Rongeurs

Une lésion musculaire est provoquée chez 240 rats porteurs d'une dystrophie, par injection intramusculaire ou rétro-orbitaire sous sédation puis anesthésie gazeuse. Ils reçoivent ensuite un antidouleur deux fois par jour pendant au moins deux jours, certains des injections intrapéritonéales deux fois par jour pendant trois à six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués entre six et huit mois pour que leurs muscles soient prélevés. L'objet est de comparer les cellules souches des muscles qui bougent les yeux, épargnés par la maladie, et celles des muscles des membres, qui se détériorent. Le porteur affirme que jusqu'à six mois aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome n'a été constatée, après avoir décrit une douleur inflammatoire modérée qui exige un morphinique.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. Certaines dystrophies sont causées par des changements dans le gène codant pour la dystrophine (porté par le chromosome X), générant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), que touche surtout les garçons. Chez les patients, la production anormalement faible ou absente de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Pour autant, les muscles qui contrôlent le mouvement des yeux conservent leur capacité de régénération, contrairement aux muscles des membres. Ce projet vise ainsi à comparer le comportement des cellules souches musculaires, responsables de la réparation du muscle, entre ces deux types de muscles. L’objectif est d’identifier les facteurs clés permettant le maintien de la capacité régénérative des cellules souches épargnées par le vieillissement précoce, ce qui permettrait d'ouvrir une nouvelle piste de traitement pour traiter l'ensemble des myopathies dystrophiques.

Bénéfices attendus

Nous comptons identifier les mécanismes protecteurs du vieillissement précoce des cellules souches. Avec ce projet, nous comptons in fine identifier de nouvelles molécules pour moduler les mécanismes identifiés en vue d'empêcher ou de retarder le vieillissement précoce des cellules souches musculaires dans certaines maladies et ainsi, favoriser la réparation musculaire par le maintien des capacités régénératives des cellules souches.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux seront sédatés une fois par injection sous-cutanée puis anesthésiés par inhalation de gaz. Une injection sera réalisée par voie intramusculaire ou rétro-orbitaire. Les animaux seront injectés 2 fois par jour avec un traitement anti-douleur par voie sous-cutanée pendant un minimum de 2 jours. Certains recevront des injections intrapéritonéales 2 fois par jour pendant 3 ou 6 jours.

Impact sur les animaux

L'expérience de réparation musculaire induite qui constitue la base de ce projet cause une douleur modérée d’origine inflammatoire que l'on peut efficacement contrer avec une un antalgique puissant ou un morphinique qui sera systématiquement administrée aux animaux. Les animaux seront mis à mort entre l’âge de 6 à 8 mois. Jusqu’à 6 mois, aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome en animalerie confinée n’a été constatée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé tous les essais approfondis sur les cellules souches musculaires en culture. Ces expériences in vitro ne peuvent pas reproduire toutes les interactions et réponses cellulaires observées de façon chronologique dans un organisme vivant. Ainsi, la validation chez l'animal est maintenant indispensable pour évaluer de manière complète et précise les mécanismes de coopération entre les cellules dans la réparation musculaire et dans un contexte physiologique qui respecte la complexité des contributions nerveuses et endocrines.

Réduction

De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles animaux utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique et le calcul de puissance statistique nous recommande d'utiliser 8 animaux par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant et approprié pour conclure de façon non ambiguë.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les animaux ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Nos animaux sont sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les animaux sont constamment évalués en observant chaque individu, 7 jours sur 7. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une mise à mort compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal. La survenue d'une éventuelle douleur modérée chez l'animal est anticipée et prévenue par l'administration préalable de molécules anti-douleur très efficaces sur ce type de procédures. Les molécules utilisées dans ce projet sont toutes des médicaments pour lesquels les risques de toxicité sont faibles, connus et anticipables.

Choix des espèces

Nos animaux appartiennent à une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, cette espèce est devenue un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Les animaux seront âgés de 6 à 8 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement.

Administrations par voie intranasale, intratrachéale, intramusculaire, intradermique, intracérébrale, intravésicale ou par minipompe posée chirurgicalement, jeûnes pouvant durer seize heures, phase expérimentale allant jusqu'à douze mois : 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'effectif se répartit entre 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, pour une prestation de mesure de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués. La plupart seront tués pour récupérer les organes et de grands volumes de sang, 10 400 pouvant être gardés vivants et réutilisés s'ils sont restés moins d'une semaine en procédure après une administration unique. Le porteur écrit qu'un phénotype dommageable "n'affectera pas le bien-être animal", tout en précisant dans la même phrase que les animaux concernés pourraient boire davantage ou devenir obèses.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations de la SBEA. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués peuvent être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique et intracérébrale sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); injection intraportale ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Pour les administrations orales et oro-gastriques où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés avant et après le jeûne. Les volumes administrés et les fréquences d’administration respecteront les recommandations de la SBEA. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement. En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. De plus, les animaux seront réhydratés une fois par jour avec avec du Ringer Lactate. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance, les expérimentateurs seront formés pour reconnaître ces signes. Les poses et retraits d’implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait dans la vie de l’animal. Les voies intracérébrale, intrathécale et intraportale ne pourront être réalisées que maximum une fois dans la vie de l’animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Les implants (pose et retrait) ne pourront pas être combinés avec d’autres administrations nécessitant une chirurgie. A la suite de chirurgies, les animaux seront suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie, des soins locaux seront apportés si nécessaire. La fréquence de changement des litières sera augmentée si nécessaire et de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique. Les administrations oro-gastriques via un dispositif de gélules ne pourront être réalisées uniquement sur des rats de plus de 150g et les animaux devront être anesthésiés. Ces administrations pourront être pratiquées à une fréquence maximale d’une fois par jour avec le matériel adapté à la taille de l’animal. De plus, un lubrifiant inerte devra être utilisé afin de faciliter le passage de la canule dans l’œsophage. Les variations de poids seront enregistrées quotidiennement à la suite des administrations oro-gastriques. Les perfusions IV de plus de 15 minutes et de 30 minutes maximum devront être réalisées sur des animaux anesthésiés.

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Un infarctus du myocarde provoqué en trente minutes chez l'adulte et en quinze chez le souriceau d'un jour, une artère fémorale ligaturée ou excisée, un muscle lésé par une anse refroidie appliquée trois fois quinze secondes : 7 110 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne de toxine. Les échographies obligent à les transporter vers un second établissement, transport que le porteur compte lui-même parmi les sources de stress. Le projet vise à comprendre le rôle des cellules du microenvironnement musculaire dans la régénération, et le porteur justifie le choix de la souris par la disponibilité d'animaux génétiquement modifiés et par la consanguinité des lignées, qu'il présente comme un gage de reproductibilité et donc de réduction des effectifs.

Objectifs

Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs. Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies affectant le muscle squelettique et cardiaque, y compris les pathologies cardiovasculaires comme l’infarctus du myocarde, les myopathies et les blessures chroniques du muscle squelettique. Par ailleurs, le manque d’irrigation locale des membres inférieurs sont fréquentes dans différentes pathologies chroniques y compris le diabète. Malgré le succès de certains traitements, ces maladies chroniques restent encore aujourd’hui fréquentes et très peu soignables, elles ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de ces pathologies affectant le muscle et le traitement des patients.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux lésions musculaires. Notre étude permettra notamment de comprendre le rôle de certaines cellules dans la régénération ou les lésions chroniques des muscles. Ces avancées pourraient, à terme, permettre de développer de nouvelles thérapies pour réparer ou régnérer les muscles. Ceci pourrait concerner, par exemple, l’infarctus du myocarde, qui est la première cause de mortalité en France.

Procédures

- Infarctus du myocarde chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 30 minutes. Réalisé par EU1 - Infarctus du myocarde chez le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Échocardiographie chez la souris et le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes ainsi que le stress lié au transport vers le site n°2 pour l’échocardiographie. Réalisé par EU2 - Constriction puis excision d’un segment d’artère fémorale sur souris adulte anesthésiée = 15 minutes. Réalisé par EU1. - Ligature de l’artère fémorale chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Dans certaines expériences, injection de toxine: quotidien, 10 secondes. Réalisé par EU1 - Blessure localisée du muscle par anse refroidie (1x par souris) = 3x 15 secondes. Réalisé par EU1 - Ligature de l’artère fémorale et injection de toxine chez la souris adulte anesthésiée = 15minutes. Réalisé par EU1 - Chirurgie terminale sous anesthésie pour prélèvement d’organes. Réalisé par EU1.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés aux procédures : inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers l'EU n°2 pour les échocardiographies. L’induction de l’anesthésie gazeuse pour la réalisation de l’échocardiographie est stressant pour l’animale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyse des organes.

Remplacement

Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement musculaire, y compris les cellules immunitaires, stromales et endothéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Un grand nombre de données de transcriptomiques étant déjà disponible pour la communauté scientifique, des analyses informatiques pilotes ont déjà été performées pour étayer nos hypothèses.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales et la mise en place de points limites spécifiques et précoces. Pour l’ensemble des procédures chirurgicales, une supplémentation hydrique par injection sera effectuée en pré et post opératoire. Une analgésie pré et post opératoire sera réalisée le cas échéant. Pour la procédure d’infarctus du myocarde, le maintien au chaud de la cage sera effectué sur les 48h per-opératoire. Un renforcement de l’enrichissement par de la litière douce (cellulose) et du gel hydrique sera apporté. Le transport des animaux vers le site numéro 2 pour les échocardiographies sera effectué par un transporteur agrée. Les animaux seront dans des boites de transport contenant des croquettes, de l’hydrogel et du coton (ainsi que de la litière).

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies musculaires, car des modèles sont bien établis et récapitulent les pathologies chez l’homme. Le choix de l'espèce murine nous permet également d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés cruciaux dans l’étude précise des cellules d’intérêt de ce projet. La consanguinité des modèles utilisés permet une reproductibilité des résultats et une réduction du nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 1 jour à 30 semaines, car nous étudierons ces pathologies chez le souriceau et à l’âge adulte.

Anesthésiés une heure trente, cathétérisés dans une veine et une artère, équipés d'un bouton fixé à travers la peau, 20 rats sont ensuite perfusés en continu pendant trente heures, seuls dans leur cage. Neuf prélèvements sanguins de 250 microlitres sont effectués pendant cette perfusion, sur animal éveillé. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, l'isolement de trente heures étant lui-même compté par le porteur comme facteur de stress. Le projet cherche à reproduire chez le rat sain des concentrations d'antibiotiques comparables à celles obtenues chez l'humain, étape présentée comme intermédiaire avant une étude d'efficacité. Tous les rats sont tués à la fin, pour vérifier post-mortem l'état du système de perfusion.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un problème de santé majeur. Bien que de nouvelles options de traitement pour les infections graves causées par des bactéries résistantes aient émergé récemment, les résistances continuent d’apparaître. Il est donc essentiel d’étudier de nouvelles combinaisons d’antibiotiques et d’optimiser les traitements pour mieux combattre ces infections. Ce projet vise à tester une combinaison prometteuse d’antibiotiques, identifiée pour son efficacité contre des bactéries résistantes en laboratoire. Avant d’envisager des essais chez l’homme, il est nécessaire de vérifier son efficacité chez l’animal infecté. Une première étude a permis de développer un modèle d’infection rénale fiable chez le rat. Cette nouvelle phase se concentre sur la mise en place des meilleures modalités d’administration de ces antibiotiques. Traditionnellement, les études sont menées sur des souris avec des doses souvent supérieures à celles utilisées chez l’homme, ce qui limite leur pertinence. Ce projet cherche donc à créer un modèle plus réaliste chez le rat, où les concentrations d’antibiotiques ressemblent à celles obtenues chez l’homme. Pour cela, les rats reçoivent une perfusion continue d’antibiotiques à des débits ajustés, afin de compenser l’élimination plus rapide des médicaments chez eux par rapport aux humains. Ce modèle pourrait rendre les études sur l’efficacité des traitements plus proches de la réalité clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pilote permettra d'evaluer les conditions de perfusion continue (débits, durée de perfusion à un débit donné) chez l'animal sain afin de mettre en place une étude de pharmacocinétique humanisée chez le petit animal. Ce projet est une étape intermédiaire nécessaire intervenant dans une étude pharmacocinétique -pharmacodynamique in vivo évaluant de nouveaux schémas posologiques de la combinaison d’antibiotiques qui pourront être, par la suite testés en clinique, afin d’améliorer la prise en charge d' infections sévères chez les patients.

Procédures

Tous les animaux recevront 3 injections sous cutanée d'analgésique et une injection sous cutanée d'anesthésique local . Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale pendant 60 à 90 minutes pour l'implantation de cathéters veineux et artériel et pour la pose d'un bouton transcutané permettant de connecter les cathéters de prélèvements . Les animaux vigiles seront perfusés en continue d'une solution d'antibiotique pendant 30h . Au cours de la perfusion, 9 prélèvements de 250µL de sang sur 30 secondes seront réalisés sur l'animal vigile et libre de ses mouvements .

Impact sur les animaux

- Chirurgie : inconfort transitoire au réveil - Implantation de cathéters intraveineux et artériel à demeure : gêne légère pendant la durée de la perfusion intraveineuse et pendant les prélèvements - une légère perte de poids inférieure à 5 pour cent attendue au lendemain de la chirugie. - Douleur minimisée par traitement antalgique pendant et après la chirurgie et pendant toute la durée de l'étude pharmacocinétique - Isolement de l'animal pendant 30h qui engendre un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour évaluation post-mortem du système de perfusion.

Remplacement

Des résultats préliminaires in vitro ont montré l’efficacité de la combinaison d’antibiotiques étudiée à des schémas posologiques innovants. A notre connaissance, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet aujourd'hui de reproduire ce type d'outils d'évaluation des médicaments incluant la variabilité pharmacocinétique mais aussi dans la réponse aux traitements que l'on va observer avec ce modèle in vivo à terme.

Réduction

Ce projet in vivo a nécessité au préalable de réaliser des simulations nous permettant de déterminer de manière fiable des débits de perfusion ainsi que les durées de perfusions visant à reproduire de manière la plus exacte possible les concentrations humaines chez le rat. En effet, l'élimination des médicaments est plus rapide chez les rats que chez les humains. Des perfusions continues successives à des débits de perfusion variables d'antibiotiques doivent être réalisées afin de compenser cette perte. Ces simulations sont basées sur des données pharmacocinétiques chez le rat et chez l'homme de ces antibiotiques retrouvés dans la littérature, ce qui fait que une idée très précise des débits est connue pour être au plus près des concentrations attendues. A ce titre, le nombre de rats utilisés pour chaque lot (6 au total, dont 3 males et 3 femelles) est le nombre minimal d'animaux permettant de décrire de manière fiable la pharmacocinétique humanisée de chacun des antibiotiques en monothérapie et de leur combinaison en tenant compte d'une éventuelle variablité intersexe qui pourrait être observée, sachant qu'au vu de la pharmacocinétique et notamment de l'élimination exlcusivement rénale de ces médicaments, aucune influence du sexe n'est attendue dans les résultats. Deux animaux supplémentaires ont été ajoutés pour prévenir les éventuels problèmes techniques comme un cathéter qui se bouche, ne permettant pas de réaliser l'expérimentation.

Raffinement

Les rats sont élevés dans des cages standards sur portoir ventilé avec enrichissement (tunnels pour se cacher et des batonnets à ronger) limités à 2 animaux par cage jusqu’à l’étape de la chirurgie. La souffrance des animaux sera évitée ou réduite au maximum. Les techniques chirurgicales seront réalisées sous conditions aseptiques et thermorégulées sous anesthésie générale avec analgésie opératoire et postopératoire. Cette couverture antalgique sera maintenue en continu sur toute la durée du projet. Une grille de suivi du bien-être animal est mise en place pour suivre les animaux tout au long du projet. Des points limites strictes et bien identifiés ont été établis. Le système de perfusion utilisé au cours de cette procédure est un système commercial, validé, sécurisé er robuste permettant à l’animal de se mouvoir librement dans sa cage-bol avec accès à l’eau et nourriture. Il permet une perfusion continue et la réalisation de prélèvements sanguins sans toucher l’animal, réduisant ainsi son stress.

Choix des espèces

La lignée "Sprague-Dawley" est une lignée de rats non-consanguins permettant d’obtenir une variabilité génétique inter-individuelle qui permet de se rapprocher de la variabilité inter-individuelle présente lors d'études cliniques. Cette lignée, qui n'est pas une lignée génétiquement modifiée, est la plus utilisée dans le domaine biomédical et sera donc utilisé dans le cadre de ce projet.