Rongeurs

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse modifiée, laissées plusieurs mois, avant huit à vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses, en cholestérol et en sucre destiné à provoquer obésité, résistance à l'insuline, maladie du foie et athérosclérose. Suivent des mises à jeun, cinq microprélèvements de sang à la queue par test, des tests de tolérance au glucose et aux lipides sur animal vigile, et pour une partie une échographie cardiaque sous anesthésie. Les retombées annoncées se limitent à envisager un lipide comme marqueur de risque et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, quand l'obésité provoquée, elle, est immédiate. Le porteur affirme que le dialogue entre organes ne peut pas s'étudier en culture cellulaire et que le projet ne s'envisage qu'à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les maladies métaboliques telles que l’obésité sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète, le cholestérol ou la maladie du foie gras. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Parmi les mécanismes suggérés dans la littérature scientifique, une modification de certaines cellules immunitaires pourrait avoir un rôle important. Parmi ces éléments, un lipide essentiel pourrait être crucial. Cependant, le mécanisme d’action n’est pas compris pour le moment. Nous souhaitons donc dans ce projet bloquer la production de ce lipide essentiel uniquement dans les cellules immunitaires identifiées comme importantes afin d’identifier les mécanismes que ce lipide contrôle, notamment dans la progression des troubles qui sont associés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés à l’émergence des maladies liées à l’obésité et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’athérosclérose ou l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des macrophages dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des macrophages dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager ce lipide comme un marqueur pertinent, et ainsi d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et finalement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une greffe de moelle osseuse qui implique une irradiation préalable (moins de 15 min) et une injection de cellules de moelle modifiées, sous anesthésie (5 min). Après plusieurs mois de repos pour que la greffe ait bien prise, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie. A la suite du régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h). Les réponses des souris à une ingestion de sucre ou de graisse seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements de sang à la queue (5) sur de courtes périodes (moins de 2h). De même, la réponse des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront distribuées équitablement afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur plusieurs jours grâce à des cages munies de divers capteurs. Enfin, une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie et un électrocardiogramme. Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les souris seront exposées à des régimes riches en graisses, en cholestérol, et en sucre pendant plusieurs semaines (8 à 24) afin d’induire une obésité et de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, maladies du foie non alcoolique, troubles du rythme, athérosclérose, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à l’obésité développée. L’injection de progéniteurs de moelle-osseuse aux souris pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération de la fonction des cellules immunitaires dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués

Réduction

Le projet impliquera 560 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en graisse utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 10 à 12 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour supporter la transplantation, seront utilisées. Les régimes obésogènes seront mis en place à l'âge de 12 à 16 semaines, afin de laisser le temps aux souris de récupérer de leur transplantation.

Sept jours enfermées seules dans une cage calorimétrique, sans congénères et sans enrichissement : 2 160 souris vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant hormonal sous la peau lors d'une chirurgie d'une trentaine de minutes, puis des injections deux fois par semaine, une partie recevant en plus un régime gras pendant près de trois mois. Le déséquilibre hormonal ainsi provoqué doit reproduire un syndrome ovarien chronique et entraîne, selon le texte, prise de poids, résistance à l'insuline, anxiété accrue et agressivité perturbant la cohabitation. Les femelles utilisées ont 5 à 7 semaines, un stade prépubère retenu pour observer l'effet d'une perturbation hormonale prolongée sur le développement ovarien.

Objectifs

Certaines maladies chroniques touchant les ovaires peuvent entraîner des troubles hormonaux importants chez les femmes. Ces affections apparaissent souvent dès l’adolescence et peuvent évoluer au cours de la vie. Elles se manifestent notamment par des irrégularités menstruelles, une production excessive d’hormones masculines, une difficulté à ovuler ou à concevoir un enfant, ainsi que par la formation de petits kystes dans les ovaires. Ces troubles sont parfois associés à une prise de poids, à des problèmes de peau (acné), à une pilosité excessive ou à une chute de cheveux. Ils peuvent également augmenter le risque de développer d'autres maladies comme le diabète, l’hypertension ou certains troubles cardiovasculaires. L’origine de ces pathologies reste encore mal comprise, bien que des facteurs génétiques et liés au mode de vie soient probablement impliqués. Ces maladies peuvent aussi avoir un impact psychologique important, notamment en raison de l’infertilité ou de la modification de l’apparence physique. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contribuent à l’apparition et au maintien de ces troubles, afin d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, qui présente des caractéristiques proches de celles observées dans ces maladies. Nous testerons si l’activation ou la régulation de certains processus biologiques naturels permet de limiter les manifestations les plus marquantes de la maladie. L’objectif est d’identifier de nouvelles stratégies pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes concernées, en agissant à la source des déséquilibres hormonaux et métaboliques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider, au sein de plusieurs modèles expérimentaux, une nouvelle approche thérapeutique ciblant les déséquilibres biologiques impliqués dans une maladie hormonale chronique des ovaires. Cette affection fréquente chez les femmes en âge de procréer est souvent sous-diagnostiquée. Elle constitue l’une des principales causes de troubles de la fertilité, et elle s’accompagne fréquemment de complications métaboliques, cardiovasculaires et psychologiques, ayant un impact significatif sur la santé globale et la qualité de vie des personnes concernées. Le développement d’un traitement capable de corriger les dérèglements hormonaux et métaboliques associés à cette pathologie pourrait contribuer à améliorer la fonction reproductive, à prévenir les complications à long terme, et à limiter l’apparition de maladies associées. En améliorant la prise en charge globale, cette approche permettrait aussi de réduire les coûts médicaux et sociaux liés à ces troubles. À terme, cette stratégie pourrait déboucher sur des solutions thérapeutiques innovantes et mieux tolérées, destinées à améliorer durablement la santé des patientes.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (environ 30 minutes), précédée et suivie d’une analgésie. Certaines souris recevront un régime alimentaire riche en graisses jusqu’à la fin de la procédure (durée du régime : 80 et 87 jours). Elles recevront des injections sur animaux vigiles, deux fois par semaine (quelques secondes). Certaines souris recevront également 4 à 5 injections d’une molécule supplémentaire (quelques secondes) sur animaux vigiles en 1 semaines ou en 4 semaines. La composition corporelle sera mesurée deux fois par une méthode non invasive, sans anesthésie (durée inférieure à 2 minutes). Elles seront également hébergées individuellement en cage (durée 7 jours) pour permettre de mesurer en continu des paramètres physiologiques tels que la consommation d’oxygène, la production de dioxyde de carbone, l’activité locomotrice.

Impact sur les animaux

Les souris recevront un implant hormonal sous-cutané destiné à reproduire les déséquilibres endocriniens caractéristiques de certaines maladies chroniques des ovaires. Cette intervention chirurgicale peut entraîner une réaction inflammatoire locale et un inconfort transitoire au site d’implantation. L’anesthésie générale utilisée peut provoquer une hypothermie, une dépression respiratoire, voire des troubles du réveil. Une mauvaise cicatrisation de la plaie, une dessiccation des tissus ou une gêne post-opératoire peuvent également survenir. Le déséquilibre hormonal induit peut entraîner une prise de poids, une résistance à l’insuline, des troubles glycémiques, une baisse de l’activité physique, une sécheresse cutanée, une modification du pelage, une anxiété accrue, ainsi qu’une augmentation de l’agressivité pouvant perturber la cohabitation des animaux. Une altération du comportement exploratoire est également observée dans certains cas. Certaines souris recevront des injections intrapéritonéales répétées, ce qui peut générer un stress lié à la contention, une douleur transitoire au point d’injection, ainsi qu’un risque d’irritation locale ou d’adhérences. Des infections, bien que rares, peuvent survenir aux sites d’injection ou de prélèvement. Les animaux seront également placés, pendant une semaine, en hébergement individuel dans des cages calorimétriques. Ce dispositif, indispensable à la mesure de paramètres métaboliques individuels, impose l’absence temporaire de cohabitation et d’enrichissement, ce qui peut induire un stress social et sensoriel. Le passage en cage calorimétrique ainsi que la manipulation répétée des animaux au cours du protocole peuvent également constituer des facteurs de stress supplémentaires.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Le laboratoire réalise un grand nombre d’expérimentations pour lesquelles les animaux ont été remplacés par des méthodes alternatives. Ces approches incluent notamment l’utilisation de modèles in vitro et d’outils in silico, utilisés dans les phases exploratoires pour limiter le recours aux animaux. Cependant, l’avancée du projet nécessite la mise en place d’expériences, justifiées, qui impliquent de l’expérimentation animale. L’étude des déséquilibres hormonaux et métaboliques liés aux maladies chroniques des ovaires implique des interactions complexes entre systèmes endocrinien, ovarien, nerveux et immunitaire, qui ne peuvent être fidèlement reproduites dans des systèmes alternatifs. Aucun modèle in vitro ou in silico ne permet actuellement d’évaluer l’impact d’une modulation hormonale prolongée sur l’ensemble des fonctions métaboliques, comportementales et reproductives. Le modèle animal reste donc indispensable pour valider les effets des interventions thérapeutiques dans un organisme entier, dans des conditions mimant au plus près la physiopathologie humaine.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2160 souris. Afin de limiter le nombre d’animaux témoins, les expérimentations seront regroupées autant que possible. Plusieurs tissus seront prélevés et analysés par différentes approches biologiques afin d’exploiter pleinement les données obtenues. Ces échantillons seront également partagés avec des collaborateurs, ce qui contribuera à réduire le nombre total d’animaux nécessaires. La taille des effectifs a été déterminée à l’aide d’un calcul de puissance, permettant d’utiliser le nombre minimal d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables. Des analyses statistiques seront effectuées pour interpréter correctement les effets observés et garantir la robustesse des conclusions.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront la réglementation en vigueur et seront optimisées en collaboration avec le personnel de l’animalerie afin d’assurer le bien-être des animaux. Les souris auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum, et leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification pour favoriser leur confort et leur comportement naturel. Une surveillance rigoureuse et régulière sera mise en place pour identifier rapidement tout signe de mal-être, tel que des yeux mi-clos, une réduction de l’activité ou des comportements anormaux, permettant ainsi une intervention précoce si nécessaire. Des points limites spécifiques à chaque type d’expérience seront définis afin de minimiser toute douleur ou souffrance. Une perte de poids significative, une altération marquée de l’état général ou l’apparition de signes cliniques sévères (difficultés respiratoires, prostration) entraîneront une évaluation immédiate et, si nécessaire, l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. Les réactions au site d’implantation et aux injections seront surveillées régulièrement afin de détecter précocement toute inflammation, infection ou complication locale. Des interventions seront prévues en cas de nécessité, incluant l’application d’antiseptiques ou l’administration d’analgésiques adaptés aux animaux présentant des signes de douleur. En cas de difficulté d’alimentation, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage pour garantir un apport nutritionnel suffisant. L’ensemble du personnel impliqué dans ce projet est spécifiquement formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale et suit une formation continue afin d’assurer des manipulations sécurisées et respectueuses du bien-être animal. Toutes les interventions seront réalisées dans le strict souci de réduire l’inconfort des animaux, notamment grâce à l’utilisation d’anesthésie et d’analgésie adaptées ainsi que de lampes chauffantes pour limiter l’hypothermie post-anesthésique. Les femelles présentant des signes d’agressivité liés à l’hyperandrogénie seront placées en hébergement individuel pour éviter les blessures et le stress liés aux interactions sociales conflictuelles. Si nécessaire, des ajustements en temps réel seront apportés aux conditions d’hébergement et aux protocoles expérimentaux afin d’améliorer le bien-être des animaux tout en garantissant la rigueur scientifique du projet.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur des considérations scientifiques et méthodologiques. La souris est un modèle bien établi, bénéficiant d’une expertise approfondie en élevage, en techniques expérimentales et en suivi vétérinaire. Le choix de la souris repose sur des critères scientifiques et pratiques. Il s’agit d’un modèle largement utilisé, pour lequel les connaissances en matière de manipulation, d’élevage et de suivi vétérinaire sont bien établies. Ce modèle permet de reproduire de manière fiable les manifestations cliniques observées dans certaines pathologies humaines, notamment en ce qui concerne les déséquilibres hormonaux, les troubles métaboliques et comportementaux. Les animaux utilisés dans ce projet présentent des caractéristiques compatibles avec l’étude des effets d’un déséquilibre hormonal prolongé. Ils sont viables, fertiles et ne présentent pas d’anomalies phénotypiques connues. Les expérimentations seront réalisées chez des femelles âgées de 5 à 7 semaines, correspondant à une période prépubère. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour étudier l’impact des perturbations hormonales sur le développement ovarien et les fonctions métaboliques à long terme.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant deux fois seize heures en cage métabolique individuelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit cinq injections quotidiennes de diurétique en état vigile, d'autres subissent une chirurgie sous anesthésie pour la pose d'une minipompe délivrant une molécule en continu, les souris témoins étant elles aussi ouvertes puis suturées pour rester comparables. Le protocole associe un régime pauvre en sel et une eau enrichie en oxalate afin de provoquer une atteinte rénale par cristaux, l'objectif déclaré étant de comprendre une néphropathie mal connue chez les patients déshydratés. Les critères d'arrêt sont la prostration ou la perte de 10 % du poids initial. Sur les atteintes, le porteur affirme que les souris ne seront pas impactées par la déshydratation grâce à la brièveté du protocole, tout en indiquant que l'ajout d'une autre molécule pourrait induire une insuffisance rénale modérée.

Objectifs

Notre projet porte sur l’étude de l’absorption digestive de l’oxalate dans le côlon en situation de déshydratation. L’oxalate est une petite molécule éliminée dans l’urine, qui précipite avec le calcium urinaire, formant des cristaux d’oxalate de calcium dans les reins et pouvant entrainer une insuffisance rénale aigue liée à une néphropathie oxalique dite « cristalline ». L’hyperoxalurie peut être génétique (production accrue d’oxalate par le foie) ou dgestive (absorption accrue de l’oxalate dans le côlon. Cependant, certains patients développent des insuffisances rénales aigües avec précipitation d’oxalate de calcium dans des circonstances de déshydratation extracellulaire (dû à des vomissements et/ou diarrhées, diurétiques...) sans que l’on identifie de cause classique d’hyperoxalurie. Le transporteur « DRA » au niveau colique permet le transport du chlore et de l'oxalate. Notre but est de montrer, lors d'un état de déshydratation, une augmentation de stimulation de ce transporteur, induisant ainsi une augmentation de l’absorption digestive de l’oxalate et par conséquent une augmentation de l’oxalate urinaire. L’objectif est de comprendre la physiopathologie d’une néphropathie cristalline encore mal connue, probablement plus fréquente que supposé, et de mieux comprendre la physiopathologie de l’hyperoxalurie suite à une déplétion sodée importante. Cette étude permettra également de déterminer la mise en place des mesures préventives spécifiques lors des épisodes de déshydratation extracellulaire chez les patients atteints de syndrome de grêles court ou autres conditions à risque de néphropathie oxalique.

Bénéfices attendus

Ce projet aura un impact clinique important si nos hypothèses se confirment. La néphropathie oxalique est caractérisée par la précipitation de cristaux d’oxalate et de calcium dans les tubules rénaux. Cette néphropathie peut entraîner une insuffisance rénale terminale dans 50 pourcents des cas. Sa fréquence est non négligeable. Cette prévalence augmente drastiquement dans les groupes de patients à risque, notamment les situations de malabsorption, qui concernent jusqu'à 50 pourcents des diagnostics de néphropathie oxalique. Ce projet permettrait de confirmer la voie innovante d'un potentiel effet propre de la déplétion sodée sur l'augmentation de l'activité de transport digestif de l'oxalate, menant ainsi à une hyperoxalurie digestive, tout en se passant de la voie physiopathologique classique malabsorptive (sus-mentionnée). En effet, les patients atteints de diarrhée chronique avec malabsorption (comme dans les situations de syndrome de grêle court, de maladie de Crohn...) sont affectés par une hyperoxalurie massive qui conduit au développement d'une insuffisance rénale. Si cette oxalurie est liée en partie à l'effet de l'angiotensine 2, cela permettra de prendre en compte la part liée à la déshydratation dans l’apparition de cette néphropathie, et de prévenir davantage le déclin de la fonction rénale en adaptant les apports hydro-sodés chez ces patients.

Procédures

Une partie des souris seront sous régime alimentaire pauvre en sel ou enrichie en oxalate (eau de boisson) pendant 5 jours ou 14 jours. Toutes les souris seront exposées à 2 reprises à un recueil urinaire en cages métaboliques en état vigiles au cours de chacune des procédures (15 jours avant le traitement et jour 5 ou jour 14 après le premier traitement) sur une durée de 16h impliquant un hébergement individuel. Certaines souris auront également des injections quotidiennes d'un diurétique pendant toute la procédure (5j), soit 5 injections au total sur souris vigile (durée de l’acte moins de 5 secondes). D'autres souris seront également soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant la mise en place d'une pompe osmotique délivrant en continu une molécule (la mise en place de la pompe dure environ 5 minutes). Enfin, à l’issue de la période de maintien, tous les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin (durée de cet acte 1 minutes) sous anesthésie et analgésie qui sera suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées en diurétique ou en diluant seul administré quotidiennement. L’exposition à une alimentation pauvre en sel ne devrait pas avoir d'impact majeur sur les animaux qui seront en déshydratation extracellulaire modérée. Les souris ne seront pas impactées par cette déshydratation modérée grâce à la durée courte du protocole. En revanche, l'ajout de petites doses d’une autre molécule associé à ce régime pourrait induire une insuffisance rénale modérée, qui ne devrait pas avoir de retentissement pour les animaux grâce à une surveillance adaptée (mesure du poids). Les changements de régimes pourraient induire un léger stress chez les souris qui sont néophobes (peur de la nouveauté). Les injections sont nécessaires pour la mise en place du modèle pourraient induire un stress lors de la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille). Dans l’un des modèles, des mini pompes seront installées sous anesthésie générale/analgésie pour délivrer des molécules en continu ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Comme pour toute chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie (rare), elle peut induite des douleurs/irritations notamment au niveau de la suture, ou encore des complications liées à l'anesthésie (stress thermique, détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire). De même, les souris contrôles devront également être anesthésiées, ouvertes et suturées et recevront 2 injections d’une analgésie pour garantir le même traitement des souris et éviter un bais suite à la chirurgie et de l’injection. Le recueil d'urine en cage métabolique peut induire un stress social pour les animaux. Enfin, un prélèvement sanguin unique et terminal sera effectué en fin de période, sous anesthésie et analgésie sans autre contrainte que la piqure permettant l’anesthésie correspondant à un stress lié à la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le mécanisme du système rénine angiotensine suite à une déplétion sodée avec ou sans apport d'oxalate sur les transporteurs rénaux et du tube digestif. Pour cela, nous souhaitons mettre en évidence la physiopathologie de plusieurs organes (reins, colon, foie) lors d'une déplétion sodée et l'expression des transporteurs d'oxalate ainsi que la réponse du système rénine angiotensine suite à ce stimulus. L'implication de plusieurs organes avec une supplémentation en oxalate (alimentation) et d'un traitement ne nous permet pas de réaliser ces procédures sur des cellules ou des organoïdes. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable. Les essais thérapeutiques sur le modèle d'insuffisance rénale ne peuvent être réalisés que sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle. La taille des effectifs a été établis grâce à un calcul de puissance pour prendre en compte les risques afin de réduire au maximum d’animaux utilisés. Le nombre de 10 animaux par groupe est issu notamment de l’expérience dans le modèle connu de l’équipe. Un calcul de puissance nous a permis de déterminer un nombre minimal de 8 souris par groupe, auquel nous préférons ajouter un pourcentage de sureté expérimentale et pour pallier aux potentiels variabilités interindividuelles, soit 10 souris par groupe. Pour des raisons de reproductibilité, nous réaliserons une deuxième série, soit 20 souris par groupe. De plus, nous utiliserons des tests afin de prendre en compte l’effectif des souris par groupe et pourvoir obtenir des résultats fiables et les interpréter. Nous utiliserons également d’autres tests pour la comparaison de plusieurs groupes. Le nombre d'animaux prévu est de 240 souris à ratio égale de mâles et femelles de 3 mois.

Raffinement

La prise hydrique est contrôlée lors du change de biberons et si nous observons un groupe plus ou moins déshydraté, le personnel pourra ajouter de la nourriture hydratée directement dans la cage. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), d’un dôme en cellulose et de morceaux de bois à ronger. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Si une agressivité est observée, les souris seront placées en hébergement individuel pour une durée de 5 heures. Lors du regroupement au décours des 5 heures, les cages seront enrichies avec des cocoons et de la sizale en plus. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de 10 pour cent du poids initial (les animaux seront pesés tous les jours). Le recueil d'urine n'est pas invasif et les animaux seront habitués aux cages métaboliques. Les points limites seront surveillés tout au long de la procédure par du personnel qualifié (écarts de poids, apparence physique externe, changement de comportement, évolution des signe cliniques, degré d’activité). Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et repérer tout saignement et/ou risque d'infections. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. Des mini-pompes osmotiques seront installées, sous anesthésie générale, sous la peau des souris ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Un analgésique sera donné aux souris 30 min avant le début de la chirurgie puis 5-6h après. Si des signes de douleurs persistent et sont détectés 20 heures après la chirurgie, l’analgésie pourra être injectée une troisième fois. Concernant la chirurgie, si au-delà de 48 heures post chirurgie, les souris présentent toujours des signes de douleur ou agitation, nous considèrerons que ce point limite nuit au bien-être animal et la souris sera euthanasié.

Choix des espèces

Le protocole ne peut pas être réalisé sur des cellules ou organoïdes, mais afin de pouvoir étudier la physiologie de plusieurs organes dans son ensemble, cela doit être réalisé sur un organisme entier. Le modèle murin permet d’avoir des résultats fiables en limitant au minimum le nombre d’animaux nécessaires ainsi que l’impact du protocole sur le bien-être des animaux. Pour les procédures, nous utiliserons des souris de 3 mois, âge à partir duquel les souris seront assez robustes pour supporter 16 heures dans une cage métabolique (cage individuelle avec grille avec un accès illimité à la boisson) et obtenir une quantité suffisante d'urine. Nous achèterons des souris qui auront 11 semaines et auront 1 semaine d’acclimatation avant les protocoles. Les souris auront donc 12 semaines au moment du protocole.

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer 48 heures seule en cage à métabolisme, sur une grille métallique de surface réduite. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent quinze jours d'un médicament qui reproduit les symptômes du syndrome de Gitelman, jusqu'à quinze jours de gavages deux fois par jour avec un risque de fausse route, deux prélèvements sanguins sous anesthésie, ou une chirurgie sans réveil pour prélever leurs reins. Le porteur écrit qu'aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure, et qu'une souris dont l'état se dégrade en cage à métabolisme est ramenée en hébergement classique avant le franchissement des points limites, sa mise à mort pouvant ensuite être envisagée.

Objectifs

Le syndrome de Gitelman est une maladie génétique rare conduisant à une perte rénale de sel qui s’accompagne d’une déshydratation modérée, d’une perte rénale de potassium et de magnésium ce qui provoque une baisse de leur concentration plasmatique (hypokaliémie et hypomagnésémie). La prévalence de cette maladie est de 1 sur 40000. Ce syndrome est dû à des mutations inactivatrices d’un gène codant pour un co-transporteur sodium et chlorure. A noter, qu’il existe un inhibiteur pharmacologique (la famille des thiazides) utilisé dans le traitement de l’hypertension qui reproduit les effets de ces mutations. L’hypokaliémie chronique entraine souvent de la fatigue et des troubles du rythme cardiaque. Des protéines participent à la conservation du potassium et ce projet vise à étudier si deux d’entre elles pourraient être mises en jeu dans le syndrome de Gitelman pour limiter la perte de potassium et l’hypokaliémie.

Bénéfices attendus

La découverte récente d’un lien entre un facteur de croissance, un transporteur rénal de potassium et la capacité du rein à retenir le potassium, nous a amené à envisager que cette voie pourrait être mis en œuvre dans le contexte du syndrome de Gitelman. Notre projet, qui utilisera 624 souris mâles et femelle invalidées ou non pour les gènes codant soit pour facteur de croissance soit pour transporteur de potassium permettra d’évaluer le rôlr de cette voie dans ce contexte pathologique ce qui pourrait permettre d’envisager d’agir dessus pharmacologiquement au bénéfice des malades. Par ailleurs, la mesure de du facteur de croissance dans le plasma ou l’urine des patients, pourrait devenir un outil diagnostique pour évaluer l’état de déplétion potassique de la personne considérée.

Procédures

Certains animaux seront traités avec un agent pharmacologique pendant 15 jour afin de mimer les symptômes du syndrome de Gitelman selon différentes méthodes : par injection 1 fois par jour sur animal vigile (quelques secondes par animal), ou via l’alimentation ou l’eau de boisson en prise spontanée.. Une partie des animaux subira une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Pour une autre partie des animaux et afin de mesurer l’effet du traitement pharmacologique, deux recueils urinaires sur animal vigile seront réalisés ce qui nécessitera de les placer 48 heures en cage à métabolisme (24h d’habituation et 24h pour le recueil). Toujours pour évaluer l’effet du traitement, nous effectuerons, également, 2 prélèvements sanguins à 9 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal). Afin de documenter la voie de signalisation impliquée dans les effets du traitement pharmacologique, une partie des animaux sera soumise à 6 ou 15 jours de gavages deux fois par jour (30 secondes par animal) avec l’inhibiteur d’une protéine et subira un prélèvement sanguin unique sous anesthésie (1 minute par animal) pour analyser si l’inhibition de cette protéine affecte l’effet du traitement. Toutes les souris sont euthanasiées en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions prévues chez la souris sont connus car celles-ci ont été et sont utilisées en routine dans d’autres projets. Une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (risque d’arrêt cardio-respiratoire) pouvant entrainer une hémorragie (stress hémodynamique). Pour le prélèvement de leurs reins, certains animaux seront également sujet à une chirurgie sans réveil sous anesthésie et antalgie susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire (risque d’arrêt cardio-respiratoire). En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés individuellement (stress social) et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite (inconfort). Des animaux subiront également un gavage qui pourrait conduire à une fausse route (étouffement).

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure. A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences physiopathologiques sur l’équilibre de la balance potassique induit par un syndrome de Gitelman. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 624 souris. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous l’avons calculé au plus faible à l’aide de tests statistiques et sur la base de notre expérience. Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et qui pourraient impacter négativement certains résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles ou si nous constatons que certaines de nos hypothèses concernant l’implication de nos protéines d’intérêt ne sont pas validées.

Raffinement

Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre sur cette grille ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier en n’étant plus en contact permanent avec la grille, ce dispositif n’altérant pas le recueil d’urine. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation classique avant que son état ne se détériore si ces points devaient être franchis. Le suivi de ces points limite continuera afin de vérifier s’ils reviennent à la normal. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagé. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil. L’ensemble des expériences sera mené dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur, par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associés à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles, jeunes adultes matures sexuellement (âgées de 8 à 15 semaines), afin d’étudier le syndrome de Gitelman car c’est souvent dans cette période de la vie que les symptômes de cette maladie se manifestent chez l’Homme.