Rongeurs
Caractérisation de l’effet d’un pesticide sur les cellules d’origine d’un cancer pédiatrique musculaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour vérifier si des cellules neuronales embryonnaires transformées donnent des tumeurs du muscle, et si un pesticide favorise ce basculement, 250 souris de six semaines reçoivent une greffe dans la patte. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, sans possibilité d'être réutilisées. L'épaisseur de la patte greffée est mesurée deux fois par semaine sur animal vigile, jusqu'à seize fois, et le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer une douleur modérée. La mise à mort est déclenchée par l'atteinte de points limites décrits comme précoces et prédictifs d'un mal-être, et le porteur annonce l'ajout de nourriture humidifiée au fond de la cage au cas où les souris auraient des difficultés à se déplacer.
Objectifs
Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre leurs origines et leurs particularités moléculaires pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers du muscle observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules neuronales, sous l’effet de facteurs environnementaux et/ou génétiques. Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers du muscle dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Par ailleurs, l’exposition de ces cellules aux pesticides favorise leur potentiel tumoral. Il faut maintenant vérifier que les cellules neuronales transformées donnent des tumeurs dans les muscles. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être l’origine de certains cancers pédiatriques.
Procédures
Injection anti-douleur / analgésie avant la greffe (Nombre : 1 fois maxi - Durée : 30 s). Anesthésie lors de la greffe (Nombre : 1 fois au moment de la greffe tumorale - Durée : 5 min) Pesée en début de procédure puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 30 s). Mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte controlatérale avant la greffe puis 2 fois par semaine (Nombre : 16 fois maxi - Durée : 1 min).
Impact sur les animaux
Avant l’implantation intra-musculaire (IM), l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. L’implantation IM sous anesthésie quant à elle entraîne une douleur légère. Le suivi de la prise tumorale va engendrer un stress léger lors de la mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Le développement de tumeurs peut engendrer une douleur modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou en cas d'atteinte de points limites. Les animaux ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences.
Remplacement
Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d'intervenir dans le potentiel tumorigénique de ces lignées cellulaires embryonnaires. Des études in vitro précédemment réalisées ne permettent pas de répondre aux objectifs.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les mutations d’intérêt. D’après les données de la littérature et notre expérience, le taux de prise de greffe sera de minimum 50%. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.
Raffinement
Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Une fiche de scoring sera également mise en place. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures. L'administration d’antidouleur, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présentent des difficultés à se déplacer.
Choix des espèces
L’utilisation de ce modèle souris est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral des cellules embryonnaires modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de s’affranchir du risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les cancers musculaires sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquels autant de jeunes femmes que de jeunes hommes sont touchés. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais liés au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines, âge optimale pour la prise de greffe d'après la littérature.
Autophagie et Cellules endothéliales : études préliminaires de l’utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) spécifiques des cellules endothéliales pour caractériser l’autophagie endothéliale dans un modèle murin d’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyses immunohistochimiques. Elles subissent la pose d'un cathéter caudal, puis une craniotomie de soixante-dix minutes qui suppose de dissocier le muscle masséter pour atteindre l'artère cérébrale moyenne et provoquer un accident vasculaire cérébral, avant une imagerie par résonance magnétique quatre ou vingt-quatre heures plus tard. Il s'agit d'une étude préliminaire, destinée à vérifier qu'un virus adéno-associé permet de visualiser l'autophagie dans les cellules des vaisseaux cérébraux, le porteur avançant qu'une telle mise au point limiterait ensuite l'utilisation d'animaux transgéniques. Sur le remplacement, il écrit que les techniques sans animaux ne sont "pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information" et retient la souris comme le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser les processus autophagiques mis en place par les cellules endothéliales lors d’un stress induit lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. Cette étude est une étude préliminaire afin d’évaluer la faisabilité de l’utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) pour permettre la transduction des cellules endothéliales in vivo et ainsi visualiser les flux autophagiques dans les cellules endothéliales à la suite d’un modèle d’AVC ischémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'autophagie endothéliale lors des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. De plus, la validation de l'utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) pour transduire les cellules endothéliales in vivo permettre de développer de futurs outils pour monitorer l'autophagie et ainsi limiter l'utilisation d'animaux transgéniques
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal d'une durée de 15 minutes et un chirurgie permettant l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 4h ou 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 14 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient des douleurs postopératoires après l’induction de l’AVC ischémique, notamment dû à la dissociation du muscle masséter pour procéder à la craniotomie. Les animaux sont susceptibles de perdent de la masse corporelle et de ressentir un stress après les anesthésies et l'induction du modèle d’AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (30 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 30 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Différents points limites ont été mis en place, évaluables à tout moment après l’injection d’AAV, ou évaluables après la chirurgie. De fait, nous veillerons à l’absence de signe de douleur extérieure, d’une respiration laborieuse, de roulements et de convulsions. Nous veillerons également à l'absence de toutes complications chirurgicales inattendues. Pour les animaux mis à mort à 24h post chirurgie, nous veillerons à ce que leur poids ne diminue pas de plus de 15% sur cette période. Nous veillerons à ce que l’animal réagisse correctement après la fin de l’anesthésie générale. 6h après la chirurgie nous effectuerons un rappel de buprénorphine (0.1mg/kg). Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est contrôlée et adaptée au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude de l’autophagie et de l’ischémie cérébrale. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les AVC ischemiques. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ceci se justifie par le fait que les AVC touchent principalement les adultes. De plus, les études antérieures sur les AVC concernent également des modèles murins adultes.
Étude du rôle de récepteurs spécifiques dans le traitement de l’information par les cellules cérébrales dans le modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune pouvant enchaîner jusqu'à vingt séances d'habituation puis trente-deux séances d'enregistrement d'une heure trente, tête immobilisée, et vivre en cage avec une plaque métallique fixée sur le crâne. L'implantation se fait sous anesthésie générale, après une injection dans une zone du cerveau, et le porteur indique que le dispositif peut gêner l'animal par son encombrement et limiter son comportement habituel. Toutes sont tuées, une partie pour les analyses post-mortem et les autres parce que leur modification génétique interdit de les réutiliser. L'objet immédiat est de comprendre comment des récepteurs NMDA participent au traitement de l'information visuelle, alors que les retombées annoncées, de nouvelles pistes contre la schizophrénie, l'autisme, la dépression ou la douleur chronique, sont renvoyées au long terme.
Objectifs
Notre projet de recherche vise à comprendre comment le cerveau traite les informations visuelles. Nous étudions des récepteurs spéciaux dans le cerveau, appelés récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information par les cellules cérébrales. Notre hypothèse est que les différences dans le fonctionnement et le nombre de ces récepteurs sur divers types de neurones, en particulier les interneurones, influencent grandement la façon dont notre cerveau traite ce que nous voyons. Nous pensons que ces variations sont essentielles au bon fonctionnement de nos réseaux cérébraux et à notre capacité à percevoir et comprendre le monde visuel qui nous entoure. Cette recherche pourrait nous aider à mieux comprendre certains problèmes de vision et potentiellement ouvrir de nouvelles pistes pour les traiter.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, le dynamisme, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, nous pensons que le dysfonctionnement du néocortex est à l'origine de déficiences cognitives et de troubles tels que la schizophrénie, l'autisme, la dépression, ou encore de symptômes de douleur chronique. Cependant, nous ne comprenons pas encore comment les circuits du cortex fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation d’animaux génétiquement modifiés, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau et à long terme améliorer nos connaissances dans ce domaine afin d’améliorer également la prise en charge des patients.
Procédures
Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1min). Durant une procédure chirurgicale menée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, une partie des animaux recevra une injection dans une zone du cerveau (1 fois, durée 45minutes maximum). Une autre partie des animaux aura en plus de l’injection une implantation d’un dispositif sur leur tête lors de la même procédure chirurgicale, toujours sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1 fois, durée 1h maximum). Ils seront ensuite habitués au dispositif expérimental pendant 5 jours, avec 1 à 2 sessions quotidiennes en commençant par quelques minutes et en augmentant progressivement jusqu'à 1h30 maximum . L’habituation pourra être prolongée d’1 semaine si nécessaire, soit 20 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Puis pour une partie de ces animaux des enregistrements quotidiens de 1h30 sont effectués, sur animal vigile, pendant 4 jours consécutifs, pendant 3 mois avec 1 semaine de repos entre chaque période d’enregistrements de 2 semaines, soit 32 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Pour l’autre partie, un protocole d'enregistrement similaire sera mis en œuvre mais précédé d’une courte anesthésie générale pour implanter un dispositif d’enregistrement cérébral (60 minutes, une fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, avec une partie d’entre eux euthanasiée lors d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée (sans réveil, durée 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress dû aux manipulations et contentions nécessaires au cours du projet. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale qui pourra générer une douleur et un inconfort pendant quelques jours ainsi qu’un risque d’infection. Une telle procédure implique une anesthésie générale qui entrainera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire. De plus, après l'implantation de la plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec cette plaque métallique sur la tête, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons et réaliser des enregistrements neurophysiologiques, les animaux seront éveillés mais leur tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête et génèrera un stress pour les animaux. Pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous prélèverons un petit fragment de la queue pouvant générer une brève et légère douleur.
Devenir
À la fin des procédures, une partie des animaux sera euthanasiée afin de réaliser des analyses post-mortem et les autres seront euthanasiés car il ne pourront pas être réutilisés en raison de leur modification génétique.
Remplacement
Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale: l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (5160) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales et l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. En outre, notre expertise dans l'entraînement des animaux à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’U.E.) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.
Raffinement
Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout au maximum l’impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Ils seront observés quotidiennement. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec la structure chargée du bien-être animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera le plus petit possible et réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Nous vérifierons ensuite la bonne reprise en charge des petits par leur mère. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après les interventions pour limiter la douleur. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, nous prévoyons d'étudier les mécanismes cellulaires aux stades précoces et tardifs du développement. C'est pourquoi nous prévoyons d'utiliser des animaux pour certaines procédures dès leur naissance et pour d'autres jusqu'à plusieurs mois. Les animaux reproducteurs seront mis en accouplement à partir de l’âge de 2 mois environ jusqu’à l’âge de 12 mois maximum. Dans le cadre de notre étude, nous prévoyons de déterminer le patrimoine génétique des animaux avec un petit prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 7 à 10 jours.
Rôles de protéines associées à la neuroinflammation dans les traumatismes de la moelle épinière [EU 2/2]
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux souches de souris génétiquement modifiées pour ne pas exprimer une protéine du système nerveux central fournissent les 192 animaux de ce projet, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La moitié subit une hémisection de la moelle épinière sous anesthésie, opération de trente minutes qui paralyse une patte arrière, altère le contrôle du sphincter urinaire et peut provoquer des escarres. Les tests sont détaillés : activité motrice spontanée pendant huit minutes, marche et coordination pendant dix minutes, force d'agrippement, qualité du nid sur vingt-quatre heures, temps de toilettage et latence à rejoindre la nourriture, répétés jusqu'à six semaines après la lésion. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus destinés aux analyses histologiques, les animaux utilisés étant les surnuméraires issus des croisements menés pour un autre projet.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines sur le site 1 . Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.
Traitement du diabète de type 1 par administration intranasale combinée d’antigènes modifiés et d’anticorps chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Anesthésiées pour recevoir un produit dans le nez une à quatre fois par semaine, les souris de ce projet subissent aussi une injection intraveineuse, un prélèvement de sang et un recueil d'urine hebdomadaire pendant six à vingt-cinq semaines. Elles sont 1 530, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que les femelles développent un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'au décès en trois semaines environ, la mesure du sucre dans les urines servant de seuil pour déclencher la mise à mort. L'objectif déclaré est de prévenir le diabète de type 1 chez de jeunes enfants au stade prédiabète, et l'effectif de 1 530 souris n'est appuyé par aucun calcul, le porteur écrivant seulement qu'il sera "réduit au minimum".
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune résultant de la destruction des cellules bêta du pancréas, productrice d’insuline, par le système immunitaire. Son incidence est en constante augmentation et touche des enfants et adolescents de plus en plus jeunes. Actuellement, on ne guérit pas du diabète. Son traitement est uniquement palliatif, et implique des injections pluriquotidiennes d’insuline, impactant gravement la qualité de vie des patients et n’empêchant pas des complications à long terme. De nombreuses thérapies ont été testées dans le diabète de type 1, avec des succès souvent très mitigés, probablement dus à une intervention trop tardive, c’est-à-dire chez des patients déjà diabétiques alors qu’une grande majorité des cellules bêta est détruite. Les efforts se concentrent maintenant sur la possibilité d’arrêter ou du moins freiner le développement de la maladie au stade « prédiabète ». Cette approche préventive, ciblant principalement de jeunes enfants, implique la mise en place de thérapies avec une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive pour faciliter leur application clinique. Dans ce projet, l'effet de nouvelles thérapies et combinaisons thérapeutiques sera testée dans un modèle de souris qui développe un diabète de type 1 de manière très similaire à l’homme. Des molécules produites par la cellule bêta (telles que l’insuline), modifiées pour augmenter leur efficacité, ainsi que des anticorps qui agissent en s'attaquant à la cause immunologique du diabète de type 1, seront administrés par voie intranasale. Ce choix est motivé par un intérêt clinique grandissant pour cette voie d'administration simple pour délivrer des anticorps, combattre l'inflammation et bénéficier des mécanismes de tolérance immunitaire associés aux muqueuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de nouvelles molécules innovantes administrées seuls ou en combinaison par voie intranasale pour moduler les réponses immunitaires et prévenir la maladie chez les enfants au stade de prédiabète. En cas de succès, ces recherches pourraient permettre d’envisager un premier essai clinique de prévention de la maladie qui touche principalement les enfants et adolescents. Cette stratégie, combinant une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive, remplit les exigences de sécurité sanitaire inhérentes au ciblage de populations pédiatriques.
Procédures
*Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 1 à 4 fois par semaine (1/jour). *Injection intraveineuse sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée seule 1 fois. *Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois. *Prélèvement d’une goutte d’urine pour mesure du taux de sucre sur souris vigile, 10 secondes, 1 fois/semaine, pendant 6 à 25 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris femelles développent un diabète (taux anormalement élevé de sucre dans le sang). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. Les souris peuvent également subir un léger stress lié à l’anesthésie et ressentir des douleurs modérées liées à l’injection intraveineuse et au prélèvement sanguin.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Des tests cellulaires appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact des protéines sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer sur modèle vivant l’efficacité thérapeutique de la stratégie proposée pour la prévention du diabète de type 1 et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris traitée, plusieurs organes seront prélevés, incluant le tissue nasal, poumons, rate, ganglions et pancréas pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’information biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé, le protocole donnant le meilleur effet thérapeutique sera déterminé avant de lancer de nouvelles expériences pour comprendre les mécanismes responsables de cet effet.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus (groupes sociaux) dans un environnement enrichi. Des points limites adaptés ont été établis (notamment la mesure du sucre dans les urines pour diagnostiquer un diabète) permettant de mettre à mort l’animal en cas de signes de souffrance ou de développement d’un diabète.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix dans les études sur le diabète de type 1 étant donné la bibliographie existante sur le sujet et la caractérisation des réponses auto-immunes chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes à partir de 6 semaines d’âge afin que les souris aient un système immunitaire mature mais suffisamment jeune pour impacter le développement du diabète.
Dynamique et plasticité cérébrale lors de l’anesthésie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement histologique. Chacune reçoit un implant posé au cours d'une chirurgie d'une heure, la moitié recevant en plus une injection de virus directement dans le cerveau, avant d'être maintenue la tête fixée pendant trois heures d'anesthésie. Les tests de mémoire durent environ une heure et encadrent l'anesthésie, deux jours avant et jusqu'à trois jours après, l'objectif étant de relier les tracés d'électroencéphalogramme aux activités neuronales profondes du cortex et du thalamus pour mieux piloter l'anesthésie humaine. Le porteur reconnaît que certains aspects de la mémoire spatiale peuvent être altérés, et écrit ignorer ces troubles dont la caractérisation est justement l'objet du projet. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des dynamiques cérébrales et de leurs conséquences comportementales ne peut se faire que sur des animaux.
Objectifs
Chez l’humain, l’électroencéphalogramme (EEG) est actuellement le meilleur moyen utilisé pour suivre et piloter l’état de l’anesthésie des patients qui subissent une chirurgie ou une endoscopie en milieu hospitalier et pour lesquels une grande variabilité de réponse à l'anesthésie existe selon l'âge, le sexe et la condition physique. La lecture des marqueurs EEG pour le pilotage peut être ambigüe si une grille de lecture des marqueurs EEG n'est pas associée, pouvant conduire ainsi à un surdosage ou sousdosage. De plus, il est parfois difficile de prévenir sans les identifier certains des marqueurs EEG associés à des troubles cognitifs post-opératoires et de comprendre d'où ces troubles peuvent venir. Pour surmonter ces inconvénients de l'anesthésie clinique et comprendre les changements de plasticité cérébrale à l'origine des troubles cognitifs, ce projet vise à caractériser les activités neuronales sous-jacentes des marqueurs EEG au cours des différentes phases de l’anesthésie générale : induction, maintenance et réveil et mesurer si une plasticité s'opère pendant ces états anesthésiés selon la profondeur de ceux-ci. Cette caractérisation indiquera quelles structures sont impliquées dans les marqueurs EEG et expliquera les transitions entres les états cérébraux de l'anesthésie. Ces transitions pourront ainsi être mieux prédites et maitrisées par le dosage de l'anesthésique en amont de l'avènement des états non souhaitables de l'anesthésie. Le projet s'effectuera chez la souris afin d'enregsitrer les neurones de structures profondes du cortex et du thalamus notamment impliqués dans les marqueurs EEG les plus caractéristiques. En tant que mammifère la souris a essentiellement la même structure cérébrale ainsi que la même architecture temporelle de l'EEG que l'humain en réponse à l'anesthésie. L’enregistrement de l’activité des neurones en même temps que l’EEG visera à mieux comprendre le caractère prédictif de certains états sur le comportement et la plasticité et de prévoir des troubles cognitifs post-anesthésie. L'utilisation d'animaux transgéniques dans ce projet permettra d'induire des stimulations optogénétiques qui sont essentielles pour mesurer les changements de force de la connectivité dans le réseau et donc la plasticité induite par l'anesthésie. L’application médicale du projet est de prévenir de façon personnalisée les causes des troubles cognitifs observés chez certains patients subissant une anesthésie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de l’anesthésie et d’altération de la mémoire par celle-ci. Nous nous intéresserons en particulier au réseau thalamo-cortical et à l’hippocampe, des structures qui chez l’homme jouent un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée lors de troubles post-anesthétiques réalisés en conditions hospitalière. À ce titre, l'amélioration des méthodes du pilotage de l'anesthésie a déjà été entamée dans le cadre de la collaboration (hôpital-entreprise-laboratoire) financée par ce projet. Le projet permettra d'encore mieux prédire les états non désirables de l’anesthésie mais aussi de remédier aux troubles cognitifs induits par celle-ci. Le projet aura des bénéfices pour la recherche médicale, pour les connaissances sur la plasticité cérébrale et des conséquences de l’anesthésie chez les personnes fragiles notamment ayant des dégénérescences cérébrales.
Procédures
Ce projet utilisera 336 souris. Les animaux seront implantés (durée d'intervention : 1h) au préalable de toute tâche comportementale ou enregistrement afin de pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (EEG et neuronale) au cours du processus d’anesthésie. La moitié sera aussi préalablement injectée d’un virus de façon intracérébrale, de façon à pouvoir stimuler certaines populations neuronales. Pendant l’anesthésie (durée totale prévue 3h) les souris seront maintenues en tête fixée ce qui est un protocole classique pour l’étude électrophysiologique en conditions vigile et anesthésiée. Des tests comportementaux (durée de test environ 1 heure) où la souris doit explorer son environnement motivée ou non par l'obtention d'une récompense, permettront de mesurer ses capacités de mémoire (à court terme et long terme, un test de chaque type) avant et après la phase anesthésiée. Ces tests durent une heure environ de 2 jours avant l'anesthésie et jusqu'à 3 jours après l'anesthésie.
Impact sur les animaux
Certains animaux, qui subissent une chirurgie longue (pour la pose de l'implant), peuvent souffrir d'effets indésirables comme l'hypothermie, la déshydratation et les douleurs post-opératoires. De plus les anesthésies longues et trop profondes sont le sujet de notre étude pour savoir si l'anesthésie peut avoir un impact sur les performances cognitives à long terme. Il est donc possible que comme indiqué chez l'humain que certains aspects de mémoire spatiale soient altérés. Cependant nous ignorons ces troubles et le but est de les caractériser.
Devenir
À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique.
Remplacement
Certains mécanismes cellulaires et moléculaires de l'anesthésie peuvent être abordés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de réseaux de neurones peuvent être testées sous forme de simulation numérique. Mais in fine, l’étude des dynamiques cérébrales au cours de l’anesthésie et ses conséquences comportementales nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire. Elle ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel. Une partie des mécanismes de plasticité sera testé in vitro dans un projet séparé afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents des observations de plasticité observés in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément ou sur plusieurs sites au travers du cortex, l’hippocampe et le thalamus, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. Les études utilisant ce type d’approches permettent de publier avec des résultats statistiquement significatifs une vingtaine d’animaux. Nous utiliserons les mêmes animaux pour tester les performances cognitives (test de mémoire spécifique) et les expériences de mesures de plasticité afin de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Après les chirurgies, les souris seront surveillées et les points limites évalués quotidiennement pendant une semaine afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur validée pour éviter toute souffrance des animaux. Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotiques, analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Nos expériences s'effectueront sur des animaux soit anesthésiés pour les besoins de l’expérience, soit vigiles, en tête fixée afin d’optimiser les conditions d’enregistrement des transitions entre l’état d’éveil et l’état éveillé. Ils peuvent s’alimenter et se nettoyer librement la face avec leurs pattes. L'ajustement des électrodes est indolore et ne nécessite pas d’opération particulière lorsque l’animal est tête fixée. Les animaux peuvent être hébergés par deux afin de favoriser les échanges sociaux.
Choix des espèces
Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés. De plus les souris sont faciles à habituer dans un système de contention nécessaire pour le protocole expérimental utilisé. Nous utiliserons des adultes (à partir de 3 mois jusqu'à 14 mois) de façon à mesurer si les effets de l’anesthétique sont semblables selon l'age. En effet chez l’humain la sensibilité est plus élevée chez les patiens agés. Sur chaque groupe de 12 animaux, 3 tranches d'âge seront sélectionnés : 3 à 6 mois, 7 à 12 mois et 13 à 15 mois afin de mesurer et corréler l'effet de l'âge avec les effets de l'anesthésie.
Evaluation de l’efficacité de traitements par radiothérapie interne vectorisée chez la souris porteuse de tumeur EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie de cinquante-cinq minutes, une irradiation du corps entier et deux injections intraveineuses par semaine sur trois semaines : 5 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux sous la peau ou dans la graisse mammaire, avec des nécroses et une perte de poids possibles, et les femelles des modèles hormonodépendants peuvent être mises sous estradiol au risque de calculs rénaux. L'objet est d'évaluer l'efficacité antitumorale de traitements par radiothérapie interne vectorisée et de mesurer les doses de radioactivité reçues par la tumeur comme par les organes sains, pour les extrapoler ensuite à l'être humain. Le porteur retient la souris parce que son génome est connu, que la prise tumorale est homogène sur un fond génétique stable et qu'elle est compatible avec les appareils d'imagerie du laboratoire, proches de ceux de la clinique.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies utilisant la radiothérapie interne vectorisée (RIV). Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. Pour la thérapie, on utilise de la radioactivité Beta- ou Alpha qui est très vite arrêtée par la matière mais possède une grande énergie. Elle va ainsi détruire les cellules à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique (qui fait l’objet d’une autre DAP). Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas se fixer et endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc doubles : * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * Evaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme lors de travaux nommés études dosimétriques afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser précisément des nouveaux composés de RIV pour proposer un traitement parfaitement personnalisé aux patients en utilisant la radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.
Procédures
*Induction tumorale : Sous anesthésie
Impact sur les animaux
- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée ou dans la graisse mammaire de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - Pour les études sur modèles hormonodépendants, les animaux pourront être mis sous estradiol qui peut induire des calculs rénaux. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.
Devenir
Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée.
Réduction
Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=10 souris sont suffisamment robustes pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.
Raffinement
La majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA (Structure chargée du Bien Être des Animaux) de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dry ou tubes en polycarbonate ou bâton de bois). La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’implantation nécessite l’incision de la peau (cas de l’implantation des fragments de tumeurs ou dans la graisse mammaire), la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprénorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Le transport vers la plateforme d’irradiation sera réalisé par un transporteur agréé, et le trajet ne dépassera pas 2h. Les animaux seront irradiés directement dans leur cage et leur environnement (cage, litière, enrichissement et nourriture) ne sera pas modifié. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur retour dans l’animalerie, les animaux seront changés de cages. Les animaux seront transportés par un transporteur agréé de l’EU1 vers l’EU2 (environ 1km de trajet) dans des cages avec litière, enrichissement et nourriture. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur arrivée dans l’animalerie de l’EU2, les animaux seront changés de cages.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation préalable des traceurs eux-mêmes très proches des appareillages d'imagerie, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine
Mise en place d’une décompensation spontanée de la cirrhose et d’un modèle d’ACLF suite à une induction de la cirrhose par un agent hépatotoxique et d’un désordre métabolique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Jusqu'à 44 administrations d'un produit toxique pour le foie, deux fois par semaine pendant 22 semaines, par gavage ou par injection dans l'abdomen : c'est ce que subissent des rats arrivés au laboratoire à quatre semaines, pour reproduire une cirrhose puis sa décompensation aiguë. 8 140 rats sont concernés, dont 4 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Le porteur annonce des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire dans les heures qui suivent l'induction, écarte l'analgésie au motif qu'elle introduirait un biais, et écrit viser une gravité "jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique". Dans les études de survie, le délai jusqu'à la mort compte comme donnée, et c'est l'atteinte du point d'arrêt anticipé qui vaut déclaration de la mort de l'animal.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à identifier de nouvelles molécules permettant de traiter la cirrhose à stade très avancé ou une ACLF (acronyme d’Acute on Chronique liver Failure ou décompensation aiguë de la cirrhose) La cirrhose se définit par l'accumulation excessive de fibrose conduisant à la dégénérescence du foie.
Bénéfices attendus
Le pronostic des patients cirrhotiques est variable en fonction de la cause et de son contrôle et de la présence de décompensations. L’ascite réfractaire survient chez 5-10 % des patients cirrhotiques, avec un taux de mortalité de plus de 50 % à 2 ans. Souvent, elle s’associe à d’autres complications comme l’infection spontanée du liquide d’ascite. Lors de la phase terminale de cette décompensation et suivant la qualité de vie du patient, l’espérance de survie en dehors d’une transplantation hépatique n’est que de quelques mois. Dans le cadre de l’ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour des défaillances multiples et de préserver le capitale hépatocitaire des patients. La perte de fonctionnalité du foie durant cette période conduit à un décès du patient de façon précoce. Les traitements actuels sont purement symptomatiques et ne visent qu’à limiter les risques liés à l’hypertension portale, les surinfections, les risques d’hémorragie ou au contraire de thrombose et sont proposés au cas par cas, ce de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons développer visent à agir sur les différents mécanismes conduisant à une réfractarité de l’ascite, la perméabilité de la paroi intestinale et les productions d’ammoniaque à l’origine de l’encéphalopathie pour la décompensation traditionnelle. Elles visent à agir sur les différentes voies à l’origine de la défaillance multiple (inflammation, immunitaire, métabolique et vasculaire) dans le cadre de l’ACLF.
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 44 administrations par gavage ou par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique, à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes) ou jusqu’à 44 administrations par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes). Sur les procédures de caractérisation de chacun des agents inducteurs (procédure 1 et 2), les animaux pourront subir jusqu’à 6 prélèvements de sang à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). En dehors de ces deux procédures, les animaux subiront un prélèvement de sang intermédiaire à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). Pour les études de type ACLF, les animaux subiront une administration intrapéritonéale, par voie intraveineuse ou par gavage des agents inducteurs (15 secondes). Pour les études avec test de composés, en dehors de la phase d’induction de la cirrhose et de l’ACLF, les animaux pourront subir jusqu’à 10 administrations par gavage, voie intrapéritonéale ou intraveineuse (15 secondes). Dans certains cas, les 4 administrations avec un volume plus important en intrapéritonéale se fera sous anesthésie (durée 1 minute), avec 4 drainages du dialysat à raison d’une fois par jour (15 minutes) sous anesthésie générale. L’administration intraveineuse pourra être faite par infusion lente à l'aide d'un perfuseur (durée 120 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur mais un inconfort et un stress passager lié à la contention nécessaire pour le gavage ou l’administration intrapéritonéale des agents, l’habituation au geste estompe rapidement ce stress. La gêne est présente mais pas accompagnée d’une analgésie chez l’humain. Les animaux présentant de l’ascite semblent présenter des signes de gêne de posture lorsque celle-ci est abondante sans pour autant présenter des signes de douleurs (grimace scale). L’administration massive d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). L’ACLF est un épisode grave chez le patient dont le pronostic vital est engagé. Le modèle animal présente, par voie de conséquence, lors de l’induction de l’ACLF des signes d’inconfort manifestes. L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Dans les situations d’études de survie où le délai jusqu’à la mort est une donnée clé de la procédure, le recours au point d’arrêt anticipé sera appliqué et c’est à ce moment précis que sera déclarée la mort de l’animal. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'intégralité des animaux sera mis à mort à l'issue des procédure afin de pouvoir étudier les biomarqueurs circulant, histologique ou transcriptionnelle permettant de caractériser la pathologie et l'efficacité d'une molécule.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Les pathologies étudiées étant multi-organes, le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans un système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevant. Ces études pilotes nous permettront de caractériser et d’écarter les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide d’un test statistique qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Une priorité sur le développement sera accès par rapport à la prépondérance observée chez l’homme : infection (LPS), consommation excessive d’alcool et/ou intoxication médicamenteuse (APAP), le développement des autres agents précipitants sera envisagé qu'au cas où ceux-ci ne donneraient pas les résultats escomptés. Dans le cas d’administrations de composés par voie veineuse en aigue ou en répétés, peuvent se présenter des difficultés techniques et nous oblige parfois à augmenter les effectifs de façon à combler les pertes.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire, l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital et induction au composé hépatotoxique, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans la littérature, c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gr environ que l'effet du phénobarbital est le plus efficace. L'ensemble des autres études (sans présensibilisation au phénobarbital) sera réalisé sur de jeunes adultes, à savoir 6 à 7 semaines (250 à 300 g) à l'arrivée. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental.
Enseignement de techniques chirurgicales chez le Porc, le Mouton, le Lapin, le Rat et la Souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 4000
Lapins : 100
Cochons : 750
Moutons : 100
Former des internes en chirurgie, des vétérinaires et des scientifiques aux gestes de base mobilise ici 5 950 animaux non-humains, dont 4 000 rats, 1 000 souris, 750 cochons, 100 moutons et 100 lapins. 4 950 d'entre eux sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, les 1 000 autres étant utilisés pour l'apprentissage du gavage, des injections et de la contention, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal peut rester une demi-journée à une journée entière sous anesthésie pendant que se succèdent laparotomies, thoracotomies, sutures et anastomoses digestives ou vasculaires, le porteur indiquant faire passer le maximum d'étudiants sur chacun. Les souris viennent de l'élevage maison, écartées pour n'avoir pas le bon génotype, et les rats sont achetés "réformés" chez des fournisseurs, c'est-à-dire déjà destinés à être tués.
Objectifs
Le but est d'aider à la formation médicale pratique initiale des étudiants en médecine (internes des spécialités chirurgicales essentiellement, externes) et des étudiants en sciences (dès le Master 2). Nous assurons également la formation chirurgicale continue auprès des chirurgiens, des vétérinaires et des scientifiques dans le cadre des formations à la chirurgie expérimentale ainsi que pour concevoir ou réaliser des procédures expérimentales obligatoires pour toute personne pratiquant un acte chirurgical chez l'animal de laboratoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que les étudiants en chirurgie soient formés aux techniques chirurgicales de bases afin d'avoir toutes les compétences nécessaires à leur activités en fin de cursus, que les chirurgiens ou vétérinaires en activité se forment aux nouvelles techniques chirurgicales et que les scientifiques apprennent les bonnes pratiques et gestes avec les différents modèles animaux (contention, gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse,...) encadrés par des personnes compétentes afin de pouvoir poursuivre leurs recherches dans les meilleures conditions pour eux et pour l'animal (Raffinement).
Procédures
Une partie des petits mammifères (rats et souris) serviront à l'enseignement des gestes de base tels que gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse, contention. Pour les autres et les grands mammifères, les formations visent à former les futurs chirurgiens, gynécologues, vétérinaires et toute personne réalisant des procédures expérimentales chez l'animal. Ces enseignements sont axés sur la maîtrise des gestes chirurgicaux de base tels que la suture ou l'hémostase pour les scientifiques. Les internes des spécialités chirurgicales seront davantage formés sur les sutures, l'hémostase, les anastomoses digestives, les anastomoses vasculaires ainsi que la coelioscopie. En fonction du geste à acquérir, l'animal pourra rester d'une demi journée à une journée sous anesthésie générale (avec vérification des constantes en permanence).
Impact sur les animaux
Pour les gestes réalisés de classe légére (procédure 1), une contention de courte durée sera pratiquée (moins de 1 minute). Lors des injections, une douleur légère de très courte durée est possible au site d'administration. Un léger saignement après les injections, très vite contenu par simple pression digitale, est également possible sans douleur associée. Une couverture analgésique locale sera appliquée pour réduire la douleur qui pourrait être engendrée par les injections (xylocaïne en spray 5%). Pour les procédures 2 et 3 (sans réveil), les interventions chirurgicales consisteront en des laparotomies/thoracotomies essentiellement avec techniques chirurgicales digestives et thoraciques. Les animaux seront tous sous traitement analgésique avec utilisation de dérivés morphiniques (buprénorphine et fentanyl) pour optimiser la prise en charge de la douleur jusqu'à leur mise à mort.
Devenir
A la fin de la procédure 1, étant une procédure légére, les animaux sont réutilisés pour les procédures 2 et 3 (sans retour à l'hébergement entre les deux). Les animaux des procédures 2 et 3 seront anesthésiés puis systématiquement euthanasiés à la fin des procédures. Etant des procédures chirurgicales nécessitant l'apprentissage de l'euthanasie ou des procédures chirurgicales trop importantes ne permettant pas leur réutilisation, l'euthanasie a été décidé comme l'issue la plus favorable.
Remplacement
Dès que possible et en 1ère intention, nous aurons recours à des peaux artificielles, des pelvi-trainers, des mannequins rats et souris, à la technique de la double horloge pour la microchirurgie ainsi qu'à des simulateurs de chirurgie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour certaines formations nous sommes également en contact avec des abattoirs qui nous livrent des pièces anatomiques (pieds de porc pour les sutures, périnée de truie pour les sages femmes) afin d'éviter de commander des animaux.
Réduction
Toutes les souris utilisées lors des formations sont des souris provenant de l'élevage de l'animalerie Eops destinées en temps normal à l'euthanasie car elles n'ont pas le génotypage souhaité. En ce qui concerne les rats nous essayons dès que possible de réutiliser des rats en fin de protocole ou nous commandons des rats dits "réformés" chez les fournisseurs, c'est à dire des rats voués à l'euthanasie car incompatibles avec les protocoles de recherche. Enfin, nous faisons passer le maximum d'étudiants sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être et répondant à leurs besoins physiologiques et éthologiques (cycle jour/nuit - 12h/12h ; nourriture et eau ad libitum; enrichissements) les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Une période de 10 jours d'adaptation sera appliquée à chaque animal. Les manipulations seront effectuées ou encadrées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Si une anesthésie est nécessaire les animaux seront systématiquement prémédiqués en intra-musculaire ou en intra-péritonéale. Le relais anesthésique est assuré par un gaz anesthésiant (0,5 à 2,5%). Seuls les grands animaux (porcs et brebis) seront intubés. Dès l'anesthésie maintenue, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée ou intra-péritonéale. Si nécessaire, pour les procédures de classe légère, un traitement à base d'anesthésique local sera pratiqué pour lutter contre la douleur in situ.
Choix des espèces
Le porc et le mouton ont été choisis pour des raisons anatomiques (similarités avec l'homme). Les rats, souris et lapins ont été choisis pour la formation à la chirurgie expérimentale (espèces utilisées par les étudiants dans leurs recherches) ou pour l'apprentissage des anastomoses vasculaires en ce qui concerne les rats (similarité avec l'homme). Nous prendrons des porcs charcutiers juvéniles et des miniporcs adultes pour une raison de taille. En ce qui concerne les moutons, rats, souris et lapins, nous prendrons des individus adultes pour des raisons anatomiques et de taille étant manipulés lors de travaux pratiques. Cela permet aussi de faciliter cette manipulation des petits mammifères par les étudiants.
Excitabilité des neurones épineux striataux chez des animaux compulsifs pour l’alcool
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolés en cage individuelle, 272 rats sont conditionnés à boire de l'alcool au cours de quelque 80 sessions de trente minutes étalées sur une vingtaine de semaines. Six de ces sessions s'accompagnent de stimuli aversifs, destinés à séparer ceux qui continuent de boire malgré le signal négatif de ceux qui s'arrêtent, et le porteur classe l'isolement combiné au modèle de consommation comme un impact sévère, qui concerne 200 animaux sur 272. Vient ensuite une chirurgie d'une quarantaine de minutes, avec des injections dans deux à quatre sites du cerveau, avant trois semaines d'attente puis la mise à mort et le prélèvement des cerveaux. Les 40 rats qui ne boivent pas assez pour rester dans l'étude sont proposés pour des formations à l'expérimentation animale.
Objectifs
Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones sensibles à la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau - par des approches génétiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).
Bénéfices attendus
Comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de la dopamine dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
La production des animaux transgéniques nécessitera une biopsie de tissus. La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à stimuli aversifs pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Les animaux utilisés dans ce projet auront ensuite des injections dans le cerveau (chirurgie sous analgésie et anesthésie générale d’injections en deux à quatre sites, pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui permettront au bout de trois semaines d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool.
Impact sur les animaux
La production des animaux transgéniques nécessitant un génotypage par biopsie d’oreille peut induire une douleur légère de courte durée. L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux pour cette expérimentation sont à considérer comme ayant un impact d’ordre sévère sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont attendues liées à la procédure de chirurgie d’injection et à la procédure des stimuli aversifs. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses histologiques. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères diagnostic des addictions).
Réduction
Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité́ comportementale seront relevés et les analyses des cerveaux de ces mêmes animaux prélevés en fin d’expérimentation permettront de déterminer également les pourcentages de neurones préférentiellement activés en fonction de nos conditions expérimentales. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans les conditions répondant aux critères légaux relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à la procédure expérimentale, mais en cages ouvertes, ce qui limitera toutes nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés de la dessication par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré́ de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui pourront, pour certaines, prendre plusieurs mois.
Effets de dérivés de peptides naturels sur la sensibilité douloureuse cutanée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
9 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, et chacune commence par une coupe du bout de la queue à quatre semaines. 6 760 d'entre elles sont ensuite exposées à une douleur thermique ou mécanique sur une patte ou la queue, dont 5 400 toutes les quinze minutes pendant deux heures, tandis que 900 subissent une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3 600 une inflammation d'une patte durant de quatre heures à sept jours. 9 000 reçoivent en plus une à cinq injections d'un composé dérivé de venins d'anémone de mer, de mygale ou de serpent. Aucune ne reçoit d'analgésique, le porteur écrivant qu'il ne peut pas en envisager l'emploi dans des procédures qui ont pour objet l'étude de la douleur.
Objectifs
Notre équipe étudie les mécanismes de la perception douloureuse, et en particulier le rôle de détecteurs joué par des protéines membranaires des neurones sensoriels innervant la peau, les canaux ioniques, en développant leur pharmacologie. A partir d‘une bibliothèque de venins animaux, nous avons déjà identifié plusieurs peptides (d‘anémone de mer, de mygale et de serpents) qui ont donné lieu à des publications de haut niveau scientifique. Dans le cadre d'un projet collaboratif, des dérivés de peptides naturels que nous avons découverts doivent être testés dans la perspective d’un prochain développement clinique.
Bénéfices attendus
Ces études précliniques chez l’animal, qui permettent seule l'étude de la réalité physiologique dans un contexte intégré, sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux composés anti-douleur, ce qui est crucial face à la crise mondiale des opioïdes et à l'augmentation des addictions et morts par overdoses.
Procédures
Toutes les souris (9500) subiront à l'age de 4 semaines le prélèvement du bout de queue pour déterminer leur génotype (30’’) et le stress de contentions répétées pendant les tests comportementaux. A l'age de 7 à 15 semaines dans le cadre des tests comportementaux, 6760 souris seront exposées à une douleur légère thermique ou mécanique sur une patte ou la queue de durée < 2 minutes et de laquelle elles pourront s'échapper (mesure d'un seuil de douleur), dont 5400 de façon répétée toutes les 15 minutes pendant 2h. 900 souris subiront une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3600 souris subiront une inflammation d'une patte ne s’accompagnant d’aucun comportement traduisant une douleur spontanée (de 4h à 7 jours). 9000 souris subiront de 1 à 5 injections d’un agent pharmacologique (30’’), dont 3000 sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Nuisance légère pour prélèvement de bout de queue pour génotypage, stress léger de la contention après habituation pour les tests comportementaux et l'anesthésie gazeuse, nuisances légères des injections pharmacologiques, nuisance modérée de l'inflammation induite sur une patte arrière et de la douleur ou de l'hypersensibilité inflammatoire ressentie sur la queue ou une patte arrière.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des souris expérimentales (500 souris) seront mises à mort à l'issue de leur période physiologique de reproduction (8 mois pour les femelles, 15 mois pour les mâles). Ils permettront des prélèvements d'organes post-mortem pour des analyses biochimiques. Ce sont de plus des animaux OGM qu’il est interdit de disséminer hors des établissements de recherche. C’est aussi le cas pour les animaux ayant suivi les procédures expérimentales (9000) qui ont de plus subi des injections pharmacologiques, des tests invasifs et certains une hypersensibilité douloureuse chronique qui empêche aussi toute réutilisation. Toutes les souris seront donc mises à mort à l'issu des procédures et permettront des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Au préalable, nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro sur les canaux ioniques dans des lignées cellulaires en culture, puis sur des cultures primaires de neurones sensoriels de rongeurs. Mais, pour savoir si ces peptides peuvent avoir un intérêt thérapeutique, des expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires, pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et de la pharmacologie in vivo. Utiliser la souris comme modèle permet d’utiliser des modèles pathologiques de référence, ainsi que d’étudier des animaux transgéniques chez lesquels un gène d’intérêt, codant pour une protéine cible du composé pharmacologique à tester, a été invalidé (knock-out). Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux analgésiques.
Réduction
Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souris expérimentales ainsi que d’inclure un croisement pour maintenir le fond génétique. Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées déjà produites et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem. L‘objectif de Réduction a également été pris en compte en réduisant le nombre d‘animaux prévisionnel au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs tout en intégrant des aléas expérimentaux. Le nombre d’animaux expérimentaux sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile ou redondante par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. Les expériences prévues sur les souris transgéniques ainsi certaines procédures testant la capacité motrice ne seront conduites qu’avec les composés et par les voies d’injection induisant un effet analgésique. De plus, la réalisation d’une procédure est conditionnée par le résultat préalable d’une autre. Ainsi, le nombre d’expériences ainsi que le nombre maximal de souris prévues pourra être réduit.
Raffinement
Toute souris qui présenterait des signes d'infection au niveau de la queue dans la semaine qui suit le prélèvement pour génotypage sera traitée par des soins vétérinaires adaptés jusqu'à guérison. Si la plaie persiste au-delà d’une semaine, la souris sera mise à mort. Dans le cadre de l'objectif de Raffinement, la longue expérience de notre groupe dans les études des mécanismes de la douleur chez l'animal nous permet de proposer des tests comportementaux complémentaires mettant en jeu différentes modalités douloureuses ou motrices avec une sévérité légère à modérée. Les animaux sont habitués aux tests de façon à réduire leur stress et obtenir des mesures reproductibles et fiables. Les protocoles prévoient parfois un suivi des effets pharmacologiques sur 5 jours, mais cette durée sera réduite en cas d’absence d’effet ou d’effet transitoire. Les animaux sont mis à mort dès la fin de l’expérience de comportement associée à de la pharmacologie in vivo. Grâce à un suivi quotidien de chaque animal tout au long de chaque procédure, tout animal qui présenterait des signes de comportement anormal ou d‘une pathologie quelconque serait mis à mort. Nous ne pouvons en effet pas envisager l’emploi d’analgésique dans nos procédures qui ont pour objet l’étude de la douleur.
Choix des espèces
Les expériences de comportement et de pharmacologie in vivo sont réalisées chez la souris pour pouvoir utiliser des animaux transgéniques (knock-out) pour déterminer la spécificité de l’effet des composés testés et en utilisant des modèles pathologiques de référence. Au sevrage, à 4 semaines, un prélèvement de tissus (extrémité de la queue) permettra une analyse génétique. Les expériences comportementales seront conduites sur des adultes entre 7 et 15 semaines. Cet âge permettra aussi la comparaison avec des expériences déjà publiées.
Mise en place d’un modèle d’infection urinaire murin et validation de nouveaux traitements.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Une partie des 680 souris de ce projet vient des portées surnuméraires du laboratoire, animaux que le porteur décrit comme voués à être tués sans avoir été utilisés. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont tuées à l'issue, pour dénombrer les bactéries logées dans leur vessie et leurs reins. Sous anesthésie gazeuse, un cathéter pédiatrique introduit des Escherichia coli dans leur urètre, puis un traitement ou un placebo est injecté par la même voie 24 heures plus tard, en une fois ou pendant trois jours, l'infection pouvant durer deux semaines. Le porteur affirme que ses traitements tuent 100 % des bactéries visées in vitro, et qu'il lui faut malgré tout les valider sur "animal entier".
Objectifs
Les infections urinaires sont un motif très fréquent de consultation et de prescription d’antibiotiques en médecine générale. On estime en France leur incidence à 625 000 cas/an. Environ 50% des femmes adultes font un épisode d’infection urinaire au moins une fois dans leur vie et 20% des femmes ayant une infection urinaire auront un nouvel épisode. En mai 2023, Santé publique France publiait les chiffres des infections liées aux soins (infections nosocomiales), et montrait que les infections urinaires arrivaient en tête (28% des cas). En termes de germes impliqués, la bactérie Escherichia coli, est la cause principale des infections urinaires. Selon les données de l’assurance maladie, en ville, E. coli est la cause de 90% des infections urinaires. En ce qui concerne les infections urinaires nosocomiales, E. coli arrive également en tête des germes responsables. Les infections urinaires se traitent par des antibiotiques, notamment des fluoroquinolones. Cependant, les traitements peuvent être mis en échec par des souches résistantes aux antibiotiques. La Haute Autorité de Santé dans un rapport de 2021 montre qu’en ville près de 13% des souches de E. coli sont résistantes aux fluoroquinolones et ce chiffre monte à 19% en Ehpad. Le but de cette demande d’autorisation d’expérimentation animale est de mettre en place un modèle d’infection urinaire et de tester de nouveaux traitements de décolonisation bactérienne ciblant notamment les souches résistantes aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de valider notre approche thérapeutique dans le cadre des infections urinaires. Nous espérons montrer une forte décolonisation de l'arbre urinaire suite au traitement. Nous testerons notre traitement sur 4 souches cliniques résistantes aux antibiotiques. Nous espérons pouvoir apporter la preuve de concept que nos traitements sont efficaces et ainsi proposer une solution là où les antibiotiques sont inefficaces.
Procédures
(i) Anesthésie gazeuse des animaux + injection des bactéries dans l'uretère à l'aide d'un cathéter pédiatrique. Cette procédure prendra moins de 10 minutes par animal. (ii) 24h après infection, les animaux recevront le traitement ou le placebo. Pour cela, ils seront de nouveau anesthésiés (anesthésie gazeuse) de manière à injecter le traitement dans l’urètre. Cela prendra au maximum 10 minutes. L'administration du traitement sera unique ou répétés pendant 3 jours au total.
Impact sur les animaux
Nous allons induire une infection urinaire par l’administration dans l’urètre de bactéries. L'infection urinaire causera une nuisance légère à l'animal. Cependant, les animaux infectés vont mettre en place une réponse immunitaire visant à contrôler la prolifération bactérienne. La littérature scientifique ne reporte aucun cas de souffrance animale nécessitant le sacrifice ou l'administration de médicaments lors d'infections urinaires. La durée de l'infection urinaire sera au maximum de 2 semaines.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort. En effet, nous voulons quantifier les bactéries présentes dans la vessie et dans les reins et pour cela, la mise à mort de l'animal est indispensable. Des analyses histologiques seront aussi effectuées pour notamment objectiver le maintien de l'intégrité des tissus grâce à notre traitement.
Remplacement
Le but du projet est de valider de nouveaux traitements dans l'éradication des bactéries responsables d'infections urinaires. Même si des études préalables montrent une très forte capacité à tuer les bactéries ciblées in vitro, il nous faut les valider sur animal entier.
Réduction
Nous avons mené de nombreux travaux in vitro de manière à sélectionner les meilleurs traitements possibles contre des souches d’Escherichia coli responsables d’infections urinaires (leur efficacité est de 100% de bactéries tuées). Nous prévoyons 2 types de traitements (1 dose unique ou 1 dose pendant 3 jours). Nous commencerons par la répétition des administrations car c’est ce traitement qui a le plus de chances de fonctionner. Si nous ne constatons aucun effet du traitement, nous arrêterons les manipulations. Une approche statistique sera effectuée de manière à déterminer si le traitement est réellement efficace. Dans le cadre de la règle des 3R, un maximum de prélèvements sera réalisé sur les animaux (vessie, reins + urine) pour effectuer : par exemple le dosage des protéines impliquées dans l’inflammation, de la microscopie, des dénombrements bactériens... Nous prévoyons d'acheter des souris mais également d'utiliser des animaux surnuméraires issus des reproductions du laboratoire. L'utilisation de ces derniers permettra de limiter le nombre d'animaux achetés et d'utiliser à des fins de recherches des animaux qui auraient été mis à mort sans avoir été utilisés.
Raffinement
Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichi à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux par des expérimentateurs habitués sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. De plus, nous utilisons un système de score dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
Les souris se sont rapidement imposées comme étant un bon modèle d’infection urinaire dès le début des années 1980. Elles sont considérées comme étant notamment un meilleur modèle que les rats pour plusieurs raisons. Nous pouvons par exemple citer l’absence de reflux vésico-urétéral (la remontée d'urine vésicale vers les uretères et les reins), ce qui est le cas chez l’Homme; ou la présence dans l’arbre urinaire de la souris d’uroplakines (des structures transmembranaires présentent également chez l’Homme) servant de récepteurs aux bactéries E. coli responsables d’infections urinaires. Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines au moment de l'infection. C'est un stade de développement classiquement utilisé dans la littérature.