Rongeurs

Injectées avec des cellules de lymphome B, 1 300 souris sur les 1 800 du projet développent des tumeurs ganglionnaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le grossissement des ganglions peut réduire leur mobilité, voûter leur posture, accélérer leur respiration et leur faire perdre du poids. L'équipe cherche à comprendre comment les cellules tumorales produisent leur énergie, et pourquoi certains lymphomes résistent aux immunothérapies quand d'autres y répondent. Toutes les souris sont tuées à la fin pour récupérer les tumeurs, geste que le porteur présente comme la seule façon d'étudier le fonctionnement interne des cellules cancéreuses.

Objectifs

Les Lymphomes Diffus à Grandes Cellules B (LDGCB) sont des cancers du système immunitaire qui touchent les lymphocytes B, des cellules chargées de défendre l’organisme contre les infections. C’est le type de lymphome le plus fréquent dans les pays industrialisés. Ce cancer est très variable d’un patient à l’autre. Une des raisons principales est la façon dont les cellules cancéreuses produisent l'énergie pour se développer et se multiplier. Pour produire cette énergie, elles peuvent utiliser deux grands mécanismes: l'un rapide mais peu efficace, tandis que l'autre est plus complexe mais plus efficace. Des études ont montré que, chez certains patients, le lymphome dépend de l'un ou l'autre de ces mécanismes. Cette différence peut influencer leur réponse aux traitements actuelement disponibles. Notre objectif vise à mieux comprendre pourquoi ces cancers ne fonctionnent pas tous de la même manière. Nous cherchons notamment à déterminer si ces différences sont liées à des facteurs génétiques ou à l'environnement des cellules tumorales. Nous étudierons si d'autres modifications du métabolisme sont associées à la croissance des cellules cancéreuses. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons un modèle expérimental de souris reconnu et largement utilisé pour l'étude des lymphomes en laboratoire.

Bénéfices attendus

Ce projet est à la base des recherches menées par notre équipe pour mieux comprendre pourquoi certains lymphomes sont résistants aux traitements actuels (immunothérapies et thérapies ciblées), alors que d'autres y sont sensibles. Il s'intéresse à la manière dont les cellules tumorales produisent l'énergie nécessaire à leur développement. À court terme, il permettra d'identifier les mécanismes qui favorisent la croissance des lymphomes. À plus long terme, ces travaux aideront à mieux comprendre les causes de la résistance aux traitements et pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de traitements plus efficaces et mieux adaptés aux caractéristiques de chaque patient.

Procédures

Dans ce projet les souris seront soumises à des contentions (environ 30 secondes, 1 à 3 fois par semaine). 1300 animaux recevront une injection de cellules tumorales (environ 30 secondes). Parmi elles, 1000 souris recevront une injection ultérieure (environ 30 secondes). 300 souris auront un prélevement de sang (environ 45 secondes), suivi de 2 injections (environ 30 secondes chacune).

Impact sur les animaux

La croissance des lymphomes dans les ganglions lymphatiques pourra entraîner une augmentation du volume des ganglions et, selon leur localisation, provoquer une gêne modérée chez les animaux. Celle-ci pourra se traduire par une diminution de la mobilité, une posture voûtée, une baisse de l'activité, une respiration plus rapide ou une perte de poids.

Devenir

Afin de mieux comprendre comment les cellules des lymphomes produisent et utilisent l'énergie nécessaire à leur survie et à leur multiplication, nous devons récupérer les tumeurs développées chez les animaux à la fin de l'expérience. Cela nécessite de procéder à la mise à mort de l'ensemble des animaux du projet. Les analyses réalisées sur ces tumeurs après leur prélèvement sont indispensables pour étudier le fonctionnement interne des cellules cancéreuses, comprendre les mécanismes biologiques qui favorisent leur développement et identifier de nouvelles caractéristiques pouvant être exploitées pour améliorer les traitements des lymphomes.

Remplacement

Les lymphomes B peuvent utiliser différentes sources d’énergie selon leur environnement, ce qui influence leur sensibilité aux traitements. Lorsqu’on étudie ces cellules cancéreuses en laboratoire dans des conditons de culture in vitro, cette diversité n'est plus observée. En effet, ces conditions sont très artificielles et ne reproduisent pas fidèlement l’environnement réel de la tumeur dans l’organisme. De plus, les milieux de culture contiennent des nutriments spécifiques présents à des concentrations élevées et non-physiologiques, qui “forcent” les cellules tumorales à utiliser certaines réactions biochimiques. Avec le temps, les cellules s’adaptent à ces conditions artificielles et finissent par se comporter différemment des celles qui évoluent dans l'organisme (in vivo). C’est pourquoi, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, notamment des souris, pour étudier correctement cette diversité métabolique et mieux comprendre le comportement biologique des lymphomes.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au strict minimum tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à l’aide d’un outil informatique de calcul, en tenant compte des connaissances que nous avons acquises au cours des 15 dernières années avec le modèle animal utilisé dans cette étude.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera assuré par la mise en place de mesures de raffinement adaptées au modèle de lymphome B étudié. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière (une à trois fois par semaine selon la procédure expérimentale), voire quotidiennement (selon la phase expérimentale), incluant l'évaluation de leur état général, de leur comportement, de leur mobilité, de leur poids et de l'évolution du développement tumoral. La palpation régulière des ganglions lymphatiques permettra également de suivre la progression de la maladie.

Choix des espèces

La souris présente de nombreuses similitudes biologiques avec l'Homme, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté à l'étude des lymphomes. Le choix de cette espèce repose également sur l'existence de modèles murins génétiquement modifiés bien caractérisés, qui reproduisent certaines caractéristiques des lymphomes B humains et permettent d'étudier les mécanismes impliqués dans leur développement et leur réponse aux traitements. La souris présente par ailleurs l'avantage de disposer d'un système immunitaire et d'un environnement tumoral étudiables dans leur intégralité, ce qui est essentiel pour analyser les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. De plus, comparativement au plasma humain, les concentrations en nutriments observées dans le plasma murin sont globalement conservées. Ces similitudes suggèrent que l'environnement nutritionnel disponible pour les cellules tumorales est comparable entre les modèles murins et humains, renforçant ainsi la pertinence de ce modèle pour l'étude du métabolisme tumoral. Les animaux utilisés seront des souris âgées d’environ 6 semaines au début des procédures expérimentales. Cet âge correspond à une période compatible avec les greffes cellulaires, les analyses métaboliques et le suivi du développement tumoral dans ce modèle.

1 600 souris rendues obèses par une alimentation enrichie en graisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant jusqu'à 91 administrations de traitement, 89 pesées et 13 prélèvements sanguins. Elles sont hébergées seules pendant l'étude, ce que le porteur décrit comme une nuisance d'isolement chez une espèce sociale, puis toutes tuées sous anesthésie pour prélèvement d'organes. Le projet teste des composés contre l'obésité, seuls ou associés au tirzépatide, avec l'idée d'en limiter la perte de masse musculaire. Le porteur indique qu'aucune méthode de substitution ne permet cette étude et que l'essai in vivo reste une "étape règlementaire incontournable" pour constituer le dossier de passage aux études cliniques.

Objectifs

Depuis 1975, le nombre de personnes en situation d’obésité a fortement augmenté dans le monde, faisant de cette maladie un enjeu majeur de santé publique. De nombreux traitements sont actuellement en développement pour améliorer la prise en charge des patients. Parmi eux, le tirzépatide permet une perte de poids importante, mais cette perte peut aussi s’accompagner d’une diminution de la masse musculaire, ce qui peut être problématique. Ce projet prévoit la réalisation de 10 études sur les cinq prochaines années afin d’évaluer de nouveaux traitements contre l’obésité chez des souris rendues obèses par une alimentation riche en graisses. Les traitements seront testés seuls ou en association avec un traitement de référence déjà utilisé contre l’obésité. L’objectif est d’évaluer leur efficacité sur la perte de poids, mais aussi leur capacité à limiter les effets indésirables sur la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont le tirzépatide qui est le plus efficace et le plus prescrit. Néanmoins, le tirzépatide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, le composé X pourra venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec le composé de référence, et dans ce dernier cas, il pourrait en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (89 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des traitements (91 administrations ; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (13 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (13 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Anesthésie générale avant mise à mort et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, de composition corporelle ainsi que le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. La mise à jeun de 4h ou 6h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères. De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyses biochimiques et histologiques ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tunnels, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. L'administration des traitements sera réalisée par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue une semaine avant la phase de traitement afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages pharmacocinétiques ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Avant la mesure des dépenses énergétiques en cages métaboliques, les animaux seront également habitués à leur nouvel environnement durant 20h. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'anti-inflammatoire en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses (45% ou 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documentés dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques.

Vingt-quatre injections sur huit semaines, six tests d'agrippement et une chirurgie de trente minutes pour mesurer la force musculaire : 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime alimentaire particulier, suivi de huit à vingt-quatre semaines, provoque chez les souris génétiquement modifiées une myotonie et une faiblesse musculaire qui peuvent réduire leur activité motrice. Le porteur signale aussi des interventions chirurgicales menées sans réveil, des diarrhées, des pertes de poids et de rares complications cardio-respiratoires, alors que la totalité de l'effectif est déclarée en gravité modérée. Le choix de la souris tient, selon lui, à la conservation de la structure et de la fonction du muscle squelettique entre cette espèce et l'humain, et à des lignées produites au laboratoire qui expriment la mutation humaine.

Objectifs

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la maladie neuromusculaire génétique la plus fréquente chez l’adulte. Elle affecte principalement les muscles squelettiques et se caractérise notamment par une myotonie, c’est-à-dire une difficulté à relâcher les muscles après contraction, ainsi que par une faiblesse musculaire progressive. Le muscle squelettique est un tissu dynamique capable de s’adapter aux contraintes fonctionnelles grâce à des processus de remodelage et à l’ajout de nouveaux noyaux au sein des fibres musculaires, un phénomène appelé accrétion nucléaire. Dans la DM1, ces mécanismes sont perturbés, conduisant à une modification de la composition musculaire, types de fibres musculaires et une augmentation du nombre de noyaux centraux et périphériques. L’objectif principal de ce projet est d’étudier les mécanismes physiologiques responsables du remodelage musculaire et de l’accrétion des noyaux dans les fibres musculaires, afin de mieux comprendre la physiopathologie de la DM1. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin reproduisant les symptômes musculaires fonctionnels observés chez les patients. Ce modèle, généré au laboratoire, expriment la mutation humaine responsable de la DM1 et reproduit fidèlement les altérations musculaires caractéristiques de la maladie. Ce projet servira à long terme à identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le remodelage musculaire et l’accrétion nucléaire, et définir de potentielles stratégies thérapeutiques visant à préserver la fonction musculaire chez les patients atteints de DM1.

Bénéfices attendus

La dystrophie myotonique de type 1 est la dystrophie musculaire la plus fréquente chez l’adulte avec une prévalence estimée à environ 1 personne sur 2 000 dans la population européenne. Les symptômes impactent au quotidien les patients et menacent leur autonomie. A ce jour, aucune thérapie n’est disponible pour soigner cette maladie génétique. Ce projet vise à mieux comprendre mécanismes moléculaires à l’origine de la pathologie en disséquant les processus physiopathologiques musculaires des patients DM1. Ces études sont prérequises pour le développement de thérapies ciblées.

Procédures

Certains lots d'animaux seront soumis à un régime alimentaire spécial pendant 8 à 24 semaines (animal vigil, prise alimentaire spontanée et à volonté), d'autres subiront une injection à raison de 3 fois par semaines pendant 8 semaines (animal vigil, 24 injections maximum, 30 secondes). Certains animaux auront deux injections (animal sous anesthésie générale, 1 injection par patte, 3 minutes). Certains animaux seront soumis au test d'agrippement pendant 8 à 24 semaines à raison d'un test par mois afin d’évaluation leur force musculaire (animal vigil, 6 tests maximum, 3 minutes). Certains lots d'animaux subiront une administration orale à l'aide d'une micropipette par jour pendant 8 jours (animal vigil sans contrainte physique, 8 administration max, 30 secondes à 1 minute). Si l’administration orale à l’aide d’une micropipette et non réalisable, certains lots d’animaux subiront une injection à raison d’1 injection pendant 5 jours (animal vigil, 5 injections max, 30 secondes). Enfin, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale pour la mesure de la force musculaire (animal sous anesthésie générale et analgésie, 1 fois, 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire spécifique administré aux souris génétiquement modifiées est susceptible d’induire un phénotype comprenant une myotonie (défaut transitoire de relaxation musculaire après contraction) ainsi qu’une faiblesse musculaire pouvant entraîner une diminution de l’activité motrice. Les procédures expérimentales prévues peuvent générer des nuisances et effets indésirables, principalement liés aux manipulations et aux actes réalisés dans le cadre du projet. Les injections répétées peuvent provoquer une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi qu’un stress ponctuel lié à la contention nécessaire aux manipulations. Les mesures de force musculaire peuvent également induire un stress léger et temporaire. Les traitements administrés sont globalement bien caractérisés, mais peuvent, dans de rares cas, entraîner des effets indésirables tels que des troubles digestifs (diarrhées) ou une perte de poids. Les procédures sous anesthésie peuvent entraîner une altération transitoire de la thermorégulation et, plus rarement, des complications cardio-respiratoires. Enfin, les interventions chirurgicales réalisées sans réveil peuvent induire une douleur et un stress pré-opératoires ainsi que des effets délétères transitoires associés à l’acte chirurgical.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, car des analyses poussées doivent être réalisées sur différents muscles. Ces analyses permettent d’étudier les effets de la maladie sur le muscle.

Remplacement

Les modèles utilisant des cellules musculaires cultivées en laboratoire permettent d’étudier certains mécanismes de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1). Ils ont notamment permis de mieux comprendre les anomalies présentes dans les cellules musculaires des patients et les perturbations de leur développement et de leur fonctionnement. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie, car ils ne prennent pas en compte l’ensemble du muscle, son environnement et les interactions entre les différents organes. Il est donc nécessaire d’utiliser également des modèles animaux pour mieux comprendre comment la maladie se développe dans un organisme entier. Les modèles de souris actuellement disponibles reproduisent seulement une partie des caractéristiques de la DM1 observées chez les patients. Le développement de nouveaux modèles murins reproduisant plus fidèlement la maladie humaine est ainsi essentiel pour mieux comprendre ses mécanismes et, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements.

Réduction

Afin de réduire et d’optimiser le nombre d’animaux, tous les animaux présentant le génotype d’intérêt pathologique (patrimoine genetique) seront utilisés, sans distinction de sexe. Les souris ne présentant pas ce génotype pathologique seront utilisées comme contrôles dans les différentes expériences. Chaque animal permettra de recueillir le maximum d’informations possible, notamment à partir de plusieurs tissus et par différentes analyses (physiologie, biologie moléculaire et histologie). Les tissus prélevés pourront également être conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures, afin d’éviter de réutiliser de nouveaux animaux. Pour les expériences impliquant des injections dans le muscle, la patte opposée de chaque animal servira de contrôle, ce qui permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, le nombre d’animaux a été défini à partir de nos études précédentes et d’analyses statistiques afin d’utiliser le nombre minimal nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Pour ce projet, un maximum de 960 animaux sera utilisé.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum), en portoirs ventilés, avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec deux d’enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal.Des mesures spécifiques sont mises en place pour limiter le stress et la douleur liés aux procédures expérimentales. Une période d'acclimatation sera respectée après leur arrivée au sein de l’établissement utilisateur. Une habituation préalable des animaux aux manipulations et aux gestes de contention est réalisée avant le début des procédures, afin de réduire les réactions de stress lors des interventions répétées. Une attention particulière est portée à la manipulation douce des animaux et des cages tout au long de l’étude. Les injections et autres procédures invasives sont réalisées dans des conditions limitant l’inconfort, avec recours à une anesthésie lorsque cela est requis. Lors des procédures sous anesthésie, les animaux sont maintenus à température contrôlée à l’aide d’un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi quotidien du bien-être animal est assuré, incluant l’évaluation de points limites précoces et prédictifs. En cas d’effets indésirables tels que des troubles digestifs (diarrhées) ou une diminution de l’état général, des mesures de soutien adaptées sont mises en place, incluant notamment un enrichissement alimentaire directement dans la cage si nécessaire. L’ensemble de ces mesures vise à limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long du protocole expérimental.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utilisons des modèles murins développés par notre laboratoire. Le choix de cette espèce est pertinent car la structure et la fonction du muscle squelettique sont fortement conservées entre la souris et l’humain, ce qui permet de reproduire de manière pertinente les mécanismes physiopathologiques observés dans la dystrophie myotonique de type 1. Ces modèles présentent une proximité biologique avec la pathologie humaine, en particulier au niveau des altérations moléculaires et des dysfonctionnements musculaires, ce qui en fait des outils adaptés pour l’étude des mécanismes de la maladie et l’évaluation de stratégies thérapeutiques. Le projet vise à étudier les défauts liés à la dystrophie myotonique de type 1, pathologie qui se développe chez l’adulte. Chez la souris, la maturation du muscle continue jusqu'à 8 semaines après la naissance. Les souris portant le génotype d'intérêt et leur contrôle seront donc utilisées sevrées et adultes âgées de 8 semaines au minimum au début des procédures.

Nourries pendant trente-huit semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour les rendre obèses, 30 souris sur les 40 du projet subissent en plus un jeûne nocturne pouvant atteindre quinze heures, une injection de glucose sur souris consciente et six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Toutes sont tuées après ces trente-huit semaines pour prélever le foie, le sang et d'autres tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'obésité ainsi provoquée est décrite comme les rendant "un peu moins actives", et l'objet est de tester un composé contre la fibrose du foie, pour laquelle le porteur indique qu'aucun traitement efficace n'existe. L'effectif de 40 souris est présenté comme calculé pour obtenir un effet statistique significatif, sans que ce calcul soit rapporté.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent un enjeu majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Parmi ces maladies, la stéatose hépatique non alcoolique, qui correspond à une cirrhose du foie sans consommation d’alcool, est en forte progression à cause de l’augmentation de l’obésité ou encore du diabète de type 2. Dans cette maladie, il y a une accumulation importante de graisses dans les cellules du foie ,ce qui entraine une cicatrisation du foie appelée fibrose hépatique. Cette fibrose va rigidifier des parties du foie conduisant progressivement à une perte de fonction du foie et pouvant évoluer vers une insuffisance hépatique terminale. De plus, la fibrose hépatique chronique peut être responsable du développement de cancer du foie, ce qui accentue la gravité de cette pathologie. La stéatose hépatique non alcoolique est souvent diagnostiquée à un stade avancé, lorsque les lésions dans le foie sont déjà présentes. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace pour inverser ou ralentir cette fibrose. Le développement de traitements efficaces contre la fibrose étant un enjeu majeur en santé, l’objectif principal de ce projet est de tester chez la souris un nouveau composé pour traiter la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement d’un traitement efficace pour lutter contre la progression de la fibrose hépatique. De plus ce projet permettra de mieux connaitre les mécanismes biologiques encore mal connus responsables du développement de la maladie.

Procédures

Pendant 38 semaines, 30 souris seront nourries avec un régime riche en graisses et cholestérol pour les rendre obèses et 10 souris recevront un régime standard. Pour tester la glycémie au cours du régime, 20 souris parmi les 40 souris du projet seront mis à jeun sur la nuit (maximum 15h) APRES 16 SEMAINES DE REGIME. Le lendemain, une injection de glucose (moins de 20 secondes) sera réalisée sur l'animal conscient et des prélèvements de sang se feront au niveau de la queue. Les prélèvements seront réalisés sur un temps court (durée inférieure à 2 minute) et de façon répétée en 6 fois sur une période de 2h dans la même journée. APRES 37 SEMAINES DE REGIME, UN AUTRE TEST DE LE GLYCEMIE APRES UNE PERIODE DE JEUNE MAXIMALE DE 6H SERA REALISE SUR LES 30 SOURIS NOURRIES AVEC LE REGIME GRAS DONT 10 SOURIS AURONT DEJA SUBI CE TEST A LA SEMAINE 16. Un autre prélèvement sanguin au niveau de la queue (une seule prise) sur la totalité des 40 souris sera réalisé 11 semaines plus tard.

Impact sur les animaux

Les souris qui recevront sur 38 semaines le régime riche en graisses et cholestérol vont prendre du poids et devenir un peu moins actives à cause de l'obésité. Durant la période de jeûne de 14-15h sur la nuit, les souris privées de nourriture pourront ressentir une sensation de faim. Lors de l’injection de glucose, le passage de l’aiguille de petite taille au travers de la peau sera de très courte durée (moins de 20 secondes) et entrainera un inconfort chez les souris. Des prélèvements sanguins à la queue seront pratiqués sur animaux conscients après 16, 27 ET 37 semaines de régime. Ces prélèvements bien que rapides (durée < 2 minutes) sont susceptibles d’induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Après les 38 semaines de régime, tous les animaux seront mis à mort par une méthode d'euthanasie réglementaire pour prélever les tissus et le sang. L'analyse de ces prélèvements nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement dans le foie de la fibrose et d'identifier les cibles thérapeutiques de notre composé.

Remplacement

ll n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire de manière fiable l’environnement in vivo que l'on retrouve dans un organisme vivant et dans lequel plusieurs types de cellules interagissent entre elles et participent au développement de la fibrose . De plus, cette maladie se développe lorsqu’il y a des problèmes métaboliques (ex hausse de la glycémie) dans l’organisme entier suralimenté, ce qui justifie l’utilisation d’animaux. Enfin il n’existe pas de méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire pour tester l’efficacité d’un composé sur la fibrose hépatique.

Réduction

Le nombre total de souris a été calculé pour avoir un effet statistique significatif sur les paramètres étudiés. A la fin de l’étude, des tissus autres que le foie pourront être prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe en lien avec d’autres maladies étudiées dans notre laboratoire (obésité, pré-diabète, atteintes cardiaques, rénales). Pour l’analyse des données recueillies lors des différentes expériences nous appliquerons les tests statistiques appropriés en utilisant un logiciel d'analyse.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement et la litière des cages sera plus fréquemment changée. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel expérimenté. Pour diminuer le stress lors des prélèvements de sang, les animaux seront habitués au mesure de contention quelques semaines avant la prise de sang. Pour éviter d’avoir recours au gavage source de stress, le traitement sera administré quotidiennement (5 jours sur 7) dans de la nourriture constituée de beurre de cacahuète pour l’appétence. Le traitement avec le composé a déjà été administré chez le rongeur (rat et souris) dans de précédents travaux sans entrainer d’effets indésirables

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont très sensibles au régime riche en graisses et développe une obésité et une stéatose hépatique non alcoolique similaire à la maladie humaine. Les souris utilisées seront de jeunes mâles âgés de 5 à 6 semaines car la plupart des études sur le modèle murin pour étudier cette maladie sur une longue période utilisent de jeunes souris adultes. Ainsi, grâce aux nombreuses études scientifiques publiées, de nombreuses informations sur la souris sont disponibles et permettront de mieux comparer les résultats obtenus dans ce projet.

Récupérées parmi les femelles dont d'autres projets n'avaient pas l'usage et qui auraient été tuées au sevrage, 50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rasées sur le ventre sous anesthésie, incisées au cou pour atteindre la veine jugulaire et l'artère carotide, reçoivent jusqu'à deux injections, puis dix minutes d'ultrasons sur le thorax et trois points de suture, pour une trentaine de minutes en tout. Leur cœur est prélevé après la mise à mort, afin de vérifier où les nanoparticules se sont fixées. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire de recourir à un organisme entier" pour étudier cette distribution, et présente ce passage par la souris comme "indispensable" avant d'envisager un plus gros animal puis la clinique.

Objectifs

Les arythmies cardiaques ventriculaires sont la principale cause de mort subite cardiaque. Chaque année, environ 250 000 personnes sont victimes de mort subite en Europe. De manière générale, les résultats de l’ablation de tachycardie ventriculaire par cathéters (stratégie actuellement utilisée en clinique) sont mauvais avec environ 50% de récidives. Nous souhaitons développer une méthode permettant de réaliser une ablation combinant différentes stratégies. Pour cela, il est envisagé une délivrance de molécules thérapeutiques encapsulées dans des nanoparticules, facilitée par l’ouverture préalable de pores dans la barrière vasculaire grâce à l’utilisation de microbulles et d’ultrasons, pour permettre aux nanoparticules d’atteindre la cible cardiaque avec une forte concentration et d’ainsi augmenter leur efficacité.

Bénéfices attendus

L’intérêt de la démarche est d’améliorer le pronostic des patients souffrant de tachycardie ventriculaire en traitant sélectivement la région cardiaque responsable de l’arythmie, de façon plus efficace et sécuritaire que les techniques actuelles. De manière plus large, ce projet pourra ouvrir des perspectives d'application au-delà du traitement des arythmies cardiaques ventriculaires (traitement de maladies génétiques, protection du cœur après un infarctus).

Procédures

Tous les gestes potentiellement douloureux seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie (2 maximum par animal). Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale sous anesthésie générale pour des raisons d'imagerie (1 par animal, environ 2min). Des incisions sous-cutanées seront réalisées pour l'analgésie (3 maximum par animal) Des incisions seront réalisées au niveau du cou pour accéder aux vaisseaux (veine jugulaire, artère carotide) afin d’injecter les traitements (2 injections maximum par animal). Un appareil générateur d’ultrason sera appliqué sur le thorax de l’animal afin d’envoyer les ultrasons au cœur (1 par animal, environ 10 min). 3 points de sutures par animal seront réalisés pour suturer l'incision réalisée. Les animaux seront imagés sous anesthésie générale (1 par animal,

Impact sur les animaux

Il s’agit d’une approche impliquant une chirurgie légère (pour accéder à la veine jugulaire et à l’artère carotide), une administration intraveineuse de nanosystèmes non toxiques et l’application ciblée (thorax) d’ultrasons non délétères. Le rasage de la face ventrale de l'animal peut occasionner du stress chez l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre le prélèvement du cœur et l’analyse (histologie) des tissus afin de confirmer l’efficacité de la thérapeutique étudiée.

Remplacement

Il est nécessaire de recourir à un organisme entier pour étudier le profil de distribution des molécules injectées et évaluer l'efficacité de l'ouverture de la barrière vasculaire cardiaque par les ultrasons. La preuve de concept sur l’efficacité de cette nouvelle approche sur petit animal vivant est indispensable avant d’envisager des études plus approfondies sur plus gros animal, puis un transfert à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Le sexe des animaux n’ayant pas d’importance d’un point de vue scientifique dans ce projet, les femelles non-utilisées d’autres projets (dont le sexe d'intérêt sont les mâles) seront utilisés dans ce projet au lieu d’être mises à mort au sevrage.

Raffinement

Durant toute la durée des protocoles, les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Une analgésie sera mise en place avant et après l'étape de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour les études de diffusion des nanoparticules dans le cœur. De plus, ce modèle est parfaitement compatible avec une approche par ultrasons cardiaque.

Choisies pour leur système immunitaire complet et fonctionnel, 3 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis des injections de traitements qui peuvent être quotidiennes, et pour certains groupes une anesthésie gazeuse tous les trois à quatre jours pendant environ un mois pour suivre la croissance de la tumeur. La progression tumorale peut entraîner une perte de poids, et les mesures comme les séances d'imagerie s'accompagnent d'un isolement transitoire. Toutes sont tuées à la fin des procédures pour prélever les tumeurs, le porteur cherchant à comprendre comment les cellules cancéreuses échappent à l'immunothérapie.

Objectifs

Ces dernières années, l'immunothérapie a beaucoup amélioré le traitement de plusieurs cancers, dont le mélanome (un cancer de la peau). Elle agit en réactivant les défenses immunitaires du patient contre la tumeur. Cependant, une grande partie des patients ne répond pas à ce traitement, ou cesse d'y répondre après une amélioration initiale : c'est ce qu'on appelle la résistance à l'immunothérapie. Ce projet vise à comprendre comment les cellules tumorales modifient leur métabolisme pour échapper à l'action du système immunitaire, afin d'identifier de nouvelles stratégies permettant de restaurer l'efficacité du traitement chez les patients résistants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la biologie du cancer de la peau et des mécanismes métaboliques associés à la résistance aux traitements, ouvrant la voie à de nouvelles combinaisons thérapeutiques pour les patients atteints de ce cancer.

Procédures

Les principales interventions consistent en : une greffe de cellules tumorales ; des injections répétées de traitements (anticorps, molécules ciblant le métabolisme tumoral) , pouvant être quotidiennes ; et, pour certains groupes, un suivi de la croissance tumorale par imagerie (détection de la lumière émise par les cellules tumorales), nécessitant une anesthésie gazeuse de courte durée (quelques minutes), répétée tous les 3-4 jours pendant environ un mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : un stress lié à la manipulation et aux injections répétées ; un stress lié à l'isolement transitoire lors des mesures ou des séances d'imagerie ; une perte de poids éventuelle liée à la progression tumorale ; un inconfort léger lié aux injections quotidiennes ou répétées.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir prélever les tumeurs.

Remplacement

Il n'existe pas à ce jour de méthode de remplacement (culture cellulaire, modèles invertébrés, intelligence artificielle) qui permette de caractériser, chez un mammifère, les interactions complexes entre cellules tumorales, cellules immunitaires et système immunitaire dans son ensemble, qui sont au coeur de la résistance à l'immunothérapie. Nos travaux préliminaires réalisés en culture cellulaire ont permis de sélectionner un nombre restreint de candidats prometteurs, mais leur validation nécessite un modèle animal possédant un système immunitaire complet et fonctionnel.

Réduction

Des statistiques prédictives ont été réalisées afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir un résultat scientifiquement fiable, tout en évitant d'utiliser plus d'animaux que nécessaire. Nous effectuons également un suivi des animaux afin de minimiser les nuissances.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo, tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid). Elles seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris par cage de 500 cm2. Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux qui permettra l’arrêt de l’expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance. Les souris utilisées dans ce projet sont maintenues dans des conditions sanitaires optimales : les animaux sont hébergés en cages ventilées, manipulés sous hotte, et les équipements, les aliments, l’eau de boisson ainsi que les enrichissements (tigettes, igloo) sont stériles. La définition précise des points limites de chaque procédure expérimentale nous permettra de limiter les nuisances subies par les animaux. Enfin, nous utilisons quand cela est possible des méthodes d'imagerie non-invasise pour le suivi des tumeurs.

Choix des espèces

La souris a été choisie car son système immunitaire présente une forte homologie avec celui de l'homme, et parce qu'il existe des outils bien établis (anticorps, techniques d'imagerie) pour étudier précisément les interactions entre cellules tumorales et système immunitaire. Les souris utilisées possèdent un système immunitaire complet et fonctionnel, indispensable pour étudier la résistance à l'immunothérapie. Des souris adultes (5 à 8 semaines) car le mélanome est un cancer de l'adulte , mâles et femelles selon les lignées tumorales utilisées, seront utilisées.

Jusqu'à quinze injections par souris, un prélèvement de tissu à l'oreille sur souris vigile et la séparation répétée des souriceaux de leur mère : 1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs os longs, leurs vertèbres et leur crâne sont prélevés après la mise à mort, pour mesurer l'effet d'un traitement administré avant et après la naissance. L'effectif de 1 440 souris n'est appuyé que sur la littérature et l'expérience du laboratoire, sans calcul rapporté. Le résumé ne nomme ni les maladies osseuses visées, qualifiées seulement de génétiques et rares, ni la molécule testée.

Objectifs

Les pathologies osseuses étudiées sont des maladies génétiques rares. L’objectif du projet est de tester en prénatal et en post-natal un traitement afin de proposer aux patients une prise en charge plus précoce.

Bénéfices attendus

Ce projet préclinique permettra d'envisager un traitement précoce et plus adapté pour ces pathologies.

Procédures

Prélèvement de tissu sur animal vigile (une fois, 5 secondes). Contention pour les injections (maximum 15 fois, une minute). Injections (maximum 15 fois, une minute). Prélèvement sanguin sous anesthésie et analgésie (une fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Le prélèvement à l'oreille provoque une douleur brève. Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention au moment de l'injection peut aussi provoquer un stress chez les souris. La séparation courte et ponctuelle des souriceaux de la mère pour le geste d'injection peut causer un stress de courte durée.

Devenir

A l’issu du projet les animaux seront mis à mort car nous prélevons les os longs, les vertèbres et le crâne afin d'étudier l'impact du traitement sur le squelette.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de tester des molécules thérapeutiques avec un traitement précoce sur l’ensemble du squelette. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de développement d’un mammifère dans sa complexité avec les nombreux types cellulaires qui interagissent.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. Il a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience sur le modèle souris.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans un environnement adapté. Les animaux subissant un prélèvement sanguin reçoivent une anesthésie générale. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole. Les points limites définis dans le projet seront strictement respectés afin que la douleur soit limitée au minimum. Les animaux présentant des signes de détresse seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour tester un traitement ayant un impact sur le squelette grâce à la similarité de développement et de structure avec l’Homme. Chez la souris, la formation du cartilage débute au stade embryonnaire E14.5 et les anomalies de croissance sont visibles au niveau des os longs et du crâne pendant la période anténatale, il est donc pertinent de commencer un traitement à ce stade de développement pour avoir un impact sur la formation osseuse. La période de traitement s'étend jusqu'à 15 jours après la naissance pour couvrir une longue période de la croissance. Nous disposons de modèles mimant bien les pathologies osseuses étudiées. L'étude de l'impact de la molécule thérapeutique est réalisée en prénatal et post-natal.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, vigile, reçoit deux ou trois administrations espacées d'au moins trente minutes, puis subit un prélèvement de deux minutes, entre les mains de personnes qui apprennent le geste. La finalité est de valider la formation réglementaire des applicateurs et des concepteurs de procédures, que le porteur décrit comme un "pré requis incontournable". Il justifie la mise à mort de toutes les souris par l'apprentissage des "multiples techniques nécessaires", et invoque "le respect de l'animal" pour expliquer qu'une personne en apprentissage ne réalise pas tous les gestes sur une même souris.

Objectifs

Le projet présenté ici constitue la partie pratique des formations initiales réglementaires en expérimentation animale (formations A et B). Ces formations étant spécialisées rongeurs, elles ciblent la connaissance des modèles de rats et souris. Elles ont reçu un avis favorable de la Commission nationale pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et sont agréées par le ministère de l’Agriculture, de l’Agroalimentaire et de la Souveraineté Alimentaire. La formation A s’adresse à toute personne devant appliquer des procédures expérimentales aux animaux, la formation B aux personnels concevant des procédures expérimentales et des projets. Ces formations sont indispensables pour la réalisation de projets scientifiques en recherche biomédicale et la dispense d’enseignement supérieur technique spécialisé en sciences du vivant. Elles constituent donc un pré requis incontournable pour toute personnes devant utiliser des animaux à des fins scientifiques. Cette formation pratique permettra d’initier les participants à la manipulation de rat et souris et illustrer les concepts fondamentaux abordés en cours. L’apprentissage technique sera focalisé sur l’approche de l’animal, contention et identification, surveillance des animaux, administrations et prélèvements de base et méthodes de mise à mort.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet sera de former de nouveaux applicateurs et concepteurs de procédures expérimentales en leur transmettant les connaissances pratiques indispensables à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques dans le respect de l’animal.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : lot 1 : animal vigile, 2 injections espacées de 30 minutes au minimum (1 minute/administration), un prélèvement (2 minutes). Lot 2 : animal vigile, 3 administrations espacées de 30 minutes au minimum (1 minute/administration), un prélèvement (2 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont stress et inconfort liés à la manipulation, aux contentions/injections/prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de permettre l’apprentissage des multiples techniques nécessaires. Pour le respect de l’animal et limiter les stress et inconfort subis, il n’est pas possible qu’une personne en apprentissage réalise tous les gestes sur une même souris.

Remplacement

L’objectif pédagogique de ce projet est un enseignement par la pratique de la manipulation, de la contention, des administrations et des prélèvements chez le rat et la souris. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux vivants. Néanmoins, les souris seront les seuls animaux vivants manipulés. Le modèle de rat ne sera abordé que sous forme de supports inertes (photos et vidéos , écorché/planches anatomiques de rat et des mannequins Koken).

Réduction

Seuls les gestes de base les plus courants sont pratiqués afin de diminuer le nombre de souris utilisées. Les gestes spécifiques/particuliers seront gérés ultérieurement par les responsables du suivi des compétences de chaque établissement utilisateur. Le nombre de souris utilisées a été calculé au plus juste pour satisfaire à la fois à la nécessité de réduction et à l’exigence d’une formation de qualité.

Raffinement

La chronologie des manipulations à enseigner sur les souris est définie de sorte que les gestes les plus délétères soient réalisés en dernier et que la procédure soit terminale afin de s’affranchir de toute souffrance inhérente à l’inexpérience des apprenants. Tout geste/attitude permettant de s'affranchir ou le cas échéant de limiter au maximum souffrance, stress ou inconfort de l’animal, sera mis en exergue. Avant chaque séance pratique, une séance théorique d’une heure sous forme de photos/vidéo détaillera les gestes qui seront à réaliser. Un encadrant est prévu pour 3-4 étudiants afin de dispenser un enseignement aussi personnalisé que possible et donc une surveillance rapprochée de chaque animal, chacun réalisant tour à tour les manipulations sous l’œil exercé des formateurs expérimentés.

Choix des espèces

Le présent projet constitue la partie pratique des formations initiales réglementaires en expérimentation animale spécialisées rongeurs. C’est donc la souris qui a été choisie comme modèle. Le modèle de rat ne sera présenté que sous forme de supports inertes (photos/vidéos, écorché/planches anatomiques de rat et des mannequins kokken) Les souris seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines) car cela correspond à l’âge fréquemment utilisé en recherche et permettra ainsi de mettre les apprenants en conditions réelles