Rongeurs
Étude de l’efficacité d’une thérapie génique dans un modèle d’hypertension artérielle pulmonaire chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
140 rats de huit semaines vont être utilisés, chacun passant au moins cinq anesthésies, de l'induction de l'hypertension pulmonaire aux trois échocardiographies hebdomadaires puis au cathétérisme cardiaque final. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère et tous les rats sont tués, leur cœur et leurs poumons analysés après la mort, le porteur annonçant par ailleurs un total de 120 animaux quand la déclaration en compte 140. À partir du quatorzième jour, la maladie provoquée entraîne un inconfort respiratoire, un essoufflement à l'effort, une fatigue et une mobilité réduite, jusqu'à une insuffisance cardiaque droite. Le porteur choisit de jeunes adultes parce que l'induction de l'hypertension y est "plus rapide et plus sévère", et annonce une utilité "majeure" pour des patients dépourvus de traitement, quand le projet en reste à valider l'intérêt d'une cible chez le rat.
Objectifs
Le projet vise à mieux comprendre et à améliorer le traitement d’une maladie rare et grave : l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). La pathogenèse de l’HTAP est complexe, et implique une dysfonction vasculaire, des facteurs hémodynamiques et environnementaux, ainsi que des prédispositions individuelles. En juin 2013, une étude scientifique commune à notre laboratoire de recherche et un laboratoire américain a démontré chez des patients atteints d’hypertension pulmonaire, l’existence de mutations dans le gène codant le canal potassique KCNK3. De plus, nous avons récemment mis en évidence dans différents types d'HTAP chez l'homme ainsi que dans différents modèles animaux d'HTAP, une perte d'expression et de fonction du KCNK3. Ces travaux démontrent qu’une perte d'expression ou de fonction du canal KCNK3 est un élément crucial initiateur de l'HTAP. Ainsi, nous voulons restaurer l'expression pulmonaire de KCNK3, par une approche de thérapie génique afin de réduire le développement de l’HTAP.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de valider l'intérêt de notre approche thérapeutique pour réduire le développement de l’hypertension pulmonaire. Les patients atteints de cette pathologie n'ayant actuellement aucun traitement spécifique, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
L'induction de l'hypertension artérielle pulmonaire sera réalisée sous anesthésie. Tous les animaux subiront des échocardiographies, chaque semaine (au nombre de 3), réalisée sous anesthésie (environ 15 min par rats). Les prélèvements sanguins à la veine caudale, réalisés sous anesthésie, seront réalisés au moment des échocardiographies de fin de procédure. À la fin des procédures, tous les animaux subiront un cathétérisme cardiaque sous anesthésie (environ 20 minutes par animal). Toutes les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Comme décris précédemment, l'induction de l'hypertension artérielle pulmonaire sera réalisée sous anesthésie générale. Celle-ci va conduire à des effets secondaires important tels que de l'inconfort respiratoire, de l'essoufflement à l'effort ou encore la fatigue conduisant à une mobilité réduite de l'animal, à partir du 14ème jour. Les réveils des anesthésies réalisées pour les échographies peuvent également être une source de stress pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure, à moins qu'ils aient atteint leurs points limites avant celle-ci. Des analyses post-mortem seront alors réalisées ensuite sur le cœur et les poumons.
Remplacement
L’objectif de recherche est de mieux comprendre le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire et de déterminer la pertinence d'une nouvelle cible thérapeutique. Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte dit normal ou sain (physiologique) et un contexte ou l'animal est malade (physiopathologique). Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'hypertension artérielle pulmonaire qui est un processus complexe.
Réduction
Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque est réalisé à la fin de l'expérimentation afin de collecter un maximum de données. Le nombre total de rats utilisés sera de 120 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de déterminer le plus précisément possible le nombre nécessaire et suffisant d'animaux, nous avons utilisé un test statistique adéquat.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques. À la fin des expérimentations, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes. L'eau ainsi que la nourriture sera en illimité pour les animaux. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaux seront donc surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites précoces, notamment la perte de poids) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress.
Choix des espèces
Les rats présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme, en faisant le meilleur modèle pour ce projet. Il est indispensable d'évaluer l'efficacité d'une thérapie génique sur un modèle animal avant de pouvoir tester cette approche chez l'homme. Jeune adulte (8 semaines, 200g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide et plus sévère. De plus, chez l'Homme l'hypertension artérielle pulmonaire se développe chez les jeunes adultes.
Réponse au traitement et nouvelles thérapies contre l’infection par le VHD (EU 2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Greffées avec des cellules de foie humain injectées dans la rate, 98 souris chimériques vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Environ une greffe sur dix échoue, et ces souris développent en deux à trois semaines une insuffisance hépatique aiguë avec perte de poids rapide. Les autres sont infectées par les virus des hépatites B et D, reçoivent un traitement quotidien par injection ou gavage, et passent huit prélèvements sanguins en seize semaines, le porteur signalant que ces prélèvements peuvent provoquer une inflammation et une cécité et que le gavage peut perforer l'œsophage ou l'estomac. Les deux animaux d'un couple reproducteur sont tués dès qu'aucune portée n'arrive depuis plus de trois mois, et celles dont la greffe a échoué sont tuées parce qu'elles ne pourront pas être utilisées ailleurs.
Objectifs
Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération de la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le cancer du foie. Si certains traitements permettent aujourd’hui le contrôle de l’infection par le VHB, les traitements disponibles contre le VHD sont non satisfaisants, malgré le développement récent de nouvelles molécules. Notamment, le bulevirtide, inhibiteur d’entrée du virus dans les cellules, bénéficie d’une autorisation conditionnelle d’utilisation en Europe depuis 2020. Cependant, tous les patients ne répondent pas au traitement bulevirtide et les causes de cette variation entre patients est inconnue. De nouvelles stratégies de traitements contre le VHD et la compréhension de la réponse au traitement par bulevirtide sont indispensables. Dans ce contexte, nous avons récemment caractérisé l’activité anivirale d’une molécule utilisée dans le traitement contre l’arthrite rhumatoïde, l’upadacitinib, contre le VHD. Ce projet combine à la fois une analyse de la réponse au traitement par bulevirtide chez les souris co-infectées par le VHD et le VHB, à la recherche de marqueurs de la réponse au traitement, et le test in vivo de l’upadacitinib. Il s'agit d'un projet multisites.
Bénéfices attendus
La thérapie antivirale de dernière génération pour l'infection par le VHD est le bulevirtide, qui conduit à une diminution significative de la charge virale dans les études cliniques chez 70% des patients. Cependant, aucun marqueur de réponse au traitement n'est disponible et des antiviraux plus efficaces sont nécessaires pour améliorer la durée de vie et la qualité de vie des patients infectés par le VHD. Cette étude vise à identifier des marqueurs pour la réponse au traitement par le bulevirtide et le risque de cancer. De plus, l'étude fournira une preuve de concept préclinique en utilisant une nouvelle molécule antivirale comme candidat médicament.
Procédures
Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux après anesthésie générale et analgésie. Cette chirurgie est réalisée en moins de 10 minutes. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie locale sera réalisé 3 mois après la greffe afin de nous assurer de la prise de greffe. Ce prélèvement prend moins d’une minute à être réalisé. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigils après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Cette injection prend moins d’une minute à être réalisée. Les traitements seront administrés de façon quotidienne par injection sous-cutanée après désinfection à l’alcool, ou par gavage oral sur animaux vigils. Injections et gavages oraux sont réalisés en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 16 semaines, soit un total de 8 prélèvements. Ces prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prennent moins d’une minute à être réalisés. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole sous anesthésie générale, réalisé en 1 à 2 minutes. Les animaux seront transportés d'un site à l'autre.
Impact sur les animaux
Les souris chez lesquelles la prise de greffe sera infructueuse (environ 10% des animaux) vont développer une insuffisance hépatique aigüe en 2-3 semaines du fait de la mort des cellules du foie murin, qui se traduit par une perte de poids rapide. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer inflammation et cécité. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une inflammation et/ou d’une induration. Le gavage oral peut également entrainer une inflammation et des saignements/perforation de l’œsophage ou de l’estomac. Les traitements peuvent entrainer une augmentation temporaire de la concentration en acides biliaires dans le sang, qui est asymptomatique et sans conséquence sur la santé. Les traitements peuvent également être associés à une élévation de niveau des enzymes du foie dans le sang ainsi qu’à une augmentation des lipidiques et cholestérol dans le sang. Le transport d'un site à un autre peut générer du stress.
Devenir
Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenue depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et D ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont sur des lignées cellulaires et sur des cellules du foie humain afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses et présentent de nombreuses modifications de leur ADN par rapport à des cellules normales du foie. De plus l’utilisation de cellules du foie issues de patients nécessiteraient un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation et la quantité de tissu n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser les modifications de l’ADN. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé grâce aux données d’une étude précédente sur des souris humanisées. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire et des résultats statistiquement fiables. Pour réduire le stress engendrer par le transport des animaux, les cages de transport seront enrichies avec un baton et du coton ou de la frisure pour que les animaux puissent faire un nid. La température sera maintenue suffisamment élevée pour que les souris puissent maintenir leur température corporelle. Les cages seront équipées de couvercles filtrants afin de garantir leur protection des pathogènes extérieurs. A leur arrivée, une période d'acclimatation de 2 semaines serra respectée afin de permettre aux animaux de s'habituer au nouvel environnement.
Choix des espèces
Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies du foie et virales sur les cellules du foie humain et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe, afin de faciliter l’intervention, et à un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus, la prise de greffe optimale étant à 3 mois post-greffe.
Infections à Staphylococcus aureus : nouvelles thérapies et réponses de l’hôte dans un modèle murin d’infection cutanée (Modification) e.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rasées la veille puis infectées sous la peau par un staphylocoque doré, 3 960 souris subissent dix prélèvements sanguins sur onze jours et des séances d'imagerie sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère, et toutes les souris sont tuées, leur peau infectée étant prélevée pour analyse. Le porteur décrit un dos courbé, une prostration, un poil hérissé et des nécroses au site d'infection, avec mise à mort si ces signes persistent plus de vingt-quatre heures. La survie des souris non traitées sert de comparateur, sans que le porteur indique combien meurent de l'infection elle-même, ni comment l'ajout de 1 080 animaux lié au changement de voie d'administration a été calculé.
Objectifs
Staphylococcus aureus est une bactérie à la fois commensale et pathogène opportuniste. C’est l’agent le plus souvent isolé dans les infections de la peau et des tissus mous et, de manière intéressante, plus de la moitié des infections du sang (bactériémies) identifiées à l’hôpital dérivent de ce type d'infection. Concernant le traitement, s’il existe un traitement majoritairement utilisé contre les infections à S. aureus, le nombre de souches résistantes est en croissance, faisant de la recherche de nouvelles molécules actives contre ce type d’infection un véritable besoin thérapeutique et financier. Dans le cadre d’une collaboration avec des chimistes, nous avons identifié un certain nombre de nouvelles molécules de synthèse ayant une forte activité antibactérienne in vitro contre différentes espèces de bactéries parmi lesquelles S. aureus. Le but de ce projet est donc de confirmer les résultats obtenus in vitro sur des cultures de S. aureus, dans un modèle murin d’infection cutanée. Il fait suite à un précédent projet dont le but était de tester ces nouvelles molécules dans un modèle de bactériémie à S. aureus. En raison de la nécessité d'utiliser une nouvelle voie d'administration des molécules testées (voie orale), une modification du projet initial est nécessaire avec un ajout de 1080 animaux.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Staphylococcus aureus. S’il existe un traitement antibiotique contre ce type d’infection, de plus en plus de souches résistantes apparaissent, et la découverte de nouveaux traitements constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.
Procédures
Les souris seront rasées au niveau du site d’infection, la veille de l’infection puis infectées par voie sous cutanée. Trois traitements avec les composés à tester seront ensuite comparés : (i) traitement par injection par voie sous cutanée, (ii) une application à l’aide d’une crème, et (iii) une administration par voie orale (modification). Des prises de sang seront effectuées sur les souris vigiles par prélèvement dans la veine caudale 4h, 24h, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 et 11 jours post infection. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées par ailleurs. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux non traités. Une souche de S. aureus sera aussi utilisée, permettant un suivi de l’évolution de l’infection et de l’efficacité du traitement par imagerie intra vitale sur les animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse). La peau au niveau du site d’infection sera prélevée pour analyse après mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux liés à l'infection en général, dos courbé, prostration, poil hérissé, ou nécrose au niveau du site d’infection. En cas d’apparition et si ces signes persistent plus de 24h ces animaux seront mis à mort. Également, les animaux subiront des prises de sang et des anesthésies répétées.
Devenir
Les souris utilisées dans cette demande seront infectées et subiront un traitement pharmacologique. Elles ne pourront donc pas être réutilisées et seront mises à mort à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les différentes molécules étudiées ont été testées sur des cultures de Staphylococcus aureus et les concentrations efficaces déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre a été calculé en tenant compte de nos résultats précédents et d’une étude statistique.
Raffinement
En termes de raffinement, les animaux seront réceptionnés à l’animalerie une semaine avant le début des expériences pour adaptation et hébergés par groupe de 5 dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). D’autre part, après chaque intervention (infection, traitement avec les composés et prises de sang), les animaux seront surveillés quotidiennement et à chaque intervention par les responsables du projet. En cas d’apparition de signes de souffrance et/ou de lésions, la surveillance serait renforcée. En cas de persistance de l’un ou l’autre de ces signes au-delà de 24h, le ou les animaux concernés seraient immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'infection. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs avec des animaux ayant un système immunitaire complétement développé.
1/2 – Identification des réseaux cérébraux impliqués dans le développement de la dépression majeure suite à un stress chronique environnemental chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Hébergées seules pendant vingt et un jours, elles reçoivent une heure de stress par jour parmi trois types de stress, passent cinq tests comportementaux dont un jeûne ou un isolement de vingt-quatre heures, puis deux heures d'IRM sous anesthésie dans un second établissement. L'apparition de l'état dépressif est présentée comme inévitable, puisqu'elle constitue l'objet même de l'étude, qui cherche des marqueurs de connectivité cérébrale utilisables en diagnostic. Le porteur écrit qu'il lui est "indispensable de travailler sur un modèle animal social, entier et complexe", tout en isolant chaque souris pendant trois semaines pour obtenir la dépression.
Objectifs
La dépression majeure chronique est une maladie mentale touchant 5 à 10 % de la population mondiale. Elle constitue la cause d’invalidité la plus fréquente, avec un fardeau social et économique estimé à plus de 170 milliards d’euros par an en Europe. Malgré les efforts déployés pour mieux comprendre et prendre en charge cette pathologie, aucun biomarqueur n’a encore pu être identifié, laissant le diagnostic de la maladie reposer uniquement sur une évaluation clinique des patients. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-tendant la dépression majeure chronique est donc nécessaire pour l’identification de biomarqueurs utilisables comme outil diagnostique, cibles thérapeutiques ou marqueurs prédictifs de la réponse thérapeutique. Il a également été démontré que le stress était une des comorbidités associées à la dépression majeure chronique ainsi qu’un facteur précipitant le développement de la maladie. Les patients dépressifs présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient ainsi constituer les biomarqueurs nécessaires à une meilleure prise en charge des patients. Ce projet a donc pour objectif d’identifier les réseaux cérébraux impliqués dans le développement et la chronicisation de la dépression induite par un stress variable chronique chez le modèle animal souris. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est de mieux comprendre l’effet du stress environnemental sur la connectivité cérébrale et le développement d’un état de dépression chez la souris afin de pouvoir proposer des solutions thérapeutiques à moyen et long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1/ un stress variable chronique pendant 21 jours constitué de 3 types de stress - exposition d’1h à 1 stress par jour - avec développement de troubles dépressifs (objet de l’étude) (EU1), 2/ Une évaluation comportementale de la dépression composée de 5 tests d’une durée de 5 min, 5 min, 6 min, 5 min et 24 h (évaluation de la construction du nid). Chaque test sera réalisé une seule fois par animal avec un délai minimal de 48 h entre chaque test (EU1), 3/ un examen IRM sous anesthésie incluant: une séquence d'IRM fonctionnelle de 16 min, une séquence d'IRM anatomique de 10 min, et une séquence d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures) (EU2) .
Impact sur les animaux
Les souris devront être hébergées individuellement dans les cages, une condition indispensable pour le développement de la dépression. L’apparition de cet état de dépression chez le modèle animal suite à un stress chronique de 21 jours est inévitable car c'est l'objet de l'étude. Dans le cadre de 2 des tests comportementaux, le jeûne (l’eau reste à disposition) ou l'isolement de 24h serait un facteur de stress inévitable pour pouvoir évaluer l'état de dépression chez l'animal. Ces tests seront réalisés une seule fois pour chaque animal. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements d'organes d'intérêt.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, cette étude sur le stress chronique et le développement de l‘état de dépression nécessite une observation comportementale ainsi qu’une évaluation de l’état et de la connectivité cérébrale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’assurer des résultats statistiquement fiables. Le nombre d'animaux a été déterminé par une analyse de puissance statistique et sur la base de nos études antérieures et de la variabilité phénotypique interindividuelle ainsi que des données de la littérature. 30 souris seront ainsi nécessaires par groupe pour effectuer nos analyses conduisant à un total de 180 animaux.
Raffinement
Avant le début de la procédure, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvelle animalerie de 2 semaines et d’habituation à la manipulation pendant une semaine. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies avec des carrés de coton et des frisures de papier pour favoriser la nidation, des barreaux de bois à ronger pour que les souris usent leurs dents, un tunnel pour fournir un abri. A l’issue de certains tests comportementaux, les animaux seront séchés puis réchauffés à l’aide d’une lampe chauffante ou immédiatement réalimentés (l’eau reste à disposition) et remis dans leur cage. Un suivi du poids corporel est effectué pendant 48-72h suivant le test pour s’assurer que les animaux ont repris le poids initial. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée par un transporteur spécialisé et une période de minimum 30 minutes sera respectée avant le début de l’examen IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. Un tapis chauffant permettra le maintien des animaux à une température physiologique. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé chez la souris adulte. Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal social, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et en particulier dans les troubles anxio-dépressifs. Cette étude s’inscrit dans la continuité de nos études précédentes au cours desquelles nous avions déjà utilisé le modèle souris. Étant donné que les études comportementales et neuroanatomiques nécessitent des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes mâles et femelles seront utilisés dans ce projet: début des procédures à l'âge de 8 semaines, poids supérieur à 20g. Cela permettra également une meilleure reproductibilité des résultats puisqu’à cet âge, les souris ont atteint leur taille et leur poids adulte.
Enregistrements des activités nerveuses autonomes en réponse au gout du gras chez les souris Knock-out CD36 lingual
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
L'objet réel de ce projet est une lignée de souris créée par l'équipe elle-même : 120 souris mâles privées d'un récepteur du goût du gras au niveau de la langue vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées d'eau six heures, elles subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie profonde, un enregistrement de vingt minutes de l'activité de leurs nerfs autonomes, puis une ponction intracardiaque juste avant la mise à mort. Le porteur signale la peur liée à la contention et les douleurs causées par la chirurgie. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à mieux connaître cette lignée pour qu'elle serve ensuite de modèle à l'étude de la préférence pour le gras, et le porteur juge ce modèle "indispensable" puisqu'il n'existe que chez la souris.
Objectifs
Le goût du gras représente une sixième saveur de base aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Les récepteurs gustatifs, sur les cellules des papilles gustatives, permettent la détection des saveurs. Pour les lipides, ce sont les récepteurs lipidiques qui sont responsables de la perception du goût du gras et du renforcement de la préférence pour le gras. Le signal gustatif est transmis de la langue au cerveau par les nerfs gustatifs puis le cerveau communique avec le système digestif pour préparer le système digestif à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue (papilles gustatives) – cerveau – intestin. Pour étudier spécifiquement le rôle d’un des récepteurs lipidiques dans la perception du gras, nous avons développé un modèle de souris n’exprimant pas ce récepteur au niveau de la langue. Nous avons observé que ces souris perdent la préférence pour le gras. De plus, elles développent des troubles métaboliques tels que des augmentations de la glycémie, de l’insulinémie et de la glucagonémie. L’insuline et le glucagon, sont des hormones sécrétées par le pancréas, qui permettent de réguler la glycémie. Elles sont sous le contrôle du système nerveux autonome, qui assure la communication entre le cerveau et l’intestin. Ces observations nous suggèrent que l’absence de d’un récepteur lipidique dans les papilles gustatives perturbe la communication entre la langue, le cerveau et l’intestin. Afin d’explorer le rôle du système nerveux autonome dans les perturbations métaboliques observées chez ces souris, nous prévoyons de mesurer l’activation de ces nerfs en réponse au dépôt de lipides sur la langue. Ces mesures seront effectuées chez des souris normales ou n’exprimant pas un récepteur lipidique au niveau des papilles gustatives.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre une nouvelle souche de souris génétiquement modifiée, n’exprimant pas un des récepteurs lipidiques au niveau de la langue. Ces souris pourront donc servir de modèle animal pour étudier la préférence pour le gras.
Procédures
Toutes les souris (120 souris) sont concernées par les points suivants : - Privation d’eau uniquement pendant 6 heures avant le début de la procédure. - une seule intervention chirurgicale suivie d’un seul enregistrement d’activité nerveuse par souris (souris profondément anesthésiées) ; durée de la chirurgie 20 minutes au maximum et durée de l’enregistrement nerveux 20 min. - un seul prélèvement sanguin en intracardiaque par souris durée de 2 minutes maximum. Prélèvement sanguin sur souris profondément anesthésiées juste avant mise à mort.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun hydrique les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaires lors des manipulations. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie.
Devenir
A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort, pour étudier leurs organes et tissus.
Remplacement
L’activité nerveuse autonome ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de l’expérimentation in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique, valable avec un test adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur (le manipulateur portera une blouse propre jetable et des gants nettoyés avec l’alcool 70%), désinfection des surfaces, utilisation d'un champ stérile, stérilisation des outils de dissections, tonte de la zone d’incision et désinfection de la peau. La délimitation des points limites permet d’éviter au maximum les douleurs sévères ou souffrance chez la souris afin de favoriser un état stable dans le bien-être animal. La douleur de la souris est en amont, prise en charge via l’utilisation d’analgésiques,15 minutes avant l’anesthésie. Ceci permettra entre autres de calmer l’animal et de maximiser l’effet de l’anesthésie. Des aiguilles fines biseautées seront utilisées lors des injections et des prélèvements, pour minimiser la douleur.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la régulation nerveuse du système gastrointestinal et du comportement alimentaire. Cette technique est plus difficile à réaliser chez la souris que chez le rat, mais notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils d’analyse biologique contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et la modification de gènes s’exprimant au niveau de la langue étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 2 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie.
Etude de la biocompatibilité d’échafaudages bicouches à base d’albumine et cellularisés implantés en sous-cutané chez la souris : modification
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Anesthésiées pour une chirurgie de trente minutes, deux patchs d'albumine bovine implantés sous la peau, 280 souris immunodéficientes gardent ensuite ces implants de trois à six mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec douleur post-opératoire, inflammation et risque d'infection au site d'implantation. Le porteur privilégie des femelles, décrites comme plus calmes au moment de la réintroduction dans le groupe après l'isolement du réveil, et n'a prévu aucun test statistique pour ces 280 animaux, seulement des "observations directes". Toutes sont tuées pour que les implants et les tissus autour soient prélevés.
Objectifs
Le développement d’implants, composés uniquement à base d’albumine et associés à l’ingénierie tissulaire, s’apparente à une nouvelle voie de recherche potentielle pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Les implants seront entièrement composés d’albumine bovine et seront construits en deux parties : une partie dite « poreuse » et une autre partie dite « lisse ». L’objectif, ici, est de proposer un matériau bicouche biomimétique, favorisant la regénération tissulaire. Nous souhaitons, dans un premier temps, tester la biocompatibilité de ces implants chez la souris, en vue de leur utilisation pré-clinique en observant l’intégration de l’implant celllulaire après une implantation en sous-cutanée chez des souris nude immunodéprimées. Les tests in vivo sur ces souris nude seront une première étape de validation avant des tests plus importants sur gros animal, puis des applications cliniques. Demande de modification car suite à des résultats préliminaires positifs nous souhaiterions faire un suivi de la dégradation du biomatériau qui nous oblige à augmenter le temps d'implantation entre 3 et 6 mois.
Bénéfices attendus
Les biomatériaux sont devenus un élément clé pour le développement de l’ingénierie tissulaire. Nous espérons, à terme, le développement d’un nouvel implant pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Dans le contexte actuel, cet implant offrirait une nouvelle voie de recherche, permettant ainsi de surmonter les limites des traitements conventionnels : intégration tissulaire chez le patient de l'implant, et morbidité du site donneur dans les traitements actuels prélevant un greffon d'un site donneur implanté au niveau d'un site receveur à un autre endroit du corps. Cet implant sera innovant car il sera formulé à partir de matériau d’origine naturelle, et ensemencé de cellules saines du patient lui même. Il ne nécessitera donc pas de traitement immunosuppresseur et ne sera pas sujet au rejet immunitaire. Ce projet est en accord avec les nouvelles avancées en santé humaines, visant à réaliser des implants tout biologiques et personnalisés pour chaque patient.
Procédures
Procédures chirurgicales : 1 par animal, implantation sous cutanée de deux patchs d'albumine, sur animaux anesthésiés. 30 minutes d'intervention par animal.
Impact sur les animaux
La procédure de mise en place de l’implant est une procédure invasive. Les nuisances attendues sur les animaux concernent : la douleur liée à la chirurgie, l’inflammation post opératoire, l’infection au niveau du site d’implantation.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement.
Remplacement
Des études in vitro antérieures ont démontré l’efficacité de ces échafaudages bicouches pour l’adhésion et la différenciation de chondrocytes. Pour une étude plus approfondie, ce projet contraint de mettre en place des études in vivo. En effet, la complexité de l'environnement physiologique sous-cutané, impossible à reproduire in vitro (vascularisation, cellules du système immunitaire, molécules inflammatoires…) atteste de la nécessité de continuer les expérimentations sur un modèle animal (rongeurs), sans remplacement possible. Seuls les échafaudages bicouches efficaces in vitro seront testés sur les animaux.
Réduction
Etant donné le nombre d’analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques…) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d’animaux nécessaires a été évalué à 280 souris pour 3 ans, nombre d'animaux nécessaire pour pallier la différence interindividuelle des cellules issues des donneurs, des aléas de la chirurgie, et des nombreuses analyses prévues qui nécessiteront chacune plusieurs échantillons. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effecturons des observations directes.
Raffinement
Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie per-opératoire, en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie pré opératoire. L’analgésie post-opératoire sera réalisée en injection sous cutanée. Les anti-inflammatoires non stéroidiens seront évités car les phénomènes de cicatrisation et de régénération tissulaire étudiés sont liés aux phénomènes inflammatoires locaux qui se mettent en place. La chirurgie sera privilégiée le matin car les animaux seront isolés dans une cage en post-opératoire précoce le temps du réveil, et remis en groupe dans la soirée. Nous privilégierons également l’emploi de femelles car elles présentent un comportement plus calme lors de la réintroduction en groupe après une période d’isolement. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, nids, coton…) afin de permettre la fabrication de nids notamment. Le type d’animal utilisé présente un phénotype dommageable mais les animaux seront dans des cages fermées et sur un portoir ventilé dans un environnement stérile et des conditions de manipulation adaptée à l’entretien de tels animaux. Si les animaux implantés au cours de l'étude présentent des signes précoces de douleur, d’inconfort ou de détresse (changements de comportement : animal prostré et isolé du reste du groupe, perte de poids et d’appétit, variations de leur apparence physique : anomalie cicatricielle observée au niveau des points de sutures), l’expérimentation sera arrêtée. Ces potentiels signes de douleurs seront évalués et scorés à partir d'un tableau de référence, permettant de juger si l'animal devra être mis à mort si celui ci atteint un point limite.
Choix des espèces
Pour tester la biocompatibilité et l’intégration tissualire, nous utiliserons des souris immunodéficientes : souris pour les implants, ensemencés ou non de cellules. Seuls les implants validés in vitro seront implantés chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines de vie minimum) pour présenter des systèmes physiologiques matures.
Etude comparative des biodistribution de nanoparticules d’oxyde de fer vectorisée envers un modèle de cancer du poumon xénotopique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une tumeur devenue trop grosse ou une perte de poids déclenchent la mise à mort immédiate de la souris. 70 souris de huit à dix semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des cellules de cancer du poumon leur sont injectées sous la peau, la tumeur est mesurée deux fois par semaine, et un mois plus tard commencent des séances d'imagerie magnétique sous anesthésie réparties sur trois semaines. Le porteur qualifie l'inoculation de la tumeur de "souffrance ou angoisse légère de longue durée", et annonce comme finalité d'augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une "rémission totale", quand l'objet immédiat se limite à suivre où vont des nanoparticules d'oxyde de fer.
Objectifs
La radiothérapie (RT) fait aujourd’hui partie intégrante de la lutte contre le cancer. Toutefois, et en dépit des nombreux progrès récents, la principale limitation de la RT réside dans son manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone cancéreuse. De récentes études ont mis en évidence des propriétés radiosensibilisantes pour les nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs). Dans ce projet nous testerons ce type d’IONPs dans un modèle de cancer du poumon. Plus précisément, nous étudierons les profils de biodistribution des IONPs après leur administration en utilisant un imageur (appelé imageur par particule magnétique ; MPI) qui permet de détecter le signal magnétique des IONPs. Nous comparerons des IONPs non fonctionnalisées et des IONPs fonctionnalisées avec un peptide spécifique des tumeurs pulmonaires. L’utilisation de ces modèles murins nous permettrait d’étudier le potentiel de nos IONPs de façon bien plus pertinente qu’un modèle in vitro eu égard des contraintes de biodistribution. Ce projet vise à améliorer l’efficacité de nanomatériaux à caractère théranostique, c’est à dire qui permette à a fois le diagnostic des tumeurs tout en améliorant l’effet thérapeutique de la radiothérapie ; théranostique = thérapeutique + diagnostique. Elles pourraient permettre le suivi de la progression du cancer en imagerie à particule magnétique tout en améliorant son traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre du test de l’efficacité de nouveaux nanomatériaux à caractère théranostique (= thérapeutique + diagnostique) dans le cadre de la lutte contre le cancer. Il est attendu que ceux-ci auront un effet thérapeutique en augmentant l’efficacité des traitements par radiothérapie, tout en permettant le suivi du développement ou de la régression des tumeurs. Cet aspect nous semble particulièrement important au vu de la haute prévalence des traitements par RT en cancérologie moderne et de ses principales limitations (dont le manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone tumorale). À long terme, nous pouvons donc dire que la finalité de cette étude est donc d’augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une rémission totale.
Procédures
Une inoculation de cellules tumorales sera réalisée par injection sous cutanée. Cette injection se fait sous anesthésie n’excédant pas 30 minutes. Au cours des semaines suivant cette injection, un suivi de la taille de la masse tumorale est réalisé 2 fois par semaine. Cette mesure rapide ne nécessite ni mesures de contention ni anesthésie. Une fois la tumeur développée, un mois après l’inoculation, les souris seront étudiées en imagerie par particule magnétique MPI. Pour cela les souris seront anesthésiées, un agent de contraste sera administré et les souris seront placé dans l’imageur sous anesthésie, en suivant la profondeur de l’anesthésie via la vitesse de respiration et le scan d’imagerie sera effectué. Dans la mesure où cette procédure est suivie d’une imagerie, l’animal sera anesthésié pendant l’injection (cette anesthésie a une durée estimée de moins d’une heure). Des examens d'imagerie des particules magnétique auront lieu périodiquement pendant un maximum de 3 semaines.
Impact sur les animaux
L’inoculation en sous-cutané des cellules tumorales peut entrainer une souffrance ou une angoisse légère de longue durée et avoir une incidence légère sur le bien-être ou l'état général de l’animal, nous surveillons pour cela que la taille de la tumeur et la présence de signe de souffrance. L’administration des particules d’oxyde de fer (IONPs) n’est pas associée à d’effets secondaires susceptibles de porter atteinte au bien-être de l’animal. L’évolution de la masse tumorale et de la biodistribution des IONPs seront évalués par des techniques d’imagerie non ionisante et non invasive. Par conséquent, l’inconfort généré lors de cette manipulation sera limité à l’anesthésie de l’animal. Il en découle que les animaux sont susceptibles d’éprouver un inconfort et une angoisse transitoire et de faible intensité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier précisément ex vivo la localisation des particules d'oxyde de fer au sein de la tumeur.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisé sur les particules d’oxyde de fer afin de sélectionner en amont la meilleure synthèse de ces particules. A ce stade, nous devont étudier le dévenir des particules d’oxyde de fer après leur administration dans un organisme, leur intéraction avec un tissu tumoral et la capture par le système immunitaire qui impact la biodistribution. Il est impossible d’étudier ces aspects complexes d’interaction avec la biologie des particules d’oxyde de fer sans utiliser de modèle animal.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés passe par l’utilisation d’un protocole d’induction et de suivi de la masse tumorale déjà mis en place et optimisé par l’équipe des chercheurs travaillant sur ce projet. Le caractère non-invasif et non-ionisant des méthodes d’imagerie in vivo employées permet de suivre le même animal au cours du temps, plutôt que de mettre un animal à mort à différent temps pos-injection. Le nombre total de souris nécessaire pour le projet a été calculé avec un test de puissance statistiques et en estimant la perte de certains animaux. Nous avons donc réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir les informations nécessaires à l’étude de la biodistribution de nos particules d’oxyde de fer, et leur interaction avec un tissu tumoral.
Raffinement
Pendant les procédure d'inoculation des cellules tumorales en sous-cutanée, les souris seront maintenus sous anesthésie. Un analgésique est également administré 20 min avant le début de la procédure. La température de la souris est maintenue avec un tapis chauffant autorégulé à 37°C et un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux. L’application d’analgésique local est également utilisé. Après la procédure, les animaux sont suivis régulièrement et une attention particulière est porté sur la présence de signe de souffrance ou de mal être de l’animal. Si des signes clairs de souffrance sont observés en terme de perte de poids, apparence ou comportement révélateur de mal être et taille de la tumeur trop importante, l’animal est mis à mort immédiatement afin de limiter au maximum la souffrance.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans le cadre de ce projet est la souris âgée de 8 à 10 semaines, correspondant au stade de jeune adulte. Ce choix est justifié par des considérations scientifiques, physiologiques et éthiques. La souris possède un système immunitaire et vasculaire relativement proche de l’homme et nous savons que les phénomènes de biodistribution et d’intéraction avec le système immunitaire observés seront très similaires chez l’homme. Le stade de souris jeune adulte permet une meilleure standardisation du modèle tumoral, en assurant une réponse homogène à l'inoculation tumorale et en limitant la variabilité interindividuelle. De plus, cet âge est le plus approprié pour tolérer l'anesthésie, la croissance tumorale contrôlée et les procédures répétées (manipulations, imagerie, etc.), sans entraîner de détérioration prématurée de l’état général.
Evaluation de nouvelles thérapies dans des modèles de Diabète de type 1
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rendues diabétiques par une à cinq injections d'un agent chimique, 8 403 souris reçoivent ensuite des administrations jusqu'à quatre fois par semaine pendant quinze semaines, des mesures de glycémie une à deux fois par semaine et jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère, avec perte de poids marquée, déshydratation, inactivité, et pour les souris humanisées une réaction du greffon contre l'hôte qui provoque diarrhées et alopécie. Une mortalité soudaine est annoncée comme possible dans le modèle induit par injection unique à forte dose, alors que le porteur écrit instaurer ces mesures "afin d'assurer le bien-être optimal des animaux". Toutes les souris sont tuées pour prélever leurs organes, au rythme d'une quinzaine d'études par an.
Objectifs
Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune (5-10% de la population mondiale) où le système immunitaire attaque par erreur les cellules bêta du pancréas, responsables de la production d'insuline. Cette destruction entraîne une carence en insuline, essentielle pour réguler la glycémie. Il est nécessaire de trouver des traitements empêchant la destruction du pancréas par les cellules immunitaires. Ce projet vise à développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies auto-immunes en utilisant des modèles murins spontanément diabétiques ou des modèles induits. Les modèles murins de diabète de type 1 sont essentiels pour la recherche car ils permettent de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de cette maladie auto-immune. Ces modèles offrent une approche pour tester de nouvelles thérapies et interventions avant de les appliquer chez l'homme, De plus, ils aident à identifier les facteurs génétiques et environnementaux qui contribuent au développement du diabète de type 1, facilitant ainsi la mise au point de stratégies de prévention et de traitement plus efficaces. Les objectifs du projet sont : Étude des mécanismes pathogéniques, le développement et l’identification de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques, les études précliniques et la compréhension des facteurs de risques. Nous estimons à 15 études par an. Ces objectifs font des modèles murins un outil indispensable pour la recherche sur le diabète de type 1, contribuant à des avancées significatives dans la compréhension et le traitement de cette maladie complexe.
Bénéfices attendus
Le développement de modèles murins diabétiques type 1 peut offrir de nombreux bénéfices significatifs. Tout d'abord, il permet de mieux comprendre les mécanismes immunologiques et génétiques sous-jacents à la maladie, en identifiant les facteurs déclencheurs et les processus de destruction des cellules β des îlots de Langerhans. De plus, ces études permettront de tester de nouveaux traitements et thérapies, y compris les immunothérapies et des interventions géniques, avant de passer aux essais cliniques chez l'homme. Enfin, les modèles murins permettent d'explorer les effets à long terme des traitements et de surveiller les complications associées au diabète, contribuant ainsi à l'amélioration des stratégies de gestion et de prévention de la maladie. A plus long terme, les données générées grâce à ce projet permettent d’augmenter les connaissances scientifiques sur les processus immunologiques ou inflammatoires impliqués dans le diabète de type 1 et feront l’objet de publications et de partage des données collectées avec la communauté scientifique. Ces recherches sont essentielles pour progresser vers des traitements plus efficaces et, éventuellement, une cure pour le diabète de type 1.
Procédures
Pour l’induction du modèle par agent chimique, injection unique ou répété (jusqu’à 5 fois) sur animal vigile, environ 10 secondes Administrations réalisées, sur animal vigile, environ 10 secondes, réalisée au maximum 4 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (maximum 15 semaines) Test de glycémie par prise de goutte de sang, 1 à 2 fois par semaine sur animal vigile, environ 15 secondes et pour le test de tolérance au glucose 6 fois sur 2 h, répété 2 fois dans l’étude Prélèvements de sang, sur animal vigile, environ 15-20 secondes, au maximum 1 fois toutes les 2 semaines. Analyse par imagerie sur animal anesthésié : environ 5-15 minutes par session d’imagerie sur 10 temps en longitudinal, au maximum.
Impact sur les animaux
Perte de poids : significative, en raison de l'hyperglycémie et la déshydratation. Mortalité soudaine possible dans le modèle de diabète induit par injection unique à forte dose d’un agent chimique. Inactivité et réduction de la mobilité : souvent liée à la faiblesse générale et à la fatigue causées par le diabète. Déshydratation : un effet indésirable courant chez les souris diabétiques, en raison de la polyurie (augmentation de la production d'urine) causée par l'hyperglycémie. Réponse de greffe contre l’hôte due à l’hyperactivation des cellules immunitaires et à une production excessive de cytokines inflammatoires dans le cas des modèles humanisés et qui se traduit perte de poids, baisse activité, diarrhées, alopécie.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude.
Remplacement
L'utilisation des modèles de diabète de type 1 est cruciale pour le développement et l'évaluation de nouvelles thérapies. Ces modèles permettent d'étudier les réponses immunitaires dans un environnement contrôlé, offrant une approche unique pour comprendre les interactions cellulaires et les mécanismes pathologiques spécifiques. Ils surmontent les limitations des systèmes in vitro et in silico, qui ne peuvent reproduire la complexité d'un organisme entier. L'évaluation in silico identifie des cibles pertinentes à valider expérimentalement. Les tests in vitro étudient certaines réponses cellulaires et testent des molécules immunomodulatrices, mais ne simulent pas les interactions dynamiques entre organes. Les modèles animaux, eux, offrent des avantages uniques : - Complexité physiologique : Ils permettent d'étudier les interactions entre le système immunitaire, le pancréas et d'autres organes, impossible à reproduire in vitro ou in silico. - Progression de la maladie : Ces modèles permettent d'observer l'évolution du diabète sur une longue période, crucial pour comprendre la maladie et évaluer l'efficacité des traitements. - Biomarqueurs et diagnostic : Ils facilitent l'identification de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic précoce et le suivi de la progression. - Évaluation de la sécurité : Essentiels pour tester la sécurité des nouvelles thérapies avant les essais cliniques humains. - Étude des complications : Ils permettent d'étudier les complications à long terme, comme les problèmes cardiovasculaires ou rénaux. - Personnalisation des traitements : Ces modèles aident à identifier des sous-groupes de patients répondant différemment aux traitements. Les modèles animaux reproduisent des aspects cruciaux comme la présentation des auto-antigènes dans les organes lymphoïdes et les mécanismes de l'activité cytotoxique des cellules T sur les cellules bêta du pancréas.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Ensuite, sur la base des données expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser selon le type de mesures effectuées. Seules les molécules ayant montré en amont une activité anti-inflammatoire in vitro sont testées sur les animaux (in vivo). L’utilisation de techniques précises comme la cytométrie en flux, l’analyse de biomarqueurs, l’histologie et l’imagerie permettra d’obtenir des données détaillées à partir de petits échantillons. De plus, le recours aux techniques d’imagerie permet un suivi non invasif et multiparamétrique des animaux pour mesurer la distribution des composés et l’évolution de la réponse inflammatoire, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les modèles décrits dans ce projet sont choisis pour leur pertinence clinique, réduisant ainsi le besoin de tests supplémentaires sur d’autres animaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions garantissant l’absence de contaminations. En raison de la polyurie et de la polydipsie caractéristiques du phénotype diabétique de type 1, nous mettrons en place un protocole de soins adapté. Celui-ci comprendra un changement de litière (douce, non-poussiéreuse) plus fréquent, trois fois par semaine et une surveillance accrue de la consommation d'eau. Ces mesures seront instaurées dès l'apparition des premiers signes cliniques du diabète, afin d'assurer le bien-être optimal des animaux et la fiabilité des données expérimentales. Les techniques de manipulation douce, telles que l’utilisation de tunnels et la préhension dans le creux des mains, sont mises en œuvre pour réduire le stress et l’inconfort des animaux. Un apport nutritif sous forme de gel hydrique ou alimentaire pourra être mis en place 1 semaine avant le début de l’étude pour faciliter l’accès des animaux. Les animaux pourront être hébergés dans des cages spéciales permettent de détecter 24h/24 toute anomalie dans l’activité des animaux (hypoactivité ou hyperactivité ou stéréotypies, litière humide due à la polyurie) permettant de mettre en place très rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Une grille de score a été mise en place afin de permettre la définition et l’application de points limites, généraux et spécifiques à la procédure, et ainsi intervenir de manière anticipée pour éviter toute douleur ou dommages pour les animaux au-delà de la classe de gravité définie pour la procédure. Le phénotype dommageable de risque accru d’infection lié à l’immunodéficience sera maitrisé par hébergement des souris en rack ventilé et manipulation sous hotte. Pour les souris humanisées pouvant présenter un risque de rejet du greffon contre l’hôte à partir de 40 semaines environ après humanisation, les études seront réalisées entre 8 semaines et 35 semaines après humanisation.
Choix des espèces
LLa souris est le modèle de choix en pharmacologie. Elles partagent une grande partie de leur génome avec les humains, permettant de modéliser les maladies humaines et d'étudier les effets des médicaments. Leur petite taille et leur cycle de reproduction rapide facilitent les études à long terme et les expériences génétiques. Les souris, étant des mammifères, ont des systèmes biologiques comparables à ceux des humains, rendant les résultats plus pertinents. Les souris adultes (à partir de 8 semaines d’âge) sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge. De plus le système immunitaire est complètement mature à partir de 6 semaines d’âge chez la souris.
Tests réglementaires de contrôle de la pathogénicité des agents infectieux entrant dans la fabrication de vaccins
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 40
Une injection de moins de dix secondes, et pour une partie des animaux la mort attendue comme résultat du test : 7 400 souris et 40 cobayes vont être utilisés dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère, tous tués. Le porteur décrit une injection de virus rabique dans le cerveau ou le péritoine pouvant tuer les souris, une injection intradermique provoquant chez les souriceaux des nécroses jusqu'à la mort, et une injection de toxine tuant les cobayes. Ces tests ne produisent aucune connaissance, ils vérifient qu'un lot de semence vaccinale est bien inactivé ou bien virulent, comme l'exigent la Pharmacopée européenne et l'OMS, et le porteur situe en 2026 la cible d'un vaccin rabique évaluable sans animaux non-humains. Souris et cobaye sont retenus pour leur sensibilité à l'agent infectieux, et l'effectif découle du prévisionnel de production de vaccins.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer la pathogénicité des agents infectieux (virus/toxine) entrant dans la fabrication de vaccins destinés à l’Homme. Le but est soit : • De s’assurer de la bonne inactivation de l’agent infectieux et ainsi éviter une éventuelle transmission de ce dernier. • De vérifier la virulence biologique d’un lot de semence avant utilisation en production. Les tests de pathogénicité sont des tests de contrôle qualité interne définis par les dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) et par les référentiels réglementaires internationaux : • OMS (TRS 941) • Pharmacopée Européenne (monographie n°1356) Ils peuvent également être réalisés : • Pour les évaluations de stabilité des vaccins requises par la réglementation. • Pour documenter les dossiers de validation de procédés, de matériels et/ou de bâtiments afin de vérifier que les changements réalisés n’ont pas d’impact sur la qualité des vaccins produits.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la mise sur le marché (ou éventuellement l’utilisation en essai clinique) de lots de vaccins conformes aux textes réglementaires cités en 3.3.2.1, et ainsi l’amélioration de la qualité de vie des patients.
Procédures
1 seule injection par voie intracérébrale sous anesthésie gazeuse ou 1 seule injection par voie intrapéritonéale est réalisée sur les souris. 1 injection par voie intradermique est réalisée sur les souriceaux. 1 injection par voie sous cutanée est réalisée sur les cobayes. Ces différents types d’injection durent moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux de ce projet sont très variables : • Une injection de produit par voie intracérébrale chez la souris pour la procédure gradée modéré, ne provoquant normalement pas d’effet • Une injection de virus rabique par voie intracérébrale ou intrapéritonéale pouvant provoquer la mort des souris (procédure sévère) • Une injection de produit en intradermique chez le souriceau pouvant provoquer des nécroses et pouvant aller jusqu’à leur mort (procédure sévère). Les souriceaux subissent également une injection intrapéritonéale (ou per os) d’euthanasiant. • Une injection de toxine en sous-cutanée chez le cobaye provoquant leur mort (procédure sévère)
Devenir
Les 4 procédures du présent projet ne permettent pas la réutilisation des animaux, qui ont tous subi des injections de composés vaccinaux, potentiellement pathogènes. Ils ne peuvent donc pas être inclus dans un autre test sans risque d’apporter un biais ou un risque sanitaire (virus rabique = classe 3).
Remplacement
Arrêt des vaccins rabiques actuels et remplacement par un vaccin nouvelle génération sans test in vivo : cible 2026.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est défini par la réglementation. Le prévisionnel du nombre de lots à tester sur les 5 années à venir et la mise en place des stratégies d’arrêt de ces tests nous permettent de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. Le dépôt réglementaire international pour la suppression des témoins positifs dans la procédure 3 utilisant des souriceaux est en cours, date cible 2026, ce qui entrainera une forte diminution du nombre de souris gradées sévères. La mise au point d’une méthode de marquage des souriceaux a permis de pouvoir diviser par 2 le nombre de mères utilisées : une mère peut garder avec elle les souriceaux inoculés avec 2 produits différents, vs 1 produit lorsque l’on ne marquait pas les souriceaux. La procédure 4 n’est plus qu’un test de caractérisation, à réaliser en cas de changement de procédés.
Raffinement
Les injections intracérébrales sont faites sous anesthésie à l’isoflurane. Toutes les injections sont faites dans une zone séparée de l’hébergement. Les tests d’inactivation rage (procédure 1) ont comme point limite le cumul de 3 symptômes rabiques qui entrainent l’euthanasie des souris. Le dépôt réglementaire international pour la suppression des témoins positifs dans la procédure 3 utilisant des souriceaux est en cours, date cible 2026, ce qui entrainera une forte diminution du nombre de souris gradées sévères. Des récompenses alimentaires (graines et fruits secs) sont distribuées systématiquement après un acte technique. Cet ajout est également conseillé après tout acte jugé stressant.
Choix des espèces
Les espèces choisies doivent être sensibles à l’agent infectieux dont la pathogénicité est évaluée. Il s’agit de la souris et du cobaye, espèces décrites comme modèles dans les Pharmacopées en vigueur, ainsi que dans les rapports techniques de l’OMS. L’estimation du nombre d’animaux utilisés est basée sur le prévisionnel de production des vaccins, et sur la perspective d’arrêt de ces tests.
Amélioration de l’efficacité des traitements par thérapie cellulaire dans le lymphome B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
576 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue en raison de leurs tumeurs et pour des analyses post-mortem. Les interventions prévues comprennent une injection de cellules tumorales qui leur donne un lymphome, une irradiation pratiquée sans anesthésie, que le porteur dit "non douloureuse", des injections de lymphocytes CAR-T, d'un inducteur et d'anticorps, et une prise de sang. Le lymphome peut entraîner fatigue, perte de poids et atteinte des ganglions, et le but affiché est une version modifiée des CAR-T qui assure "une meilleure survie chez l'animal, sans rechute", en vue d'une transposition à l'humain. Le porteur juge "indispensable" le recours à des souris vivantes et conclut : "Il faut pour cela un organisme entier."
Objectifs
Les lymphomes B représentent le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde occidental et le 9ème cancer le plus mortel. Il touche environ 15 000 personnes par an en France. Malgré les progrès des traitements conventionnels (chimiothérapie, immunothérapie), une part significative des patients ne répond pas aux traitements ou rechute quelques mois après. La première ligne de traitement repose sur de la chimiothérapie. En cas de non-réponse à ce traitement, la deuxième ligne de traitement repose sur une immunothérapie dite de thérapie cellulaire génique : les cellules CAR-T : des lymphocytes T du patient reprogrammés au laboratoire puis réinjectés. Ce protocole a pour but d’aider le système immunitaire du patient à reconnaître et tuer les cellules tumorales . Ce traitement à été révolutionnaire, mais encore 50% de ces patients ne répondent pas ou rechutent rapidement. Il a été démontré un épuisement rapide de ces cellules CAR-T après l’injection chez le patient, qui peut être expliqué par un microenvironnement tumorale très immunosuppressif notamment causée par un certain compartiment du système immunitaire, les cellules myloides. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser l’efficacité des cellules CAR-T afin d’augmenter le taux de succès qui est actuellement de 50%.
Bénéfices attendus
Nous avons réalisé différents protocoles incluant différentes concentrations de cellules CAR-T. Nous avons trouvé la concentration la plus adéquate afin d’avoir un contrôle tumoral maximal. Cependant, certaines souris répondent de manière partielle avec une rechute systématique de la tumeur. Ainsi notre modèle murin actuel reproduit bien ce qui se passe chez l’homme, le traitement par cellules CAR-T est efficace initialement, mais les souris vont présenter une rechute. Ce modèle permet donc d’évaluer des stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la réponse au traitement. Le but de ce projet est donc de modifier ces cellules CAR-T et d’étudier cette nouvelle dynamique de contrôle tumorale. Le bénéfice sera de trouver la nouvelle version du CAR-T permettant un contrôle tumoral maximal et ainsi obtenir une meilleure survie chez l’animal, sans rechute, pour transpoistion chez l'Homme.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux incluront : •Injection unique de cellules tumorales (durée : 1 minute, aneshtésie locale). •Irradiation lymphodéplétive (durée : 5 minutes, vigile sans anesthésie car non douloureuse). •Injection de cellules CAR-T (durée : 2 minutes).sous anesthésie •Injection de d'inducteur (Durée 1 min anesthésie locale). •Injection des Anticorps ( Durée 1 min, anesthésie locale). •Prise de sang unique (durée : 2 minutes, sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
•Les animaux auront un type de cancer appelé lymphome, ce qui peut entraîner fatigue, perte de poids et atteinte ganglionnaire. •La progression tumorale sera surveillée avec des points limites stricts. •L’irradiation corporelle est bien tolérée et ne provoque pas d’augmentation des infections, contrairement aux irradiations myéloablatives. •Le syndrome de libération de cytokines a été jugé modéré dans les études précédentes et sera surveillé attentivement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en raison de la présence de tumeurs et afin de réaliser des analyses post-mortem.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour : •Étudier l’interaction entre la totalité du microenvironnement tumoral et les cellules CAR T. •Il est également intéressant d’étudier les différentes populations immunitaires (notamment compartiment myéloide) dans la moelle osseuse et leur dynamisme après l’injection des CAR-T •Observer l’impact de la modulation du compartiment myéloïde sur la réponse tumorale. Ces différentes études cruciales ne peuvent pas être réalisées par des modèles in vitro ou ex vivo. Il faut pour cela un organisme entier. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro ou d’organoïdes associant cellules tumorales, cellules myéloïdes et cellules CAR-T. L’ensemble des publications dans ce domaine repose sur de l’expérimentation animale. Des modèles organoïdes sont effectivement importants à développer, mais ne sont actuellement pas du tout disponibles.
Réduction
Le nombre de souris est limité au minimum possible. Un calcul de puissance a permis de déterminer ce nombre. L’utilisation de logiciels d'aide à la conception et de statistiques nous ont permis d’optimiser ces données. Des mùéthodes statistiques seront également utilisées pour eploiter les résultats.
Raffinement
Toutes les interventions (greffes) des procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections simples seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des points limite stricts ont été définis et seront appliqués. La surveillance des animaux en procédure sera faite par un examen clinique quotidien.
Choix des espèces
- Génétique proche de celle de l’Homme. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines.
Effets thérapeutiques d’une nouvelle formulation de la mémantine dans un modele murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet sont transgéniques : à partir de leur huitième mois, elles développent dans le cerveau des plaques amyloïdes qui peuvent entraîner des déficits de mémoire et des difficultés d'apprentissage. 120 souris, mâles et femelles, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau. De trois à douze mois, elles reçoivent des traitements dans leur eau de boisson et passent deux tests de mémoire de dix minutes, trois fois chacun, ainsi qu'un test de navigation et de mémoire spatiale fait de plusieurs sessions de cinq minutes par jour pendant cinq jours, lui aussi répété trois fois. Le résumé ne nomme aucun de ces tests, et le porteur classe en souffrance légère 10 mois de traitement et de tests répétés sur des souris qui développent la pathologie à partir du huitième mois.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus fréquente après 65 ans, et représente un enjeu majeur en santé publique en raison du vieillissement de la population, de son impact sur les patients et leurs proches, ainsi que de son coût économique considérable. Malgré des avancées thérapeutiques, les traitements actuels restent peu efficaces, rendant nécessaire le développement de nouvelles approches plus performantes. Un nouveau traitement a été conçu en associant deux substances aux propriétés complémentaires : l’une, déjà utilisée en clinique, aide à ralentir la progression de la maladie, tandis que l’autre possède des effets protecteurs sur le système nerveux. Leur combinaison a montré un effet renforcé en laboratoire, en particulier sur la mort neuronale, et l’innovation repose sur un dosage optimisé pour en maximiser les bénéfices. Pour confirmer son efficacité, des études précliniques seront menées sur un modèle animal reproduisant les caractéristiques de la maladie, afin d’évaluer son impact sur la protection des cellules nerveuses et les capacités cognitives.
Bénéfices attendus
Cette étude constituera une première validation de l’efficacité pré-clinique de ce nouveau traitement dans un modèle animal de maladie d'Alzheimer. L’étude permettra en outre d’évaluer l’étendue de l’effet observé et la présence d’un effet dose potentiel, ainsi que des effets potentiels à contrecarrer la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer. Il s’agira d’une étude preuve de concept, capitale pour envisager le développement clinique de la molécule et aboutir in fine à la mise sur le marché de ce traitement pour l’amélioration du pronostic de la maladie.
Procédures
Tous les animaux seront exposés à deux tests de mémoire d’une durée de 10 minutes par test, trois fois pour chaque test sur toute la durée du projet. Un autre test (navigation et mémoire spatiale) nécessite plusieurs sessions de 5 minutes d’apprentissage par jour, pendant 5 jours. Ce test sera également répété 3 fois. Les traitements pharmacologiques seront administrés dans l'eau de boisson, quand les souris sont agées de 3 à 12 mois, soit pendant 10 mois.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent engendrer du stress lié à la manipulation des animaux et leur isolement ponctuel durant ces tests. Le traitement ne devrait pas entraîner d'effets secondaires notables, d'après les données existantes. À partir du 8e mois de vie, les souris transgéniques utilisées développent des caractéristiques pathologiques associées à la maladie d'Alzheimer. Cela inclut principalement la formation de plaques amyloïdes dans le cerveau, qui peuvent entraîner des troubles cognitifs et comportementaux. Ces troubles peuvent se manifester par des déficits de mémoire et des difficultés d'apprentissage.
Devenir
Afin d'etudier l'effet du traitement sur les marqueurs histopathologiques de la maladie d'Alzheimer,tous les animaux seront mis a mort a la suite de l'unique procedure du projet.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée, a savoir l’efficacite d’un traitement sur la cognition qui repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.
Réduction
Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Le calcul de la taille d’échantillon indique qu’un total de 60 animaux est nécessaire, soit environ 12 animaux par groupe. Afin d’assurer la représentativité biologique et d’examiner d’éventuelles différences liées au sexe, les expériences seront faites sur une cohorte de souris males, et une cohorte de souris femelles, ainsi l’effectif sera doublé avec un total de 120 animaux soit environ 24 animaux par groupe.
Raffinement
Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences pour l’acclimatation. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Un suivi du poids des souris et d’hydratation sera effectué de façon hebdomadaire, et une vigilance sera accrue sur la prise de boisson (pesee des biberons) pour s’assurer que le traitement ne perturbe pas la prise alimentaire et hydrique. Dans le cas peu probable ou la prise de boisson est pertubee par le traitement, un additif sucré sera ajouté à la preparation. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
L'étude utilisera l’un des modèles de souris transgeniques les plus utilisés dans la littérature pour l’évaluation de l’efficacité de traitements pour la maladie d'Alzheimer. Il est bien connue que le phénotype associé, ainsi que les lésions cérébrales typique de celle-ci, se manifestent aux alentours de 8 mois de vie et sont encore davantage prononcés à 12 mois de vie. Les animaux adultes seront testés selon une chronologie bien decrite dans la literature pour ce modele transgénique.
Etude pharmacologique de nouveaux candidats médicaments sur les activités électroencéphalographiques dans un modèle de rat parkinsonien
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués à l'issue pour vérifier l'exposition aux molécules testées, 2 100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une neurochirurgie de deux heures pour recevoir dans le cerveau une toxine qui détruit les neurones et reproduit la maladie de Parkinson, suivie de rétention urinaire, de perte d'appétit et de perte de poids. 900 d'entre eux vivent avec une ration limitée à 20 ou 25 grammes par jour pendant deux à six mois, en cage individuelle sur toute la durée du projet, avec trente minutes de contact avec leurs congénères par semaine dans ce que le porteur appelle une "cours de récréation". Le rat est décrit comme l'espèce "idéale" pour ce travail, en raison des similitudes entre son cerveau et celui de l'être humain, et parce que les rats adultes récupèrent plus facilement après la chirurgie.
Objectifs
La maladie de Parkinson résulte de la destruction progressive d'un réseau spécifique de neurones dans le cerveau, perturbant le fonctionnement de certains circuits neuronaux, ce qui cause les principaux symptômes moteurs de la maladie : la rigidité, la difficulté à initier les mouvements (akinésie) et les tremblements de repos. Le principal problème de cette maladie est que les symptômes moteurs apparaissent quand environ 60 à 80 % des neurones sont détruits. La maladie se détecte donc très tard, quand la plupart de ces neurones ont disparu. Les traitements actuels soulagent seulement les symptômes moteurs de la maladie sans la guérir. Bien que ces traitements soient efficaces plusieurs années, ils provoquent à long terme des effets secondaires importants (mouvements involontaires), parfois plus graves que les symptômes de la maladie elle-même. Il est donc crucial de trouver des moyens de détecter la maladie plus tôt, avant l'apparition des symptômes moteurs, pour intervenir rapidement, ralentir son évolution et améliorer la qualité de vie des patients sur une plus longue période. Pour développer de nouvelles thérapies contre la maladie, on utilise souvent des tests comportementaux. Bien qu'ils soient utiles, ils manquent parfois de sensibilité pour détecter l'efficacité de nouveaux traitements. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser des tests fonctionnels en enregistrant directement les perturbations causées dans le cerveau. Pour cela nous allons enregistrer l'activité électrique du cerveau. Cette technique est utilisée en clinique et en recherche préclinique, ce qui permet de passer facilement de l’un à l’autre. Nous nous basons sur des études cliniques qui ont montré des changements dans l’activité électrique de certaines parties du cerveau chez les patients parkinsoniens. Nous étudions ces activités cérébrales dans un modèle animal de la maladie, le rat parkinsonien. Des études préliminaires ont montré des activités cérébrales anormales chez ces animaux, similaires à celles observées chez les patients parkinsoniens. Ces signatures électriques nous aideront à évaluer plus efficacement les nouvelles thérapies dans des tests à court et long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier, sélectionner et valider de nouveaux candidats médicaments pouvant traiter la maladie de Parkinson
Procédures
Génération des rats parkinsoniens : une neurochirurgie d’environ 2 heures sera réalisée sous anesthésie générale sur un sous-groupe d’animaux de ce projet. Certains animaux vont recevoir pendant 15 jours une injection quotidienne d'un traitement anti-parkinsonien qui induira des rotations et des mouvements involontaires pendant quelques heures. Contrôle alimentaire : en dehors des phases critiques - à savoir l’établissement du modèle et la période de récupération post-chirurgicale (7 jours) - tous les animaux (900) recevront une ration quotidienne limitée de 20 à 25 g de nourriture, et ce, pendant toute la durée de l’étude à laquelle ils participent (2 à 6 mois). Tests pharmacologiques en administration de courte durée : • Des administration orales (durée : moins d’une minute par administration par animal) et des injections (durée : 30 secondes par animal) pourront être utilisées. Tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique) : les administrations pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Différents prélèvements sanguins pourront être faits au cours des procédures expérimentales. Ils seront conduits sous anesthésie générale si nécessaire, en fonction du protocole établi dans chaque étude (durée : moins de 20 min par prélèvement, fréquence : une à deux fois par semaine maximum). Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout le long du projet (entre 2 à 6 mois).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une neurochirurgie d’environ 2 heures durant laquelle ils recevront une injection intracérébrale unilatérale de toxine,qui induit la maladie, afin de reproduire la pathologie de Parkinson. La lésion des neurones peut engendrer une rétention urinaire, une perte temporaire de la motivation pour boire et manger causant une perte de poids (3 à 5 jours post chirurgie), une diminution transitoire du transite digestif. Les administrations de composés pharmacologiques peuvent causer un stress aigu et une douleur brève lors de leur injection. Lors d’injections répétées, un hématome ou des dommages tissulaires superficiels peuvent apparaitre aux sites d’injections (récupération en deux semaines). Les injections chroniques de molécule pour l’induction des mouvements involontaires (15 jours) engendrent des mouvements et rotations involontaires non-interruptibles, pouvant causer un stress aigu et une fatigue de l’animal (90 minutes post-injection). Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de candidats médicaments sur nos animaux, certains effets indésirables non anticipés peuvent survenir : relachement musculaire, somnolence ou excitation (quelques heures post-administration). Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendré du stress. Des prélèvements sanguins peuvent être faits pouvant causer stress et douleur brève au point de piqure.
Devenir
Tous nos animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en effet : à l’issue de chaque procédure, il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux nouvelles thérapies testées, à la fois chez les animaux rendus parkinsoniens et chez les animaux sains. Ceci se fera par la réalisation de prélèvements sanguins et de différents tissus.
Remplacement
Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques sur un modèle animal de la maladie de Parkinson. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro, ni de modèle computationnel reproduisant dans leur intégralité les circuits neuronaux impliqués dans cet pathologie qui puisse se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité du candidat médicament ou de la nouvelle thérapies testé, les tests précliniques in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.
Réduction
Dans le cas de nos études, chaque animal est son propre contrôle, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.
Raffinement
Les animaux qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement, pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien. Les animaux sont rassemblés 1 fois par semaine dans une « cours de récréation » pour assurer le maintien du contact social. Les animaux d’une même étude (maximum 12 animaux par session) sont rassemblés dans une enceinte fermée sur les cotés avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Cette session dure 30 minutes. Des échelles de cotation de comportement seront utilisées afin de prendre les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Enfin, afin d’éviter un stress aigu de nos animaux lors des injections, les rats sont habitués à la contention par les techniciens en charge des injections les jours précédents les traitements. Afin de réduire la douleur associée à ces injections, les aiguilles sont à usage unique et les sites d’injections alternés pour éviter d’injecter au même endroit consécutivement.
Choix des espèces
Le rat est considéré comme l'espèce idéale pour ce projet en raison des nombreuses similitudes entre le cerveau du rat et celui de l'humain, notamment en ce qui concerne le circuit neuronal impliqué dans la maladie de Parkinson et ses connexions avec le reste du cerveau. Pour ce projet, nous utiliserons des rats adultes. La maladie de Parkinson étant liée à l'âge, il est essentiel de travailler sur un cerveau adulte et pleinement développé. Un cerveau mature nous permettra également un meilleur positionnement des injections intracérébrales et des électrodes. De plus, les rats adultes récupèrent plus facilement après la chirurgie.