Rongeurs

Comprendre pourquoi une maladie génétique rare abîme surtout les vaisseaux du foie et des poumons: 620 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit trois à dix injections en état vigile, et environ un tiers subit une chirurgie avec perfusion menée sous anesthésie, sans réveil. Le porteur indique que les injections provoquent une douleur passagère, un risque d'infection et d'hématome, et que l'invalidation du gène étudié peut entraîner une perte de poids ou une baisse d'activité, l'état des nouveau-nés étant noté sur une grille qui suit la prise de nourriture, la croissance et la respiration. Les souris portent la modification génétique des patients, et le porteur juge "indispensable" d'en étudier à la fois de jeunes et des adultes.

Objectifs

Nous étudions une une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie génétique rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Différents acteurs sont impliqués dans le développement de cette maladie qui contrôlent qui contrôlent, ensemble, à différents niveaux, la bonne organisation du réseau vasculaire sanguin. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs, on utilise des modèles de souris ne produisant plus certains de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le développement de traitements pour des patients atteints de cette maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte de facteurs connus pour contrôler l’organisation des vaisseaux sanguins principalement dans le foie et les poumons. Ces facteurs sont à l’origine d’une maladie vasculaire génétique. Les patients atteints de cette maladie ont des problèmes de malformations vasculaires hépatiques et pulmonaires. Aucun traitement à cette pathologie n’existe, nécessitant des recherches dans ce domaine.

Procédures

Des injections sur animaux vigiles sont effectuées sur l’ensemble des animaux, au nombre de 3 à 10 maximum et d’une durée inférieure à 30 secondes chacune. Une injection sur animaux anesthésiés est prévue sur moins d’un quart des animaux et d’une durée inférieure à 30 secondes. Une chirurgie avec perfusion est prévue sur environ un tiers des animaux, après administration d’analgésiques et d’anesthésiants, et d’une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections sur animaux vigiles induisent une douleur passagère (quelques minutes maximum), un risque d’infection et d’hématome, ainsi qu’un stress suite à l’immobilisation (maximum 30 secondes). Lorsqu’une chirurgie est prévue, elle est sans réveil et d’une durée inférieure à 10 minutes. Une légère perte de poids ou une diminution d’activité sont possibles à la suite de l’invalidation du gène étudié.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.

Remplacement

Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules des vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un tissu à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre pourquoi cette pathologie touche particulièrement les vaisseaux du foie et du poumon, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel statistique ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires pour garantir la validité des résultats avec un nombre d’animaux minimal.

Raffinement

Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Dans chaque procédure induisant une douleur, des anesthésiants et des analgésiques sont utilisés. Suite à l’anesthésie (après environ 10 minutes), la perte totale de réactivité est testée en exerçant une pression sur les pattes avant d’effectuer tout geste technique invasif. Chez les nouveau-nés, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue la prise de nourriture du nouveau-né, la croissance et la respiration. Chez l’adulte, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue le changement de poids corporel, l’apparence physique et le comportement.

Choix des espèces

Les souris utilisées ont une modification génétique équivalente à celles des patients atteints de la maladie que nous étudions. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le développement des malformations vasculaires de cette maladie. Les animaux seront soit des jeunes pour l’étude des vaisseaux en cours de développement, soit des adultes pour l’étude des vaisseaux stabilisés. Certains symptômes de la maladie sont de naissance, tandis que d’autres apparaissent à l’âge adulte. Il nous apparaît donc indispensable d’étudier les 2 âges.

Évaluer pour un sponsor l'efficacité d'un implant d'hydrogel contenant des îlots de Langerhans humains conduit à utiliser 2 000 souris et 500 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de projet pour récupération des tissus, des organes et du sang. Les implants sont posés ou retirés par chirurgie intrapéritonéale sous anesthésie d'une heure, avec administrations de glucose par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse, jeûnes pouvant aller jusqu'à six heures, et hébergement individuel sans enrichissement pendant deux heures pour la collecte d'urine et de fèces. Le point limite est fixé à plus de 20 % de perte de poids, ou à un maintien au-delà de 15 % pendant plus de trois jours. Le nombre d'animaux par groupe, de 5 à 15, est établi sur les données du sponsor.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel sur une souche de souris immunodéficiente. L’implant est à base d’hydrogel conçu pour le traitement curatif du diabète de type 1 par thérapie cellulaire. En cas de diabète de type 1, les cellules bêta des îlots de Langerhans sont détruites par un mécanisme auto-immun. La transplantation d’îlots de Langerhans est le seul traitement curatif. Cette technique est pratiquée dans différents pays. Cependant, elle se heurte à un obstacle majeur : elle nécessite l’utilisation de traitements immunosuppresseurs lourds (comme toute allogreffe) présentant des effets indésirables importants. L’implant, une matrice immuno-protectrice contenant des îlots de Langerhans, améliore significativement les protocoles actuels de transplantation :

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel chez la souris ou le rat.

Procédures

DDes implants intrapéritonéaux pourront être posés ou retirés par chirurgie. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Des injections ou administration de glucose pourront être réalisées par voie oral, intrapéritonéale ou intraveineuse (durée des injections de quelques secondes). Suite à ces administrations ou injections où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun durant 6h au maximum. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination du composé administré. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement durant une à deux heures (maximum 2heures). En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit (glucose ou autres). Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsque le constat aura été fait que la greffe des ilots de Langerhans est acceptée ou non par les animaux et que l’évaluation de la fonctionnalité des ilots aura été appréciée. Les animaux ayant été greffés ne seront pas réutilisés pour d’autres procédures ou projets.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot sera déterminé sur la base des expériences déjà menées par le sponsor, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue. Un minimum de 5 animaux par groupe devra être inclus (avec un maximum de 15 animaux par groupe). L’utilisation de tests ou d’outils statistiques sur les paramètres mesurés en cours d’étude permettront limiter le nombre d’animaux engagés dans ce projet

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 15% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 15 et 20% du poids : les animaux seront réhydratés avec un soluté de remplissage 1 fois par jour. Une perte de poids de plus de 20% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 15% constituera un point limite. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les poses et retraits d’un implant seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait par animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Pour les implants intrapéritoneaux (pose ou retrait), sera ajouté un analgésique administré avant la chirurgie en sous cutané et/ou un anesthésique local en sous cutané au niveau de la zone d’incision avant l’incision. En fonction de la nature des implants, une couverture antibiotique large spectre pourra être mise en place en per et post opératoire. En fonction de la douleur associée à leur pose, une couverture par anti inflammatoire non stéroïdiens sera potentiellement mise en place. Suite aux chirurgies, de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les sutures seront nettoyées si besoin. La glycémie sera monitorée au cours des premières heures suivant la pose des implants. En cas d’hypoglycémie (par excès d’insuline synthétisé par les ilots), de la nourriture sera ajoutée, de l’eau sucrée pourra être donné au animaux anisi que des injections de glucose en sous cutanée.

Choix des espèces

La souris et le rat seront privilégiés pour évaluer la pharmacocinétique in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation du diabète. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte permettant la réalisation de la chirurgie dans des conditions optimales. Les animaux adultes pourront mieux supporter la chirurgie et les injections ainsi que les potentiels effets secondaires des composés ou dispositifs à tester.

Toutes tuées à la fin des procédures pour éviter la dissémination d'organismes génétiquement modifiés, 2 770 souris transgéniques sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir une greffe de cellules leucémiques, des injections antitumorales deux fois par semaine pendant quatre semaines, un gavage quotidien sur la même durée, jusqu'à douze prélèvements sanguins et trois prélèvements de moelle osseuse. Une partie est irradiée avant greffe, ce que le porteur qualifie d'affaiblissement modéré et transitoire, les animaux à pathologie avancée perdant du poids et s'affaiblissant jusqu'à l'arrêt de la procédure. Sur le remplacement, il conclut que le modèle murin est "incontournable", notamment parce que les lignées cellulaires cultivées divergent des échantillons de patients.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Les mutations sur lesquelles nous travaillons restent de très mauvais pronostic. Dans l'ensemble, l'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Nos résultats précédents indiquent que le stade développemental (ex: fœtal, nouveau-né ou adulte) dans lequel ces altérations surviennent est important. Nos analyses moléculaires suggèrent que des mécanismes induits par ces fusions et des mécanismes de coopération entre différentes mutations sont importants pour les cellules leucémiques. Il est donc indispensable de développer des modèles physiologiques prenant en compte le stade du développement pour comprendre les mécanismes de la transformation leucémique et tester leurs rôles dans l'initiation ou le maintien des tumeurs. A ce jour, l'étude de l'inactivation de certains gènes in vivo, ainsi que le rôle chez l'animal entier ne peuvent pas encore être complètement remplacés par les modèles sophistiqués de remplacement. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies à mauvais pronostic et de tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, dans le contexte d’un organisme entier.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette à court terme: -De caractériser les mécanismes impliqués dans le développement leucémique, le maintien leucémique, la rechute et la résistance aux traitements. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -D’évaluer l’effet de l’inflammation dans le développement et la propagation leucémique. -A plus long terme, nous visons l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces leucémies.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend entre quelques secondes et 3 à 5 minutes en fonction de la voie d'injection. -Injection de molécules: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et sont journaliers sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle: jusqu'à 3 prélèvements par souris avec un intervalle d'au moins 15 jours entre deux prélèvements. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général qui récapitule la maladie humaine nécessitant une surveillance renforcée, des soins puis un arrêt de la procédure. Les gavages pourront entraîner un stress léger et un inconfort temporaire. L’irradiation peut également entrainer à court terme un affaiblissement modéré transitoire des souris .

Devenir

Tous les animaux sont transgéniques et doivent être euthanasiés à la fin de la procédure pour éviter la dissémination des OGM. Des analyses post-mortem sur les organes des animaux permettent aussi de caractériser la pathologie par des analyses histologiques.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération de toutes les cellules du sang n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

Pour déterminer l’efficacité des modèles, nous évaluons le développement tumoral entre les groupes contrôles et les groupes expérimentaux à l'aide de différents paramètres (nombre de globules blanc, globules rouges, plaquettes dans le sang; pourcentage de cellules anormales par les analyses de cytométrie en flux; poids des rates et des foies) grâce à un test statistique. La robustesse des modèles est évaluée en confrontant ces résultats au cours du temps. Les nombres calculés dans ce projet sont des nombres maximaux calculés par des méthodes de calcul de puissance ou limités par le matériel cellulaire disponible (ex: dans le cas de populations purifiées de progéniteurs hématopoïétiques). Pour ce projet, nous avons favorisé l'utilisation de modèles transgéniques développés sur la base d'une expression des oncogènes proche de la physiologie et qui développent des hémopathies de manière pénétrante. Ainsi, le développement tumoral est contrôlé et le nombre de souris utilisé correspond précisément au nombre de souris permettant d'obtenir une valeur statistique des résultats.

Raffinement

Les procédures douloureuses sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie appropriées. Les animaux sont observés avec une fréquence adaptée à la procédure. L'utilisation d'une grille de score nous permet de suivre les animaux et d'intervenir pour les soulager en cas d’observation d'une souffrance. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Comme explicité plus haut, l’irradiation peut entrainer à court terme un affaiblissement des souris. Pour prévenir les conséquences après une irradiation léthale suivie de greffe et assurer le confort des animaux durant le premier mois post-irradiation, une nourriture enrichie est mise à disposition.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisie pour les raisons suivantes : -Les souris possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l'homme et de nombreux modèles de souris existent déjà permettant des croisements avec nos modèles. -Les approches précliniques in vivo sur souris sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères. Les nombreux modèles murins déjà disponibles reposent sur la proximité entre le développement des cellules du sang chez l'homme et la souris et ils permettent de comparer les résultats avec ceux d'autres études. Nous utiliserons des souris adultes et/ou des nouveau-nés et des embryons. Les souris adultes auront entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, un article récent montre l’importance d'utiliser des receveurs à différents stade de développement. Ainsi, nous utiliserons à la fois des cellules fœtales (foie fœtal), des cellules de nouveau-nés et des cellules adultes qui seront greffées dans des receveurs soit nouveau-nés soit adultes, âges qui correspondent à la population de patients..

Six injections intrapéritonéales sur animal vigile, quatre semaines de corticostérone dans l'eau de boisson, quatre prélèvements sanguins hebdomadaires puis un test de tolérance au glucose ou à l'insuline après cinq heures de jeûne : 144 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux tiers d'entre elles reçoivent une dernière injection abdominale sept minutes avant d'être tuées, toutes l'étant pour prélèvement du pancréas, du foie, des muscles et des tissus adipeux. Le porteur indique que la corticostérone peut faire monter la glycémie, augmenter l'émission d'urine et la prise de boisson, et provoquer une perte de poids. L'enjeu déclaré reste une étape de connaissance sur la contribution du muscle squelettique à l'adaptation du pancréas, sans application annoncée pour les 4,3 millions de personnes diabétiques que le porteur cite à l'appui du projet.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. Le pancréas est capable d’augmenter sa production d’insuline en réponse à une résistance à l’insuline des tissus périphériques tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Toutefois, la communication entre ces organes et qui sous-tend cette adaptation pancréatique reste méconnue. Le laboratoire a développé un modèle murin d’insulino-résistance par traitement chronique aux glucocorticoïdes (GC) et a caractérisé l’adaptation pancréatique qui en découle. Cependant, la contribution des différents tissus sensibles à l’insuline reste méconnue. Des résultats indiquent un rôle important des muscles squelettiques en réponse aux GC. L’objectif du projet est de définir la contribution des muscles squelettiques dans les conséquences métaboliques et l’adaptation pancréatique en réponse à un traitement chronique aux GC chez la souris.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Il est bien connu que le pancréas est capable de produire plus d'insuline lorsque les tissus comme le foie, le tissu adipeux et les muscles deviennent moins sensibles à cette hormone, ce qui est appelé résistance à l'insuline. Cependant, on comprend encore mal comment ces organes communiquent entre eux pour permettre cette adaptation du pancréas. Nous avons développé un modèle chez la souris où la résistance à l'insuline est induite par un traitement prolongé avec des glucocorticoïdes (un type de médicament souvent utilisé pour réduire l'inflammation). Ce modèle nous permet de mieux comprendre comment le pancréas réagit à cette situation. Le but de notre projet est de découvrir le rôle des muscles dans cette réponse et dans les changements métaboliques qui surviennent suite à un traitement prolongé avec ces médicaments chez la souris.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement par injections intrapéritonéales afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours puis une injection unique de rappel 4 semaines après, soit un total de 6 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite soumis à un traitement via l’eau de boisson durant 4 semaines. Nous réaliserons des prélèvements sanguins de faible volume effectués une fois par semaine pendant 4 semaines. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 4 prélèvements sur la durée de traitement. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées en intrapéritonéal et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Une partie des animaux (environ 2/3) subira une injection unique au niveau de l’abdomen 7 minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

L’induction du modèle génétiquement modifié reposent sur une injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours puis une injection unique un mois après, pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Aucun effet secondaire n’a été décrit dans la littérature pour cette administration. L’administration de corticostérone via l’eau de boisson pourrait induire un stress de courte durée lors de sa mise en place en raison de la peur de la nouveauté des souris (néophobie) et après plusieurs semaines le traitement pourrait induire un une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements sur les adaptations métaboliques et pancréatiques en présence ou non du récepteur des glucocorticoïdes dans les muscles squelettiques. Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de définir comment produire un plus grand nombre de cellules produisant de l’insuline dans le pancréas et notamment comment le muscle squelettique produit des facteurs qui induisent l’adaptation pancréatique. Nous étudions donc la communication inter-organes adaptative. Un organisme vivant est nécessaire pour définir la contribution spécifique des organes et notamment des muscles squelettiques. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 144 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les différents types de muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte concerne les injections intrapéritonéales pour induire le modèle génétiquement modifié qui seront effectuées par du personnel formé au geste. De même, l’administration via l’eau de boisson de glucocorticoïdes sera surveillée et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous avons montré qu’il existait une adaptation pancréatique chez les souris traitées aux glucocorticoïdes (GR). Le projet actuel vise à caractériser plus en avant cette adaptation en absence du GR dans le muscle squelettique. Ce modèle d’invalidation du GR est disponible chez la souris. C’est la raison pour laquelle nous souhaitons réaliser nos expériences chez la souris. Justification des stades de développement Les études se feront avec des animaux adultes. En effet, le projet s’intéresse aux adaptations métaboliques et pancréatiques en réponse à un traitement chronique aux GC, ce qui nécessite de réaliser les expériences dont le métabolisme glucido-lipidique est fixe, c’est-à-dire chez des souris adultes, post-sevrage et post-puberté. En effet, le sevrage est associé à des modifications profondes de l’utilisation des substrats énergétiques car l’alimentation pré-sevrage est principalement lipidique (lait maternel) tandis que l’alimentation post-sevrage est majoritairement glucidique. D’autre part, la puberté est associée à une insulino-résistance transitoire qui pourrait impacter nos études métaboliques.

80 souris, 40 rats et 40 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des séances de travaux pratiques impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est contenu vigile, examiné, gavé pour les rongeurs, puis anesthésié pour subir deux à quatre prélèvements veineux et une à deux injections par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse et intradermique ou sous-cutanée, les lapins recevant en plus un cathéter à l'oreille et un tatouage. Le porteur compte un animal par participant pour les souris, un pour deux participants pour les rats et les lapins, et signale l'accident anesthésique comme effet indésirable le plus fréquent. Les rats et les lapins tués servent ensuite à une séance de dissection anatomique.

Objectifs

La licence professionnelle dont le présent projet décrit la partie pratique sur animaux de laboratoire est un diplôme inter-universitaire de niveau bac+3. Il s’agit d’une formation spécifique destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales sur animaux vivants.Elle vise à former des spécialistes sensibilisés à l’éthique en lien avec l’utilisation des animaux à des fins scientifiques . D’un volume total de 550 heures, cette formation comporte une partie d’un volume de 150 heures portant sur les aspects liés à l’animal parmi lesquelles 50 heures environ sont consacrées à des travaux pratiques.

Bénéfices attendus

Dans le cadre des formations obligatoires des personnes appelées à intervenir dans des projets de recherche impliquant des animaux, il est indispensable que les apprenants pratiquent sur des animaux vivants les actes techniques autorisés par cette formation les plus courants. Depuis le début de 2016, une séance de travaux pratiques sur des modèles inertes (mannequins de rats, modèles d'oreilles de lapins, ...) est organisée préalablement aux séances de travaux pratiques sur animaux vivants objets de la présente demande d'autorisation de projet. Cette séance permet d’acquérir la maitrise technique des gestes avant de les pratiquer sur des animaux vivants et de réduire ainsi le risque d’infliger une douleur, un stress ou une lésion à un animal (Raffinement). Il demeure que la réalisation ou l'observation d'actes pratiqués sur l'animal vivant est une partie essentielle à la qualité de la formation des personnels ayant à les réaliser dans leur activité professionnelle, garantissant ainsi des gestes en conditions réelles techniquement mieux réalisés, plus sereinement, cela au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. Ces séances sont animées par un nombre conséquent d’encadrants (un encadrant pour six participants) très expérimentés, motivés par la transmission de leurs savoir-faire et très attentifs au bien-être des animaux.

Procédures

Les animaux, vigiles, sont soumis à la contention, un examen général, pour les souris et les rats à un gavage (5 min) et une injection pour l'induction de l'anesthésie générale (environ 20 min), puis sous anesthésie générale à 2 ou 4 prélèvements veineux (10 min), la réalisation de 1 à 2 injections de chacune de ces voies (intra-musculaire, intra-péritonéale, intraveineuse et intra-dermique ou sous cutanée, 20-30 min environ), et pour les lapins à la mise en place d'un cathéter à l'oreille (5 min) et la réalisation d'un tatouage (5 min).

Impact sur les animaux

La contention des animaux et la réalisation des premiers gestes avant anesthésie induisent un stress des animaux. L'administration de l'analgésique et de l'anesthésique peut engendrer une douleur légère au moment de la piqûre. L’effet indésirable le plus fréquent est un accident anesthésique chez un rat, une souris ou un lapin.

Devenir

Les rongeurs et les lapins sont mis à mort à l’issue de la séance car aucune utilisation ni aucun replacement ne peut être envisagé pour ce nombre d’animaux, après réalisation de plusieurs gestes dont des prélèvements rétro-orbitaires et après rupture de leur statut sanitaire lors de cette séance. Les rats et les lapins mis à mort sont ensuite utilisés pour une séance de dissection.

Remplacement

Il en va du bien-être des animaux ultérieurement manipulés par nos participants dans leur exercice professionnel qu'ils aient pratiqué ou au minimum vu pratiquer la plupart des gestes courants et peu invasifs pouvant être utiles à la réalisation de projets de recherche. Pour cette raison, les animaux vivants ne peuvent être remplacés intégralement par des modèles inertes. Toutefois, nos participants commencent toujours par pratiquer les mêmes gestes sur des modèles en silicone.

Réduction

Ce projet nécessite pour 5 ans l’utilisation d’un total de 80 souris,40 rats et 40 lapins au maximum. Le nombre d'animaux utilisés correspond à une souris par participant, un rat et un lapin pour 2 participants, ce qui est le minimum pour que la qualité de l'apprentissage soit suffisante. Par ailleurs, les rats et les lapins mis à mort lors du TP d’administrations et prélèvements sont ensuite utilisés lors de la séance de dissection pour l’anatomie.

Raffinement

La douleur, le stress et le risque de lésion sont réduits au maximum grâce un entrainement des participants sur modèles inertes, à un encadrement nombreux et de qualité, tourné vers l’accompagnement des participants et le respect des animaux, et au fait que les gestes les plus douloureux ou stressants sont réalisés sous anesthésie générale. Les protocoles d’analgésie et d’anesthésie sont optimisés pour les gestes réalisés. L’accent est mis tout au long des travaux pratiques sur le respect des animaux et la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles. L’objectif est clairement énoncé aux participants que ces travaux pratiques doivent leur servir à réaliser par la suite l’ensemble de ces gestes nécessaires dans les meilleures conditions possibles pour le respect de l’animal et la pertinence des résultats scientifiques. Des points limites précoces sont mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Le rat, la souris et le lapin sont les modèles les plus pertinents pour le module rongeurs-lapin, de par la fréquence de leur utilisation et leur différence de taille qui permet d’appréhender la variation des gestes techniques. Les animaux commandés sont des souris d’environ 16 semaines (environ 30 g) ,des rats de 6-7 semaines (250-300 g), et des lapins. Les animaux sont choisis pour leur couleur blanche qui facilite la détection des veines caudales, leur calme et leur taille adaptée aux manipulations. Adultes pour les souris (16 semaines), jeunes adultes pour les rats (6-7 semaines), jeunes adultes pour les lapins (environ 4 à 6 mois). Les animaux sont ainsi de taille suffisante sans être trop gras (ce qui rendrait l’anesthésie plus difficile et donc dangereuse), avec une bonne homogénéité des lots pour faciliter la gestion anesthésique.

Neuf semaines de traitement dans l'eau de boisson, une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, deux injections intrapéritonéales et un poinçonnage de l'oreille : 850 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. L'objectif déclaré est d'identifier les signaux du microbiote intestinal qui font mûrir le système immunitaire inné. Le porteur annonce une étude en condition d'équilibre physiologique, avec peu d'interventions invasives, tout en décrivant une inflammation intestinale susceptible d'entraîner diarrhées, déshydratation, douleurs abdominales, prostration, arrêt du toilettage, prolapsus rectaux et amaigrissement rapide. Le choix de la souris tient à la disponibilité des anticorps et à la ressemblance, affirmée, des processus inflammatoires intestinaux avec ceux de l'humain.

Objectifs

Le système immunitaire permet de se défendre contre les infections. Pour qu’il soit performant, le système immunitaire doit se préparer et entraîner en permanence, grâce aux signaux donnés par l'ensemble des microorganismes qui résident dans notre intestin. Ces signaux non inflammatoires entraînent la maturation du système immunitaire, le préparant ainsi à combattre de futures infections. Le système immunitaire comporte deux branches principales : l’inné, qui réagit rapidement mais de manière générale, et l’adaptative, qui répond plus subtilement et spécifiquement. Bien que distinctes, ces deux unités sont en interaction constante. Ce projet permettra de définir certains mécanismes moléculaires, microbiens et cellulaires qui maturent notre système immunitaire durant l'homéostasie.

Bénéfices attendus

Les cellules immunitaires constituent une des premières lignes de défense contre les infections et le développement de tumeurs. Ainsi, l’identification de mécanismes permettant la bonne maturation/préparation du système immunitaire en condition homéostatique est primordiale pour prévenir les infections et les tumeurs.

Procédures

Injection en rétro-orbitaires aprés anesthésie gazeuse (1 fois 2 min/souris) - Injections intrapéritonéales (2 fois 20sec/souris)- Légère contention et pesée des souris (20s/2 fois par semaine) – Poinconnage oreille (biopsie 1 mm, 20sec/1 fois)

Impact sur les animaux

- Léger stress dû à la contention. Mais le geste et maitrisé et ne durera pas plus de 20 secondes. - Récolte des fécés : procédure non invasive et rapide (2 fois). Traitement dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 9 semaines (procédé non invasive et aucun problème de prise hydrique n'est observée). L’inflammation intestinale amène à des problèmes d’hydratation consécutifs à une forte diarrhée. Elle génère des problèmes de transit telle la diarrhée. La douleur abdominale peut aussi entraîner des prostrations longues, un isolement anormal de l’animal, et une absence de toilettage. Des rectoprolapses devront être aussi surveillés. Un amaigrissement rapide de l’animal est tout autant un signe de l’inflammation intestinale à scruter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement de divers tissus. Ces prélèvements permettront de mesurer différents marqueurs inflammatoires.

Remplacement

La maturation du système immunitaire est un processus complexe qui implique l'interaction de divers acteurs, tels que le microbiote, le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif, et ne peut actuellement être étudiée qu'à l'échelle de l'organisme entier. Par ailleurs, nous avons renforcé nos hypothèses et éliminé un grand nombre de pistes en effectuant une recherche bibliographique exhaustive et en réalisant divers tests in vitro, réduisant ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet.

Réduction

Nous avons toute l’expertise immunologique et technique. Ainsi, il n’y a pas de mises au point nécessaires. Utilisation de techniques d’analyses multiparamétriques ce qui réduit considérablement le nombre de matérielsbiologiques nécessaires. Optimisation maximale des échantillons biologiques. Le nombre de souris proposées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Ce nombre a été calculé à partir d’outil statistique. Ce nombre peut encore être réduit si les tests de prises de décisions ne valident pas nos hypothèses avancées. Nous utilisons mâles et femelles ce qui limite considérablement le nombre de souris à générer.

Raffinement

- Notre étude s’intéresse au comportement du système immunitaire en condition homéostatique (en condition d’équilibre physiologique), ainsi peu d’intervention invasive sera faite - Un suivi quotidien des animaux (zootechnicien +expérimentateur) permettant un repérage rapide des premiers signes de mal être (tel que l’isolement, des mouvements ralentis ou anormaux, présence de selles molles dans la cage). – Des points limites définis et précoces nous permettant d’agir rapidement ont été mis en place. – Hébergement en portoirs ventilés et manipulation des souris strictement dans un environement stérile (Hotte à flux laminaire) afin que le phénotype dommageable ne s'exprime pas - Anesthésie des animaux lors de manipulations invasives comme l’injection rétro orbital de cellules et ainsi réduire le stress de l’animal et éviter des mouvements de l’animal pouvant le blesser. – Pour favoriser le bien-être des animaux, leur environnement sera enrichi de maisonnettes en cartons pour se cacher et de bâtonnets en coton pour créer un nid. - Pas d’isolement des souris pour respecter au tant que faire ce peu le comportement social des souris

Choix des espèces

L’ensemble des outils, anticorps pour ce genre d’études sont développés chez la souris. Par ailleurs, son système immunitaire intestinal est extrêmement bien caractérisé et les processus inflammatoires intestinaux décrits chez la Souris sont souvent conservés et similaires à ceux observés chez l’Homme. Le stade adulte (souris 2 mois) est choisi de façon à avoir un système immunitaire mature et une flore commensale stable et complète. Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude pour minimiser le biais lié au sexe dans nos observations.