d’accueil.

Choix des espèces

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliquant une protéine kinase dans l’inflammation, la thrombose et la dysfonction endothéliale en contexte thrombo-inflammatoire. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre la paroi des vaisseaux, les cellules sanguines et le système immunitaire, s’inscrivant dans une réponse physiopathologique intégrée qui ne peut être reproduite de manière pertinente par des approches in vitro ou ex vivo. Le recours à l’expérimentation animale constitue donc l’unique approche permettant d’étudier ces mécanismes dans leur globalité. Le modèle murin est largement reconnu comme le modèle de référence pour les études précliniques de la thrombose et de l’inflammation, en raison de fortes similitudes avec l’Homme, tant au niveau des cellules impliquées que des voies moléculaires mises en jeu. Par ailleurs, l’utilisation de souris génétiquement modifiées ciblant spécifiquement la protéine kinase, sans phénotype dommageable en conditions basales, permet une analyse mécanistique en contexte pathologique. Nous utiliserons des souris de 12 à 25 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire mature).