Rongeurs

Jusqu'à vingt séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse par animal, une injection de cellules cancéreuses dans l'oreille, l'ablation de cette oreille si la tumeur grossit trop vite, puis une injection dans la rate. 724 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, y compris celles dont la tumeur régresse. Les métastases hépatiques attendues peuvent provoquer douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et perte de poids, et chaque animal reçoit en plus une injection de médicament tous les deux jours pendant quatre à huit semaines. Le choix de la souris est justifié par un contexte immunitaire complet et par des molécules cibles que le porteur décrit comme conservées à 100 % chez l'humain, les animaux étant utilisés à six ou sept semaines pour limiter les variations physiologiques.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur qui se développe à partir de cellules épidermiques appelées mélanocytes. Bien qu’il ne représente qu’environ 1% des cancers cutanés, le mélanome est responsable de 75% des décès dus aux cancers de la peau. L’agressivité du mélanome est liée à son très fort potentiel métastatique et à la capacité de ces cellules cancéreuses à proliférer dans les organes vitaux, notamment le foie. Il est donc crucial de comprendre quels sont les mécanismes qui gouvernent le développement des métastases, pour envisager des traitements qui bloqueront ou ralentiront la progression tumorale dans les organes vitaux. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous avons mis en place une méthode qui nous a permis d’identifier des gènes impliqués dans le développement des métastases pulmonaires et nous souhaitons maintenant étendre cette méthode aux métastases hépatiques. Les mélanomes utilisent des signaux produits localement dans chaque organe pour stimuler leur croissance. Empêcher les mélanomes de percevoir ces signaux, devrait en théorie prévenir leur croissance. Dans le but de tester cette hypothèse, nous avons mis au point un système qui permet d’éteindre individuellement l’expression d’une sélection de gènes impliqués dans la réception des signaux stimulant la croissance des mélanomes. Grace à cette méthode, nous avons pu déterminer quels sont les récepteurs qui sont responsables de la croissance des mélanomes dans les poumons. Nous souhaitons maintenant étendre notre étude au foie car le mélanome conduit fréquemment à des métastases dans cet organe. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome ainsi que la réponse anti-tumorale. Le modèle cellulaire choisi récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique chez les souris . Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un anti-douleur pourra être administré et un enrichisement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage. Pour réduire le nombre d'animaux, une étude statistique préliminaire a été réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’implication des gènes étudiés dans la croissance des métastases de mélanomes. Il permettra d’identifier précisément quels récepteurs sont utilisés lors de la colonisation spécifique du foie. Ces gènes ont un potentiel thérapeutique formidable puisqu’environ 40% des médicaments sur le marché sont des agonistes ou antagonistes de ces récepteurs. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé (stade 2 à 4) mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.

Procédures

Injection de cellules dans l'oreille 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Procedure chirurgicale d'ablation de l'oreille (uniquement si la tumeur atteint un certain volume avant l'apparition des métastases) sous anesthésie gazeuse, une seule fois, durée maximale 30 min. Injection de cellules 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Injection de cellules en dans la rate : 1 par souris sous anesthésie générale, durée maximale 20 min. Injection de médicaments : 1 fois tous les deux jours après anesthésie locale (Lidocaïne) pendant 4 à 8 semaines (en fonction des résultats). Anesthésie gazeuse pour imagerie, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant au maximum 10 semaines soit 20 séances maximum, durée maximale des procédures.

Impact sur les animaux

Les animaux auront des nuisances légères dues aux injections sous anesthésie locale ou générale dans le derme (flanc (anesthésie locale), ou oreille (anesthésie générale)) ou dans la rate (anesthésie générale). Avant l'anesthésie, une analgésie adaptée sera administrée. L'excision d'une oreille sous anesthésie générale avec analgésie pourra entraîner une gêne et un handicap modérés. La croissance de tumeurs dans le derme peu entraîner une gêne physique et des douleurs modérées. La croissance de tumeur dans la rate peut entraîner des symtômes de douleur abdominale modérée. L'apparition de métastases hépatiques peut entraîner des symptômes de gravité modérée: douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et éventuellement perte de poids.

Devenir

Tous les animaux ayant reçu une injection de cellules seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils développeront tous potentiellement des tumeurs et des métastases. Pour les animaux pour lesquels on observerait une régression tumorale, ils seront aussi euthanasiés car on ne peut pas éliminer la possibilité d'une reprise de la tumeur et/ou une progression lente. Tous les animaux ayant été utilisés pour la procédure de détermination de la dose maximale d'antagonistes seront aussi euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme entier (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Enfin, notre projet offre une opportunité thérapeutique qui justifie la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.

Réduction

Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficicacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire permet d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les étapes de validation des gènes d'intérêt et l'étude de leur effets sur la croissance primaire et pour l'étude des effets des antagonistes. De même, seuls les gènes d'intérêt validés seront étudiés par la suite. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses d'antagonistes seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. De même, une période de wash out sera observée entre l'injection de deux doses lors de l'évaluation de la dose maximale tolérée , ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont observés tous les jours par le personnel de l'équipe de recherche. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Un score de contrainte est établi en observant le comportement des animaux toutes les semaines. Des points limites pour traitement ou arrêt ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront anesthésiées lors des différentes procédures. Si des métastases hépatiques se développent, nos méthodes de suivi (palpation abdominale et luminescence) nous permettront d'arrêter le procédure à un stade de gravité modérée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser le modèle de la souris pour étudier les mécanismes de développement de métastases de mélanome. L'utilisation de ce modèle nous permet d'être dans un contexte immunitaire complet. Ce modèle nous a déjà permis d'identifier des molécules impliquées dans la croissance métastatique du mélanome dans les poumons. D'une part, le modèle cellulaire choisis récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique. D'autre part, les molécules identifiées chez les souris sont 100% conservés chez l'homme. Nous souhaitons utiliser les souris à maturité sexuelle, adulte, de 6 à 7 semaines, jeunes adultes. En effet, le développement de la souris entraîne des variations d'expression géniques, hormonaux, des changements physiologiques qui peuvent avoir des effets sur l'expression des gènes étudiés et donc biaiser nos résultats. Nous souhaitons limiter les variations de ceux-ci et pouvoir standardiser au maximum la physiologie des souris à un jeune âge.

Isolés en cage individuelle et placés en cycle inversé, des rats sont conduits à boire de l'alcool au fil d'environ 80 sessions de trente minutes. Après une soixantaine de sessions d'habituation, six sessions associent la recherche d'alcool à des stimuli aversifs, pour séparer ceux qui continuent malgré le signal négatif de ceux qui s'arrêtent. Vient ensuite une chirurgie cérébrale d'au plus quarante minutes sous anesthésie et analgésie, puis trois semaines d'attente avant l'analyse. 376 rats sont engagés dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 276 sont tués pour prélever leur cerveau, et les 100 autres, ceux qui n'ont pas assez d'appétence pour l'alcool, sont proposés pour servir à des formations à l'expérimentation animale.

Objectifs

Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones produisant de la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau - par des approches génétiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).

Bénéfices attendus

Comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de la dopamine dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces qui sont inéxistantes à ce jour.

Procédures

La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à stimuli aversifs pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Les animaux utilisés dans ce projet auront ensuite des injections dans le cerveau (chirurgie sous analgésie et anesthésie générale pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui permettront au bout de trois semaines d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool.

Impact sur les animaux

L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’hebergement individuel des animaux pour cette expérimentation ont un impact d’ordre modéré sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont attendues liées à la chirurgie d’injection et aux des stimuli négatifs lors der derniers jours de consommation d'alcool. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.

Devenir

Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux soit pour analyse des tissues, soit pour analyse de l'activité des neurones après la mort. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt à cinquante pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères diagnostic des addictions).

Réduction

Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité comportementale seront relevés et les analyses des cerveaux de ces mêmes animaux prélevés en fin d’expérimentation permettront de déterminer également les pourcentages de neurones préférentiellement activés en fonction de nos conditions expérimentales. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base d'expériences similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cycle inversé et seront isolé pour répondre aux besoins experimentaux du projet. Cependant, les grilles des cages ainsi que les portoirs seront ouverts, et les cages seront proches les unes des autres, permettant le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux, ce qui limitera toute nuisance associée à un isolement plus strict. De plus ils recevront un enrichissement supplémentaire pour pallier cette individualisation. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés de la dessication par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi quotidien et les pesées quotidiennes des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des expériences.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à sept ou quatorze jours pour prélever les zones en cicatrisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux incisions de 2 mm sous anesthésie, l'une dans le dos, l'autre dans le palais, puis passe deux jours seule en cage, un isolement que le porteur reconnaît stressant pour un animal social. Les applications annoncées, au bénéfice de personnes brûlées ou porteuses de séquelles faciales, sont renvoyées au moyen terme, l'objet immédiat restant de comparer la cicatrisation du palais et celle de la peau. Sur le remplacement, le porteur écrit que la cicatrisation est "trop compliquée pour être reproduite en laboratoire" et qu'il faut donc l'étudier chez l'animal.

Objectifs

La gencive, muqueuse qui entoure les dents et recouvre l’os sous-jacent, est composée principalement de populations cellulaires appelées fibroblastes gingivaux (GF). Parmi ces populations, se trouvent des cellules souches gingivales (GSC) capable de se renouveler et de se transformer en différents types cellulaires. De plus, le tissu dont elles sont issues présente une cicatrisation complête, ne laissant aucune trace et se démarque par cette propriété des autres tissus conjonctifs de recouvrement (notamment de la peau). Les GSC, facilement recueillies chez les patients adultes, peuvent s'adapter à différents environnements du corps et influencer le système immunitaire, ce qui en font un outil de choix pour la thérapie cellulaire. De plus, la biopsie indolore n’entraine ni cicatrice ni problème fonctionnel. Ces cellules, qui seraient dérivées des crêtes neurales, sont utilisées avec succès en dermatologie et en cardiologie. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules participent à la guérison cutanée et comment les utiliser en thérapie. Elles seront ainsi triées selon leur origine embryonnaire et leur contribution dans la cicatrisation sera étudiée. Des modèles de souris transgéniques seront utilisés pour suivre ces cellules et comprendre leur répartition dans différents tissus. Ces recherches pourraient ouvrir de nouvelles voies pour la reconstruction des tissus après des blessures graves ou des maladies.

Bénéfices attendus

Des travaux préliminaires sur ces modèles de souris transgéniques ont permis de faire une différence sur l’origine embryologique des cellules constituant la tête, de celles à l'origine du reste du corps. Ainsi notre idée serait de montrer que l'origine particulière des fibroblastes de la gencive est la raison essentielle de la cicatrisation complête et sans traces, dans la bouche. Pour cela, nous utiliserions ces modèles de souris transgéniques afin de déterminer la distribution des cellules selon leurs origines dans les tissus qui cicatrisent parfaitement, le palais, versus un référentiel moins performant, la peau. Le projet de recherche ici présenté a pour objectif de décrire les implications du fibroblaste gingival et des cellules souches associées pendant la cicatrisation complète et quasi parfaite. Les résultats de ces recherches permettront de mieux appréhender l’utilisation des fibroblastes gingivaux dans la réparation tissulaire par thérapies cellulaires. Nous espérons aussi pouvoir identifier des molécules responsables de cette régénération. Les applications à moyens termes pourraient profiter aux personnes présentant des traumatismes faciaux avec des séquelles cutanées ou patients présentant des brûlures importantes.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour la chirurgie. Deux incisions cutanées de 2mm seront réalisées. L'une se situera dans le dos, l'autre dans le palais. Nous estimons réaliser l’ensemble de ces gestes en moins de 5 minutes pour chaque animal. Ces incisions seront réalisées sur la totalité des animaux, soit 42 souris. Un traitement analgésique de plusieurs jours sera systématiquement mis en place pour anticiper l’apparition de douleurs post opératoires possibles. Du fait d'une aggressivité possible et reconnus chez les souris après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle durant 2 jours. Les souris seront euthanasiées et les prélévements seront réalisés à 7 et 14 jours

Impact sur les animaux

A l’âge adulte, les animaux subiront un acte de chirurgie rapide impliquant deux biopsies (punch). Cet acte pourra induire des contraintes liées à l’anesthésie elle-même (stress thermique, risque de détresse respiratoire, etc.) et pourra induire une douleur post-opératoire malgré la prise en charge de la douleur associé à la cicatrisation (irritation, inflammation, etc...). De plus, la plaie créée dans le palais, ainsi que la gêne qu’elle occasionne, pourrait entraîner une perte de poids. Enfin, afin d’éviter des comportements agressifs après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement durant 2 jours ce qui impliquera un stress social pour ces animaux sociaux.

Devenir

Aux différents temps défini post-chirurgie, nous allons récupérer les zones en cicatrisation (après 7 jours de maintien) ou cicatrisées (après 14 jours de maintien) pour effectuer les analyses nécessaires afin de répondre à la question scientifique. L’euthanasie des animaux est donc de ce fait inévitable.

Remplacement

La cicatrisation est un processus complexe qui se déroule en plusieurs phases : inflammation, formation de nouveaux vaisseaux sanguins (angiogénèse) et mobilisation de cellules spécifiques. Ce processus est trop compliqué pour être reproduit en laboratoire. Pour comprendre le rôle des fibroblastes (des cellules importantes pour la cicatrisation), il faut étudier ce processus chez l'animal. Cela permet d'observer toutes les cellules et les étapes impliquées dans la cicatrisation de manière naturelle.

Réduction

À la fin de cette étude, nous analyserons les échantillons de deux manières différentes. D'abord, une analyse qualitative en histologie examinera les sites prélevés aux jours 7 et 14 sur les deux lignées transgéniques. Ensuite, une analyse quantitative aux jours 7 et 14 également, mais qui ne portera que sur l'une des deux lignées. Étant donné que le marquage fluorescent ne modifie pas l'expression génique des cellules, nous ne prévoyons pas de différences entre les résultats des deux lignées. Par une approche statistique appropriée à notre étude, nous avons déterminé la taille des groupes nous permettant d’avoir une force statistique adéquate tout en respectant les considérations éthiques en matière de nombre d'animaux. Ainsi, il nous faut comparer 7 échantillons de palais à 7 échantillons de dos pour les deux temps d’arrêt et les deux types d’approches. De plus, comparer les deux sites chirurgicaux chez le même animal renforce la validité statistique de l'étude tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. L'étude portera sur un total de 42 animaux.

Raffinement

L’ensemble de la procédure sera réalisé sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique pré et post opératoire durant une surveillance accrue de deux jours. Les deux actes chirurgicaux seront réalisés sur un temps court inférieur à 5 min. L’hébergement se fera en cages individuelles avec enrichissements (maisonnette ou tunnel plus radeau) durant 2 jours maximum et les cages positionnées côte à côte pour que les animaux se voient. Les conditions de stabulations seront conforment à la réglementation. Exceptionnellement, la litière sera faite de carrées de cellulose, moins agressif pour les plaies. Les animaux recevront en plus un régime alimentaire sous forme de gel nutritif ainsi que de l'eau par abreuvement automatique. Des points limites ont été définis sur le poids des animaux qui sera mesuré quotidiennement jusqu'à 14 jours (semaine et week-end). Un traitement analgésique sera lancé si une perte inférieure à 20 pour 100 du poids de l’animal est observée. Au delà de cette valeur, l’animal sera euthanasié pour limiter sa souffrance. La mise en évidence de signes de contamination de la plaie ou de signes cliniques observés au cours du suivi sera prise en compte (apparence, posture, appétit, poids corporel, respiration, plaie) pour l’arrêt de l’expérimentation et l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

La souris possède des similarités morphologiques avec son homologue humain, elle représente donc le modèle le plus adapté pour réaliser des plaies. De plus, dans les limites de la réglementation, ce modèle facilite l'utilisation d'un nombre suffisant d'échantillons pour permettre la collecte de données statistiquement significatives. Enfin, par rapport au rat, la disponibilité des modèles génétiquement modifiés est moins restrictive. Les outils biologiques pour l'exploration des échantillons sont plus facilement utilisables sur cette espèce. Les souris utilisées seront des souris adultes ayant terminé leur croissance. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi des animaux âgés de 3 mois. De part la difficulté à avoir assez d’animaux double mutants, nous utiliserons les souris des deux sexes. Nous essayerons de répartir au maximum les deux sexes aux deux temps d’arrets (après 7 jours et 14 jours de maintien) et que cette répartition soit similaire pour les deux lignées.

1 019 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir douze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, douze à seize jours d'isolement pour la mesure du métabolisme et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et commencent par une chirurgie cérébrale de vingt minutes sous anesthésie générale, suivie d'injections dans l'abdomen. Certaines lignées développent à partir de neuf mois des problèmes musculaires ou une paralysie, que le porteur présente comme une caractéristique de la lignée. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, muscle, tissu gras et foie, la question posée étant de relier le dérèglement du métabolisme à la maladie d'Alzheimer.

Objectifs

Les maladies liées à l'âge constituent l'un des principaux défis des sociétés modernes, à mesure que l'espérance de vie augmente. C’est notamment le cas des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la plus répandue dans le monde. Malgré des avancées importantes, les mécanismes pathologiques de la maladie d’Alzheimer restent mal compris et les options thérapeutiques insatisfaisantes. De nombreux éléments suggèrent que la maladie d’Alzheimer n'est pas seulement caractérisée par un dysfonctionnement neurologique mais également par des troubles métaboliques. Un dysfonctionnement métabolique est un trouble du corps qui perturbe la manière dont il transforme les aliments en énergie, pouvant mener à des maladies telles que le diabète ou l'obésité. Ce projet vise à comprendre comment la dérégulation du métabolisme est liée aux maladies neurodégénératives. Pour atteindre cet objectif, nous allons caractériser l'impact du dysfonctionnement métabolique sur la progression de la neurodégénérescence chez des modèles animaux de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Nous étudierons également la régulation du métabolisme au cours de la progression de la neurodégénérescence chez ces modèles. Afin de prendre en compte des facteurs liés au sexe et au stade de développement de la maladie, l’étude sera menée sur des mâles et des femelles, et sur des groupes ayant deux âges différents. Enfin, nous proposons de valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la maladie par imagerie. Le projet se déroulera dans 2 Établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre l’implication du contrôle métabolique sur les mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence et vice-versa. À plus longue-terme, nous espérons que ces connaissances aideront à révéler de nouvelles perspectives thérapeutiques, ciblé sur l’amélioration de la fonction métabolique, pour prévenir ou ralentir le déclin cognitif liée à la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. Enfin, nous espérons valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la neurodégénérescence par imagerie, ce qui pourra réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la recherche préclinique à l’avenir.

Procédures

- Chirurgie sous anesthésie générale et analgésie afin d’injecter des composés dans le cerveaux (durée: 20 minutes) - Détermination du poids, da composition corporelle et de la fonction métabolique sur souris vigile (durée : 4 jours). - Isolement des souris pour l’étude individuelle de la fonction métabolique (durée: 12 a 16 jours). - injection péritonéale sur la souris vigile (1-3 injections par souris ; durée : 30 secondes). - Prélèvement de sang sur animaux vigiles, par incision du bout de la queue. Fréquence : 12 fois par souris, reparti en 6 fois à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h ; et 6 fois une semaine après, à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h. - Imagerie de la souris sous anesthésie générale (4-12 fois par souris, 1 fois / semaine sur 1 ou 3 mois; durée : 3 minutes). L’étape de chirurgie se déroulera dans l’établissement EU1 puis, les analyses de la fonction métabolique et l’imagerie se feront dans l’établissement EU2. Les deux établissements sont attenants.

Impact sur les animaux

- Douleur locale transitoire après injection et en post-opératoire ; - Après la chirurgie, il est possible que certains animaux développent une infection, présentent des problèmes de cicatrisation, ainsi qu'une perte de poids ou du stress. - le transport des animaux du fournisseur vers l’animalerie et d’une animalerie à l’autre peut induire du stress. - Stress ou anxiété à cause de l’isolement pour la mesure de la fonction métabolique chez les souris en isolement - Certains animaux plus âgés (à partir de 9 mois) appartenant à l'une des lignées de souris utilisées peuvent développer des problèmes musculaires ou une paralysie, caractéristiques de cette lignée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (cerveau, muscle, tissu gras, foie) pour analyse des molécules clés dans la régulation du métabolisme et des protéines pathologiques liées au processus de neurodégénérescence.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique. Des expériences sur cellules ont déjà été réalisées et ont validé notre hippothèse sur l’effet inhibiteur des facteurs pathologiques sur la fonction métabolique et sur l’activité des cellules neuronales. Pour continuer notre étude, nous avons maintenant besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée du métabolisme en lien avec la progression des maladies neurodégénératives. Cela ne peut se faire que sur l’animal vigile. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques et des maladies neurodégénératives, car les modèles utilisés ont été générés chez la souris.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Les mesures de la fonction métabolique et d’imagerie de bioluminescence sont effectuées sur plusieurs jours sur le même animal, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Plusieurs mesures spécifiques seront prises pour minimiser les nuisances causées aux animaux, telles que : - anesthésie et analgésie pour limiter la douleur; - des mesures spécifiques pour éviter l'hypothermie; - des mesures spécifiques pour diminuer le stress et l’angoisse des souris pendant le transport des animaux entre les deux établissements; - les animaux sont hébergés groupés (sauf si une nécessité d’individualisation se présente), dans un milieu avec enrichissement approprié, et avec de la nourriture et d'eau ad-libitum; - Tout au long de la procédure, les souris seront observées quotidiennement conjointement par les soigneurs et/ou les expérimentateurs; - application de points limites stricts et spécifiques au projet; - Ce projet privilégie les techniques non invasives d'analyse métabolique globale et d'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce Mus Musculus a été choisie car plusieurs modèles de souris présentant des caractéristiques similaires à celles des patients atteints de maladies neurodégénératives ont été développés et validés. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude de la fonction métabolique car la régulation métabolique est similaire entre la souris et l’homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes (dans le contexte des maladies métaboliques et neurodégénératives) sur la souris est un atout majeur dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, lorsque leurs comportements alimentaires et locomoteurs, ainsi que leur masse, sont stables. Les souris seront utilisées à l’âge de 3, 6 et jusqu’à 9 mois. Ce choix se justifie par le fait qu’à l’âge de 3 mois les souris transgéniques sont à un stade précoce de la maladie, tandis que à 6 mois et 9 mois les troubles de mémoire et d’apprentissage sont bien documenté dans la littérature.

La restriction alimentaire imposée aux rats ne doit pas leur faire perdre plus de 15 % de leur poids, seuil au-delà duquel le porteur rétablit l'accès à la nourriture. 1 920 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine jugulaire posé en trente minutes, des injections intracérébrales et une fibre optique implantée en une heure et demie, et les femelles subissent un prélèvement vaginal quotidien pendant sept jours. Le projet cherche à savoir si la progestérone protège de la rechute à la cocaïne, un bénéfice thérapeutique pour l'humain que le porteur situe explicitement à long terme.

Objectifs

Les objectifs de ce protocole sont triples : - Premièrement, tester l’effet des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne - Deuxièmement, étudier comment l’activité des neurones d'une partie du cerveau, appelée insula, est modulée par les hormones sexuelles lors de la rechute à la cocaïne - Troisièmement, étudier si la manipulation de l’activité des neurones de cette partie du cerveau influence la rechute à la cocaïne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le rôle des neurones d'une partie du cerveaux (insula) dans l’effet protecteur des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne chez les rats mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement basé sur les hormones sexuelles qui sont déjà des molécules pharmacologiques approuvées par l’ANSM (Agence Nationale de la Santé et du Médicament).

Procédures

Les animaux subiront deux types d’intervention chirurgicales, la pose d’un cathéter dans la veine jugulaire qui durera 30 minutes et des injections intracérébrales ainsi qu’une implantation de fibre optique (durée 1h30) quand nécessaire pour enregistrer d’activité des neurones. Enfin, chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal (durée 10 secondes) quotidien. Les males seront manipulés de la même façon sans prélèvement pour éviter tous biais expérimentaux.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer des douleurs post-opératoires au niveau des sites d’incision, l’injection, ou d’implantation de matériel (crâne, cou, abdomen). La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors des premières sessions, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent un poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivité des animaux qui disparaît 1 heure après la fin de la prise de drogue. La littérature ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne et il n’y a pas de syndrome de sevrage (tremblement, perte de poids) dans les modèles animaux de prise de cocaïne. La restriction alimentaire engendre une perte de poids de l’animal qui sera contrôlée quotidiennement par l’expérimentateur. Cette restriction ne devrait pas engendrer plus de 15% de perte de poids par rapport au poids initial, si la perte de poids dépasse 15% alors l’animal aura accès immédiatement à la nourriture ad libitum et ne subira pas d’autre privation tant qu’ils n’auront pas repris leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous avons utilisé un logiciel statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure en prenant en compte la quantité de conditions expérimentales pour chacune d’elle. Nous utiliserons ainsi 1920 animaux sur cinq ans.

Raffinement

Hébergement en cages collectives pour limiter le stress de l’isolement. Réduction au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour raisons expérimentales (dérogation 4.5). Les cages seront enrichies en nid cotonné et bois. Avant chirurgie et après anesthésie, un antalgique sera administré en sous-cutané (s.c.) afin d’éviter la souffrance opératoire. Un anesthésiant local en crème sera appliqué (en plus de l’anesthésie à l’isoflurane) 10 min avant l’incision. La chirurgie sera effectuée en conditions stériles. Si infection, le vétérinaire mettra en place un traitement antibiotique approprié. Après chirurgie, l’expérimentateur suivra quotidiennement l’animal (alimentation, qualité du poil, locomotion) et le pèsera 4 jours jusqu’à stabilisation. Du baume cicatrisant sera appliqué sur les sites d’incision si mauvaise cicatrisation. Si douleur post-opératoire : Points limites, critères d’arrêt : Stade 1 : Normal. Si perte de poids jusqu’à 10% du poids initial une injection s.c. de saline sera réalisée et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 2 : Perte de poids persistante 24h post chirurgie avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c. d’antalgique et de saline et nourriture humidifiée au sol. Stade 3 : Perte de poids qui persiste 48h avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c d’antalgique, de saline, et intrapéritonéale de glucose 5% et nourriture humidifiée au sol. Une seconde injection d’antalgique et de saline pourront être réalisées à 72h si pas d’amélioration. L’animal sera euthanasié si état prolongé au-delà de 72h sans amélioration. Stade 4 : Etat de l’animal ne pouvant être pris en charge par médication et engendrant de la souffrance, ou état non amélioré voire dégradé au-delà de 72h même avec prise en charge. Euthanasie immédiate par décapitation ou exsanguination si animal a réalisé des tests comportementaux nécessitant le prélèvement du cerveau pour analyses histologiques. Dans les deux, injection s.c. d’antalgique puis i.p. d’euthanasiant avant sacrifice. Afin que la restriction alimentaire impacte au minimum le bien-être, si perte de plus de 15% du poids initial (mesuré pendant 3j avant début de restriction), accès immédiat à la nourriture ad libitum sans privation tant que les rats n’auront pas repris leur poids initial. Le poids des animaux sera suivi durant les 5j d’acquisition.

Choix des espèces

Les rats sont un modèle largement utilisé pour l’étude des neurones impliquées dans les troubles de la consommation de drogues. L’administration de cocaïne est utilisée depuis de nombreuses années et largement décrit dans la littérature, et l’injection d’hormones sexuelles est une manipulation facile à conduire. De plus, les régions cérébrales d’intérêt de notre étude possèdent la même structure chez le rat que chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones des aires cérébrales ciblées matures. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux âgés de 10 semaines.