Rongeurs
Exploration de la contribution des fibres du toucher social dans la modulation de la douleur post lésionnelle.#2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à une injection destinée à provoquer une douleur, puis à neuf séances de stimulation mécanique de la patte arrière étalées sur quarante jours, 40 souris génétiquement modifiées sont toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le protocole enchaîne un traitement quotidien pendant cinq jours, deux injections à soixante-douze heures d'intervalle, puis pour certaines quatre injections supplémentaires, avant un transfert vers un second établissement où l'activité électrique de leur moelle épinière est explorée. Le projet porte sur le rôle des fibres du toucher léger et affectif dans la modulation de la douleur chronique, les souris étant modifiées pour que ces fibres puissent être supprimées. Les effets indésirables déclarés se limitent pourtant à un stress de contention et à une douleur "modérée et de courte durée".
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier la le rôle des fibres sensorielles codant le toucher léger et affectif dans la modulation des réponses douloureuses à long terme, en condition de douleur chronique. Ces fibres somatosensorielles sont capables de transmettre des stimulations mécaniques de faible intensité, détectées au niveau de la peau poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et transduction du toucher social ou affectif (plaisant). Alors que plusieurs études suggèrent que ces fibres pourraient contribuer à une diminution des douleurs chroniques à long terme, il n'existe pas de démonstration de directe de ce phénomène, dont les mécanismes demeurent totalement inexplorés. Notre projet utilise des souris transgèniques permettant de supprimer ou de manipuler spécifiquement ces fibres et d'enregistrer les propriétés des neurones de la moelle épinière consécutives à ces modifications. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somatosensoriels qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains.
Procédures
Au sein de l’établissement utilisateur 1, l’ensemble des animaux recevront, premièrement un traitement une fois toutes les 24h, pendant 5 jours consécutifs. 1 semaine plus tard, l’ensemble des souris recevront deux injections espacées de 72h. Ensuite, et seulement une partie des souris, recevront, 4 semaines minimum après l’injection, quatre injections espacées de 48h. Les animaux mentionnés dernièrement feront l’objet d’une étude comportementale sur une durée de 40jours pour un total de 9 sessions de stimulations mécaniques de la patte arrière. Chaque session est composé d’un maximum de 7 stimulations mécaniques espacées sur une durée d’une heure. Cette étude a pour but d’évaluer la sensibilité mécanique de l’animal. L’ensemble des animaux de ce projet seront ensuite transférés de établissement utilisateur 1 à l’établissement utilisateur 2 pour l’exploration de l’activité électrique mise en jeu au niveau de la moelle épinière pour une durée pour une durée n'excédant pas 3 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à des injections ou des gavages qui peuvent induire un stress chez l'animal. La réalisation des gavages et injections nécessite la réalisation d'une contention qui peut induire un stress chez l'animal. Certains animaux reçoivent une injection de substance visant à entraîner une douleur. Les animaux sont soumis à des tests comportementaux pouvant entraîner un stress ainsi qu'une douleur modérée et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans chaque procédure seront euthanasiés afin de prélever les tissus nécessaires aux besoins de l'analyse.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cortex somatosensoriel. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur, grâce à la génération de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Ainsi, la qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Nous prenons en considération différents critères (variabilité liée au traitement, variabilité liée aux tests comportementaux, nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable...etc.) nous permettant de déterminer au plus juste le nombre d’animaux prévus dans ce projet. Le nombre indiqué tient compte de toutes ces variables.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal de l’animal. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. De plus, les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la souffrance chez l’animal : - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages. - Planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. - Etablissement des points limites les plus précoces possibles. Enfin, l'euthanasie des animaux est éffectuée après utilisation d'analgésiques et d'anesthésiques.
Choix des espèces
La souris possède des fibres nerveurses sensorielles similaires à celles décrites chez l'homme sous le nom de C-Tactiles. Cette étude sera réalisée sur des souris âgées de 3 (début des procédures) à 18 (fin des procédures) semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes. La suppression de ces fibres chez l'adulte nécessite néanmoins d'intervenir à différents stades du développement juvénile, députant 3 semaines après la naissance.
Caractérisation des rythmes circadiens et évaluation de candidats médicaments chez la souris dans le cadre de la recherche sur les maladies neurologiques rares
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 304 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tuées à l'issue et 60 réutilisées dans d'autres procédures ou d'autres projets. Une partie subit une chirurgie intracérébrale de vingt minutes sous anesthésie pour recevoir un candidat médicament, toutes passent par des prélèvements sanguins sur animal vigile et par des modifications du cycle lumière-obscurité, et les lignées génétiquement modifiées développent des troubles de l'équilibre, des tremblements et des dermatites, avec un point limite fixé à 20 % de perte de poids. À court terme, le projet cherche à vérifier que ces modèles murins reproduisent les troubles du sommeil observés chez les patients, l'amélioration de leur qualité de vie étant renvoyée au long terme. Le porteur conclut au caractère "indispensable" du recours à l'animal, les rythmes circadiens ne pouvant selon lui s'étudier qu'à l'échelle d'un "organisme entier".
Objectifs
Les maladies rares neurologiques comme les ataxies spinocérébelleuses sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. Elles peuvent se manifester dès la naissance ou apparaitre chez l’adulte et, pour la majorité d’entre elles, aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. Chez les mammifères, la majorité des processus biologiques, aussi bien sur le plan macroscopique que moléculaire, évoluent dans le temps en suivant des rythmes quotidiens précis. Le système nerveux intègre un grand nombre d’informations environnementales pour pouvoir mobiliser les ressources suffisantes et reconstituer les réserves aux moments opportuns. Les affections de ces rythmes appelés circadiens se matérialisent régulièrement par des troubles du sommeil et de la fatigue excessive pendant la journée. Ces symptômes sont très fréquents chez les patients atteints de pathologies neurodégénératives c’est pourquoi il est important de les étudier chez les modèles murins utilisés pour le développement de médicaments ciblant ces maladies. Ces modèles permettent de mettre en avant l’action bénéfique des traitements sur la pathologie et ses symptômes. Les symptômes de certaines pathologies sont reproductibles chez la souris à la suite d’altérations génétiques destinées à modifier le fonctionnement du système nerveux central. La souris présente une forte homologie génétique (90% des gènes humains ont un homologue chez la souris), physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. Chez la souris hébergée en animalerie, le paramètre environnemental qui a la plus grande influence sur le rythme circadien est la lumière. L’ensemble des autres paramètres (température, pression…) sont régulés et maintenus constants. La souris est une espèce nocturne : la majorité de son activité a lieu pendant la période d’obscurité, la période de lumière étant réservée au repos. Des conditions de basse luminosité ou d’obscurité totale sont favorables à la souris et limitent son anxiété. L’objectif de ce projet est d’identifier des défauts de rythmes circadiens chez des modèles murins de maladies neurologiques et d’évaluer la capacité de composés médicaments à diminuer ces affections. A long terme, l’objectif du projet est de participer à la mise au point de médicaments qui, en agissant sur leur cible, permettent de diminuer le plus grand nombre de symptômes, y compris ceux touchant les rythmes circadiens pour améliorer la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier des défauts de rythmes circadiens chez nos animaux modèles de maladies neurodégénératives et d’évaluer la capacité de nos candidats médicaments à restaurer ces modifications. A court terme, les résultats obtenus avec ce projet visent à prouver que les modèles animaux utilisés récapitulent correctement les troubles de rythmes circadiens retrouvés chez les patients. Ce projet permettra aussi de mettre en évidence un impact positif des composés médicaments testés sur la physiopathologie de la maladie chez la souris en plus d’avoir un effet au point de vue moléculaire identifié préalablement. Ces éléments ont pour but de renforcer les preuves d’efficacité des composés étudiés, en plus des données de tolérabilité et engagement de cibles obtenus plus tôt dans le processus de développement. A long terme, l’objectif de ce projet est de participer à la mise au point de médicaments qui, en agissant sur leur cible, permettent de diminuer le plus grand nombre de symptômes possibles, y compris ceux touchant les rythmes circadiens dans le but d’améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
• Administration des médicaments vétérinaires analgésiques par voies sous-cutanée ou intra-péritonéale (contention d’une durée maximale de 30s). Cela concerne 3 produits lors de la phase de chirurgie (5 administrations cumulées en pré et post opératoire) en cas d’administration intracérébrale de candidat médicament. La chirurgie pour l’administration intracérébrale est réalisée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique comme décrit ci-dessus (durée maximale de 20 minutes – 1 seule fois au cours de l’expérience seulement en cas d’administration intracérébrale de candidat médicament). • Administration des médicaments vétérinaires analgésiques et anesthésiants en fin de procédure par voies sous-cutanée ou intra-péritonéale (contention d’une durée maximale de 30s). Cela concerne 2 produits lors de l’euthanasie en fin de procédure. • Prélèvement de sang sur animal vigile (1 fois toutes les 3-4 semaines pendant 11 semaines maximum) : o Contention d’une durée maximale de 2min o Piqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes o Prélèvement de sang d’une durée maximale de 30 secondes
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress et/ou de douleur peut provenir lors : - Avant et pendant les phases de chirurgie et d’euthanasie. Préalablement à ces étapes, des analgésiques et/ou anesthésiques sont injectés en sous-cutané ou intra-péritonéal (3 administrations pour la phase chirurgicale lors de l’administration intracérébrale de candidat médicament et 2 administrations en fin d’étude pour l’euthanasie). La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer un stress léger. La phase d’anesthésie générale gazeuse puis la chirurgie pour l’administration par voie intra cérébrale (1 chirurgie maximale d’une durée d’environ 20 minutes) et le suivi post-opératoire peuvent générer une douleur modérée. - Des prélèvements de sang au niveau de la veine saphène de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer un stress léger. 3 prélèvements maximum sur animal vigile, espacés de minimum 3 semaines et répartis sur une durée de 7 semaines. - De la modification du cycle lumière/obscurité pendant l’hébergement (stress léger). Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : - D’une perte de poids limitée à 20% du poids de l’animal (nuisance modérée). - De signes cliniques liés à l’expression du phénotype dommageable : les souris génétiquement modifiées miment les pathologies humaines et sont susceptibles de développer ainsi des signes cliniques évolutifs tels que des troubles moteurs (incoordination motrice, nuisance légère), des dermatites… (nuisance modérée).
Devenir
Procédure 1 et 2 : maximum 10 animaux par groupe expérimental seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront de réaliser des analyses biochimiques. Minimum 6 animaux par groupes seront réutilisés : si la fenêtre d’expression du phénotype est toujours compatible et si les génotypes/sexes étudiés n’ont pas encore été mis en œuvre dans la procédure suivante, les animaux de la procédure 1 peuvent être utilisés pour la procédure 2 et inversement. Si la fenêtre d’expression du phénotype n’est plus compatible avec les procédures de ce projet ou si les génotypes/sexes étudiés ont déjà été mis en œuvre dans la procédure 1 et 2 de ce projet, les animaux seront réutilisés dans d’autres projets. Procédure 3 : toutes les souris sont euthanasiées en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront de réaliser des analyses biochimiques.
Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches pluripotentes induites) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal mimant les troubles de la pathologie humaine. Il est donc nécessaire de valider les modèles physiopathologiques avant que les molécules les plus abouties dans leur développement ne soient administrées in vivo pour évaluer leur capacité à réduire les symptômes préalablement identifiés. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sain ou génétiquement modifié) possède des caractéristiques comportementales et neurophysiologiques permettant d’étudier des phénomènes comportementaux intégrés à l’échelle d’un organisme entier comme les rythmes circadiens. L’identification de modèles physiopathologiques qui récapitulent précisément les symptômes retrouvés chez les patients est critique afin de tester l’efficacité des nouvelles thérapies sur ces mêmes altérations. Le recours à l’animal est indispensable étant donné qu’une majorité des aspects physiopathologiques, en particulier des affections des rythmes d’activité, d’une maladie ne peuvent être récapitulés in silico ou in vitro.
Réduction
Les phases de caractérisation et de validation des modèles permettent d’appréhender le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour les études d’efficacité de traitements pharmacologiques. Un accompagnement par le service des Biostatistiques sera assuré dans le but d’affiner le design expérimental. Le portoir de télémétrie connecté enregistre les données à l’échelle de la cage, sans discriminer le nombre et les animaux dans la cage. Cette spécificité limite donc la puissance statistique, l’unité de mesure (répliquât biologique) étant la cage et non pas l’animal. Il a ainsi été préféré un hébergement en binôme, soit le minimum permettant de ne pas faire d’hébergement individuel stressant pour l’animal mais permettant néanmoins de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’historique interne d’analyse des mesures d’activité générées par le portoir connecté suggère que des effectifs de 8 cages par groupe représente le minimum nécessaire pour observer des tendances ou des différences significatives sur les paramètres étudiés. La méthode de prélèvement de sang répété de faible volume, peu invasive et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le projet tout en respectant le bien-être les limites de volémies. Les études seront mises en place dans un premier temps et en priorité sur les lignées transgéniques et génotypes pour lesquels les informations historiques ou de la littérature existante suggèrent qu’ils peuvent mimer les symptômes des patients et donc nous apporter les réponses nécessaires aux questions scientifiques. Les animaux employés dans l’une des deux premières procédures seront réutilisés, après s’être assuré que les animaux sont correctement resynchronisés à un cycle lumière/obscurité classique, dans l’autre procédure (1 ou 2) seulement et seulement si la fenêtre d’expression du phénotype est toujours exploitable, si aucun prélèvement terminal n’est nécessaire et les souches/génotypes/sexes n’ont pas déjà été étudiés dans l’autre procédure. Si la fenêtre d’expression du phénotype n’est pas compatible avec une réutilisation dans une procédure de ce projet, les animaux seront réutilisés dans un autre projet. En cas de prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal après son euthanasie permettant la réalisation de nombreuses et différentes analyses biochimiques et/histologiques.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de 2 dès l’arrivage et pendant toute la durée de l’étude, sauf si les caractéristiques et l’historique liés à la souche ne le permettent pas (agressivité), en accord avec les recommandations de la Structure de Bien-Être Animal (SBEA). Dans le cas d’un hébergement individuel suite à de l’agressivité, une mesure compensatoire est prévue par l’ajout d’un élément de nidification. Les recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la SBEA seront appliquées aux souris génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. L’activité des animaux sera enregistrée en continu et de manière non-invasive grâce à l’hébergement des animaux dans des cages d’hébergement classiques insérées dans un portoir de télémétrie connecté. Les composés ne passant pas la barrière hématoencéphalique seront administrés chirurgicalement par voie intra cérébrale sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire favorisant une meilleure récupération de l’animal. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal), se fera sur couverture chauffante puis pour le réveil dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien. Le suivi est accru pendant la période post-chirurgie, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation 1 heure après la chirurgie, des pesées quotidiennes pendant les 7 jours qui suivent l’opération et l’application de points limites éthiques adaptés à cette intervention le cas échéant. Ce projet bénéficie d’une expérience interne robuste et de données déjà existantes sur (i) l’utilisation des souris transgéniques ciblés dans ce projet, (ii) l’administration par voie intra cérébrale et (iii) l’analyse de l’activité des souris grâce au portoir connecté. Ces connaissances permettent de définir des mesures de raffinement cohérentes comme l’utilisation d’une grille de scoring post-chirurgie ou des soins appropriés en cas d’expression du phénotype dommageable. Lors de la mise à mort et si nécessaire la perfusion intra-cardiaque est réalisée après observation de l’arrêt respiratoire suite à l’injection létale de pentobarbital pour limiter la souffrance liée à ce geste.
Choix des espèces
- La souris présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. En particulier, sur le plan comportemental, de nombreux modèles génétiquement modifiés ont été développés chez la souris, en miroir des fonctions cognitives, sensori-motrices et des états émotionnels de l’Homme en conditions physiologiques ou pathologiques. - Les procédures d’évaluation décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. - La souris est génétiquement modifiable et ce avec des techniques de plus en plus performantes, offrant une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles dans les maladies neurologiques rares. En accord avec les symptômes observés chez les patients des pathologies étudiées, les phénotypes présentés par certains animaux incluent des troubles de la démarche et de l’équilibre, une légère hypoactivité, de légers tremblements. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge maximal des animaux pendant les procédures est de 12 mois. L’âge n’est pas une variable étudiée dans ce projet : aucune procédure ne vise à déterminer les différences d’affection des rythmes circadiens en fonction de l’âge des souris. Pour les lignées à phénotype dommageable les animaux adultes seront utilisés au plus tôt dans leur période symptomatique. La fenêtre d’expression du phénotype chez chaque souche est déterminée grâce à l’historique d’utilisation en interne et aux données de la littérature. Les animaux seront utilisés à un âge compris entre 2 et 12 mois de manière à couvrir l’ensemble des fenêtres d’expression phénotypique pour toutes les souches citées dans ce projet. L’âge d’utilisation dépend aussi des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure du Bien Être Animal.
Travaux Pratiques-Formation relative à l’expérimentation animale destinée aux personnels concepteurs et réalisateurs de procédures
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 150
Cinq voies d'administration et trois sites de prélèvement sanguin, dont le sinus rétro-orbitaire, pratiqués sur chaque animal maintenu quarante-cinq minutes sous narcose : 450 souris et 150 rats vont être utilisés dans cette formation, une partie tuée sans reprise de conscience, l'autre dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. La séance se termine par une ponction intracardiaque, la mise à mort étant réalisée par les apprenants eux-mêmes sous supervision. D'autres souris, vigiles et à jeun depuis douze heures, subissent une incision de l'extrémité de la queue pour six gouttes de sang prélevées sur quatre-vingt-dix minutes après injection de glucose ou d'insuline. Ces séances ne produisent aucune connaissance, le porteur décrit une offre de formation dispensée deux fois par an, dont l'effectif n'a fait l'objet d'aucun calcul statistique.
Objectifs
L'objectif du projet vise à former les futurs chercheurs et techniciens qui seront amenés dans leur métier à utiliser des animaux vivants dans des procédures expérimentales. Il est attendu que la maîtrise des aptitudes pratiques se développe de façon progressive au cours de trois (3) séances de travaux pratiques sous supervision sans accroître les risques pesant sur le bien-être animal. Les mises en situation pratique des apprenants permettront de compléter les connaissances acquises dans les cours théoriques avec acquisition de gestes qui correspondront aux procédures expérimentales légères et/ou sans réveil pour lesquelles les stagiaires pourront acquérir une base d’expérience pratique du fait d’un encadrement renforcé (ratio apprenants/enseignants de 5 à 6 maximum).
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette formation modulaire axé sur des acquis d’apprentissage permettront aux apprenants de maîtriser la contention manuelle chez les rongeurs tout en exécutant les procédures courantes faiblement invasives comme les administrations et les prélèvements (voie d’administration, volumes, fréquences) dans le respect du cadre juridique et réglementaire de l’expérimentation sur les animaux vivants (selon la Directive 2010/63/UE). Il est aussi attendu que les apprenants puissent décrire la biologie minimale de base chez le groupe d’espèces rongeurs et lagomorphes (anatomie comparée, physiologie), définir la sédation, l’analgésie, l’anesthésie (avec évaluation des niveaux d’anesthésie, décrire les effets indésirables) et les urgences anesthésiques. La formation permettra d'intégrer les questions d’éthique et de bien-être soulevées par l’utilisation des animaux vivants dans les procédures expérimentales (application des 3Rs, classification et degré de gravité) tout en décrivant des exemples de méthodes et de stratégies de recherches alternatives.
Procédures
Le projet utilisera en majorité des animaux maintenus sous anesthésie générale pour atténuer les effets indésirables et supprimer les sensations douloureuses lors des contentions et des manipulations. Les animaux seront donc soumis à des confinements en chambre d’induction et à des injections intrapéritonéales pour le maintien des anesthésies générales. La pratique additionnelle de 5 voies d’administration (po, sc, id, im, iv), et de 3 sites de prélèvement sanguin (veine de la queue, veine saphène, sinus-rétro-orbitaire) chez les animaux maintenus sous narcose pendant 45 minutes précèdera le prélèvement sanguin terminal par ponction intra-cardiaque après un renfort de l’analgésie effectif de 30 minutes. Enfin les prélèvements répétés chez la souris vigile à jeun de 12 heures se feront par une incision superficielle unique de l'extrémité de la queue insensibilisée par l’application locale de lidocaïne et permettront de collecter un total de 6 gouttes de sang sur une période de 90 minutes après injection ip de glucose ou d'insuline. Les interventions/manipulations sur les animaux n'occasionneront que des contraintes légères et de courte durée limitant les douleurs ou dommages engendrés.
Impact sur les animaux
Le projet utilisera en majorité des animaux maintenus sous anesthésie générale pour atténuer les effets indésirables et supprimer les sensations douloureuses lors des contentions et des manipulations. Les principales nuisances seront un confinement en chambre d’induction pour les (pré)anesthésies gazeuses (isoflurane 4%, station TEM SEGA), puis des administrations/prélèvements sous narcose après injection intra-péritonéale (ip) d’un mélange de kétamine 100mg/kg et de xylasine 10mg/kg chez le rat (aiguille 23G) et la souris (aiguille 27G). Le maintien de la narcose et de l’analgésie limitera les interventions aux contraintes légères et de courte durée avec une pratique additionnelle de 5 voies d’administration de solution saline (po, sc, id, im, iv), et de 3 sites de prélèvement sanguin (veine de la queue, veine saphène, sinus-rétro-orbitaire) avec aiguilles 27G et seringues de 1ml. L’anesthésie sous surveillance (maximum 45 minutes) sera suivie d’une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05mg/kg) et de lidocaïne (7mg/kg) pour renforcer l’analgésie chez les animaux 30 minutes (délai d'action) avant prélèvements terminaux par ponction intra-cardiaque. Enfin chez la souris vigile à jeun, une incision superficielle unique de l'extrémité de la queue insensibilisée par l’application locale de lidocaïne permettra de gérer les prélèvements répétés avec prise de 6 gouttes de sang sur une période de 90 minutes après injection ip de glucose ou d'insuline.
Devenir
Les animaux utilisés dans chacune des procédures seront mis à mort par les apprenants sous supervision selon les recommandations de l’annexe IV de l’arrêté du 1er février 2013 pour le groupe d'expèces rongeurs. Une aide technique adéquate permettra aux apprenants de procéder à une mise à mort de manière compétente et sans cruauté sur les espèces d’animaux de laboratoire concernées (rat, souris), puis d’inculquer les principes pour maîtriser le traitement ou l’élimination des cadavres après confirmation du décès par une méthose supplémentaire (arrêt respiratoire, rigidité cadavérique).
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants dans ce projet est jusitifée par la nécessité de mettre en situation pratique les apprenants pour l'acquisition de gestes réalisés dans le cadre de procédures courantes et peu invasives (sans et avec anesthésie). Afin de respecter la régle des 3R, une approche progressive prévoyant des méthodes de remplacement avec des maquettes et des démonstrations vidéo permettra de garantir qu’aucune douleur, souffrance ou angoisse ainsi qu’aucun dommage durable ne soient infligés aux animaux lors du passage à l’utilisation d’animaux vivants après développement d’aptitudes manuelles.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum tout en répondant aux critères de qualité de la formation et à ses objectifs qui sont axés sur les acquis d’apprentissage afin de garantir que les procédures réalisées par les apprenants atteignent un niveau de qualité suffisant. Cette formation proposée deux (2) fois par an s’appuiera sur un nombre limité de séances de travaux pratiques en favorisant le travail par binôme de façon à réduire l'utilisation des animaux à son nombre minimum sans nécessité de recourrir à une approche statistique pour calculer leur nombre au plus juste. La réutilsation et le partage des tissus permettront également de répondre à la régle des 3Rs en réduisant le nombre d'animaux.
Raffinement
En plus d'un encadrement renforcé, l'utilisation d'agents anesthésiants locaux et généraux (isoflurane, kétamine, lidocaïne) et d'analgésiques (xylasine, buprénorphine) fera partie des mesures pour réduire au minimum les inconforts et les nuisances causées aux animaux. Cette stratégie de raffinement s’appuiera aussi sur la protection des yeux (onguent ophtalmique) et l’utilisation de tapis chauffants pendant la durée de l’anesthésie générale. En complément, les réactions inattendues aux procédures, puis l’évaluation régulière des signes vitaux (respiration, coloration muqueuses, hypothermie) pendant l’anesthésie seront choisies comme points limites précoces compatibles avec les objectifs scientifiques du projet relatifs à l’anatomie comparée des rongeurs (rats, souris). Les signes cliniques de malaise (déshydratation, tremblement, convulsion) qui pourraient apparaitre lors d’un diabète sucré chez le rongeur serviront quant à eux de points limites chez les animaux modèles de diabète alloxanique pour le personnel zootechnicien (et d'astreinte) et les participants au projet de formation.
Choix des espèces
L’utilisation de rongeurs (rats/souris) dans le cadre de cette formation pratique permet aux apprenants de développer leurs aptitudes manuelles afin de concevoir et de réaliser des procédures expérimentales chez ce groupe d’espèces dans le cadre de leur(s) fonction(s). Ce groupe d’espèces comprend les modèles animaux les plus employés en recherche biomédicale et leur utilisation en expérimentation permet d’étudier la biologie et les comportements normatifs, puis les processus pathologiques spontanés ou induits ayant un ou plusieurs aspects communs avec l'homme. Les animaux utilisés (souris femelles, rats mâles) seront de jeunes adultes à maturité sexuelle qui autoriseront une étude de la physiologie des systèmes ainsi que l'analyse de paramètres biologiques (volume sanguin, hématocrite) et biochimiques (glycémie).
Evaluation de l’innocuité et de l’immunogénicité d’antigènes associés ou non à des adjuvants en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
Rats : 1000
Cochons d'Inde : 1000
Hamsters dorés : 1000
Lapins : 1000
Cochons : 100
Des souris transgéniques, des animaux âgés choisis pour leur immunité déclinante et des nouveau-nés au système immunitaire immature figurent parmi les 29 100 animaux non-humains de ce projet. 25 000 souris, 1 000 rats, 1 000 cobayes, 1 000 hamsters dorés, 1 000 lapins et 100 porcs vont être utilisés dans des procédures que le porteur classe en souffrance légère. Chaque animal reçoit d'une à six immunisations espacées de une à huit semaines, avec les prélèvements sanguins associés, pour mesurer la réponse immunitaire à des candidats vaccins destinés à l'être humain. Le porteur annonce 200 lapins adoptés, 150 lapins et porcs réutilisés et 100 rendus à l'élevage, soit 450 individus sur 29 100, les autres étant tués dès que les prélèvements de sang deviennent importants ou que des organes doivent être prélevés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer, l’immunogénicité et l’innocuité de candidats vaccins développés en traitements préventifs ou thérapeutiques de maladies infectieuses humaines. Ces candidats incluent des protéines recombinantes, des bactéries ou virus vivants atténués ou inactivés, des acides nucléiques (ARN ou ADN), des vaccins sous-unitaires de type polysaccharides, etc…. Les études d'immunogénicité permettent d'évaluer le bénéfice de nos candidats préventifs ou thérapeutiques, d'identifier les composants nécessaires à leur formulation, d'évaluer les nouvelles voies d'administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d'améliorer leur performance et leur innocuité. Ces études permettent également de comprendre le mécanisme d'action des candidats vaccins. L’objectif est d’analyser la réponse immune primaire, de rappel ou mémoire, ainsi que certains paramètres d’innocuité (réactogénicité locale et systémique, suivi du poids et éventuellement de la température corporelle, …). Des études de dosage du candidat vaccin d’intérêt peuvent être aussi nécessaires (contexte thérapeutique ou de biodistribution).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la mise sur le marché ou éventuellement l’utilisation en essai clinique, de nouveaux vaccins qui répondent aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de l’innocuité et de la réponse immunitaire des candidats. La découverte de nouveaux candidats vaccins permettra de lutter contre des maladies pour lesquelles il n'existe pas de thérapies ou de prophylaxies suffisamment efficaces et de sauver des vies humaines dans le monde.
Procédures
Les études d’immunogénicité et d’innocuité consistent à administrer des vaccins constitués d’antigènes, mRNA ou DNA,ou germes entiers dont la dose peut être unique ou multiple sous différentes voies d’immunisation en vue de générer des réponses immunitaires spécifiques contre un pathogène défini. Les études d’immunogénicité et d’innocuité consistent à administrer des vaccins constitués d’antigènes, mRNA ou DNA,ou germes entiers dont la dose peut être unique ou multiple sous différentes voies d’immunisation en vue de générer des réponses immunitaires spécifiques contre un pathogène défini. Le nombre d'immunisations/ injections est compris entre 1 et 6 avec un intervalle entre chaque immunisation de 1 à 8 semaines. L’ensemble des voies d’administration peut être réalisé sur animal vigile ou anesthésié. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute, tout comme les différents prélèvements envisagés
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures utilisées est évalué en léger. L’administration des candidats vaccins génère des signes cliniques légers. Une réactogénicité systémique comme une élévation de la température corporelle pourraient être observés. Ces signes sont transitoires et disparaissent quelques jours après l’immunisation. La contrainte représentée par les prélèvements est également évaluée en degré léger. Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est également évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux pour lesquels des volumes sanguins prélevés nécessaires permettant le maintien en survie pourront être adoptés ou replacés. Dans le cadre de volumes sanguins plus importants et des prélèvements d’organes, les animaux seront euthanasiés. Le placement des animaux n’ayant pas fait l’objet ni d’un prélèvement terminal ni d’une injection par un germe entier sera possible et analysé au cas par cas sous réserve que : – l’état de santé de l’animal, certifié par un vétérinaire, le permette ; – il n’existe aucun danger pour la santé publique, la santé animale et l’environnement – des mesures appropriées aient été prises pour préserver son bien-être.
Remplacement
L’immunogénicité induite par un candidat vaccin nécessite un enchainement d’étapes et implique de multiples organes et tissus. Cette succession d’évènements est difficile à reproduire in vitro. Dans le cadre du développement de candidats vaccins, la réponse immunitaire ainsi que la protection induite doivent être évaluées sur un organisme entier. A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour reproduire la complexité des réponses immunes et évaluer les capacités d’un vaccin à induire une réponse immunitaire. Les essais in vitro apportent des données complémentaires, mais ne peuvent substituer les essais in vivo. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est revu par nos équipes de biostatisticiens et correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’avoir des résultats scientifiquement fiables et reproductibles. Lorsque le design du test le rend possible, un prélèvement sanguin des animaux avant la première immunisation est réalisé pour éviter l’ajout d'un groupe contrôle non immunisé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et au sol (lapins), dans des modules (lapins, cobayes) ou dans des cages (lapins, souris, hamsters, cobayes) contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les manipulations. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés. En fonction des procédures réalisées et des traitements administrés, les animaux peuvent être proposés à l’adoption.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des antigènes évalués, de la réponse immune analysée et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : - développant une maladie et/ou une réponse immunitaire similaire à l’homme - type d’antigènes : protéines, polysaccharides, pathogènes (vivants, atténués, non réplicatifs ou inactivés), acides nucléiques, anticorps en présence d’adjuvant ou non. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : âge et taille des animaux (voie ou volume administrés, volume de prélèvement…), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire et à la protection. Elles seront à phénotype non dommageable et ne nécessiteront pas de génotypage. Pour des projets Recherches & Développement (R&D) particuliers, des animaux âgés seront utilisés pour étudier les phénomènes d’immunosénescence et l’évaluation de candidats vaccins pour les personnes âgées. De même, pour l’évaluation de candidats vaccins pédiatriques des modèles d’animaux juvéniles avec des systèmes immunitaires non matures, (souriceaux, raton ; etc…) seront utilisés.
Développement d’une technique innovante et mini-invasive d’injection de thérapie génique dans l’oreille interne par bioimpression assistée par laser
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Opérées de l'oreille interne à l'âge de deux semaines, 70 souris reçoivent une thérapie génique déposée au laser sur la fenêtre ronde, puis passent quatre mesures d'audition sous anesthésie étalées sur huit semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées après la dernière mesure, pour prélèvement des tissus de l'oreille interne. Une partie des animaux appartient à une lignée sourde par mutation, ce qui doit permettre de vérifier que la thérapie restaure l'audition avant un passage chez l'être humain. Le porteur affirme que le dépôt au laser et les mesures d'audition n'engendrent aucune douleur, et annonce des points limites définis sans dire lesquels.
Objectifs
L’oreille interne, où se situe la cochlée, l’organe permettant d’entendre, est difficile d’accès pour l'administration de médicaments. En effet, la cochlée est un organe de quelques millimètres situé derrière le tympan. La présence d’une barrière physiologique entre la circulation sanguine et les liquides de l’oreille interne limite l’accès par les voies conventionnelles telles que la voie orale ou intraveineuse. Une des extrémités de la cochlée, la membrane de la fenêtre ronde, fine et perméable, est une voie d’accès à la cochlée. En effet, il est possible de venir déposer le médicament sur la membrane de la fenêtre ronde, cette approche étant considérée conservative et peu invasive. La bioimpression assistée par laser permet le dépôt contrôlé et très précis de bioencre contenant des cellules. En adaptant la technique de bioimpression assistée par laser, il est possible de faire de l’administration de médicaments assistée par laser. Cette méthode a déjà été utilisée pour l’administration d’anti-inflammatoires sur la membrane de la fenêtre ronde chez la souris. Les résultats montrent que le médicament diffuse jusqu’aux cellules au sein de la cochlée sans effet délétère. Dans la continuité de ce projet, l’objectif est d’améliorer le procédé de dépôt ciblé pour l’administration de thérapie génique permettant la correction de surdité d’origine génétique. Nous souhaitons valider un nouveau dispositif laser conduit à l’aide d’une fibre optique et permettant le dépôt ciblé de thérapie génique sur la fenêtre ronde humaine. Des méthodes pour augmenter la diffusion à travers la membrane doivent également être validées pour améliorer le transfert de la thérapie génique. Finalement, la correction du défaut génétique et la récupération de l'audition seront validées chez un modèle animal présentant une modification génétique similaire à l'homme, touchant la production d'une protéine indispensable pour entendre.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer le dispositif d’injection et de diffusion de médicaments, et plus particulièrement de thérapie génique, dans la cochlée, avec une grande précision et sans risque de lésions, contrairement aux injections invasives développées à ce jour. L’utilisation d’une fibre et de médicaments plus volumineux nécessite une nouvelle validation du procédé de dépôt ciblé assisté par laser sur la fenêtre ronde et une diffusion dans l’oreille interne. De plus, cette étude pré-clinique est nécessaire pour ensuite passer aux essais cliniques chez l’homme. D’un point de vue technique, ce projet est une étape-clé pour optimiser la technologie de dépôt ciblé de médicaments assisté par laser conduit par fibre. Plus largement, ce projet permettra de valider l’utilisation du laser pour l'administration de médicaments.
Procédures
Les animaux seront soumis à des mesures pré-opératoires et post-opératoires de l’audition, n’excèdant pas 10 minutes. Les mesures post-opératoires seront effectuées 48h, une semaine, deux semaines et huit semaines après l’opération. Cette mesure est similaire aux mesures réalisées sur l’homme éveillé. Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 15 minutes) et à une administration de médicaments dans l’oreille (durée de 10 à 12 minutes au total pour installer la souris, paramétrer le laser puis administrer le médicament). Un anti-douleur est également administré en pré-opératoire, et 24h après la chirurgie, pour limiter la douleur occasionnée par la chirurgie. L’administration de médicaments assistée par laser ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et sont réalisés sous anesthésie générale car cela nécessite une immobilisation complète de l’animal. Dans leur globalité, les procédure pré-opératoire et opératoire n’excèdent pas 40 minutes maximum afin de limiter la durée de l’anesthésie. Toutes ces interventions seront faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir du stress avant et lors des anesthésie (entre 2 et 5 minutes). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies pour le limiter. Des douleurs pourront être ressenties après la chirurgie durant les 2 jours post-opératoires. Les protocoles de dépôt ciblé et de mesure de l’audition n'engendreront aucune douleur. Chez les souris avec surdité d'origine génétique, la thérapie génique doit entraîner la récupération de l'audition dans les semaines suivant le traitement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue à la fin de la dernière mesure de l'audition (huit semaines post-opératoire). Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse quantitative et qualitative (histologie, fluorescence).
Remplacement
L’application de thérapie génique sur la membrane de la fenêtre ronde assistée par laser s’insérant dans un projet d’application clinique future, il est nécessaire de valider son efficacité (diffusion et transfert) et son innocuité (sans impact auditif) sur un modèle animal. Seules les conditions in vivo chez l’animal permettent d’évaluer l’effet de la procédure sur l’audition. Ces mesures doivent être effectuées sur des animaux mammifères qui possèdent un système auditif suffisamment proche de l’homme, et un défaut auditif génétique similaire. Aucun environnement multifactoriel ne permet de reproduire ce modèle in vitro. Néanmoins, des études in vitro et ex vivo seront réalisées pour sélectionner les paramètres laser du dépôt ciblé, de la perméabilisation, et du gel contenant la thérapie génique.
Réduction
Des tests préliminaires seront effectués sur des lames receveuses et du matériel inerte afin de fixer l’entièreté des paramètres de bioimpression (paramètres laser et composition de l’hydrogel) avant de procéder aux expérimentations animales. La méthode de perméabilisation sera décrite précisément et validée in vitro et ex vivo, avant de procéder aux études in vivo. Chaque souris sera utilisée pour l’entièreté de la procédure : mesure pré-opératoire de l’audition, chirurgie, perméabilisation et dépôt ciblé assistés par laser, et les quatre mesures post-opératoires de l’audition, afin d’en limiter le nombre. Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions (contrôles, validation du dépôt ciblé, délivrance de médicaments actifs). Le nombre total de 70 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage en groupe (5 par cage) à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux dans la semaine précédant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante, uniquement avec la mère puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe per-opératoire. La douleur engendrée par la chirurgie sera réduite au maximum par utilisation d’analgésique et anesthésique local. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites sont définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Tous les expérimentateurs satisferont les obligations de formation en chirurgie sur rongeurs et en expérimentation animale.
Choix des espèces
L’évaluation de l’impact de la procédure sur la fonction auditive et de la diffusion et du transfert de thérapie génique dans l’oreille interne nécessite de réaliser des expérimentations sur l’animal. Les mesures de l'audition ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Chez la souris, l’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible par voie chirurgicale. Des études présentent les voies d’accès à la membrane de la fenêtre ronde chez la souris, afin d’avoir une chirurgie reproductible et le moins traumatique possible. Par ailleurs, une lignée de souris présentant un défaut auditif génétique similaire à l’homme existe au sein de l’animalerie et nous permettrait de valider la diffusion, le transfert génique et la récupération de l’audition. Les souris utilisées auront deux semaines lors de la procédure opératoire, car les souris plus âgées présentent une structure anatomique limitant l’accès à la fenêtre ronde.
Rôle des molécules S100 dans la pathogenèse du diabète de type 2 EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées puis nécropsiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent jusqu'à quinze gavages un jour sur deux, seize prélèvements sanguins à la queue, une chirurgie de pose de pompe osmotique sous anesthésie, un régime enrichi en lipides pendant douze semaines au plus, des séances de tapis roulant cinq fois trente minutes par semaine sur six semaines, et pour certaines un isolement de quarante-huit heures en cage de calorimétrie. Le porteur décrit des blessures œsophagiennes possibles après les gavages répétés, des crampes abdominales après l'injection de molécules toxiques pour les cellules du pancréas, et des blessures légères aux pattes à la course. L'objet est de mesurer le rôle d'une protéine dans l'insulino-résistance et la fonte musculaire, et le porteur écrit que le recours à la souris est "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant ces interactions.
Objectifs
L'obésité est un facteur de risque majeur de diabète de type 2 (DT2) qui représente un fardeau de santé publique et diminue l’espérance de vie en bonne santé. Ces deux pathologies sont également associées à une insulino-résistance et une sarcopénie, i.e. perte progressive de masse et de force musculaire. Nous avons mis en évidence une surexpression marquée d’une protéine d’intérêt. Cette protéine peut s’hétérodimériser avec une autre protéine de la même famille pour former un complexe multi-protéique. Ces protéines jouent un rôle clé dans l’inflammation et l’immunité. Cependant leur rôle dans la pathogenèse du DT2 reste incertain. Nous émettons l’hypothèse que cette protéine pourrait jouer un rôle causal dans les altérations métaboliques et fonctionnelles du muscle squelettique dans un contexte d’obésité et de vieillissement. L’objectif de ce projet est de : 1) démontrer un rôle causal de notre protéine d’intérêt dans le développement de l’insulino-résistance et de la sarcopénie ; 2) évaluer si l’inhibition de l’action de cette protéine prévient au moins en partie du développement de l’insulino-résistance et/ou de la sarcopénie associée à l’obésité et à l’âge. Ces questions exigent le recours au modèle animal pour se placer dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet visant à étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie promet de générer des bénéfices substantiels tant au niveau scientifique que clinique. En premier lieu, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ces pathologies métaboliques et musculaires, en étudiant spécifiquement le rôle de notre protéine d’intérêt. Une connaissance plus détaillée de l'implication de cette protéine pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, offrant ainsi des perspectives innovantes pour le développement de traitements spécifiques et efficaces. Sur le plan clinique, l'identification de la protéine comme un biomarqueur clé dans l'inflammation chronique associée à l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie pourrait améliorer le diagnostic précoce et la stratification des patients. Les praticiens pourraient ainsi mieux évaluer le risque de complications métaboliques et musculaires chez les patients obèses et ceux présentant une résistance à l'insuline, permettant une intervention préventive plus rapide et personnalisée. De plus, cibler cette protéine dans des approches thérapeutiques pourrait offrir une nouvelle avenue pour réduire l'inflammation et améliorer la sensibilité à l'insuline, atténuant ainsi les effets délétères de ces conditions sur la santé des patients. L'impact potentiel sur la gestion de la sarcopénie est également significatif. En étudiant les mécanismes par lesquels notre protéine d’intérêt contribue à la perte de masse musculaire et à la dysfonction métabolique, ce projet pourrait mener à des stratégies visant à préserver la masse et la fonction musculaire chez les personnes âgées et les patients atteints de maladies chroniques. Cela pourrait améliorer considérablement la qualité de vie et l'autonomie des individus affectés, tout en réduisant les coûts de santé associés aux complications liées à la sarcopénie. En somme, ce projet offre une opportunité de faire progresser notre compréhension des maladies chroniques liées à l'obésité et au vieillissement, tout en ouvrant la voie à des interventions thérapeutiques novatrices et personnalisées pour améliorer la santé et le bien-être des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 15 gavages (1 jour sur 2) et/ou à 7 injections sur 5 jours consécutifs seulement ainsi que 16 prélèvements sanguins à la queue (4 séquences de 7 prélèvements consécutifs). Tous les actes précédemment cités ne durent qu’au maximum 30 secondes chacun. Certains animaux auront une injection unique sous anesthésie générale. D’autres animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale une fois au cours de leur vie pour la pose de mini-pompe osmotique. Certains animaux auront une alimentation enrichie en lipides pendant un maximum de 12 semaines ou encore deux tests d’effort et de préhension au maximum. Un nombre limité d’animaux sera entrainé sur tapis roulant 5 fois 30 minutes maximum par semaine pendant 6 semaines consécutives. Certains animaux subiront au maximum deux isolements de 3 minutes pour mesures de composition corporelle et d’autres subiront un isolement pour mesure de dépense énergétique pendant un maximum de 48h. Dans le second établissement utilisateur, un nombre restreint d’animaux subira une injection de traceur radioactif pendant 15 minutes avant mise à mort et l’ensemble des animaux seront mis à mort et nécropsiés.
Impact sur les animaux
Le régime hyperlipidique induit une obésité chez les animaux pouvant créer un inconfort. Le gavage répété peut causer du stress et des blessures oesophagiennes (entrainant une diminution de la prise alimentaire) abolis après arrêt des gavages. La pose d’une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie gazeuse peut provoquer des douleurs quelques jours après l’opération. La surexpression de notre protéine peut entraîner une inflammation associée à l’obésité et engendrer l'aggravation de l'insulino-résistance ainsi qu’une diminution des fonctions musculaires. Les prélèvements répétés de sang lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer du stress et des douleurs légères pendant 120 minutes au maximum. Les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant 2 à 3 minutes seulement. Les tests de force provoquent un stress pendant 120 minutes au maximum. La course provoque un stress pendant 120 minutes au maximum et peut provoquer des blessures légères aux pattes. La mesure de calorimétrie provoque un stress dû à l’isolement visuel et olfactif pendant 48h au maximum. Le transfert adoptif de cellules immunitaires peut provoquer une inflammation de bas grade. L’injection de certaines molécules est cytotoxique pour les cellules pancréatiques et peut engendrer des crampes abdominales.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort de manière réglementaire en fin de procédure et sont nécropsiés pour récolte d’organes et analyses ex vivo. Aucun animal de ce projet ne sera ré-utilisé.
Remplacement
Nous avons effectué des travaux préliminaires sur des modèles in vitro de myotubes humains montrant des effets de notre protéine d’intérêt sur la sensibilité à l’insuline et l’atrophie des myotubes. Le recours au modèle animal est indispensable pour évaluer les effets de cette protéine dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des études in vitro sont réalisées en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur les animaux. Des études pilotes permettront d'ajuster le protocole expérimental pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans les études principales ; ces études pilotes permettront aussi de s’assurer de la fiabilité du modèle. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats significatifs sont effectués.
Raffinement
Les animaux auront une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le responsable de la mise en oeuvre sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Lors des actes chirurgicaux ou injections douloureuses des anesthésies gazeuses sont prévues avec utilisation d’antalgiques en périopératoire. Lors des injections de produits provoquant des douleurs nous administrerons des antalgiques en amont. Pour les tests d’exercices physiques les animaux seront préalablement acclimatés et surveillés afin de détecter d’éventuelles blessures aux pattes. Pour les manipulations nécessitant l’isolement des animaux pendant 48 heures maximum, une surveillance accrue sera appliquée lors de leur retour en groupe afin de détecter des comportements agressifs. Nous pourrons alors ajouter des enrichissements dans les cages voire séparer les individus trop agressifs. Pour les animaux spontanément diabétiques nous réaliserons un change de litière plus fréquent et des contrôles de la glycémie. Pour l’expérimentation terminale dans l’établissement n°2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles de souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies métaboliques. Le modèle de souris choisi se prête bien aux phénotypage métabolique en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes moléculaires des maladies et de sa bonne susceptibilité aux régimes obésogènes. De plus, l’utilisation de souris spontanément obèses et diabétiques et leurs contrôles non-diabétique permettent une étude plus fine des mécanismes moléculaires. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 8 semaines. L’intérêt est ici d’étudier l’obésité, son développement et ses complications chez l’individu adulte.
Système nerveux central – modèle chronique de depression chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1000
Rendre des rongeurs dépressifs pour y faire passer une quinzaine de molécules : 2 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des situations stressantes de quinze minutes à quatre heures par jour pendant une à huit semaines, sont privés de nourriture ou d'eau jusqu'à vingt-quatre heures d'affilée une fois par semaine, et reçoivent des substances jusqu'à deux fois par jour. L'état obtenu est mesuré par des tests comportementaux que le porteur ne nomme pas, et la mise à mort de tous les animaux est justifiée par les effets méconnus des substances testées. Quinze molécules par modèle et par espèce doivent passer par ce criblage sur la durée du projet.
Objectifs
La dépression est une maladie psychiatrique complexe qui est actuellement reconnue comme l’une des principales causes d’invalidité et de souffrance dans le monde. Le National Institute of Mental Health (NIMH) rapporte qu’environ 12 % des Américains souffrent de dépression clinique, avec deux fois plus de femmes touchées que d’hommes. La dépression représente des milliards de dollars de coûts directs de santé et aussi indirects (baisse des revenus et perte de productivité). Les symptômes de la dépression comprennent l’anhédonie (absence de prise de plaisir), les changements de poids et des cycles de sommeil, la diminution de l’activité physique et de l’hygiène personnelle, des sentiments de désespoir ou de culpabilité et/ou des pensées récurrentes de mort ou de suicide. Des études épidémiologiques et cliniques ont indiqué que la dépression est prédictive d’un pronostic plus sévère de pathologies cardiovasculaires. L’étiologie et la physiopathologie associée de cette maladie sont mal comprises et l’hétérogénéité de la maladie due à divers facteurs (par exemple, des composants génétiques, biologiques et environnementaux, particulièrement l’exposition chronique au stress est un facteur de risque majeur) rend le diagnostic clinique difficile à définir. La dépression est principalement traitée avec des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine. Cependant, après une période de 2 à 3 mois de traitement, les taux de rémission sont faibles et certains patients ne présentent pas de rémission après des traitements avec plusieurs antidépresseurs : la résistance à la pharmacothérapie est conventionnellement appelée dépression résistante au traitement. Les modèles animaux des troubles psychiatriques demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie de ces maladies, l’identification des nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicamenteux ainsi que la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Ce projet vise à mettre en place des modèles de stress chronique induisant des comportements anxio-dépressifs chez le rongeur et permettant d’évaluer de nouveaux traitements. Nous prévoyons évaluer environ 15 molécules différentes de chacun des modèles chez le rat et la souris au cours de la durée du projet
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'améliorer la qualité de vie des patients et de leur entourage. Un traitement plus efficace pourrait réduire plus rapidement et plus durablement les symptômes de la dépression, sa sévérité et le taux de rechute permettant ainsi une meilleure qualité de vie des patients, de maintenir un état de santé stable plus longtemps, de diminuer les taux d'invalidité . Ce projet permettra également d'avoir un impact socio-économique positif en réduisant les coûts de santé (nombre de consultations médicales, d'hospitalisations et de traitements complémentaires nécessaires).
Procédures
Les animaux sont exposés à des situations inconfortables et stressantes de 15 min à 4 heures par jour pendant 1 à 8 semaines selon les procédures de façon à induire un état depressif. Cet état est évaluer en 2 ou 3 occasions à partir de tests comportementaux dont la durée varie de 5 à 40 minutes environ. Pour certaines procédures les animaux sont privés de nourriture ou d'eau pour une période maximale de 24 heures pouvant être répétés (1 fois par semaine, maximum 8 semaines). Les administrations de substances pourront être réalisées jusqu’à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration). La durée du traitement peut aller jusqu’à 8 semaines. Les autres interventions subies par les animaux sont la préhension (maximum 1 minute) pour le placement et le retrait dans les différents dispositifs de mesures comportementales et l’administration du traitement.
Impact sur les animaux
La répétition des situations inconfortables et stressantes vont engendrer un état de stress chronique et une modification de comportement pendant plusieurs semaines (maximum 8 semaines). Les manipulations/contentions des animaux réalisées au cours des procédures d’administrations peuvent également engendrer un stress de courte durée. L'injection des différents traitements pourra entraîner une douleur légère de courte durée.
Devenir
Compte tenu de l'induction de stress chronique, tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. De plus, les substances d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus pourrait induire un effet délétère sur l’animal, ce qui ne serait pas compatible avec un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation chez l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité, réduisant de façon significative le nombre de substances à tester et donc le nombre d’animaux. L'impact des traitements pré-sélectionnés sur le comportement des animaux, et l'amélioration de symptômes liés aux états d'anxiété/dépression ne peut se faire que sur des animaux vigiles. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 12 - 18 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte des tests statistiques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur et de souffrance (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, tunnels, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions. Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie éthique si nécessaire. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.
Choix des espèces
Un certain nombre de symptômes des troubles anxieux et dépressifs comprenant l’anhédonie, apathie, troubles du sommeil, changements de poids/d'appétit, alltération psychomotrice, retrait social peuvent être facilement évaluées chez les animaux, en particulier chez le rongeur. Ainsi, divers tests ont été conçus pour mesurer ces différents aspects. L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature. Les symptômes d'anxiété et dépression se retrouvent plutôt chez des sujets adolescents ou adultes, aussi les traitements qui seront appliqués dans ce projet seront appliqués sur des rongeurs dont le SNC a atteint ce niveau de maturité.
Prélèvement de tissu pour le génotypage de 2 lignées de souris transgéniques pour le récepteur du peptide vasocatif urotensine
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées lorsque leur profil génétique ne sert plus à la reproduction, versées à d'autres projets autorisés dans le cas contraire, 3 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Au sevrage, entre trois et cinq semaines, chacune se fait découper un bout d'oreille sous anesthésie brève et implanter une puce électronique sous la peau, et jusqu'à 5 % d'entre elles repassent une seconde fois par ce prélèvement. Le projet ne sert qu'à entretenir deux lignées transgéniques liées au récepteur de l'urotensine II, élevées depuis cinq ans dans l'établissement pour alimenter des travaux sur les hémorragies cérébrales. Le porteur qualifie ces lignées d'"indispensables" à ces travaux et conclut que "l'animal entier est donc nécessaire", les cerveaux devant être étudiés en entier.
Objectifs
Ce projet vise à identifier et à réaliser des prélèvements de tissus (petit bout d'oreille) permettant de réaliser la caractérisation génétique de souriceaux issus de la reproduction de souris de 2 lignées transgéniques, des souris n'exprimant pas le récepteur d'un peptide vasoactif (urotensine II) et des souris exprimant le gène du récepteur de l'urotensine humain. Les biopsies permettront de maintenir l’élevage de ces 2 lignées de souris, en cours dans l'établissement depuis 5 ans, et permettra de fournir les animaux nécessaires aux projets scientifiques autorisés. Ces souris sont actuellement utilisées dans différents projets scientifiques du laboratoire cherchant à caractériser le rôle de l'urotensine dans divers processus pathologiques, notamment les hémorragies cérébrales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la caractérisation génétique et l'identification des souris issues des reproductions nécessaires aux élevages et utilisées pour les différents projets scientifiques de l'équipe. Ce projet permettra de produire et d'entretenir des lignées de souris transgéniques qui sont indispensables aux projets scientifiques actuellement en cours (projets autorisés) visant à élucider les mécanismes impliquant le système urotensinergique et à rechercher des thérapies potentielles dans le cadre de modèles d'hémorragies cérébrales.
Procédures
Les souriceaux issus de la reproduction au sein de chacune des 2 lignées de souris transgéniques feront l'objet d'une biopsie au moment du sevrage (entre 3 et 5 semaines post-natal) afin de permettre leur caractérisation génétique. Pour cela un petit bout d’oreille sera prélevé grâce à des micro-ciseaux chirurgicaux, désinfectés avant chaque utilisation. Les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) afin de limiter le stress éventuel lié à leur manipulation nécessaire pour le prélèvement de tissu et pour l'injection sous-cutanée d'une puce électronique permettant leur identification à long-terme. En cas de problème techniques rencontrés parfois au moment des expériences de caractérisation génétique, il pourrait être nécessaire de réaliser à nouveau, quelques jours après le sevrage, un prélèvement de tissu à l'oreille sur les animaux anesthésiés brièvement, et ceci pour moins de 5 % des souris.
Impact sur les animaux
Une possible douleur au niveau de la zone de la biopsie et un stress de courte durée pourraient apparaitre.
Devenir
Les animaux anciens reproducteurs ou dont le profil génétique n'est pas utile pour la reproduction, et qui ne seront pas utilisables pour d’autres projets ayant reçu une autorisation du ministère, seront mis à mort. Les autres animaux seront utilisés pour des projets scientifiques spécifiques (ayant fait l'objet d'autres demandes d'autorisation de projet).
Remplacement
Des souris sont nécessaires pour assurer la reproduction des animaux des 2 lignées transgéniques et ainsi fournir les souris utilisées dans les projets de recherche faisant l’objet ou ayant fait l’objet d’autres demandes d’autorisation au Ministère et portant notamment sur des modèles murins d'hémorragie cérébrale qui sont évalués dans des tests comportementaux et dont le cerveau entier est indispensable pour des études neurobiologiques. L'animal entier est donc nécessaire.
Réduction
Les prélèvements nécessaires à la caractérisation génétique des animaux ne concerneront que les souris servant au maintien de l'élevage. Le nombre d'animaux de ce projet est un nombre maximal car il ne tient pas compte de la variabilité de l'effectif de nouveau-nés d'une portée à l'autre (variant de 0 à 15). Afin de réduire le nombre d'animaux qui feront l'objet de prélèvements pour le génotypage, des schémas de reproduction pourraient être mis en place (entre homozygotes) pour obtenir des souris en plus grand nombre en cas de besoin dans des procédures décrites dans d'autres projets autorisés.
Raffinement
Les prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté. Afin de réduire le stress des animaux soumis à une contention pour le prélèvement de tissus au moment de leur identification, les souris seront anesthésiées brièvement. Le tissu prélevé sera le plus petit possible. Les outils nécessaires à la biopsie seront désinfectés avant chaque utilisation. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur au minimum. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement et permet de déceler un éventuel signe de souffrance. Un suivi particulier sera fait au niveau des zones de la biopsie au cours de la semaine qui suit les gestes. Parmi ces signes, des plaies, des vocalisations anormales, une agressivité anormale, une posture « dos voûté », une lenteur des mouvements, une prostration indiquent une souffrance de l’animal. Si l’un de ces signes ou une combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé dans les heures qui suivent son apparition, des soins seront apportés, par exemple désinfection des plaies. Et si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 48h, il sera considéré que le niveau de souffrance atteint nécessite une mise à mort anticipée.
Choix des espèces
La souris est très couramment utilisée comme modèle transgénique et c’est une espèce classiquement utilisée le cas des études sur l'hémorragie cérébrale car leur anatomie et physiologie sont bien connues. Ce projet utilise des souris n’exprimant pas le gène du récepteur de l'urotensine ou exprimant le gène codant le récepteur humain. Ces 2 lignées de souris sont déjà utilisées dans notre établissement et permettront de poursuivre les projets scientifiques en cours ou prochainement mis en place. Le prélèvement de tissu pour permettre la caractérisation génétique des individus sera fait sur des souris âgées de 3 à 5 semaines.
Acquisition d’une maitrise des gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 690
Cochons d'Inde : 817
Lapins : 647
Pour que le personnel d'animalerie acquière et maintienne la maîtrise de gestes techniques exigée par l'arrêté du 1er février 2013, 2 772 animaux non-humains vont être utilisés et tous tués. Ce sont 817 cobayes, 690 rats, 647 lapins et 618 souris, chacun soumis vigile et sous contention à quatre gestes différents au maximum, de trente secondes à deux minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les mannequins et les simulateurs d'injection servent en amont mais ne suffisent pas à réussir le geste sur un animal vigile. Il précise que ces animaux sont des animaux de réforme "déjà destinés à l'euthanasie" ou repris d'autres protocoles, et qu'ils ne sont pas gardés en vie afin de pouvoir vérifier la qualité du geste.
Objectifs
Ce projet est dédié à l’acquisition d’une parfaite maîtrise de gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales par les personnels d’animalerie. Il répond aux exigences réglementaires de l'arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation de compétences du personnel des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux à des fins scientifiques. Maîtriser les gestes techniques est fondamental pour le bien-être animal (réduction au maximum du stress et de la douleur associé à ces gestes) et la reproductibilité des résultats scientifiques (exécution correcte du geste et fiabilité du résultat scientifique en découlant) lors des prochaines procédures de l’établissement. L’objectif de ce projet est d’assurer, après une première acquisition théoriques et sur modèles inertes, des compétences relatives aux gestes techniques, leur qualification et leur maintien dans le temps tout en garantissant le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la maitrise pour nos personnels travaillant avec les animaux des gestes techniques de routine dans nos activités, en respectant les bonnes pratiques actuelles et en minimisant les contraintes sur les animaux. En s’assurant que nos personnels sont à jour dans les connaissances pratiques et théoriques des gestes techniques, nous nous assurons que les procédures sont réalisées dans les meilleures conditions possibles et dans le respect du bien-être de l’animal.
Procédures
Chaque animal sera soumis au maximum à 4 gestes techniques différents, vigile et sous contention, d’une durée oscillant entre 30 secondes et 2 minutes.
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention et douleur associée aux gestes techniques (introduction d’une aiguille).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Les animaux utilisés sont des animaux de réformes déjà destinés à l’euthanasie, il a donc été décidé de ne pas les garder en vie après les procédures pour éviter tout stress supplémentaire et pouvoir, le cas échéant, vérifier la qualité du geste technique.
Remplacement
Des méthodes alternatives comme des vidéos explicatives ou encore le recours à des mannequins ou autre support inerte (ex : simulateur d’injection intra veineuse) serviront de supports préalables lors des volets théoriques et pratiques des différents gestes techniques. Cependant, ces méthodes alternatives ne suffisent pas pour que le personnel réussisse à réaliser les gestes en conditions réelles, sur animal vigile tout en minimisant les nuisances sur cet animal lors de la réalisation du geste : cette partie ne peut être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour les procédures est composé d’un minimum et d’un maximum, afin de pouvoir vérifier que le personnel maitrise la technique. Dès lors que le nombre minimum d’animaux est atteint et que le geste est maîtrisé, la procédure s’arrête. Si le nombre maximum est atteint et que le personnel ne maîtrise toujours pas le geste, il repasse sur modèle inerte. Les animaux utilisés seront uniquement des animaux de réforme de l’animalerie de l’établissement où se déroule le projet ou des animaux réutilisés de protocoles expérimentaux (après validation vétérinaire et selon les recommandations éthiques). Lors de ces procédures et sur les conseil du vétérinaire et/ou la SBEA, il est possible d’utiliser un même animal pour plusieurs gestes techniques (selon leur caractère invasif) afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour atteindre les objectifs du projet.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge. Des points limites en fonction des spécificités des gestes seront appliqués. Une observation de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (soins locaux, ajout d’enrichissement, ajout d’aliment, ...). ...). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. La manipulation et la contention des animaux se fera par le biais de méthodes les moins stressantes possibles (creux de la main, tunnels, habituation …). Les techniciens s’entraineront d’abord à la contention avant d’effectuer le geste, pour que le geste soit réalisé de manière sécurisée et non stressante pour l’animal et la personne. Les volumes prélevés ou injectés seront basés sur les doses minimales, et avec des produits neutres comme du sérum physiologique, ceci dans le respect des volumes d’administration et de prélèvements propres à chaque espèce.
Choix des espèces
Mâles ou femelles peuvent être utilisés. Dans la mesure du possible, les surplus de stock comme les mâles chez l’espèce souris et lapins et les femelles chez l’espèce rat et cobayes seront choisis. Ces espèces ont été choisies car ce sont les espèces élevées et utilisées dans notre établissement, il est donc nécessaire que le personnel maitrise les gestes techniques sur ces différentes espèces qui ont chacune leurs particularités. Pour pouvoir être cohérent avec les conditions réelles dans laquelle ces gestes techniques vont être réalisés et minimiser ainsi l’impact sur le bien-être animal, la qualification et la requalification des gestes techniques est effectuée sur des animaux vivants dont l’espèce correspond à celle sur laquelle les gestes seront réalisés. Les mâles ou femelles peuvent être utilisés. Dans la mesure du possible, les surplus de stock comme les mâles chez l’espèce souris et lapins et les femelles chez l’espèce rat et cobayes seront choisis.
Développement et utilisation d’une nouvelle technique double d’activation neuronale et d’imagerie simultanée : la sonogénétique
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Rats : 480
344 souris et 480 rats vont être utilisés, chacun pouvant subir jusqu'à trois opérations du cerveau de trente minutes à quatre heures, et jusqu'à 28 tests de sensibilité de la patte. 320 souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère, une partie des animaux recevant une lésion du nerf sciatique qui installe une douleur persistante, tandis que les séances sur le sommeil et la récompense durent de trente minutes à deux heures, deux fois par semaine. Le porteur décrit cette douleur tantôt comme de "faible intensité", tantôt comme d'"intensité moyenne", et annonce qu'elle n'occasionnera "qu'une gêne ou une douleur légère". Tous sont tués à la fin du protocole, leur cerveau étant collecté pour l'étude histochimique.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer une nouvelle technique d’étude des circuits cérébraux, par stimulation ultrasonore. Nous souhaitons stimuler les neurones et enregistrer en même temps les conséquences de cette stimulation sur les réseaux cérébraux, ainsi que le comportement animal.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront le développement d’une nouvelle technique d’étude du cerveau chez le petit rongeur (principales espèces modèles en neuroscience) permettant à la fois de stimuler et d’imager des zones cérébrales et des réseaux avec une grande précision spatiale et temporelle. De plus cette nouvelle modalité d’étude est non invasive chez la souris ce qui en fait une méthode de stimulation cérébrale unique. Par ailleurs, en plus de cet apport technologique, nos travaux visent à définir le réseau de structures cérébrales activées et désactivées au cours d’une tâche de récompense et au cours du sommeil.
Procédures
Au cours des phases du projet, les animaux seront amenés à subir : - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 minutes et 4 heures. Certains animaux subiront plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. Ces chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale. Ils subiront également 4 semaines après la chirurgie, un test pour évaluer le seuil de douleur. - Des tests comportementaux pour étudier leur sommeil ou leur comportement de récompense. Ces tests dureront entre 30 minutes et 2 heures, deux fois par semaine maximum. - Certains animaux seront soumis à une douleur persistante de faible intensité car ils subiront une chirurgie de lésion du nerf sciatique au niveau de leur patte droite et une chirurgie au niveau de leur cerveau. Ces animaux subiront à des tests de leur seuil de sensibilité de la patte : avant cette chirurgie de lésion du nerf sciatique, puis deux fois par semaine (délai de 4 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental (soit un total de 28 tests maximum). Il n'occasionnera qu’une gêne ou une douleur légère.
Impact sur les animaux
Suite aux chirurgies (présentes dans toutes les procédures du projet), une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue, mais celle-ci disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les animaux ayant reçu une lésion d'un nerf de la patte postérieure vont développer une douleur persistante d'intensité moyenne. Dans les différentes parties de notre étude, la technologie utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera environ une heure. Au cours des expériences sur le sommeil, il se pourrait que le repos et le rythme de vie des animaux soit impacté négativement. Nous espacerons donc les sessions d’expérimentation pour chaque animal afin que les effets potentiellement négatifs ne s’accumulent pas. Au cours des séances d’imagerie chez les animaux anesthésiés, l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables, notamment sur les constantes vitales de l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole. La collecte de leur cerveau est nécessaire à notre étude histochimique.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse anatomo-fonctionnelle des réseaux cérébraux impliqués dans la sensibilité, l'action motrice ou le sommeil nécessitent une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives. Ce nombre a été calculé grâce à un calcul de puissance statistique sur la base d'expériences antérieures de notre laboratoire, des articles publiés et le taux de succès attendu de certaines procédures. Autant que possible, nous allons recueillir le maximum de données scientifiques des animaux utilisés afin d' utiliser le plus petit nombre possible. Nous utilisons également leurs tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.
Raffinement
Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures ont été mises en place : - Les animaux sont manipulés à l’aide de la technique du tunnel pour limiter les interactions négatives avec les experimentateurs. - Chez le rat, une interaction par ‘tickling’ (chatouillis mimant les interactions de jeux entre congénères) sera mise en place pour améliorer leur bien-être quotidien. - Des protections de fenêtre chronique ont été développées afin de permettre de garder les animaux implantés chroniquement en petite colonie. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques, analgésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs.
Choix des espèces
Il est important que cette nouvelle technologie soit développée et validée chez le rat et la souris. Les deux espèces sont largement utilisés en Neurosciences pour des raisons différentes : - Le rat a un comportement très riche. Plus calme, il peut porter des charges plus importantes sur sa tête (comme le porte sonde et la sonde échographique) et est, de ce fait, l' espèce de référence pour faire des études chez l'animal vigile. Son cerveau est aussi plus gros, ce qui rend la quantification de l' imagerie plus robuste. - La souris est un choix évident pour comparer l'efficacité de notre technique avec une prédente approche qui activait les neurones avec de la lumière. De plus, le modèle de douleur utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé chez la souris et non dans une autre espèce. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifiques posées.
Thérapie Génique par surexpression de la phosphodiestérase de type 3 chez la souris pour traiter l’insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une minipompe implantée sous la peau du dos pour faire monter la pression artérielle, ou une aorte resserrée chirurgicalement pour provoquer une insuffisance cardiaque, puis une injection de virus derrière l'œil et une échocardiographie sous anesthésie tous les sept jours pendant six semaines. 404 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dont 244 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit l'hypertrophie du cœur qui évolue vers l'insuffisance cardiaque, l'œdème pulmonaire, la fatigue, la difficulté respiratoire et la prostration, et reconnaît des douleurs importantes pour la constriction de l'aorte. Il écrit aussi que l'injection derrière l'œil "ne provoque aucune nuisance notable" et que l'entretien des animaux est conduit de façon à "s'assurer qu'ils ne subissent aucun stress".
Objectifs
L’objectif du projet est de 1: Démontrer in vivo par l'utilisation de modèles d'hypertension provoquée chez la souris, qu’une thérapie génique réalisée par injection intraveineuse de virus qui cible le coeur et permettent l'augmentation de l'expression d'une enzyme dans le coeur, améliorerait l'activité cardiaque des patients atteints d’hypertension artérielle et éviterait que leur pathologie amène à l’insuffisance cardiaque. Des mesures de la fonction cardiaque par échocardiographie, de la mesure de pression artérielle et des analyses biochimiques réalisées ex vivo fourniront des éléments de réponse à ce sujet. 2: Ce projet permettra de caractériser également les effets protecteurs de notre traitement ex vivo à l'échelle cellulaire et moléculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter des connaissances essentielles pour la compréhension des mécanismes sous-jacents aux effets cardioprotecteurs d'une thérapie génique de l'insuffisance cardiaque ; ii/ A court terme ce projet nous permettra de valider notre concept thérapeutique innovant ouvrant la voie à une éventuelle thérapie génique de l'insuffisance cardiaque par une enzyme. A plus long terme il permettra de développer une alternative prometteuse ou un complément aux traitements actuels de l'insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle qui pour l'instant reste inefficace pour de nombreux patients.
Procédures
Un groupe d'animaux sera traité pharmacologiquement pour induire une hypertension. Pour cela, une minipompe délivrant des produits induisant une hypertension est placée sous la peau du dos de l'animal anesthésié et analgésié. Une deuxième groupe est soumis à une contriction de l'aorte pour induire une insuffisance cardiaque. Ces procédures chirurgicales réalisées sous anesthésie générale durent 10 minutes environ. Les animaux sont ensuite soumis à une seule injection rétro-orbitale des virus qui est réalisée en 1 minute sous anesthésie générale et qui ne provoque aucune nuisance notable. L'activité cardiaque et la pression artérielle des animaux est suivie régulièrement par échocardiographie tout les 7 jours sous anesthésie générale pendant 6 semaines. Ces mesures sont réalisées en 10 minutes.
Impact sur les animaux
L’hypertension et l’éventuelle insuffisance cardiaque qui vont ensuite s’installer dans le groupe soumis au traitement pharmacologique pour élever la pression artérielle ou l'autre, subissant la constriction de l’aorte, vont s’accompagner des signes cliniques de ces pathologies. L’apparition d’un œdème pulmonaire, qui provoquent fatigue, difficulté respiratoire, perte de poids et une prostration sera surveillée. Les chirurgies réalisées entraineront des douleurs peu importantes (pour le modèle induit pharmacologiquement) ou importantes (pour le modèle de constriction de l'aorte) qui seront prises en charge par un traitement analgésique approprié. Les modèles provoquent dans les 14 jours après traitement pharmacologique ou 2 jours après constriction de l’aorte, une hypertrophie du coeur qui évolue vers l'insuffisance cardiaque caractérisée par une diminution de sa capacité à pomper le sang et l’apparition d’un œdème pulmonaire caractéristique de la maladie.
Devenir
L’insuffisance cardiaque est une pathologie irréversible, les animaux sont donc euthanasiés en fin de procédure. L’ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvements d’organes, ce qui est nécessaire pour permettre l’évaluation du potentiel thérapeutique de la thérapie génique que nous testons.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant de récapituler le phénotype d’une cellule cardiaque adulte. Les tests cellulaires ne peuvent donc être réalisés que sur des cellules fraichement isolées de cœurs. De plus, dans l’hypertension artérielle et l’insuffisance cardiaque, le corps met en place des régulations physiologiques impliquant le système neuro-hormonal. Ces régulations neuro-hormonales ne peuvent pas être reproduites in vitro ce qui rend indispensable l’expérimentation dans un modèle préclinique intégré.
Réduction
(i) une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu sur la diminution de la fonction cardiaque (ii) les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux, (iii) afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les souris sont mises en cage et observées tous les jours. Les cages sont changées 2 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. L’hypertension artérielle sera induite en respectant au maximum les procédures de bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Un suivi rigoureux des animaux engagés dans les procédures est mis en place. Des points limites ont été scrupuleusement déterminés et sont soigneusement évalués quotidiennement. Si ces points limites sont atteints, les animaux sont euthanasiés pour limiter leur souffrance et leurs organes sont prélevés.
Choix des espèces
La souris est choisie car c’est un mammifère qui constitue un modèle courant et classique pour l'étude de la fonction cardiovasculaire y compris dans un contexte pathologique. Il est un modèle de choix car il offre la possibilité d’induire l’insuffisance cardiaque par des procédures chirurgicales. Des souris mâles et femelles de 6 semaines (30g ) jeunes adultes sont utilisées car les maladies cardiovasculaires se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Etude de l‘oubli adaptatif chez le rat après administration d’un composé à visée promnésiante.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Amenés à 85 ou 90 % de leur poids initial par restriction alimentaire pour rester motivés à chercher de la nourriture, 72 rats Dark Agouti parcourent un labyrinthe à huit bras puis un labyrinthe en croix, après trois injections dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et le porteur prévoit de proposer tous les rats à l'adoption ou à la réutilisation dans un autre projet de l'unité, la mise à mort ne venant qu'en l'absence de solution. L'objectif est de voir si une molécule qui active le système histaminergique améliore l'oubli des informations inutiles et la mémoire de travail, avec en visée lointaine l'autisme, les troubles de l'attention et la maladie d'Alzheimer. Cette molécule n'est jamais nommée, pas davantage que la dose administrée aux rats.
Objectifs
Le projet vise à mieux comprendre comment un composé qui stimule le système histaminergique influence la mémoire. Plus précisément, il s'agit d'étudier son impact sur l'oubli nécessaire lors de tâches de mémoire spatiale et sur l'efficacité de l'apprentissage dans ces tâches. Pour cela, nous utilisons des rats dans des expériences qui créent différents niveaux de confusion entre anciennes et nouvelles informations. Cela nous aide à voir comment ils gèrent l'oubli et la mémorisation à court terme, ainsi que l'apprentissage à long terme. Nous allons évaluer leurs performances dans un labyrinthe à 8 bras après leur avoir administré un composé qui active le système histaminergique. En activant ce système, nous espérons améliorer leur attention, ce qui pourrait les aider à mieux accomplir les tâches et à mieux mémoriser et/ou oublier des informations.
Bénéfices attendus
Cette étude va examiner si un composé qui stimule le système histaminergique aide à mieux se concentrer et à mieux oublier des informations inutiles. Cela pourrait améliorer la façon dont nous traitons les informations à court terme et renforcer notre mémoire à long terme. Le but final est le traitement des déficits de mémoire de travail qui sont visibles dans des pathologies telles que l’autisme, les troubles de l’attention ou encore la maladie d’Alzheimer.
Procédures
3 piqures (10 secondes chaque) avec administration intrapéritonéale de ringer (J1) et d’un composé activant le système histaminergique (J2), le matin juste avant les deux jours (J1 et J2) de test comportemental en labyrinthe à 8 bras (test de mémorisation) et une un semaine plus tard avant le test en labyrinthe en croix (test d’anxiété).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront 3 administrations intraperitonéales (douleur liée à la piqure). Les autres effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de la restriction alimentaire qu’ils subiront pendant le test du labyrinthe à 8 bras : les rats seront amenés à 85-90% de leur poids initial durant la semaine d’habituation.
Devenir
Tous les rats (72 au total) seront proposés à l'adoption (interne ou externe = GRAAL) et/ou proposés pour une réutilisation dans un autre projet au sein de notre unité à la fin du projet. La mise à mort pourra être effectuée si aucune solution de replacement n'a abouti.
Remplacement
La nature même de l’expérience ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elle repose sur une tâche d'apprentissage complexe que les animaux effectuent et ne peut donc pas être réalisée à partir de modèles in vitro ou in silico car nécessitant l’animal entier comme modèle expérimental. On ne peut donc envisager pour l'instant une méthode alternative de modélisation qui ne nécessiterait pas l'utilisation d’animaux. Le rat sera préféré à la souris puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche, des études pilotes ont été conduites au sein de l’équipe avec des souris et se sont révélées non concluantes pour les tâches comportementales nécessaires à ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum (n = 12 pour chaque groupe, soit 72 animaux) en se basant sur les études précédentes. Ce nombre d’animaux est nécessaire car nous allons étudier différents apprentissages comportementaux ainsi que leurs contrôles et de par la nature des tâches, un rat ne peut en effectuer plusieurs (les phénomènes de sur-apprentissage biaisant les performances comportementales). Le calcul de puissance avec les chiffres connus d’une étude précédente nous indique un nombre d’animaux nécessaires de 11 minimum nous élargissons ce chiffre à 12 dans le cas ou un animal présente des difficultés dans la réalisation des tests (ce qui est probable et connu de part nos précédentes études)
Raffinement
Les animaux seront hébergés en binômes. Tâches comportementales : la restriction alimentaire nécessaire à l’induction de la motivation dans notre tâche d’apprentissage ainsi que ses conséquences seront hautement contrôlées (de précédentes expériences de l’équipe montrent que la perte de poids modérée (maximum 10-15% de leur poids initial) est bien supportée par les rats). Nous adaptons ensuite chaque jour l’apport d’aliments pour que l’animal reprenne un peu de poids chaque jour (2 à 3 g) et reste motivé pour autant. Cela implique un contrôle strict du poids de l’animal chaque matin et adaptation de la dose de nourriture chaque soir. Nous utilisons une grille de suivi avec des points limites adaptés aux tâches comportementales et à la restriction alimentaire, nous permettant d'arrêter l'expérience si l'animal présente un mal-être. L'expérience comportementale sera précédée d’une période d’habituation à l’expérimentateur, à la pièce et au matériel d’expérimentation, dans le but de faire disparaître tout stress lié à la manipulation des animaux ou l’agencement des labyrinthes. La durée de cette période d’habituation sera adaptée aux besoins de chaque animal.
Choix des espèces
Ce protocole nécessite un apprentissage de paradigmes comportementaux. Le rat est donc préféré à la souris quand cela est possible puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche. Il existe notamment une large littérature traitant des bonnes performances des rats dans des tâches d’orientation spatiale et de planification. La souche Dark Agouti possède une bonne vision ce qui est nécessaire pour nos tâches d'orientation spatiale dans un labyrinthe. Cette souche est également peu agressive et facilement manipulable. Les rats de souche Dark Agouti sont de plus consanguins ce qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle. Les animaux auront 7 semaines lors de leur réception et effectueront les test comportementaux à l'age de 10-11 semaines (repos post-transport, habituation a la manipulation, restriction alimentaire, habituation au labyrinthe), ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale et étant à leur pic de capacités cognitives, qui resteront inchangées tout au long de l’expérience.