Rongeurs

6 900 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur greffée sous la peau du flanc et recevant jusqu'à neuf injections d'immunothérapie en trois semaines, plus neuf gavages quotidiens de thérapie ciblée. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La masse tumorale peut gêner les déplacements et dégrader l'état général, la mise à mort intervenant quand la croissance de la tumeur atteint le seuil fixé. Le but déclaré est d'optimiser des combinaisons de chimiothérapie et d'immunothérapie déjà utilisées en clinique, la perspective d'essais thérapeutiques dans les cancers du poumon et du pancréas restant au conditionnel.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association de traitement anticancéreux (immunothérapie et chimiothérapies) utilisées en clinique dans plusieurs modèles de cancers du côlon, du poumon ou du pancréas chez la souris.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer des combinaisons de traitement utilisable chez l’homme et ayant des propriétés anti-tumorales. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre l’impact de ces nouvelles associations sur la croissance du cancer et d’évaluer l’effet qu’ils peuvent avoir sur la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons en particulier à la capacité de certaines chimiothérapies et de thérapies dites « ciblées » (spécifique de la cellule cancéreuse) d’augmenter l’effet des médicaments d’immunothérapies. In fine, notre projet devrait nous permettre d’optimiser l’utilisation de ces traitements et de proposer la mise en place d’essais thérapeutiques dans le cancer du poumon et du pancréas.

Procédures

- Injection sc des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Traitements par chimiothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 30 secondes - Traitements par immunothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum par animal - Durée : 1 minute - Traitements par thérapie ciblée par voie orale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration par jour pendant 9 jours par animal - Durée 1 minute - Traitements par anticorps (ip): - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum par animal - Durée : 1 minute

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Gêne et douleur associées à l’administration des traitements par gavages et par injections en i.p.

Devenir

Dans ce projet deux axes de travail sont prévus : Nous avons prévu de faire des analyses de croissance tumorale et de survie. Lorsque les points limites seront atteints (en lien avec la croissance de la tumeur), les souris seront euthanasiées comme décrit précédemment. Si des souris présentent une guérison à long terme une récupération d’organes (rate, ganglion) et de sang sera faite de manière à évaluer la mémoire immunologique dirigée contre la tumeur. Enfin, nous avons prévu d’étudier la réponse immunitaire dans les tumeurs à différents temps d’analyse.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. Par ailleurs, les thérapies que nous cherchons à évaluer impliquent la présence d’un système immunitaire compétent. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour tous les modèles, les expériences d’immunomonitoring ainsi que les expériences sur le rôle des lymphocytes T CD8, T CD4, NK et de la voie CXCR/IFNAR1 (partie II) ne seront pas réalisées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. Certains points limites peuvent survenir, ce qui conduira dans un premier temps à un arrêt des traitements, puis si persistance à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Une colite est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson pendant six à sept jours, répétée sur plusieurs cycles, avec diarrhées et perte de poids de 5 à 10 %, et des injections dans l'abdomen déclenchent ensuite un cancer du côlon. 5 004 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le dialogue entre cellules épithéliales et fibroblastes du côlon, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur écrit que la colite provoque une douleur qu'il ne peut traiter ni par analgésique ni par anti-inflammatoire, ceux-ci fausseraient les résultats, et détaille par ailleurs les cabanes en carton, la pâtée et le fond musical installés dans l'animalerie.

Objectifs

Le cancer colorectal est le 3° cancer le plus répandu et le 2° cancer qui tue le plus de patients au monde. Les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, présentent un risque accru de développer un cancer du côlon. Les patients atteints d’un cancer du côlon suite à une inflammation présentent un pronostic plus sombre que ceux atteints d’un autre type de cancer du côlon, car l’inflammation chronique augmente leur agressivité. De plus, souvent indolore, il est fréquemment diagnostiqué aux derniers stades de la croissance tumorale, ce qui diminue l’efficacité des traitements proposés aux patients et augmente la résistance des tumeurs à ces mêmes traitements. Malgré l’ampleur de cette pathologie dans la population, les cellules et les molécules responsables du déclanchement et de la progression de cette maladie restent encore mal comprises. En conséquence, un grand nombre de cas ne sont pas efficacement diagnostiqués puis soignés. Notre projet est centré sur l’étude du dialogue entre les deux types de cellules les plus importantes du côlon. Ces deux types de cellules interagissent entre elles pour maintenir la structure du côlon, le réparer et coordonner la réponse immunitaire mise en place en cas d’agressions. Leur nombre est très fortement augmenté en pathologie et notamment lors d’une inflammation ou pendant la progression du cancer. Découvrir le rôle précis de ces deux types de cellules et les molécules qu’elles libèrent, pourrait ouvrir la voie vers de nouveaux traitements. Les modèles animaux de pathologies intestinales (inflammation aigue et chronique ou cancer du côlon) constituent des outils importants pour étudier le déclanchement et le développement de ces maladies. Par exemple, ils permettent de suivre les changements des tumeurs depuis une tumeur bégnine à une tumeur plus agressive comme cela a été observé chez l’homme. Enfin, les modèles animaux permettent aussi de tester de nouveaux traitements et étudier la réponse des tumeurs à ces traitements.

Bénéfices attendus

Notre projet, centré sur l’étude du dialogue entre les deux types cellulaires majoritaires du côlon, permettra de mettre en lumière de nouveaux mécanismes favorisant ou inhibant le développement du cancer colorectal. A court terme, l’utilisation des modèles animaux des colites aigues, chroniques et du cancer colorectal permettront de délimiter les similitudes entre ces pathologies induites chez l’animal et les caractéristiques des maladies humaines correspondantes. A long terme, la description de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans le dialogue entre les fibroblastes et les cellules épithéliales pourront être proposées dans le traitement des patients atteints de cancer colorectal liés à une maladie inflammatoire chronique de l’intestin.

Procédures

Les seules interventions sur animal vigile prévues dans cette étude sont des injections intrapéritonéales. Ces injections sont soit unique, comme celle d’un agent inducteur de mutation pour induire un cancer ; soit double, à deux jours d’intervalle, pour induire la perte du gène d’intérêt. Étant donné notre expérience, chaque injection ne dure pas plus 2-3 secondes avant que l’animal ne revienne dans sa cage. Tous les prélèvements d’organes seront réalisés après anesthésie et euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les injections en intrapéritonéal représentent le premier effet indésirable attendu chez les animaux. Notre pratique régulière de ces injections nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Les cages restent sous surveillance rapprochée au moins 20minutes après toute injection pour détecter le plus rapidement possible les signes de souffrance chez les animaux (prostration). Les effets indésirables attendus chez les animaux résultent essentiellement de la prise, dans l’eau de boisson, du traitement qui induit une inflammation localisée au niveau du colon. La prise du traitement pendant 6 ou 7 jours induit une altération de la paroi du colon qui provoque une perte de poids entre 5 à10% chez les souris. Cette perte est due à une mauvaise absorbation des aliments et une perte d’eau suite à des diarrhées. Ces effets apparaissent au jour 6 après le début du traitement pour une perte maximale à jour 8 ou 9, puis les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. Nous n’avons jamais observé une prise d’eau augmentée par les souris au cours de cette procédure, qui pourrait révéler une déshydratation des animaux. D’après la littérature et notre expérience de cette procédure, la perte de poids survient majoritairement lors du 1er cycle de traitement car il est courant que les souris perdent moins de poids lors des deux cycles suivants. Enfin, nos observations des projets précédents montrent que les souris sont susceptibles de développer de multiples tumeurs du côlon avec ce modèle, sans que leur mobilité, leur appétit et leurs relations sociales soient altérées. Comme chez l’homme, la présence de polypes intestinaux est souvent asymptomatique.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans chaque procédure de ce projet seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Nous pouvons envisager de faire des expériences in vitro sur des cellules épithéliales intestinales et des fibroblastes isolés du colon pour étudier le caractère autonome des modifications génétiques dans ces deux types cellules. Par contre, Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour évaluer avec précision et pertinence, le rôle des nouveaux gènes de notre étude dans le dialogue qui peut se mettre en place entre les cellules épithéliales tumorales et les cellules de l’environnement comme les fibroblastes. Nous utiliserons le modèle souris, permettant l’inactivation des gènes d’intérêt.

Réduction

La demande de projet actuelle reprend des procédures déjà réalisée sur d’autres lignées de souris (dans une demande précédente). Ceci nous permet de définir avec précision le nombre de souris suffisant par groupe, pour chaque procédure, afin de générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle ou expérimentale. Ce nombre a été validé par le service de statistique de notre institut pour atteindre un chiffre permettant de valider statistiquement les résultats observés.

Raffinement

Les colites entrainent une douleur pour laquelle il n’est pas possible d’administrer de traitement analgésique ni anti-inflammatoire, qui interféreraient avec le processus de régénération/cancérisation et donc modifieraient les résultats de l’expérimentation. La surveillance des animaux se fera de manière accrue lors de visites quotidiennes. Certaines souris pouvant être gênées plus que d’autres par la colite, de la nourriture pourra également être placée à même le sol de la cage pour s’assurer que toutes les souris puissent se nourrir correctement. De plus, elles auront à leur disposition dans la cage de la pâtée alimentaire en complément de leurs croquettes habituelles pour favoriser leur réhydratation. L’administration des produits permettant l’élimination des gènes d’intérêts ou l’induction du cancer se fera par voie intrapéritonéale, en changeant d’aiguille à chaque souris pour éviter que celle-ci ne s’émousse et provoque de la douleur chez les animaux. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu grâce à l'ajout dans les cages de cabanes en carton et de cotons à décortiquer. Un fond musical est assuré pour éviter les variantions sonores trop importantes entre les périodes d’expérimentation et les périodes de repos ce qui pourraient générer un stress supplémentaire chez les animaux.

Choix des espèces

La disponibilité de souris génétiquement modifiées pour les molécules que nous étudions justifie l'utilisation de ce modèle pour nos expériences. Le protocole d'induction du cancer colorectal que nous utilisons est bien standardisé chez la souris et largement admis comme le modèle de référence mimant au plus près les étapes du développement du cancer suite à une inflammation chronique. Notre étude porte sur le dialogue entre les cellules épithéliales et les fibroblastes du colon. Pour cela, nous éliminerons des lignées de souris dans lesquelles les gènes d’intérêt seront supprimés soit dans les cellules épithéliales soit dans les fibroblastes. Les gènes que nous étudions ont été démontrés comme : - Impliqués dans d'autres types de cancer que le cancer colorectal. - sur-exprimés ou sous-exprimés chez les patients atteints de cancer colorectal sans que leur fonction soit encore parfaitement déterminée. Les animaux seront utilisés à partir de 2 ou 3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer colorectal ou de colites chroniques.

Des souris reçoivent un traitement qui provoque des malformations vasculaires et des saignements dans le cerveau, puis une injection quotidienne pendant quatre mois, soit jusqu'à 81 injections par animal éveillé, auxquelles s'ajoutent douze séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ces administrations de source d'une "légère douleur" et l'imagerie hebdomadaire d'un "léger stress", tout en indiquant que les lésions cérébrales entraînent des complications à cinq mois, raison pour laquelle les souris sont utilisées avant quatre mois afin d'éviter la mortalité. Toutes sont tuées en fin de traitement pour prélever les tissus.

Objectifs

L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. L’objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs effets sur des lésions vasculaires qui sont sur le point de se former ou qui sont déjà établies dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester des molécules candidates pour le traitement des angiomes caverneux. L'utilisation de modèles animaux porteurs de la maladie permettra d'évaluer l'efficacité de ces molécules dans un contexte proche de la pathologie humaine. Ces recherches pourraient ainsi représenter une avancée majeure dans la prise en charge des angiomes caverneux chez les patients.

Procédures

L’étude implique une injection quotidienne du traitement aux animaux éveillés, pendant maximum 4 mois. Les animaux vigiles (au maximum 372) recevront 81 injections (une injection par jour, moins de 10 secondes de manipulation) pour l’expérience la plus longue c’est-à-dire 4 mois. L’étude implique également une session hebdomadaire (maximum 12 sessions) d’imagerie non invasive d’une durée maximum d’une heure, réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées. Pour vérification du génotypage, une biopsie à l’oreille sera effectuée sur 20 animaux répartis tout le long du projet.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront un traitement afin d’induire les angiomes caverneux impliquant des saignements dans le cerveau. En parallèle, les animaux recevront un traitement expérimental administré quotidiennement, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. Ces administrations peuvent induire une légère douleur. L'évolution des lésions et la réponse au traitement seront suivies par des imageries hebdomadaires qui peuvent engendrer un léger stress. La formation des lésions vasculaires dans le cerveau s’effectue de façon progressive sur 5 mois et peut induire une perte de poids.

Devenir

En fin de traitements, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidats pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animal est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Pour évaluer les effets des traitements, le nombre d’animaux tient compte des risques d’exclusion d’un animal lors de la réalisation des expériences. De plus, le nombre d’animaux pourra être réduit en fonction des résultats d’imagerie. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.

Raffinement

Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations d’imagerie seront réalisées sous anesthésie et analgésique adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué. Une échelle de cotation de douleur sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Ce n’est qu’à 5 mois que les lésions cérébrales entraînent des complications inhérentes à la pathologie. Nous utilisons les animaux avant 4 mois afin d’éviter cette mortalité et la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Nous utilisons les souris dès leur naissance pour induire la maladie et, ainsi, pouvoir évaluer l’effet préventif ou curatif de différentes molécules sur les lésions qui sont sur le point de se former ou qui sont déjà établies.

Soixante embryons reçoivent une injection dans le cerveau via vingt-cinq femelles gestantes, et soixante-quinze souris adultes en subissent deux, espacées de onze semaines. 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si les neurones nés pendant la vie embryonnaire et ceux nés à l'âge adulte se branchent sur les mêmes réseaux du gyrus denté, les retombées sur la mémoire étant renvoyées au long terme. La seule nuisance annoncée tient en une ligne, la douleur liée à la chirurgie. Le porteur justifie le choix de la souris par le fait que ce projet fait suite à un autre projet mené chez la souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre si les nouveaux neurones produits dans le cerveau, soit pendant le développement, soit à l'âge adulte, s'intègrent aux mêmes réseaux de communication. Nous nous concentrons sur une région du cerveau impliquée dans la mémoire, appelée le gyrus denté. Pour cela, nous allons étudier comment ces neurones se connectent : reçoivent-ils des messages des mêmes types de neurones ? Envoient-ils eux-mêmes des messages à des groupes de neurones similaires ou différents ?

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre le fonctionnement du gyrus denté et le rôle des différents neurones qui se forment à différentes étapes de la vie. À long terme, cela nous aidera à mieux cerner leur impact sur la mémoire, les émotions et d'autres fonctions essentielles du cerveau.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection cérébrale pendant la vie embryonnaire (25 min, 60 embryons provenant de 25 gestantes), à la naissance (5 min, 60 souriceaux provenant de 20 gestantes), à 3 semaines (30 min, 60 animaux) ou à 12 semaines de vie (30 min, 60 animaux). Les injections lors de la vie embryonnaire seront réalisées en utilisant des souris gestantes. D'autres animaux recevront deux injections cérébrales, la première à l'âge adulte et la seconde 11 semaines plus tard (75 animaux).

Impact sur les animaux

La nuisance majeure que pourrait subir les souris est la douleur associée à la chirugie.

Devenir

Tous les animaux injectés seront mis à mort car leurs cerveaux sont récupérés pour les analyses.

Remplacement

N'existant pas de modèle in vitro et in silico permettant de reproduire l'environnement complexe caractéristique du gyrus denté (multiples types cellulaires, architecture complexe, afférences variées..) et ce à différents moments de la vie, cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal ex vivo ou in vivo.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Mâles et femelles seront utilisés.

Raffinement

Pour réduire toute souffrance liée à la chirurgie, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 2- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Un suivi post-opératoire sera assuré afin d'évaluer le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence et du comportement . Des points limites stricts et précis sont définis pour détecter précocément d'éventuelles souffrances des animaux. Si l'animal est en souffrance, un analgésique sera injecté. Un soin particulier sera également accordé à leurs conditions d’hébergement.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris car il fait suite à un autre projet réalisé chez la souris. Dans la structure cérébrale étudiée, les neurones sont générés de la vie embryonnaire à l'âge adulte. Nous ciblerons les cellules à l'origine de ces neurones et ce à différents moments de la vie de l'animal: 1) pendant la vie embryonnaire, 2) à la naissance (P0), 3) en période juvénile (P21) et à 4) l'âge adulte (P84). Ces temps précis d'analyse ont été choisi en fonction de la littérature et de nos études précédentes.

407 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie de 45 minutes à 1 h 30, avec craniotomie, pour l'implantation d'électrodes, puis des stimulations optogénétiques qui peuvent provoquer des mouvements involontaires, et certaines reçoivent quatre injections intrapéritonéales sous contention. Elles passent des tests fondés sur des récompenses, désignés comme des "jeux de décisions" sans que leur déroulé soit décrit, pour étudier la flexibilité comportementale et le rôle de la protéine Shank3 dans l'autisme. Elles sont tuées pour vérifier l'emplacement des implants, et le porteur affirme que son protocole comportemental "augmente le bien-être des animaux".

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA), caractérisés par des déficits de flexibilité comportementale, résultent parfois d'une mutation monogénique de gènes codant pour les protéines d'échafaudage interagissant avec les récepteurs synaptiques, régulant l'équilibre entre stabilité et plasticité de la force des connexions synaptiques (plasticité synaptique). L'équilibre entre plasticité et stabilité synaptique constitue probablement une base neurale de la "flexibilité" :la capacité à apprendre vite quand l’environnement change, mais à ne pas forcément changer de croyances quand l’environnement est stable. La flexibilité comportementale est un processus central au développement social et cognitif typique des individus, et est fortement altérée dans les TSA. Nous testerons le lien entre les protéines d'échafaudage liées aux TSA, la plasticité neuronale dans le cortex préfrontal, et la flexibilité dans un contexte d'apprentissage.

Bénéfices attendus

Précisement, nous déterminerons: - le rôle causal des aires préfrontales dans la flexibilité - le codage au niveau neuronal de la flexibilité dans les différentes aires préfrontales - le rôle de l'échauffadage des synapses glutamatergiques (protéine "Shank3") dans ces processus.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des neurochirurgies. La durée de l'opération est de 45 minutes à 1h30, avec toutes les précautions possibles pour éviter la douleur (anesthésie gazeuse, anesthéisques locaux, morphiniques en péri-opératoire). Les seules manipulations quotidiennes consisteront en un branchement des implants à électrodes (geste non douloureux). Des injections intra-péritonéales seront réalisées pour certains animaux (4 injections par animal sur la totalité de l'expérience). Le reste des procédures implique des tests comportementaux de type "jeux de décisions", basés sur des récompenses, et décrits comme positifs pour le bien-être animal dans la littérature.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir (artefacts moteurs) et troubler l'activité locomotrice (un mouvement incontrolable mais non douloureux comme lever une patte ou tourner un peu la tête). Les animaux d'une des procédures auront des contentions (pour lesquelles ils seront habitués en douceur) en vue d'injections intrapéritonéales sur quatre jours. La lignée de souris ne présente pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour vérifier que les sites stéréotaxiques d'injection et d'implantation sont corrects.

Remplacement

Nous cherchons à évaluer le rôle des neurones pendant le comportement de décision, il est donc impossible de remplacer les méthodes in vivo par des methodes in vitro.

Réduction

Nous avons déjà effectué des expériences similaires (pour étudier d'autres zones cérébrales) ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire. De plus nous développons un modèle informatique de réseau de neurones récurrent capable de modéliser la prise de décision. L'activité électrique des neurones y est fonction des connexions synaptiques, qui elle-mêmes évoluent en fonction de l'activité électrique des neurones et des récompenses reçues par l'animal (plasticité synaptique). ce modèle fournira des prédictions précises sur ce qu'il est important d'enregister comme activité électrique, ce qui réduit le nombre d'animaux.

Raffinement

Pour diminuer et abolir les douleurs chirurgicales, nous utilisons une combinaison d'anesthésiques et d'anti-inflammatoires pendant la chirurgie et en péri-opératoire. De la pommade antifongique ainsi que du désinfectant seront appliqués pour prévenir les infections. Nous stopperons les expériences d'optogénétique en cas d'artefact locomoteur. Le protocole sera interrompu si les points limites définis sont atteints, à savoir une perte de poids durable de l’animal, des signes de souffrances évalués par l’échelle Mouse Grimace Scale et une prostration, malgré les mesures prises. Nous tiendrons une feuille de suivi post-opératoire sur les deux jours suivant l'opération pour évaluer rapidement ces points. Le stress de l’animal sera limité par un enrichissement permanent de l’environnement (igloos, tunnels, nesting), ainsi qu’une habituation quotidienne à l’expérimentateur/rice et à la salle expérimentale. Le protocole de comportement consiste en un jeu de décisions et augmente le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le système de décision (circuit mésocorticolimbique) est plus proche anatomiquement et fonctionnellement entre mammifère (rongeurs et Humains) qu'entre mammifères et invertébrés, poissons ou oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux. Enfin, nos tâches comportementales de type "jeux" ont été spécifiquement développées et adaptées à l'étude des prises de décision de la souris, tout en assurant leur bien-être. Ce projet implique d'utiliser des groupes de souris de même stade de développement (8 semaines) qui est un stade classique dans les études sur les prises de décision (8 semaines étant considéré comme le début de l'âge adulte dans cette espèce).

Une perte de 20 pour cent du poids en une semaine met fin au protocole. 54 souris porteuses d'une mutation du gène de la titine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la mutation provoquant chez elles faiblesse musculaire et troubles respiratoires ou cardiaques. Elles passent une vingtaine de minutes sous anesthésie gazeuse pour une mesure de pression artérielle et un test respiratoire, puis une trentaine de minutes sous anesthésie générale pour un test de force, à l'âge d'un an. La cohorte de quarante animaux sera tuée pour prélever organes et tissus, et le porteur précise que les animaux qui les ont engendrés le seront aussi, la lignée n'étant pas maintenue.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous allons caractériser un modèle souris qui développe une myopathie avec des problèmes respiratoires graves. Cette myopathie représente 65% des cas mondiaux de myopaythies héréditaires avec insuffisance respiratoire précoce. L’étude de ce modèle souris permettra de mieux comprendre les causes de la maladie et pourra ainsi servir pour des essais de traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

L étude de ce nouveau modèle de souris myopathe nous permettra de mieux comprendre cette maladie et en particulier d 'étudier l 'importance de l 'activité respiratoire et cardiaque. Toutes ces nouvelles connaissances nous permettront d 'envisager de nouveaux traitements mieux ciblés qui seront d 'un grand bénéfice pour les patients atteints de cette myopathie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d' une vingtaine de minutes dans un premier temps et à une mesure de la pression artérielle (phénotypage cardiaque) puis à un test respiratoire (plethysmographe). Ensuite ils subiront une anesthésie générale d 'une trentaine de minutes pour le test de la force musculaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle animal, les mâles et les femelles sont affectés avec une sévérité modérée (faiblesse musculaire, problèmes respiratoires et /ou cardiaques) ce qui peut générer un inconfort. Tous les animaux expérimentaux seront isolés temporairement ce qui peut générer un stress. L’induction de l’anesthésie nécessite la contention de l’animal peut générer un stress et/ou un inconfort. L’injection d’anesthésique peut induire une douleur ou un inconfort.

Devenir

Après la mesure de la force musculaire , les animaux de la cohorte (40) seront euthanasiés en vue de prélèvements d 'organes et de différents tissus. Les animaux ayant servi à la production de la cohorte seront également euthanasiés ( pas de maintien de la lignée).

Remplacement

Pour caractériser cette maladie ( myopaythie héréditaire avec insuffisance respiratoire précoce) et évaluer l’impact de cette mutation, nous souhaitons étudier le modéle souris porteur de cette mutation. Ce modèle étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et les conséquences de cette mutation. D’autre part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, respiratoire et cardiaque seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développerait pas et le bénéfice de la force musculaire, la fonction respiratoire et cardiaque ne pourraient pas être mesurées (REMPLACEMENT).

Réduction

Plusieurs tests seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en générant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests cardiaques et respiratoires, peu invasifs, offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en utilisant les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. Nos connaissances sur ces modèles animaux mutants et les études réalisées auparavant montrent que 10 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante et statistiquement valable. Nous prévoyons 54 animaux pour cette étude (REDUCTION).

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des faiblesses musculaires modérées apparaissaient, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage (interaction sociale). Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage pour faciliter l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration ou problèmes de déplacements. Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés et pesés une fois par semaine; une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Afin de diminuer le stress lié à aux diférents tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.(RAFFINEMENT).

Choix des espèces

La souris est une des seules espèces assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir un modèle de HMERF, une pathologie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherches dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe, ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec d'autres études et de mieux comprendre le pathomécanisme de cette maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier la fonction cardiaque, la fonction respiratoire et la fonction musculaire. Pour caractériser le phénotype de ces souris, les animaux seront étudiés à l âge d 'un an, ce qui correspond environ à la moité de la vie d 'une souris, sachant que chez l homme la pathologie se déclare vers 35/40 ans (envion demi- vie également)

Le bord de la paupière est incisé puis suturé sur un œil de ratons qui n'ont pas encore ouvert les yeux, intervention de dix minutes sous anesthésie gazeuse et analgésie oculaire locale. Douze rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour prélever le tissu cérébral. L'œil reste fermé quatre, sept ou dix jours pour reproduire l'amblyopie humaine, la mère tentant régulièrement d'arracher les points sur ses petits, ce qui conduit le porteur à prévoir 25 pour cent d'échec. Le stade choisi correspond aux jours 13 à 24 après la naissance, période où le fonctionnement du système visuel dépend le plus de l'expérience visuelle.

Objectifs

Notre projet est de comprendre la capacité de transformation (plasticité) des neurones lors de l’adaptation à une différence de vision entre les deux yeux dans l’enfance afin de mieux traiter l’amblyopie, une perte de vision d’un œil, l’une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Ce n’est pas une maladie de l’œil, l’œil étant fonctionnel. Elle est due à une perte de la capacité des neurones à répondre aux signaux visuels en provenance de l’œil le plus faible ou déviant. L’acuité visuelle à la naissance est faible à cause de l’immaturité du système nerveux. Pendant une période précoce, chez le petit enfant où la capacité du système nerveux à se modifier en fonction de l’expérience du monde environnant est la plus grande, des différences de réfraction, d’alignement entre les deux yeux ou une opacité d’un œil amènent à un défaut de fonctionnement des neurones excités par les signaux provenant de l’œil faible. Le traitement, seulement possible avant 6-7 ans, se fait d'abord en corrigeant le défaut visuel, puis en rééduquant l’œil amblyope par pénalisation de l’œil dominant. Ce projet propose de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires des transformations neuronales induites par des signaux visuels discordants entre les deux yeux au cours du développement neuronal en mimant l’amblyopie sur le jeune raton, par suture d’une paupière avant l’ouverture des yeux.

Bénéfices attendus

L’amblyopie est un déficit visuel fonctionnel chez l’humain qui, s’il n’est pas traité dans une période de temps limité, avant 6-7 ans, est irréversible. C’est la principale cause de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes neuronaux à l’origine de la perte de réponse du cerveau aux stimuli visuels dans l’objectif d’allonger la fenêtre thérapeutique au-delà de l’enfance.

Procédures

Le bord des paupières d’un œil de l’animal seront suturés avant l’ouverture des yeux. Le raton sera disposé sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Avant de procéder aux points de suture, une incision devra être faite sur le bord de la paupière pour permettre aux deux paupières de se coller l’une à l’autre durant le processus de cicatrisation. Après le réveil le raton sera remis à la mère. Durée totale de l’intervention : 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite à la procédure de privation visuelle monoculaire par suture des paupières, l’apparition d’effets indésirables sera contrôlée quotidiennement, en particulier : - risque d’infection au niveau des points de suture - risque d’arrachement des points de suture. Dans ces deux cas, l’animal sera écarté pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Devenir

Euthanasie préalable au prélèvement du tissu cérébral sur lequel seront réalisées les expérimentations.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est indispensable dans le cadre de ce projet dans la mesure où il est nécessaire de priver le système nerveux d’entrées sensorielles au cours du développement. L’utilisation de culture de neurones est donc naturellement exclue.

Réduction

• Les structures cérébrales étudiées ne présentant pas de différences entre mâles et femelles, nous utiliserons les animaux des deux sexes ce qui limitera le nombre d'animaux à euthanasier. • Le temps de suture de 10 jours est le plus délicat à obtenir sans ouverture de l’œil, car il est connu que les sutures se relâchent au bout de quelques jours et que la mère des ratons tente d’enlever les points sur les petits non sevrés. Le travail étroit avec un vétérinaire qui interviendra et formera le personnel permettra de réduire le nombre d’essais et donc de réduire le nombre d’animaux. Notamment l'incision du bord de la paupière qui sera entrepris permettra une fermeture pérenne de la paupière supérieure avec la paupière inferieure et donc une diminution du taux d’échec et du nombre d’animaux. • L'analyse de l'expression des gènes nécessitera peu de tissu animal. A partir d’un cerveau de rat congelé, une quarantaine de coupes fines seront obtenues. Nous aurons besoin pour atteindre une significativité statistique pour chaque temps de privation monoculaire de lumière de 3 rats suturés pour chacune des 3 durées de suture. Nous prévoyons d’après notre expérience passée 25 % d’échec du maintien de la fermeture de l’œil. Nombre de rat = 3 rats suturés pour chacune des 3 durées (4, 7, et 10 jours) = (3 x 3) + 25 % = 12 rats

Raffinement

Pendant la suture de la paupière, les ratons seront maintenus sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Les ratons seront remis sous la mère immédiatement après le réveil post-anesthésie, et surveillé quotidiennement par un personnel expérimenté. Vérification sera faite que la mère les reprendra bien en charge lors du change des cages. Ils seront observés quotidiennement pour vérifier qu’ils sont bien nourris, que les sutures sont en place et bien tolérées. Nous utiliserons des morceaux de papier ciselé comme matériaux de nidification, des bûchettes en peuplier pour répondre aux besoins naturels des rongeurs ainsi que des tunnels en cartons pour réduire l‘ennui et diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité aux animaux. Les animaux auront libre accès à la nourriture et à l’eau, seront maintenus à une température et une hygrométrie ambiante contrôlées avec un cycle lumière/obscurité artificielle de 12 h. En cas de problème lié à la suture (par exemple une infection) l’animal sera écarté du lot pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus utilisé comme décrit actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux de la plasticité du système visuel. Entre les jours 13 et 24 postnataux, pendant la période critique de développement au cours de laquelle le fonctionnement du système visuel est particulièrement dépendant de la qualité de l’expérience visuelle dont bénéficie le sujet.

1 708 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe un diabète de type 2 sous régime riche en glucides et en lipides, avant de subir une chirurgie de trente minutes qui retire un volume de muscle et y implante un biomatériau, la plaie étant refermée par des sutures. Après cicatrisation viennent un test de course sur tapis de vingt minutes et une mesure de force musculaire sous anesthésie, le porteur signalant que la perte de mobilité postopératoire rend l'accès à la nourriture et à l'eau difficile. Les biomatériaux ont déjà passé des preuves de concept in vitro et ex vivo, ce que le porteur reconnaît avant de conclure qu'un "modèle physiologique complexe" reste nécessaire.

Objectifs

La perte musculaire volumétrique (VML) peut résulter de traumatismes ou de chirurgies (tumeurs, infections), affectant aussi bien les civils que les militaires. Elle entraîne des déficits fonctionnels et esthétiques permanents. Lorsque la fibre musculaire est endommagée ou lorsque la VML dépasse 20% de la masse musculaire, le tissu perd sa capacité à se régénérer, et une fibrose se développe, réduisant la fonctionnalité musculaire. La régénération musculaire repose sur l’action des cellules souches musculaires activées par l’inflammation pour reconstruire les fibres musculaires endommagées. Cependant, chez les diabétiques, la cicatrisation musculaire est ralentie par des mécanismes comme l’hyperglycémie, qui altère la microcirculation et diminue l’apport en oxygène. Il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. Pour traiter ces lésions, l’ingénierie tissulaire utilise des biomatériaux qui imitent la matrice extracellulaire naturelle pour soutenir les cellules et favoriser la formation de nouveaux tissus, tout en limitant la fibrose. Ce projet se concentre sur la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en utilisant des biomatériaux innovants.

Bénéfices attendus

Actuellement les lésions musculaires dues à des traumatismes, infections ou tumeurs sont mal tolérées par le muscle et entrainent des douleurs et une perte de fonctionnalité. Cette étude nous permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales afin de réparer ces lésions musculaires chez le patinent non diabétique et diabétique.

Procédures

Les souris subiront au maximum un prélèvement de sang à la queue pour une glycémie, une chirurgie musculaire sous anesthésie générale de 30 minutes, un test de performance de course sur tapis après cicatrisation de 20 minutes maximum, un test de mesure de force musculaire sous anesthésie générale + analgésie de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Ci-dessous sont listés les étapes induisant des nuisances sur les souris lors des procédures. Douleur : chirurgie musculaire et implantation du biomatériau. Faim/soif : Mise à jeun de 4h, perte de mobilité après la chirurgie, difficulté à atteindre la nourriture et le biberon. Stress physique : Anesthésies médicamenteuse et gazeuse, plaies (présence de points de sutures sur la peau), réalisation des tests de fonctionnalité musculaire (test de performance de course sur tapis), diabète.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des muscles opérés (pour l'histologie) ne permet pas de garder les souris en vie.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre de caractériser la cicatrisation histologique et la récupération de la fonctionnalité musculaire.

Réduction

Dans un premier temps la réalisation du geste chirurgical sera validée sur un groupe restreint de souris. Ensuite le projet a été conçu de manière à ne pas répéter les groupes témoins. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’outils statistiques. En nous appuyant à chaque fois sur les résultats précédents, nous pourrons identifier les conditions optimales de manipulation, ce qui permettra de limiter le nombre de groupes et de variations expérimentales. Cela contribuera à réduire le nombre de souris utilisées tout en garantissant la pertinence des résultats.

Raffinement

Afin de gérer la douleur des souris, elles recevront une dose d’analgésique avant la chirurgie musculaire et l’implantation du biomatériau, puis une deuxième injection après l’acte chirurgical et une fois par jour pendant 2 jours. La chirurgie musculaire sera réalisée sous anesthésie générale et une anesthésie locale sera appliquée sur la plaie. Les souris seront suivies et pesées tous les jours après la chirurgie avec ajout de nourriture humide et d’hydrogel dans la cage.

Choix des espèces

Au cours de ce protocole, nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes à proportion égale âgées d’au moins 8 semaines, connues pour développer un diabète de type 2 à la suite d’un régime riche en glucides et en lipides. La cicatrisation musculaire chez la souris présente des similitudes notables avec celle chez l'humain ce qui fait de cette espèce un modèle pertinent pour ce projet.