Rongeurs

Injectées de cellules cancéreuses humaines sous la peau, dans le cœur, dans une veine ou directement dans le tibia, 832 souris immunodéficientes entrent dans un protocole pouvant durer trois mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite des anticorps deux fois par semaine par voie intrapéritonéale, et passent une à deux fois par semaine sous anesthésie pour que leurs tumeurs soient photographiées. Le porteur décrit prostration, perte de poids, pelage dégradé, morsures entre animaux et, en cas de métastases osseuses, une lyse de l'os suivie aux rayons X. Toutes sont tuées à la fin de chaque protocole, mise à mort que le porteur présente comme un moyen "de mettre fin à la souffrance des animaux".

Objectifs

Un vaste ensemble de preuves suggèrent que l'expression de la protéine TRPV6 est un événement commun dans le développement du cancer de la prostate. En effet, cette protéine qui constitue un canal calcique est totalement absente dans la prostate saine mais devient de plus en plus exprimé au cours du développement du cancer jusqu'à être présente chez 100% des patients ayant des stades tardifs du cancer. Pourtant, le rôle de cette protéine dans le développement des métastases et notamment les métastases osseuses (apparaissant majoritairement chez les patients atteint du cancer de la prostate) reste entièrement méconnu. Pour cela, notre projet vise à étudier la possibilité de cibler et supprimer des tumeurs et des métastases exprimant TRPV6 en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses humaines dans des souris immunodéficientes afin de déterminer la faisabilité du traitement par notre anticorps TRPV6 ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Afin de préciser le rôle du canal TRPV6 dans la formation de métastases in vivo, dont les métastases osseuses, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles d’injection qui reflètent divers mécanismes/étapes de cancérogénèse.

Bénéfices attendus

Retombées scientifiques et économiques attendues : Comme partie fondamentale du projet, nous allons d’abord démontrer le rôle du canal TRPV6 dans l’acquisition du phénotype agressif/métastatique tels que la migration, l’invasion et, et ainsi évaluer son implication dans le guidage et l’installation des cellules cancéreuses dans l’os. Ces données nous permettront de corréler la présence/expression de ce canal à sa fonction pathophysiologique particulière et le proposer comme outil de diagnostique en clinique. Ce dernier point est crucial pour le diagnostic du cancer de la prostate pour éviter un sur-traitement inutile et possiblement nocif pour le patient. L’application la plus importante de ce projet sera la preuve de concept de la stratégie thérapeutique en utilisant l’anticorps mabTRPV6 afin de cibler spécifiquement et de stopper les tumeurs exprimant TRPV6. Finalement, nos outils pour cibler TRPV6 in vivo comme mabTRPV6 seront validés pour être humanisés et utilisés chez l’humain. Les perspectives quant à la possibilité d’empêcher l’apparition de métastases et/ou leur expansion, notamment, les métastases osseuses, seront également considérées afin de les mettre sur l’échelle des essais cliniques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis une fois à l'injection de cellules cancéreuses sous anesthesie par isoflurane : soit par la voie souscutanée: 260 animaux, soit par la voie intracardiaque: 221 animaux, soit par la voie intraveineuse: 130 animaux, soit par la voie intratibiale : 221 animaux. Les injections des cellules cancéreuses réalisées sont faites sur un temps relativement court (30 secondes maximum par souris). Les animaux seront ensuite traités quotidiennement par injection intrapéritoneale avec des anticorps monoclonaux anti-TRPV6 (2 fois par semaine) pour suivre le développement des tumeurs (acte rapide nécessitant seulement quelques secondes par souris pour le traitement et environ 30 secondes pour mesurer la taille tumorale à l'aide du pied à coulisse). La durée de l'expérience peut s'étaler jusq'à 3 mois (temps maximal nécessaire pour avoir un développement tumoral complet). Les tumeurs seront photographiées une à deux fois par semaine sous anesthésie par isoflurane pour suivre le développement des métastases et cela nécessitera de les garder sous anesthésie environ 5min sous isoflurane le temps de l'endormissement et de l'acquisition (2 minutes). Chaque acte réalisé est effectué sur un temps le plus court possible afin de limiter le stress des animaux tout en effectuant des gestes sûrs et précis. Au maximum, cela représentera 832 animaux.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules cancéreuses entraînera l’apparition de tumeur qui constituera la nuisance principale attendue. Des signes de stress peuvent apparaître à la suite du développement de la tumeur : prostration, perte de poids, pelage dégradé ou encore des comportements agressifs avec morsures qui seront suivis quotidiennement. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse (qui sera suivie par rayons X). L’anesthésie par isoflurane ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant extrêmement rapidement (quelques secondes).

Devenir

Afin de mettre fin à la souffrance des animaux, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit en pathologie humaine. De plus, le trafficking/guidage et l’installation dans l’os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro.

Réduction

Réduction : Des analyses statistiques ont été utilisées afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 10 souris par groupe expérimental (nombre de groupes: 13) seront nécessaires pour réaliser un test de Wilcoxon requis pour ce type d’étude. Nous ferons donc 3 protocoles de 130 souris chacun. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale de mAbs, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux. Pour les procédures concernant les injections intracardiaques et intratibiales, 17 souris par groupe expérimental (13 groupes) seront nécessaires. Pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nous nous entraînerons avant chaque début d'expérience sur des souris ayant été préalablement euthanasiées issues de récupération d'autres expériences au sein de l'animalerie pour optimiser notre taux de réussite (qualité d'injection) et de prise de la xénogreffe et ainsi réduire au maximum le nombre de souris nécessaires dans nos groupes.

Raffinement

Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (tunnel en papier, batôn à ronger, coton) pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront révisés régulièrement. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures, etc). Les expérimentations se feront dans un environnement confiné. Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. En cas de plaies causées par les souris (lutte entre animaux), des soins seront immédiatement prodigués afin de réduire la douleur. En cas de signes graves de stress associé à un des points limites, les animaux correspondant seront mis à mort afin de mettre fin à leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris swiss nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T, mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines. L’incidence, et le développement des tumeurs humaines est très faible chez les animaux plus âgés.

Une injection de cellules cancéreuses dans le flanc droit, sous anesthésie gazeuse, ouvre le protocole pour 1 840 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La masse tumorale peut gêner leurs déplacements, et le porteur décrit une altération possible de l'état général, perte de poids, posture douloureuse, léthargie, arrêt du toilettage. L'objectif est de mesurer l'effet d'une cytokine inflammatoire sur l'efficacité de chimio-immunothérapies déjà utilisées en clinique contre le cancer du poumon. Les effectifs annoncés geste par geste, 920 souris pour la chimiothérapie, 2 080 pour un traitement répété trois fois par semaine et 640 pour un autre, dépassent le total de 1 840 déclaré.

Objectifs

Le cancer du poumon fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies et/ou d’immunothérapies, qui malheureusement ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de la résistance aux traitements. L’IL-1β est une cytokine inflammatoire ayant un rôle ambigu dans le cancer et dans la réponse aux traitements. Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers du poumon chez la souris. Nous étudierons également les cellules immunitaires dans les tumeurs. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans 2 modèles de cancers murins. Ce projet permettra également de déterminer son mécanisme d’action. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser les effets de la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer. L’identification d’un rôle de l’IL-1 dans la sensibilisation aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents in vitro et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.

Procédures

- Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1840. - Traitements par chimiothérapie : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 920 - Traitements : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 2080 - Traitements: - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 640

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite (perte de poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. afin de prélever la tumeur et l’analyser.

Remplacement

Le cancer du poumon est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les groupes seront constitués de 10 animaux (suivis de croissance) ou de 5 animaux (immunomonitoring) afin de considérer les variabilités inter-individuelles. Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Ce projet est divisé en 3 sous-parties. Si aucun effet thérapeutique n’est observé dans la première partie, le projet sera stoppé. Si aucun effet n’est observé en partie II, le projet sera stoppé à ce stade.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (en groupes, dans un environnement enrichi avec mise à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). Les animaux seront habitués aux techniques de préhension de contention et de pesées. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et pour les traitements intra-tumoraux. Durant toute l’expérience, suivi du poids au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée. Le volume tumoral sera déterminé trois fois par semaine, afin d’appréhender au plus tôt d’éventuels signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Les souris utilisées ont un système immunitaire déficient, condition posée pour qu'elles acceptent la greffe de cellules leucémiques humaines. 8 100 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une injection intrapéritonéale puis une injection intraveineuse quarante-huit heures plus tard, elles reçoivent des injections quotidiennes sur animal vigile pendant une à trois semaines, certaines subissant en plus des séances d'imagerie ou des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie. Toutes seront tuées, le porteur indiquant que la souche immunodéprimée et la greffe humaine interdisent de les garder en vie.

Objectifs

Les Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) sont un cancer du sang et de la moelle osseuse pour lequel la majorité des patients rechutent à cause de la présence de cellules leucémiques qui ont résisté à la thérapie. L’objectif de l’équipe est d’explorer les pistes pouvant être impliquées dans ce processus de résistance et de trouver des stratégies thérapeutiques ciblées. En effet, nous avons découvert que le métabolisme des cellules joue un rôle important dans la résistance, tout comme les mutations génétiques. L’hôte est également un environnement intéressant puisque les cellules leucémiques interagissent directement avec les autres cellules du microenvironnement pour survivre aux différentes thérapies. Notre objectif est d'utiliser nos modèles précliniques pour mimer les différents paramètres cliniques observés à la suite d'une prise en charge thérapeutique : quantification de la charge tumorale post-traitement, mesure de la survie globale des patients selon leur prise en charge, mesure du risque de récidive (apparition des rechutes). A l'issue de nos études, le but est de comparer les différents schémas de traitement et d'étudier les mécanismes de résistance associés pour trouver des combinaisons thérapeutiques efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des thérapies existantes, ou bien de nouvelles molécules en ciblant de manière différente les cellules chimiorésistantes (types inhibiteurs). Nous pourrions également établir différents groupes de patients selon les caractéristiques moléculaires de la maladie, et ainsi prédire la réponse à la chimiothérapie puis orienter les types de patients vers un autre type de thérapie ciblée.

Procédures

Au début de chaque protocole, tous les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale puis intraveineuse 48h après. Ils recevront ensuite des injections vigiles d’une minute pour permettre l’administration du traitement pendant une durée de 1 à 3 semaines. Certains animaux recevront en plus une injection de moins d’une minute pour imagerie (acquisitions de 30 secondes après une anesthésie de 15 minutes). D’autres seront anesthésiés pendant 10 à 15 minutes pour supporter un prélèvement de sang ou de moelle osseuse.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, des symptômes liés à l'apparition de la maladie, une gêne physique en cas d'administration thérapeutique prolongée. La fréquence d'administration, la dose et les volumes de traitement seront choisis optimiser le confort des animaux et tous les traitements utilisés auront pour but de réduire la charge tumorale. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés pour étudier les échantillons biologiques issus des animaux. Dans chaque cas, la souche étant immunodéprimée et les animaux ayant reçu une greffe de cellules humaines, ils ne peuvent être gardés en vie.

Remplacement

Les modèles in vitro existants de Leucémie Aiguë Myéloïde seront utilisés en première intention pour connaître la sensibilité des cellules leucémiques seules aux différentes traitements. En revanche l'utilisation des modèles in vivo reste nécessaire pour pouvoir étudier le développement tumoral au sein du microenvironnement, et le comportement/mécanisme de résistance des cellules leucémiques dans l’organisme vivant auquel elles s’adaptent.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l’outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d’optimiser le nombre d’animaux et le nombre d’échantillons issu de l’animal.

Raffinement

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant la voie et le volume d'injection, et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin est caractérisé dans la compréhension des pathologies cancéreuses et la recherche biomédicale. Il est très utilisé dans le criblage de nouvelles molécules du fait de sa similitude de nombreux gènes avec ceux de l’humain, ce qui permet d’étudier la résistance des cellules aux traitements. Il présente aussi des avantages pratiques tels qu’une reproduction et une croissance rapide, et une facilité de manipulation et d’adaptation aux conditions expérimentales ainsi qu’un coût moindre. Nous utilisons des souris avec un système immunitaire déficient qui permet d'étudier la leucémie aiguë myéloïde humaine in vivo. Nous pourrons aussi utiliser d'autres souches immunodéprimées développées par des laboratoires de production afin d'optimiser nos modèles. La procédure utilise des animaux âgés de 6 minimum à 10 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent ainsi une meilleure prise de greffe leucémique. Nous n'utiliserons pas d'animaux âgés de moins de 6 semaines car leur développement est encore en cours et le microenvironnement de la moelle osseuse pas totalement formé.

1 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales puis une à trois injections de traitement, la tumeur qui pousse sous la peau étant mesurée au pied à coulisse jusqu'à gêner les déplacements de l'animal. Ulcérations, baisse de température, perte de poids et difficultés respiratoires figurent aussi parmi les effets possibles de la croissance tumorale. L'objectif est de documenter une protéine immunomodulatrice déjà repérée par criblage in vitro, le porteur indiquant que ces études chez l'animal sont "requises" pour que le candidat médicament soit autorisé à passer en clinique.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de détruire les cellules tumorales. Cependant, la proportion de patients répondant à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. De plus, ces traitements s’avèrent inefficaces pour certains types de cancers (pancréas, glioblastome, etc.). Pour pallier ces limites, nous tentons de créer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques. Nous avons développé une technologie permettant de produire une grande variété de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de tests (cribles) d’activité immunologique réalisés in vitro, nous avons identifié et sélectionné une protéine immunomodulatrice capable de limiter, chez un modèle souris, la croissance tumorale de deux cancers différents. Ce composé pourrait représenter un médicament pertinent pour lutter contre les cancers. Ces premiers résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez des patients atteints d’un cancer. L’objectif de notre projet est de réaliser ces études précliniques approfondies. Nous évaluerons le candidat médicament pour sa capacité à induire les défenses immunitaires et le contrôle d’un large panel de cancers afin de déterminer ceux pour lesquels il pourrait constituer un traitement pertinent. Nous l’évaluerons aussi en association avec d’autres immunothérapies actuellement utilisées chez le patient afin de déterminer le bénéfice de traitements combinés.

Bénéfices attendus

La proportion de patients répondant aux immunothérapies anticancéreuses actuelles est pour l’instant trop faible et l’efficacité de ces traitements varie en fonction du cancer dont le patient est atteint. La caractérisation approfondie de l’efficacité thérapeutique et du mode d’action de notre candidat médicament permettra de progresser dans : i) l’identification des types de cancers pour lesquels il peut s’avérer efficace, ii) l’évaluation du bénéfice procuré par son association avec d’autres immunothérapies déjà commercialisées, iii) la définition d’un dosage optimal pour une efficacité maximale et une toxicité minimale. Les études précliniques réalisées dans ce projet ouvriront la voie à l’évaluation clinique de l’innocuité et de l’efficacité du candidat médicament chez le patient.

Procédures

Les animaux subiront une injection de cellules tumorales, puis une à trois injection(s) des traitements sera(ont) réalisée(s). Deux prélèvements de sang seront réalisés avec un intervalle de six jours. Les injections et prélèvements de sang seront réalisés en quelques minutes. La croissance de la tumeur sous-cutanée sera suivie par mesure au pied à coulisse. Pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés avant chaque intervention. Les 1980 animaux mentionnés dans la saisine seront soumis à l’injection des cellules tumorales et aux traitements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une douleur locale liée aux injections et aux prélèvements. La croissance tumorale peut engendrer différents effets chez l’animal. L’effet le plus fréquent consiste en une gêne dans la mobilité liée à l’encombrement de la tumeur. D’autres effets, plus rares, peuvent être rencontrés. Ainsi, les animaux peuvent présenter une température diminuée, iune ulcération des tissus. De plus, de façon encore moins fréquente, les rongeurs peuvent subir une perte de poids, des difficultés respiratoires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de prélever différents tissus ou organes. Ces organes serviront à des analyses précise des tissus et des cellules permettant d’étudier l’état des défenses immunitaire. Ces données permettront de déterminer ainsi l’effet du traitement sur le système immunitaire en lien avec son impact sur la croissance tumorale.

Remplacement

Notre objectif est de développer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques pour lutter contre les cancers. Pour cela, nous avons développé une technologie permettant de produire une très grande variété de protéines immunomodulatrices. Nous avons également mis en place des cribles d’activité immunologique réalisés in vitro permettant de se passer d’animaux dans les premières étapes de sélection de protéines présentant les activités immunomodulatrices les plus adéquates. Ces cribles ont notamment permis de sélectionner le candidat médicament qui fait l’objet de ce projet et qui s’est montré capable de contrôler la croissance tumorale chez la souris lors de travaux préliminaires. Ces résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez le patient atteint d’un cancer. L’évaluation approfondie de l’efficacité immunothérapeutique de ce candidat médicament doit être faite chez l’animal car aucune technique in vitro ne permet de reproduire le lien complexe entre la croissance d’une tumeur et son contrôle par les défenses immunitaires, ces dernières s’établissant dans un premier temps à distance, au sein d’organes immunitaires, pour migrer ensuite vers le site à protéger.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser pour le bon déroulement du projet a été réduit au minimum de deux manières. Premièrement, par la réduction du nombre d’animaux dans chacun des groupes d’étude. Pour cela, une étude statistique préalable a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour la mesure d’un effet thérapeutique significatif. Deuxièmement, par la réduction du nombre de groupes dans les études d’efficacité du candidat médicament en association avec d’autres traitements actuellement utilisés chez le patient. Pour réduire ce nombre, uniquement deux traitements, chacun représentatif d’un type d’immunothérapie, seront évalués.

Raffinement

Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’animal. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, ceux-ci seront anesthésiés avant l’injection des cellules tumorales, des traitements et des prélèvements. Leur état de santé et l’apparition de signes de souffrance liés au développement d’une tumeur seront surveillés tout au long de l’expérience de façon à intervenir de manière appropriée, notamment via l’utilisation d’analgésiques ou d’antiseptiques. Une grille de score qui permet d’évaluer précisément le bien-être de l’animal, des points limites et critères d’arrêt seront utilisés pour décider de l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Pour évaluer l’efficacité anti-tumorale du traitement ainsi que son mode d’action, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique pour étudier l’efficacité de traitements contre le cancer. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer l’effet de l’immunothérapie sur le système immunitaire ainsi que sur la croissance tumorale.

Des injections dans l'œil détruisent les cellules à mélanopsine de la rétine, une chirurgie cérébrale de trente à quarante-cinq minutes vient ensuite moduler une structure du cerveau. 546 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever rétine et cerveau. Dès l'âge de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures, chaque animal est isolé dans une cage individuelle pour mesurer son activité locomotrice, puis placé quinze à vingt jours en obscurité constante, afin d'évaluer les effets d'une exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence. Le porteur annonce sept tests comportementaux "validés" sans préciser lesquels, et qualifie l'obscurité constante de procédure standard n'induisant "aucune nuisance".

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 h synchronise l'horloge biologique du cerveau. La lumière a des effets positifs et négatifs selon ses caractéristiques (moment, durée, intensité, spectre, etc.). La littérature montre qu'une exposition aberrante à la lumière, notamment bleue la nuit, altère les rythmes, la cognition et induit des états dépressifs chez l'animal et l'Homme. Les cellules à mélanopsine de la rétine jouent un rôle clé dans la médiation de ces effets. La lumière pénètre dans l'organisme par la rétine, captée par par des cellules particulières, sensibles à la lumière bleue, convertissant le signal lumineux en un signal biochimique transmis aux structures cérébrales régulant les rythmes biologiques, l'humeur et la cognition. Les adolescents, plus sensibles à la lumière, présentent un risque particulier d'exposition nocturne à la lumière bleue, car les troubles mentaux surviennent souvent avant 25 ans. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence contribue au développement de troubles circadiens (par exemple un décalage du cycle veille sommeil ou un retard chronique à l'endormissement), affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Cette étude sera réalisée sur le modèle diurne Arvicanthis ansorgei, plus pertinent que les rongeurs nocturnes comme les rats ou souris. Les objectifs sont : 1) Étudier l'impact de la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition via des tests comportementaux validés. 2) Analyser les conséquences sur la rétine, son fonctionnement et ses projections cérébrales. 3) Caractériser les effets dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine régulant ces systèmes. Cette analyse, de la cellule au comportement, aura des résultats déterminants pour la recherche fondamentale et clinique. Avenant : Nos résultats montrent que les animaux exposés à la lumière nocturne ont un retard de rythme biologique, indiquant une perturbation de leur horloge interne. Une procédure étudiera le rôle de la sérotonine dans cette perturbation. Une autre teste si cet impact affecte leur capacité à se réajuster après un changement d'heure. Enfin, une troisième examine si la lumière bleue nocturne les rend plus sensibles au stress.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Pour définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 interventions. La première, l'électrorétinographie (ERG), évalue la fonction visuelle. Le test est similaire à celui chez l'homme, mais l'animal est endormi pendant l'enregistrement. Chaque test dure 45-60 min, avec deux passages : un avant et un après l'exposition à la lumière pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux passeront 7 tests comportementaux validés pour étudier l'impact de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test varie, mais chaque animal est testé environ 5 min. Pour étudier le rôle des cellules à mélanopsine rétiniennes, les animaux recevront des injections oculaires : une avec un "traceur" pour marquer les projections rétiniennes vers le cerveau, et une seconde avec des molécules pour cibler spécifiquement les cellules à mélanopsine et les détruire. Ces injections se font sous anesthésie et analgésie. Enfin, pour vérifier l'implication d'une structure cérébrale régulant l'humeur et la cognition, une chirurgie sera réalisée sous anesthésie. Des molécules pharmacologiques seront injectées pour moduler l'activité de cette structure. La procédure dure entre 30 et 45 min. Après récupération, un activateur de ces molécules sera injecté dans la cavité abdominale pour inhiber certains neurones. Avenant : suite aux premiers résultats, les animaux recevront une injection (moins d'une minute par animal) sur animal vigile pour bloquer un messager chimique spécifique. Ils subiront ensuite des changements de cycle lumineux. D’autres animaux seront soumis à des cycles lumineux simulant des décalages horaires ou à du stress par immobilisation (quotidiennement, pendant 2h maximum, et sur 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances: 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur horloge biologique, les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à différents types d'injections, toutes réalisées sous anesthésie. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). 7) Les animaux seront soumis à une exposition à des cycles lumineux perturbants, et à une immonilisation pouvant provoquer du stress, des perturbations physiologiques, un incofort temporaire et une altération du comportement. avenant : l’administration de molécule dans l'abdomen peut causer une légère douleur et un inconfort temporaire à l’endroit de l’injection. Le décalage horaire simulé (jet lag) peut créer du stress, perturber leur activité et nuire à leur sommeil. Ces effets peuvent durer entre 10 et 15 jours, selon la rapidité avec laquelle l’animal se réajuste. Enfin, l’immobilisation peut provoquer une douleur, du stress, des comportements inhabituels, comme des bruits ou de l’agitation, une réduction de l’activité, une perte de poids ou un manque d'appétit. Ces effets varient en fonction de l'animal et de la durée et de l'intensité de l'immobilisation.

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

Génétiquement modifiées pour développer une athérosclérose, 132 souris sont irradiées pendant trente minutes, ce qui détruit les cellules de leur moelle osseuse avant une greffe qui les repeuple. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et associent l'immunodépression, quatre semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, une perte de poids, des troubles digestifs, un grisonnement des poils et seize semaines de régime riche en cholestérol. Le porteur qualifie l'irradiation d'indolore et les plaques formées dans les vaisseaux d'"indolores et asymptomatiques". Toutes sont tuées par ponction du cœur sous anesthésie, pour prélever ces plaques et les valves aortiques.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires, comme l’athérosclérose, sont la principale cause de mortalité dans le monde. L’athérosclérose se produit lorsque des plaques graisseuses (issues des lipides) se forment dans les artères, bloquant le flux sanguin et augmentant le risque de crise cardiaque ou d’AVC. En réponse à cette accumulation de graisses, la paroi artérielle devient inflammée, activant des cellules immunitaires appelées macrophages, qui sont responsables de l’élimination des particules nocives dans l’organisme. Cependant, dans les plaques, les macrophages eux-mêmes absorbent trop de graisses, contribuant ainsi à l’emballement de la croissance de la plaque. Les traitements actuels ne réduisent que partiellement le risque cardiovasculaire, il est donc urgent de trouver de nouvelles approches. Récemment, des chercheurs ont identifié des lipides complexes, appelées plasmalogènes, qui sont associées au risque cardiovasculaire. Les niveaux de plasmalogènes dans le sang pourraient être un bon indicateur du risque de maladie cardiovasculaire. Cependant, on ne sait pas encore avec certitude si les plasmalogènes jouent un rôle direct dans l’athérosclérose et l’inflammation qui l’accompagne, ni leur rôle dans les cellules immunitaires que sont les macrophages. Ce projet nous aidera à comprendre comment les plasmalogènes, qui sont très présents dans les macrophages, pourraient contribuer au développement de l’athérosclérose en modulant des étapes clés de la maladie. Le développement de l’athérosclérose sera examiné dans un modèle de souris génétiquement modifiées prédisposées à la maladie, et dont le système immunitaire uniquement verra sa quantité de plasmalogène soit inchangée, soit partiellement réduite, soit totalement. Ces souris seront nourries avec un régime riche en cholestérol, nécessaire au déclenchement de la maladie. Ce modèle d’athérosclérose est similaire au développement de la maladie chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Chez l’homme, l’athérosclérose est un facteur de risque majeur dans les maladies cardiovasculaires, qui est la première cause de mortalité. Les moyens thérapeutiques actuels ne permettent de réduire le risque cardiovasculaire que partiellement. Il est donc crucial de trouver de nouvelles de pistes thérapeutiques. Ce projet permettra de connaître davantage la composition en lipides des plaques, de comprendre les interactions complexes des plasmalogènes au niveau du système immunitaire sur le développement de la maladie, et de confirmer leur importance dans les maladies cardiovasculaires. Ces éléments permettraient une meilleure compréhension du développement de l’athérosclérose, et pourrait mettre en lumière de nouvelles pistes ou cibles thérapeutiques pour le développement d’éventuels traitements, qui restent à ce jour encore relativement limités.

Procédures

- Prise de sang (2 prélèvements ponctuels, de moins de 5 min chacun, espacés de 5 semaines) - Transport (1h, 1 aller-retour) - Irradiation (30 min) - Injection intraveineuse caudale unique et ponctuelle (greffe, 1 injection bolus,

Impact sur les animaux

De faibles douleurs, de courte durée, peuvent être occasionnées lors des prises de sang par voie caudale et de l’injection intra-veineuse. Un tube de contention sera utilisé pour l’injection intra-veineuse afin d’éviter tout mouvement indésirés de l’animal, minimiser le temps de contention et favoriser le bon déroulement de l’injection. Cette contention entraine une gêne provisoire de quelques minutes et peut être stressante pour l’animal. Les animaux seront manipulés de manière hebdomadaire pour effectuer les pesées. L’irradiation entraine les effets suivants : - Immunodépression : destruction des cellules de la moelle osseuse entrainant un risque infectieux augmenté. Cet effet disparaitra lorsque la prise de greffe de moëlle osseuse sera effective. Afin d’éviter les infections lors cette phase d’immunodépression transitoire, les souris recevront une antibiothérapie durant 4 semaines. Ce traitement peut entrainer certains effets secondaires propres à l’antibiotique (principalement des réactions allergiques, cependant rares). - Affaiblissement général se traduisant par une perte de poids et de la fatigue. - Atteintes intestinales : L'irradiation peut endommager les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal, pouvant entrainer des troubles digestifs et une absorption réduite des nutriments (contrôlé par une pesée régulière). De nouveau cet effet est transitoire grâce au renouvellement naturel et constant des cellules épithéliales. - Altération de la peau et des poils : Grisonnement localisé des poils possible et ralentissement de la repousse. Le transport aller-retour vers la plateforme d’irradiation (moins de 20 minutes) est stressant pour les souris.

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire pour la détermination des lésions. Les plaques dans les vaisseaux sanguins seront prélevées post-mortem pour en déterminer la composition. Les valves aortiques situées au niveau du cœur seront prélevées afin de déterminer l’étendues des plaques.

Remplacement

L’athérosclérose est une maladie complexe qui ne peut pas être mimée in vitro. Elle implique des interactions entre l’inflammation, les lipides, le cholestérol, le flux sanguin, mais également entre différents tissus comme le foie ou le tissu adipeux. Il est possible in vitro d’étudier ces différents acteurs impliqués dans cette maladie séparément, mais seule l’utilisation de modèles animaux présentant une athérosclérose proche de celle de l’Homme peut permettre de tenir compte de tous ces éléments ensembles, et ainsi permettre une meilleure compréhension globale de cette maladie. Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces.

Réduction

Un modèle mathématique, tenant compte de nos variables d’intérêts ainsi que les différences nécessaires afin de pouvoir conclure à de réelles différences entre nos groupes, nous a permis de réduire le nombre d’animaux à 11 par groupe, ce chiffre correspondant au nombre minimum nécessaire pour avoir des données exploitables par la suite. Les différences attendues sont des différences dans la formation des plaques dans les vaisseaux sanguins ainsi que des paramètres qui lui sont associées. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles afin de tenir compte du dimorphisme sexuel. Enfin les expériences seront répétées une deuxième fois afin de confirmer la reproductibilité des résultats obtenus.

Raffinement

Le transport est stressant pour les souris. Tout sera fait pour limiter l’inconfort et le stress des animaux pendant cette étape (Enrichissement, gel diet, voiture climatisée). L’irradiation est quand-a-elle indolore. Les souris seront transférées dans de nouvelles cages propres à leur retour et un temps de repos de 2h minimum sera respecté pour limiter un stress trop important. Ce délai est nécessairement court puisque la greffe doit être rapidement effectuée. L’irradiation supprime le système immunitaire. 2 à 4 semaines sont nécessaire à la greffe pour fournir de nouveau un système immunitaire entièrement fonctionnel. Ceci sera pallié par 4 semaines d’antibiotiques, dilués dans l’eau de boisson et renouvelés quotidiennement, pour limiter le risque infectieux. Durant cette période, et pendant l’injection de la greffe, tout sera fait pour garder les souris dans un environnement propre et exempt de pathogènes. L’injection et les différentes prises de sang se feront après application d’un anesthésique local. Un tube de contention conçu pour restreindre le temps de confinement et le risque de mouvement indésirable de la souris pendant l’injection sera utilisé afin de réduire le temps de manipulation des souris. Le prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque se fera sous anesthésie gazeuse, la souris sera maintenue à 37°C via un plateau chauffant le temps de la ponction, de la lidocaïne sera appliquée localement sur le site d’insertion de l’aiguille. L’animal sera ensuite euthanasié pour effectuer les différents prélèvements. Le milieu d’hébergement sera enrichi (objet pour se cacher, nid). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10. La mise sous régime riche en cholestérol entrainera la formation de plaque dans les vaisseaux sanguins des souris, celles-ci sont indolores et asymptomatiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces. Des animaux adultes (8 semaines) seront utilisés, l’athérosclérose étant une maladie s’installant sur le temps et touchant la population adulte.

Le nerf sciatique droit de 75 rats est sectionné puis suturé sous anesthésie générale, opération de quarante minutes qui leur fait perdre la motricité et la sensibilité de la patte arrière. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et s'achèvent sans réveil, le nerf étant prélevé pour compter les fibres myélinisées et mesurer la gaine de myéline. Le porteur prévoit des difficultés de déplacement, une atrophie possible du membre, des douleurs après l'opération et des automutilations dont il ne peut estimer la durée, et fait courir les animaux vingt minutes par séance sur un tapis roulant pour les limiter. Il écrit par ailleurs que cette opération est "très bien tolérée" par les animaux.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse périphérique. La stratégie de réparation des nerfs périphériques considérée comme le gold-standard est la suture microchirurgicale directe sans tension, avec l’utilisation de greffe nerveuse d’interposition en cas de perte de substance nerveuse. Dans le cadre des lésions des nerfs périphériques dont la réparation par une suture directe sans tension est possible, différents types d’enveloppement nerveux ont été utilisés dans le but d’améliorer les résultats cliniques des réparations. Un enveloppement nerveux est l’utilisation d’un matériel (biologique ou de bio-ingénierie) sous la forme d’un tube placé autour des moignons nerveux, qu’ils soient suturés ou non. L’objectif principal de notre étude pré-clinique sur modèle murin est de comparer les effets de la protection de la suture nerveuse par une enveloppe graisseuse autologue sur la récupération fonctionnelle motrice et sensitive, par rapport à la protection par un manchonnage veineux. L’objectif secondaire est de comparer les caractéristiques histologiques de la cicatrisation nerveuse lors de la protection de la suture par une enveloppe graisseuse, par rapport à la protection par un manchonnage veineux.

Bénéfices attendus

Bien que la chirurgie réparatrice des nerfs périphériques soit aujourd’hui réalisée de manière quotidienne, les résultats ne sont pas excellents. Sur l’ensemble des procédures de chirurgie nerveuse réalisée, seuls 40 à 50% des patients présentent une récupération fonctionnelle satisfaisante. Une régénération nerveuse incomplète peut entrainer une mauvaise récupération motrice, par dénervation musculaire, ainsi qu’une mauvaise récupération sensitive et des douleurs chroniques. Les lésions traumatiques des nerfs périphériques ont des coûts socio-économiques importants, et les résultats concernant la douleur, la durée de récupération, l’impact psychologique et le retour à une fonction de base sont mauvais. Nous espérons que les différents tests réalisés sur la récupération fonctionnelle montreront une différence significative entre les groupes suture avec enveloppement par manchon ou par graisse autologue versus suture seule. Nous espérons également montrer au moins une absence de différence significative entre les groupes manchonnage veineux et manchonnage graisseux. Nous espérons évaluer histologiquement la présence ou non d’un micro-environnement favorable à la régénération nerveuse en cas d’enveloppement nerveux par graisse autologue. Une meilleure récupération fonctionnelle avec l’utilisation de graisse autologue dans cette étude pré-clinique, en comparaison au gold standard de la réparation nerveuse (suture directe microchirurgicale sans tension) permettrait d’appuyer la réalisation d’étude clinique, en particulier dans le cadre des lésions nerveuses périphériques traumatiques. L’utilisation de graisse autologue entourant une suture nerveuse directe serait une amélioration technique simple et peu couteuse du gold-standard. En effet, la disponibilité de graisse autologue est constante sur le site opératoire d’une chirurgie nerveuse périphérique. De plus, une récupération fonctionnelle meilleure ou équivalente avec l’enveloppement de graisse autologue en comparaison au manchonnage veineux dans cette étude permettrait également d’appuyer la réalisation d’études cliniques.

Procédures

Il y a 4 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique. Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale, sous ventilation et durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond à l’entrainement physique sur animal vigile (tapis roulant horizontal) qui permettra une meilleure récupération du positionnement de la patte lésée ; chaque test durera 20 minutes et cela dès J+1 semaine de l’intervention jusqu’à la fin du protocole. – La troisième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (3,6 et 9 semaines post-opératoire), chaque test durera environ 20 minutes. -La quatrième intervention est le prélèvement du nerf sciatique, réalisé sous anesthésie générale afin de procéder, par la suite, à l’analyse histologique. Cette dernière étape est sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux. Le prélèvement de la veine jugulaire externe, malgré son rôle majoritaire de drainage veineux cervico-facial chez le rat, n’est pas décrit comme à risque de nuisance chez le rat. Son prélèvement nécessite une incision supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

La réparation des nerfs périphériques comporte des mécanismes physiopathologiques hautement intégrés qui ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifères ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (chirurgie de la main par exemple).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à l’outil BiostaTGV avec un test bilatéral et une analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8) qui montre que l’effectif théorique de 15 rats par groupe permettra de mettre en évidence des différences significatives. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. Avant chaque procédure, nous réaliserons du "Handling" afin de diminuer le stress de l'animal. L’entrainement physique doux (tapis roulant horizontal) permettra aux animaux de limiter toute automutilation rencontrée lors de nos précédents protocoles. Cette nouvelle technique de raffinement permettra aux animaux d’avoir un membre plus fonctionnel. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrière.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chez l'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature et à celles de notre laboratoire. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

Un rat dont la température corporelle chute durablement sous 33,5 °C sort du protocole, et peut y être réintroduit après avoir été réchauffé. 580 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolés en cage individuelle pendant 19 à 26 jours, ils subissent une prise de température rectale chaque jour, et 204 d'entre eux vivent à 4-6 °C jour et nuit durant deux à trois semaines, avec des frissons possibles les premiers jours. L'objectif est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur. Le bénéfice reste au conditionnel, un système qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" contre l'obésité, alors que l'isolement touche tous les rats dès le premier jour.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire).

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, effet de la température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) seront mis en place. Afin de limiter leur stress, les rats seront placés en armoire ventilée 5 jours avant le début de l'exposition au froid ou à la neutralité thermique). Ils seront en cage individuelle, mais ils pourront se voir et se sentir. Puis après 5 jours d'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée, les rats seront exposés à la température étudiée (4-6°C ou 28°C). Durant la phase d'adaptation au froid, décrite pour durer quelques jours, une surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux est prévue. Des points limites seront définis et permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C. L'animal pourra être réchauffé et réintroduit ou pas dans le protocole selon sa récupération. Si l'acclimatation au froid s'avérait trop difficile, la mise en place d'un protocole d'exposition progressif au froid serait envisagée. Cela ne sera très probablement pas nécessaire car des études similaires ne décrivent pas d'inconfort majeur lié à l'exposition au froid. En effet, les rats, dont la neutralité thermique est autour de 28°C, présentent déjà une certaine adaptation de leur tissu adipeux brun au froid, lorsqu'ils sont hébergés à 22°C. Afin de limiter l'impact de l'isolement et du froid et d'améliorer le bien-être des animaux, leur milieu de vie sera enrichi durant toute la période de stabulation, et, notamment les 4 premiers jours d'exposition, par du matériel de nidation limitant l'impact du froid. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.

Du chocolat administré au début de la phase de sommeil pour empêcher 90 souris de dormir, des électrodes qui détruisent au courant électrique les neurones du noyau suprachiasmatique : 674 souris et 284 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les interventions chirurgicales durent de trente minutes à une heure et se répètent, avec pose d'un cathéter dans la veine du cou, injections de virus dans le cerveau, tests de comportement et de sommeil à 3, 6 et 12 mois. Certains animaux passent deux semaines isolés pour mesurer la perturbation de leurs rythmes, dans des cages transparentes voisines qui leur permettent de voir leurs congénères. Le porteur retient souris et rats pour comparer deux physiologies, garde les animaux jusqu'à 18 mois après le début des expériences et n'en laisse survivre aucun, y compris dans les groupes témoins.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées dont la prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et qui touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Comprendre le développement de la maladie est donc primordial. Cette démence se caractérise en partie par une accumulation et une agrégation d'une protéine, la protéine Tau, provoquant la dégénérescence des neurones touchés. Les atteintes cérébrales sont variées : hippocampe, cortex, … mais également l’hypothalamus et en particulier les neurones du Noyau Supra-Chiasmatique (NSC) impliqués dans le contrôle des rythmes circadiens (rythme biologique qui régule l'alternance veille/sommeil). Les troubles du sommeil représenteraient un marqueur précoce de la maladie avant l’apparition des troubles cognitifs mais également un facteur de risque. Notamment, il a été montré qu’une privation de sommeil chez l’animal et chez l’Homme conduit à une élévation des protéines Tau toxiques dans le liquide céphalorachidien. De plus, le travail de nuit, occasionnel ou habituel, qui concerne environ 15% des salariés en France soit 3,5 millions de personnes, constitue une préoccupation majeure de santé publique du fait des effets sanitaires divers qui lui sont associés, en particulier des troubles cognitifs et d’une augmentation du risque de démences. En outre, il a été montré récemment que les cellules bordant le troisième ventricule du cerveau, nommées les tanycytes, étaient également dégradées dans la maladie d’Alzheimer. Or, ces tanycytes pourraient être impliquées dans la clairance de la protéine Tau contenue dans le liquide céphalorachidien. De plus, il a été récemment suggéré que les neurones du NSC pourraient communiquer avec les tanycytes pour réguler certaines fonctions circadiennes.

Bénéfices attendus

Le projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans l’arrivée de la maladie d’Alzheimer. Les résultats de ces recherches pourraient permettre d’évaluer l’impact des troubles du sommeil ou les horaires de travail décalés sur le développement de la maladie d’Alzheimer et également d’autres démences, et ainsi aider les autorités sanitaires à mettre en place des actions afin de limiter ces facteurs de risques. D’autre part, la dégradation des tanycytes et le manque de nettoyage du liquide céphalorachidien au cours des phases de sommeil profond par ces cellules spécialisées, les tanycytes, pourraient être à l’origine d’autres pathologies et ouvre la voie à de nouvelles recherches. En effet, l’accumulation d’autres protéines dans le liquide céphalorachidien, tel que l’Orexine, pourrait être responsable de troubles métaboliques observés chez les personnes ayant des troubles du sommeil ou en travail posté.

Procédures

Un premier groupe d'animaux (100 souris/100 rats) sera nécessaire pour étudier les changements des tanycytes induits par une lésion des NSC. Une chirurgie cérébrale détruira les neurones des NSC par l’introduction d’électrodes qui envoient un courant électrique. Ces animaux subiront une deuxième chirurgie 2 semaines après afin d'injecter dans le cerveau une protéine Tau fluorescente et un cathéter sera placé dans la veine du cou afin d'effectuer des prélèvements de sang réguliers. Les animaux seront euthanasiés 10 jours après, soit au total 24 jours après le début des expériences afin de prélever les cerveaux et étudier leurs morphologies. Un deuxième groupe d'animaux sera utilisé pour vérifier l'impact d'une perturbation du rythme circadien (travail posté, mauvais sommeil) sur les fonctions cognitives des souris soit par lésions des NSC, soit par une manipulation environnementale. Un premier sous-groupe de 240 souris (90 souris sauvages, 90 souris modèles de la maladie d'Alzheimer et 60 souris contrôles) subiront une chirurgie de lésion cérébrale des NSC; un deuxième sous-groupe (90 souris avec chocolat en phase de sommeil et 60 souris contrôles avec chocolat en phase de veille) se verra administrer un aliment appétant (chocolat) au début de la phase de sommeil afin de les empêcher de dormir. Toutes ces souris seront testées 3, 6 et 12 mois après par des tests de comportements et par des tests du sommeil. Un troisième groupe d'animaux sera utilisé pour étudier un changement des gènes dans les tanycytes à court et à long terme induit par une lésion des NSC sur 80 souris et 80 rats. Les animaux subiront une lésion des NSC puis après 1, 3, 6, 12 et 18 mois, une chirurgie cérébrale permettra l'injection d'un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Ces animaux seront euthanasiés 2 semaines après l'injection du virus pour des expériences de transcriptomique. Un quatrième groupe d'animaux permettra de voir l'impact de l'activation ou l'inhibition des neurones des NSC à la fois sur la morphologie et sur la modification des gènes des tanycytes. Deux sous-groupes (52 souris et 52 rats chacun) auront une injection cérébrale de virus permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones des NSC et un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Deux semaines après l’injection cérébrale, les animaux seront mis à mort 30min après l’activation ou l’inhibition des neurones. Chacune des interventions chirurgicales durera entre 30 minutes et 1 heure.

Impact sur les animaux

Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort et des mesures de raffinement seront mises en place pour les limiter au maximum. En particulier, les expériences de chirurgie ou de prélèvements de sang sont faites sous anesthésie générale avec l'administration d'analgésique pour éviter toute douleur à l'animal lors de son réveil. Afin d’évaluer la perturbation des rythmes circadiens, il sera nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant 2 semaines (évaluation du poids, de l’absorption d’eau et d’aliments, expériences d’optogénétique). Cet isolement reste limité et sera effectué dans des cages transparentes à coté les unes des autres afin de permettre à chaque souris/rat de voir ses congénères. La lignée de souris transgéniques est une lignée de souris mimant la maladie d'Alzheimer. Ce modèle murin développe une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de l’âge de 3 mois, avérée à 6-7 mois et maximale à 12 mois. Ces animaux n'ont pas de problème de déplacement et ne souffriront pas de cette pathologie. D’autres manipulations seront effectuées sur les animaux vigiles : des tests de comportement (sur 390 souris) consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives. Ces expériences n’entraînent aucune douleur, mais peuvent générer du stress suite aux manipulations; les expériences seront réalisées par le même manipulateur et une habituation est effectué avant chaque test. Les molécules (anesthésiques, analgésiques, activateur/inhibiteur) devront parfois être injectés dans le péritoine de l’animal et nécessiteront la contention et l’injection de l’animal; un analgésique local peut être utilisé pour limiter la douleur de l'injection.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans chacune des procédures sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôles. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de 18 mois. Les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude pour faire des analyses de transcriptomique ou étudier la morphologie des populations cellulaires, par l’injection d'une euthanasiant chimique.

Remplacement

Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3R. L’étude des communications entre différentes régions cérébrales nécessite, en particulier au niveau du cerveau, d’utiliser des organismes entiers. Aucun système cellulaire n’est capable à l’heure actuelle de mimer toutes les interactions entre différentes régions cérébrales et les influences périphériques. Les tanycytes de l’éminence médiane sont des cellules placées au cœur d’une région cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions endocrines et préserver l’influence des différentes parties de l’organisme sur cette communication cérébrale est indispensable pour notre projet. Les modèles de rongeurs rats et souris sont donc pertinents pour ce type d’étude et permettront une étude comparée des deux espèces ayant des physiologies différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est calculé de façon à avoir un nombre minimal et homogène d’animaux et que ce nombre soit suffisant pour une analyse statistique. Le calcul du nombre d’animaux est basé sur un calcul statistique d’effectif (seuil de significativité de 5%, puissance égale à 85%, différence entre les moyennes de 15 et écart-type de 10) pour une comparaison entre deux lots et un test statistique bilatéral. Ce calcul évalue le nombre minimum de souris par groupe entre 6 et 10.

Raffinement

Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. * Les animaux sont manipulés individuellement, et dans le calme, afin de limiter tout stress des animaux non manipulés. Ils seront également habitués à la manipulation. * Les manipulations (administrations et sacrifices) s'effectuent à distance des autres animaux. * Les hébergements seront enrichis. * Pour les prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés dès que possible par anesthésie gazeuse. *Une surveillance quotidienne est effectuée afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle souffrance (suite à l’infection). En cas de signes cliniques défavorables et/ou si une perte de poids supérieure à 20% survenait, les animaux concernés seront mis à mort par un euthanasiant chimique. La souffrance, la détresse, l’inconfort des animaux de laboratoire seront évalués en se basant sur les cinq paramètres suivants : 1. variation du poids de l’animal 2. apparence physique externe (horripilation, accélération de la respiration, tremblements, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen) 3. signes cliniques mesurables (hypothermie) 4. changement du comportement (diminution des soins, animal prostré) 5. réponses comportementales aux stimuli externes (réaction violente de douleur associée à des vocalisations) Un stress momentané est possible suite aux manipulations mais celui-ci sera réduit grâce aux bonnes pratiques de la préhension des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle rongeur est essentielle pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie d’Alzheimer. La communication entre différentes populations cérébrales impliquées nécessite l’utilisation de l’animal entier. Par ailleurs, la possibilité d’utiliser des souris transgéniques THY-Tau22 mimant le déclin cognitif est un plus et nécessite l’utilisation de souris transgéniques et wild-type. L’utilisation des technologies DREADD et d’optogénétique nécessite également l’utilisation de souris et de rats, technologies aujourd’hui indispensables pour moduler des populations neuronales et en déduire leurs fonctions. La physiologie des souris et des rats étant différente, il nous parait nécessaire d'étudier dès que possible ces 2 espèces afin de permettre leur comparaison. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux adultes de 8 semaines à 21 mois. Toutes les expériences démarreront à l’âge de 8 semaines et se poursuivront sur 14 ou 24 jours pour les études à court-terme, ou sur 3 mois, 6 mois, 12 mois et 18 mois pour les études sur le long-terme (au maximum, les animaux seront âgés de 20,5 mois).