Rongeurs

Perte de poids, dégradation de l'état général et perte de mobilité déclenchent la mise à mort avant le terme prévu. 3 255 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem. Chacune reçoit une greffe de cellules leucémiques humaines directement dans le tibia sous anesthésie, puis des traitements oraux, intrapéritonéaux ou intraveineux quotidiens ou bi-quotidiens, et des prélèvements de sang à la patte sur animal vigile atteignant 15 % de son volume sanguin sur 28 jours, pendant 60 à 120 jours d'étude. L'établissement présente ce modèle comme un outil à intégrer dans son processus de sélection de candidats médicaments, plus fidèle que la greffe sous la peau qu'il reconnaît pourtant moins invasive.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM ou AML en anglais) est un cancer hématologique relativement rare dont le besoin thérapeutique reste important. Elle représente environ 1,2 % de l'ensemble des cancers diagnostiqués chaque année dans le monde. L’AML est une pathologie agressive qui se développe rapidement et nécessite une prise en charge rapide. Le pronostic des patients atteints d’AML reste sombre malgré les progrès réalisés ces dernières années. Le taux de survie globale à 5 ans pour l’AML est d'environ 25 % chez les adultes, mais il chute considérablement avec l'âge, atteignant moins de 10 % chez les patients de plus de 65 ans. L’AML peut également toucher les enfants, elle représente 15 à 20% des leucémies pédiatriques. L'arsenal thérapeutique contre l’AML se compose principalement de la chimiothérapie intensive, des thérapies ciblées pour certaines mutations, et de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, ces traitements présentent des limites importantes : une toxicité élevée, une résistance des tumeurs aux thérapies ciblées et surtout des options limitées pour les rechutes. Les AML se développent au sein de la moelle osseuse, puis se disséminent dans le système sanguin ou lymphatique. C'est dans cet environnement propice à la croissance et à la différenciation des cellules sanguines que les cancers des cellules hématopoïétiques prennent leur origine et se développent en premier. L’objectif de ce projet consiste à mettre en place et à intégrer dans nos études sur la souris immunodéprimée (sans système immunitaire, permettant la greffe de tumeur humaine), la greffe orthotopique (qui est située à son emplacement anatomique habituel) des leucémies, via une injection de cellules tumorales dans l’espace intra-tibial, l’un des sièges de la moelle osseuse qui présente l’intérêt d’être facile d’accès. Ce modèle présente un intérêt particulier pour l’étude de la pathologie humaine. En effet, il y a une diffusion des cellules tumorales dans le système sanguin avec pour résultante le développement de signes cliniques similaires à ceux rencontrés chez le patient. Cette approche vise à mieux reproduire les conditions de développement pathologique chez le patient, rendant ainsi les observations et les conclusions obtenues chez la souris plus pertinentes pour les futures applications cliniques.

Bénéfices attendus

Actuellement, parmi les modèles de recherche préclinique utilisés pour étudier les cancers, l’évaluation de l’efficacité et de la pharmacodynamie (vérification de l’atteinte de la cible thérapeutique) des thérapies candidates s’effectue sur des cellules tumorales greffées sous la peau de la souris avec mesure au pied à coulisse de la taille des tumeurs. Cependant cette approche ne récapitule pas l’ensemble des conditions environnementales et pathologiques des maladies du sang chez l’Homme (telles que la leucémie). Les greffes en intra-veineuse (IV) quant à elles miment la propagation de la maladie chez l’Homme dans le sang ou la lymphe, mais le micro-environnement initial n’est pas le même. Le modèle de greffe intra-tibiale, est quant à lui plus représentatif de la physiopathologie chez le patient. Il permet de sélectionner les futurs candidats médicaments dans un contexte de propagation tumorale qui reproduit plus fidèlement le contexte environnemental et pathologique du patient lors du développement de leucémies. Ce modèle vise à être intégré dans notre processus de sélection et de caractérisation de candidats thérapeutiques dans les pathologies de leucémies en complément de la greffe IV qui reste cependant moins invasive que la greffe intra-tibiale. Le choix de l’un ou l’autre de ces modèles dépendra de nombreux paramètres, tel que l’indication finale d’application du candidat médicament, la question posée ou l’objectif de l’expérience par exemple. En outre, certaines formes de cancer hématologique ne peuvent pas être reproduites chez la souris par greffe sous-cutanée ou intraveineuse, car le microenvironnement n'est pas adapté à leur développement. La greffe intra-tibiale favorise la croissance de ces tumeurs, car elle reproduit le microenvironnement propice à leur développement. Contrairement à la greffe en sous-cutanée qui permet un taux de prise de la greffe oscillant entre 70% et 90%, la greffe intra-tibiale permet un taux de prise proche de 100% ainsi que des tumeurs plus homogènes (selon sources bibliographiques). Ce modèle nous permettra donc d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments pour le traitement de l’AML.

Procédures

- Analgésie préalable à la greffe : injection sous cutanée 20 à 30 minutes avant la greffe (10 secondes/souris) - Greffe intra-tibiale pour l’implantation des cellules tumorales : cette procédure prendra moins de 5 minutes et sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale gazeuse de quelques minutes. - Prélèvements de sang au niveau des membres inférieurs sur animal vigile, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de l’envahissement tumoral ou le suivi pharmacocinétique) (environ 20 secondes par prélèvement par souris). Réitération toutes les 3 semaines. - Traitements sur animal vigile : administrations aigues orales, intra-péritonéales ou intra-veineuses de candidats médicaments (10 à 15 secondes par souris). Traitements sur plusieurs semaines, en quotidien ou bi-quotidien. Dans le respect des limites éthiques.

Impact sur les animaux

Dans de rares cas, gonflement ou hématome au niveau du genou, provoquant une douleur modérée. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la patte doivent être effectués une fois par semaine et ce toutes les 3 semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation (60 jours s’il n’y a pas d’envahissement tumoral ou 120 jours lors des études d’efficacité avec des candidats médicaments qui provoquent la disparition des cellules tumorales) : - Piqûre au niveau de la veine saphène et prélèvement du sang qui provoque une douleur légère. Ce geste dure au maximum 1 minute par animal. L’envahissement tumoral des leucémies dans la moelle osseuse et dans le sang peut provoquer une perte de poids ainsi que l’apparition de divers signes cliniques : détériorations de l’état général et altération de la mobilité.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié en fin d'étude (ou cours d'étude en cas d’apparition de signes cliniques limites) pour réalisation d'études post-mortem.

Remplacement

L’identification de candidats médicaments est réalisée selon différentes étapes. Les premières études réalisées in vitro permettent de caractériser les composés candidats et de ne sélectionner que les molécules les plus efficaces en amont des études in vivo. Mais à l’heure actuelle, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité d’une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et c’est encore plus complexe pour des maladies du sang. Aussi les études in vivo demeurent indispensables pour étudier les effets pharmacologiques d’un candidat médicament, ses potentiels effets secondaires et prédire ses effets potentiels chez l’homme. La greffe intra-tibiale représente un modèle d’intérêt pour la recherche de produits anti-cancéreux dans le cadre du traitement des AMLs puisque ce modèle se développe dans le tissu d’origine, qu’il récapitule de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine et qu’il reconstitue les interactions entre les cellules tumorales et leur micro-environnement. Ainsi à ce jour, il n’y a pas de méthode substitutive. De plus, le modèle sera utilisé dans des phases avancées de développement des candidats médicaments, lorsque l’on se rapproche des phases cliniques chez le patient. Il visera à évaluer un nombre restreint de candidats médicaments dans ce modèle complexe et translationnel.

Réduction

Un des intérêts majeurs dans la mise en place de cette approche expérimentale, en plus du fait qu’elle reproduise très finement la complexité environnementale du contexte pathologique qui existe chez le patient, est qu’elle permet un taux de réussite de greffe chez la souris proche de 100%, soit la quasi-totalité des souris greffées qui pourront être incluses dans les études. Les candidats médicaments testés dans ce projet sont issus d’une présélection drastique in silico et in vitro incluant de nombreux modèles substitutifs à l’utilisation de l’animal. Les candidats médicaments sont également évalués en amont pour les aspects de sécurité non clinique et pour définir des doses non toxiques à administrer aux souris. Selon les besoins, une évaluation pharmacocinétique (permettant d’apprécier la distribution des candidats médicaments dans le système sanguin) sera intégrée au sein des études d’efficacité thérapeutique, permettant ainsi de ne pas réaliser deux études indépendantes et ainsi réduire le nombre d’animaux. Pour les prélèvements de sang de cette partie pharmacocinétique, la technique de prélèvement à la veine du membre inférieur, sera privilégiée, donnant la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal, dans le respect des limites physiologiques et des préconisations applicables au bien-être animal. Le nombre d’animaux par groupe pour la première phase dédiée à la détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale est déterminé sur la base bibliographique de chaque lignée tumorale à étudier, et en respect des volumes de sang prélevables recommandés par la SBEA. Des études statistiques pour cette première étape seront focalisées sur la différence entre mâles et femelles. Nous réaliserons ensuite des études statistiques et nous prendrons en compte l’avancement du développement des candidats médicaments afin de réduire le nombre de groupe par étude si possible : une approche statistique basée sur les données de détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale permettra potentiellement d’affiner le nombre d’animaux par groupe ou le nombre de groupe/étude pour l’étude de l’efficacité des composés.

Raffinement

• Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Un scoring individuel (axé sur l’activité et le comportement en complément des points limites standards et spécifiques au modèle sont mis en place afin de pouvoir suivre le bien-être animal et limiter toute souffrance). • Pour des prélèvements de sang, la technique de prélèvement de sang à la veine latérale du membre inférieur, sera privilégiée. Le volume total de prélèvement est conforme aux recommandations de la structure de bien-être animal afin de respecter la volémie physiologique et le bien-être animal. Cette technique est peu invasive. • Pour la greffe en elle-même, les animaux seront anesthésiés et sous analgésie, protégés de l’hypothermie par l’utilisation de tapis chauffant. Un gel oculaire sera appliqué pour prévenir la sécheresse oculaire et une administration sous cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir la déshydratation. • À la suite de la greffe, il sera nécessaire de comprimer la zone d’injection par des gestes sûrs et acquis auprès d’un expert formateur afin d’éviter les risques de complications post injection. Les candidats médicaments sont également préalablement évalués pour les aspects de sécurité non clinique et les doses administrées dans ce modèle sont déterminées comme non toxiques pour le rongeur.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.

288 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie profonde pour prélever un volume important de sang. Chacune reçoit une injection sous-cutanée sur animal vigile de cellules coliques humaines exposées pendant plusieurs mois à trois pesticides, puis un prélèvement dans le sinus rétro-orbital. La question posée consiste à savoir si ces cellules, déjà transformées en culture par les pesticides, forment une tumeur une fois greffées. Le porteur justifie ce passage à l'animal par le fait que ces pesticides sont commercialisés depuis trop peu de temps pour qu'une étude épidémiologique soit possible chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Au cours de ces dernières années, certains facteurs environnementaux sont apparus comme une cause possible de l'augmentation de la prévalence de maladies chroniques, y compris certains cancers. In vitro nous avons observé qu’une exposition chronique de cellules non tumorales coliques pendant plusieurs mois à trois pesticides, seuls ou en cocktail provoque des changements importants et irréversibles (persistant après la levée de l’exposition). Notre objectif est de déterminer si ces altérations reflètent un mécanisme de cancérisation des cellules et si cette exposition chronique aux pesticides peut favoriser ou non le développement tumoral.

Bénéfices attendus

L’objectif est de déterminer si l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales à trois pesticides fréquemment détectés dans notre alimentation favorise ou non le développement tumoral. La mise sur le marché de ces composés est en effet encore trop récente pour permettre de mener des études épidémiologiques chez l’homme et estimer le risque que peut représenter une exposition chronique à ces composés sur la santé humaine. L’étude permettra également de valider des biomarqueurs tumoraux sanguins destinés, à terme, à améliorer le diagnostic et suivi des patients atteints de cancers

Procédures

La procédure implique au maximum une injection sous-cutanée sur animal vigile en début d’expérience (moins d'1 minute) et un prélèvement sanguin sur animal anesthésié en cours d’expérience (1-2 minutes maximum).

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à une légère douleur de courte durée lors des injections de cellules chez l’animal vigile. On peut également s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables majeurs sauf peut-être de très rares cas de détérioration de l’état général des animaux (perte de poids, par exemple) ou de nécrose de la tumeur. Un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital au cours du suivi du développement tumoral chez l’animal anesthésié ne devrait pas non plus occasionner de nuisance particulière, si ce n’est peut-être une légère douleur ou inconfort au réveil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde (sans réveil) et sous analgésie pour permettre le prélèvement d’un volume de sang important.

Remplacement

Nos résultats in vitro démontrent que l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales aux pesticides provoque des changements morphologiques importants et irréversibles. La question que nous posons est de savoir si ces cellules ont acquis la capacité de développer une tumeur, une question qui ne peut être résolue qu’in vivo, dans un microenvironnement complexe. Il n’y a, en effet, pas de systèmes alternatifs pour évaluer de façon fiable le processus d’initiation tumorale.

Réduction

Pour tester l’hypothèse selon laquelle l’exposition aux pesticides in vitro pourrait conférer à nos cellules une capacité à former des tumeurs lorsqu’elles sont xenogreffées chez la souris nude, nous avons évalué, à l’aide du logiciel G-Power, le nombre minimum requis de souris par groupe à 8 pour obtenir des données statistiquement valides.

Raffinement

La procédure a été optimisée au cours d’études similaires précédentes, dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés afin de détecter le moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions (injection d’analgésique et si nécessaire, euthanasie).

Choix des espèces

La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie sont nombreuses, bien documentées et bien validées. En particulier, les modèles de souris immunodéprimées sont idéaux pour la recherche sur les greffes de cellules cancéreuses et sont classiquement utilisés pour analyser la réponse tumorale. Après 1 semaine d’acclimatation en zone d’hébergement, les souris agées de 6 semaines seront réparties de manière homogène entre les lots à raison de 8 souris/lot. Les souris adultes offrent en effet un modèle expérimental plus robuste, stable et pertinent pour les études de xénogreffe tumorale (plus grande facilité de manipulation, meilleure tolérance des procédures, croissance tumorale plus prévisible et plus uniforme, pertinence par rapport à la tumorigenèse humaine qui est plus fréquente chez les adultes).

Les souris de ce projet développent une maladie auto-immune, spontanément pour certaines lignées ou après induction, avec perte de poids, gonflement des ganglions et inflammation de la peau ou des articulations. 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leur sang et leurs organes. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant huit à douze semaines, une irradiation du corps entier sur animal vigile, et jusqu'à sept prélèvements sanguins mensuels. Les anticorps testés disposent déjà d'une autorisation de mise sur le marché chez l'être humain contre certains cancers du sang, ce qui permet au porteur d'annoncer une translation "extrêmement rapide" tout en qualifiant ces données murines d'"incontournables".

Objectifs

Les maladies auto-immunes (MAI) systémiques sont des maladies rares caractérisées par l’attaque du système immunitaire sur son hôte, responsable de douleurs et de lésion d’organe altérant significativement la qualité de vie des malades. Les traitements actuels reposent sur des immunosuppresseurs qui permettent d’améliorer les symptômes sans toutefois assurer de guérison, au prix d’une augmentation du risque infectieux et de maladies cardiovasculaires (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral). De nouveaux traitements pourraient révolutionner la prise en charge des MAI. Parmis eux, de nouvelle thérapie permettant cibler les cellules responsables de la production d’anticorps pathogènes sont particulièrement interessantes. Il s’agit d’approches utilisant thérapie cellulaire par reprogrammation des globules blanc . Ces approchent semblent efficaces dans plusieurs maladies auto-immunes chez la souris et chez l’homme. Toutefois, il s’agit d’une technique couteuse, difficile à mettre en place, et qui pourrait être responsable de complications graves à long terme (cancer du sang). Ainsi, les anticorps thérapeutiques pourraient remplacer les CAR-T cells mais leur efficacité dans les maladies auto-immune n’a pas été étudiée. En outre, des traitements ciblant les interactions entre les plaquettes sanguines et cellules immunitaires, pourraient améliorer les symptômes tout en diminuant le risque cardiovasculaire et sans favoriser les infections. Ainsi, ces nouvelles thérapies pourraient répondre à des besoins urgents dans la prise en charge des patients atteints de maladie auto-immunes. Objectif global : identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies auto-immunes (MAI).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’apporter des données pré-cliniques solides visant à promouvoir l’utilisation de nouvelles thérapies à anticorps chez les patients atteints de maladies auto-immunes systémique sévère. Ces traitements ont déjà une Autorisation de Mise sur le Marché chez l’Homme dans d’autres maladies (pour traiter certains cancers du sang). De ce fait, si ce projet est concluant, la translation des résultats (évaluation de ces traitements) chez l’Homme pourra être extremement rapide, avec un bénéfice attendu majeur chez les patients atteints de maladie auto-immunes.

Procédures

→ Deux injections sous anesthésie, Durée de deux fois cinq minute comprenant l’anesthésie ou deux injections par semaine pendant 8 à 12 semaine durant 1 minute chacune → Une irradiation corps entier chez un animal vigile pour une durée de moins de trois minutes. → Un prélèvements sanguin sous anesthésie générale une fois pa rmois jusqu’à la fin de l’expérimentation (7 prélèvements maximum).

Impact sur les animaux

Le projet utilise des modèles souris spontanés ou induits caractérisés par le développement progressif d’une maladie autoimmune, responsable d’une perte de poids et d’un développement de ganglions. Les animaux subiront : > Stress due aux manipulations de la souris. > Inflammation de la peau ou des articulations due à la maladie auto-immune. > Douleur transitoire aigue et de courte durée suite aux injections de traitement et aux prélèvements

Devenir

A la fin de l'expérimentations, les animaux seront mis à mort dans l’objectif d’étudier l’impact des traitements sur la maladie auto-immune (étude du sang et des organes).

Remplacement

Les nouvelles stratégies thérapeutiques testées ici ont déjà été testées in vitro et on démontré leur efficacité sur leur mécanisme d'action. L'objectif du projet est d'étudier l'impact de ces traitement à l'échelle de l'organisme et notamment au sein des tissus affectés par la maladie auto-immune. Ces données pré-cliniques sont les dernières à acquérir avant d'envisager un traitement de patients atteints de maladie auto-immune, elles sont donc incontournables.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été déterminée en amont. Le nombre de souris nécessaire a été calculé à l’aide d’outil mathématiques pour chaque question posée afin d’obtenir des résultats statistiquement robustes et fiables.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements de leur environnement permettant d’améliorer le confort des souris (papier kraft, dome, tunnels). L’état de santé des animaux sera examiné de façon hebdomadaire. Des points limites ont été définis afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques. Les injections et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour diminuer l’inconfort. Une analgésie sera mise en place lorsque nécessaire. Les souris seront acclimatées pendant minimum 7 jours à l’utilisation pour réduire le stress des manipulations. Une habituation des animaux à leur manipulation sera faite préalablement au début de l’expérimentation.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 2 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 à 18 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent, selon la lignée étudiée).

Gavées une fois par jour pendant douze semaines, soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes et à une incision du bout de la queue pour un prélèvement de sang, 5 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet consiste à reproduire chez la souris des anomalies de comportement et de transit intestinal associées à l'autisme, en administrant des métabolites bactériens à des animaux dès l'âge de quatre semaines. Le porteur annonce des batteries de tests évaluant le comportement social, les comportements répétitifs et l'anxiété, avec des durées allant de quatre minutes trente à soixante-douze heures, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un partenaire crucial pour la santé humaine. Des études récentes montrent l’existence d’un axe de communication microbiote-intestin-cerveau par lequel le microbiote peut influencer le comportement. L'autisme, avec une prévalence de 1% s'accompagne de troubles comportementaux (déficits d'intéraction sociale, stéréotypies) et de comorbidités (anxiété, dépression, hyperactivité). Aussi les patients autistes ont fréquemment des symptômes gastro-intestinaux (constipation, diarrhée, douleurs abdominales, ballonnements) associés à des altérations des abondances de certaines bactéries de leur microbiote intestinal et des petites molécules qu’elles produisent, les métabolites microbiens. Ces anomalies sont aussi reproduites dans des modèles souris d’autisme. Les causes de l’autisme sont encore méconnues, mais des dérégulations de l’axe cerveau-intestin-microbiote semblent y jouer un rôle. Cela suggère que des thérapies ciblant les bactéries du microbiote ou bien les métabolites qu’elles produisent pourraient être bénéfiques, comme par exemple le transfert de microbiote, les probiotiques et les prébiotiques. Leur efficacité reste cependant à démontrer. Des métabolites issus de la dégradation de l’alimentation par les bactéries du microbiote présentent des niveaux anormalement élevés ou bas dans l'urine, le plasma et les selles de patients autistes. Les bactéries productrices et consommatrices de ces métabolites sont aussi fréquemment dérégulées chez les patients autistes. Dans ce projet de recherche, nous allons identifier parmi ces métabolites microbiens et ces bactéries ceux et celles capables d'induire chez la souris des anomalies comportementales et/ou gastro-intestinales. Aussi, nous identifierons leur mode d'action en utilisant des approches pharmacologiques. Également, nous identifierons des métabolites et des traitements probiotiques capables de restaurer les anomalies du comportement et les troubles gastro-intestinaux dans des modèles d’autisme. Ce projet ouvrira la voie à une meilleure compréhension de l’autisme et à de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un intérêt translationnel car l'étude apportera des connaissances sur les mécanismes physiologiques et neurobiologiques fondamentaux responsables des troubles du spectre de l’autisme et de l’implication du microbiote intestinal. Ce projet permettra de faire avancer les connaissances sur l'étiologie de l'autisme et pourra contribuer à valider pré cliniquement dans des modèles animaux des stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote pour les troubles du spectre de l'autisme.

Procédures

• Identification par injection sous-cutanée de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement de sang de 100µL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 12 semaines en fonction de la procédure. • Injections intrapéritonéales : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 10 jours en fonction de la procédure. • Anesthésie à l’isoflurane et imagerie sur animal anesthésié : durée 10 min ; fréquence 5 fois sur 48h en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Ce projet obéit à la règle des 3R. Cependant, certains des traitements proposés pourraient impacter le métabolisme, le comportement et\ou la physiologie intestinale des groupes d’animaux traités par rapport aux groupes témoins. Pour détecter ces changements, un suivi au moins 2 fois par semaine du poids des animaux, de leur consommation en eau et nourriture permettra d’évaluer l’état physiologique global de l’animal en réponse au traitement. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée et qui n’induisent pas de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). De plus, l’inconfort sera limité à la durée du test. Concernant l’évaluation de la physiologie intestinale, les tests provoqueront un inconfort mais limité à la durée du test. Un prélèvement sanguin sera réalisé lors du test de perméabilité intestinale, cependant un volume faible de sang sera prélevé et l’inconfort sera limité au temps nécessaire au prélèvement. Dans le cas du traitement administré par voie intrapéritonéale, une attention particulière sera portée à l’état du site d’injection (gonflement, rougeur).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques, indispensable pour une meilleure comprehension des mécanismes associés à notre contexte d'étude.

Remplacement

La littérature scientifique sur notre sujet a permis de sélectionner les métabolites microbiens, les bactéries et les substances pharmacologiques les plus pertinents, ainsi que les quantités et concentrations utilisées respectant un contexte physiologique. Avant les expérimentations sur l’animal, des expériences in vitro ont été et seront réalisées sur des cultures bactériennes permettant de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Cependant, pour évaluer l'impact du traitement avec des métabolites microbiens, des probiotiques et une substance pharmacologique à l'échelle de l'organisme entier au niveau gastro-intestinal et comportemental, le recours à l'animal sera nécessaire. En effet, l’étude du comportement animal fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et des processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car ce n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.

Réduction

Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs réalisés avec un logiciel dédié ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus pertinents. Les résultats seront analysés avec un logiciel dédié. Un total de 5832 animaux est requis pour ce projet.

Raffinement

Les paramètres suivants basés sur l'expérience de l'expérimentateur seront suivis pour nous permettre d'assurer le suivi du bien-être animal : le poids corporel, l'apparence physique, des signes cliniques objectifs tel qu’un changement de température corporelle suite à une alerte sur un animal, des comportements anormaux ou non provoqués, des réponses comportementales à des stimuli spécifiques ainsi que l'état général du site d'injection et un suivi de l’aspect des fèces indiquant ou non la présence de diarrhée. Nos conditions d’élevage comprennent une stabulation par groupes d'au moins quatre animaux, un enrichissement de l'environnement (coton pour nidifier, maison), ainsi qu'un contrôle strict de la température et de l'humidité. Un suivi quotidien des animaux est également assuré par le personnel animalier et par nous même dans le cadre des expérimentations. La majorité des procédures induiront un inconfort faible et de courte durée, sans causer de dommages. Pour les procédures affectant potentiellement le bien-être des animaux, un suivi basé sur une grille de score pourra être établi et permettra de détecter toute souffrance et de décider de la suite à donner, notamment en appliquant des points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

L'autisme cause des anomalies du comportement handicapantes. Toutes ces anomalies sont modélisables chez la souris à l’aide de batteries de tests de comportement réalisables chez la jeune souris ou l’adulte. Aussi, la physiologie intestinale de la souris (perméabilité, motilité intestinale et colonique) ne peut être appréciée que chez l'animal vivant. Les études précliniques sur l'autisme imposent donc des études in vivo, chez l’animal, afin d'identifier des mécanismes difficilement modélisables in vitro et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Puisque nous nous intéressons aux conséquences neurodéveloppementales de l’exposition aux métabolites Microbiens, nous préférons travailler dans une fenêtre où le système nerveux est encore capable d’une certaine plasticité (adolescence 4 semaines). Pour les procédures 1 et 2, nous recevrons les animaux à l'âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Nous commencerons le traitement dans la 4ème semaine et évaluerons le comportement et le tractus GI après 4 semaines de traitement, soit lorsque les animaux auront entre 8 et 10 semaines. Pour les procédures impliquant un traitement pour restaurer les phénotypes induits par les métabolites microbiens (procédure 3), les animaux seront suivis jusqu'à l'âge de 14-16 semaines.

Tués à l'issue pour prélever la peau et le sang en quantité incompatible avec la survie, 2 640 souris et 2 640 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après épilation du dos, chaque animal reçoit une injection par jour pendant cinq semaines, les mâles en recevant deux de plus par semaine, avant une ponction de sang intracardiaque sous anesthésie. Irritation de la zone épilée, dermatite et perte de poids figurent parmi les effets attendus, et le porteur écrit pourtant qu'à sa connaissance ce modèle ne provoque pas de souffrance chez les rongeurs, raison pour laquelle aucun analgésique n'est prévu. Les substances testées appartiennent à des clients de l'établissement, qui réclament des données in vivo pour justifier des essais cliniques chez l'être humain.

Objectifs

L’objectif de cette étude sera de tester plusieurs substances et traitements de nos clients contre l’alopécie de ainsi que des médicaments de références sur un modèle de régénération capillaire, à la suite d’une épilation chez le rongeur. Aujourd’hui, les facteurs qui participent à la perte de cheveux n’ont pas été entièrement identifiés et les traitements cliniques utilisés actuellement ne sont pas efficaces pour tous les types de perte de cheveux. Pour cette raison, la recherche préclinique en dermatologie est très active afin d’identifier de nouveaux produits naturels (extraits de plantes) ou synthétiques capables d’améliorer l’alopécie.

Bénéfices attendus

Le but de notre étude est de quantifier l’effet d'un traitement chronique avec des candidats médicaments sur la régénération capillaire des rongeurs. Le but ultime est donc d'identifier les candidats médicaments les plus prometteurs, qui seront ensuite testés chez le patient dans les différentes phases cliniques. Cela permettra de trouver de nouveaux médicaments plus satisfaisants pour soigner les patients touchés par l’alopécie.

Procédures

Les animaux seront sujets aux interventions suivantes : a) Uniquement pour les mâles : 2 injections/semaine pendant 5 semaines ; durée de l’injection 30 secondes b) Pour mâles et femelles : 1 injection/jour, tous les jours pendant 5 semaines ; durée de l’injection 30 secondes. c) Pour mâles et femelles: prélèvement de sang en intracardiaque sur animal anesthésié; 1 seule fois juste avant l'euthanasie. Durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter : une pilo-érection, une perte de poids plus ou moins importante, une irritation plus ou moins importante sur la zone épilée, une dermatite. Les animaux seront un peu stressés pendant les administrations des candidats médicaments, qui dureront en moyenne 30 secondes par animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale. En effet, pour nos études il est nécessaire d'euthanasier les animaux pour effectuer des prélèvements de peau et de sang en quantité importante, incompatible avec la survie.

Remplacement

Pour les études sur l’alopécie, il est possible d’utiliser des cultures cellulaires spécifiques, par exemple les cellules papillaires dermiques de cheveux humains. Bien que ces modèles soient utiles pour étudier le mécanisme d’action d’un candidat médicament et donner une première confirmation d’un possible effet d’amélioration de l’alopécie, il sera ensuite nécessaire de tester le produit chez l’animal, afin de déterminer un effet dose-réponse et aussi tester les excipients, différents pour chaque voie d’administration (exemple voie topique ou orale). De plus, les tests in vivo sont absolument nécessaires afin de déterminer la vitesse de croissance des poils à la suite des traitements médicamenteux. Pour cette raison les études chez le rongeur sont assez longues (4-5 semaines). Nous avons déjà été réalisé en amont des études de cultures cellulaires. Nos clients souhaitent maintenant effectuer des études in vivo sur rongeur. Si les résultats obtenus s’avèrent positifs, cela leur permettra de justifier des essais cliniques chez les humains.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera au maximum de 12, étant donné la variabilité interindividuelle. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux seront comparés entre eux en utilisant le test statistique le plus approprié.

Raffinement

Chaque espèce aura sa propre pièce d’hébergement. Les animaux seront hébergés 3 à 6 par cage afin de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Trois différents types d’enrichissement seront intégrés dans les cages d'hébergement. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, est une technicienne en recherche et développement expérimentée et formée pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Elle pèsera et observera les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplira quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson. Les animaux, pendant l’anesthésie, seront toujours disposés sur un tapis chauffant. A notre connaissance, ce modèle expérimental ne provoque pas de souffrance chez le rongeur, donc nous n’avons pas prévu d’utiliser des analgésiques pendant l’expérimentation. En accord avec le vétérinaire responsable, un scoring des signes cliniques sera mis en place afin de suivre l’état de santé des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques de souffrance seront euthanasiés, en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont utilisés très fréquemment dans les études sur l’alopécie. Cela est justifié par la croissance rapide des poils des rongeurs et par la facilité à quantifier la quantité de poil poussé sur le dos après rasage, en particulier pour les souris à poil noir ou marron. Les souris seront âgées de 7 semaines car à ce stade de développement, la plus grande partie des poils est synchronisé dans la phase telogène. Donc, en rasant les poils à ce stade, on réduit la variabilité inter-individuelle du cycle de croissance des poils.

Greffées d'une tumeur sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris immunodéprimées sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et les organes. Chaque animal reçoit une injection de nanoparticules puis une séance de radiothérapie, avec une imagerie sous anesthésie par semaine pendant huit semaines au maximum. L'objectif immédiat consiste à choisir un schéma de traitement en vue d'un essai clinique, essai renvoyé au futur. Le porteur écrit que la radiothérapie "ne devrait pas engendrer d'effets indésirables" et que l'imagerie est indolore, tout en reconnaissant que le modèle de souris aux défenses immunitaires réduites constitue "une nuisance en soi".

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.