Rongeurs
MODIFICATION : DM-1 : Mesure de l’efficacité de nouvelles molécules antivirales contre le virus SARS-CoV-2 et ses variants chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Infectées par le SARS-CoV-2 sous anesthésie générale, 312 souris reçoivent des injections d'antiviraux ou de placebo à huit reprises et trois prélèvements de sang à la lancette, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'infection doit provoquer une perte de poids et une chute de température, avec une survie de quinze jours annoncée, les points limites étant ajustés au fil d'observations biquotidiennes. Toutes sont tuées à la fin du protocole, cerveau, poumons, intestin, rate et sang étant prélevés post mortem pour mesurer la charge virale et suivre les antiviraux dans les tissus. Le porteur écrit que "200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire" pour atteindre ses objectifs, alors que le projet en déclare 312, l'ajout de souris étant l'objet même de cette modification.
Objectifs
Les conjugués peptide-porphyrine sont des médicaments antiviraux à très large spectre capables de pénétrer dans le cerveau et le placenta, et donc de protéger le système nerveux central et les fœtus contre l'action des virus. Ils doivent leur large spectre d'activité à la cible particulière qu'ils visent dans la structure virale : l'enveloppe lipidique. Cette classe de composés compromet l'intégrité des enveloppes et les virus sont incapables de réparer les dommages, ce qui entraîne une perte de fonctionnalité. La preuve de concept a été établie in vitro avec les virus SARS-CoV-2 et Zika et in vivo avec le virus Zika. Il est nécessaire de valider l'activité antivirale des conjugués contre le SARS-CoV-2. Dans ce cadre, les trois conjugués préalablement validés pour leur efficacité contre plusieurs souches de SARS-CoV-2 sont des candidats prometteurs pour une visée thérapeutique. Il est nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ces antiviraux injectés à plusieurs temps à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 devraient initier une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de signes cliniques. MODIFICATION : DES RESULTATS ENCOURAGEANTS ONT ETE OBTENUS ; LA MODIFICATION DE PROJET PORTE SUR L’AJOUT D’ANIMAUX AFIN D’OPTIMISER LE TRAITEMENT ANTIVIRAL EN TESTANT DIFFERENTES CHARGES VIRALES ET DIFFERENTES VOIES D’ADMINISTRATION.
Bénéfices attendus
La validation des antiviraux testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’améliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19.
Procédures
Tous les animaux, soit 312 souris. Des prises de sang seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une lancette (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Administration des anti-viraux ou placebo sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique antivirale (5 minutes par animal, 8 fois). Challenge infectieux sous anesthésie générale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptômes généralisés mais avec une faible mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire ainsi qu’une perte de température est attendue suivi d’une survie de 15 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon les observations biquotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie sous-cutanée ou en voie intrapéritonéale pour les anesthésies générales ou des traitements peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantation de la puce télémétrique. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal. La prise de sang peut aussi engendrer un stress et une douleur légère au point de prélèvement lors de l’utilisation de la lancette.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (cerveaux, poumons, intestin, rate, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le suivi des antiviraux dans les tissus, pour le recrutement cellulaire et la réponse immunitaire induite.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Cette taille d’échantillon de 12 souris permet de détecter un effet modéré. Au total, 200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques (efficacité antivirale) tout en respectant le principe de réduction des 3R.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe social, dans des cages respectant les surfaces réglementaires et dans un environnement enrichi par différents types comme de la cellulose ou du sizzle, des bâtonnets de bois et des tunnels ou maisonnette/dôme… Les animaux sont transportés via un transporteur agréé dans un véhicule adapté et respectant au mieux les conditions et paramètres environnementales jusqu’à leur acheminement dans leur lieu d’hébergement définitif où ils sont ainsi manipulés pour les déplacer de la boite de transport vers la cage d’hébergement. Lors de cette manipulation, il est implanté la puce télémétrique. Ensuite vient la phase d’acclimatation où les animaux vont s’habituer progressivement à leur nouvel environnement et à la visite quotidienne des techniciens animaliers. Dès leur arrivée et pendant l’acclimatation, une récompense alimentaire sera distribuée aux animaux de type, graine à décortiquer, popcorn... Puis durant la procédure après chaque manipulation sur l’animal, afin de récompenser et favoriser l’acceptation des gestes. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites via un suivi clinique. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les injections pour les anesthésies et les traitements seront réalisés par voie sous-cutanée, moins nocive que la voie intrapéritonéale, tout en maintenant une efficacité comparable. L’euthanasie au pentobarbital pouvant provoquer des douleurs, les animaux seront anesthésiés avant l’injection létale. Les prélèvements de sang seront espacés de plus d’une semaine.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris humanisée est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.
Etude d’innocuité et d’efficacité de molécules destinées au traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’ischémie thromboembolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 464 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de 15 à 20 minutes applique du chlorure de fer ou d'aluminium sur l'artère cérébrale moyenne pour provoquer un accident vasculaire cérébral, suivie de la pose d'un cathéter dans la veine caudale et de cinq passages en IRM 7T sous anesthésie jusqu'à J14, avant une laparo-thoracotomie donnant accès au cœur pour une ponction cardiaque. Le porteur annonce une "batterie de test comportementaux indolores" répétée à huit reprises, trois tests par animal, sans préciser lesquels. Les molécules viennent de partenaires industriels et passeront en essais cliniques en cas de résultats encourageants, "avec pour objectif la mise sur le marché dans les années à venir", quand l'occlusion artérielle et la ponction cardiaque terminale sont programmées pour l'ensemble des souris.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Les 2464 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer ou de chlorure d'aluminium au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme, les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Aucun test comportemental n’est voué à induire volontairement un stress ou une angoisse chez les souris. Les expérimentateurs sont formés et habitués à ce genre d’évaluations fonctionnelles, et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celles-ci (limitation du bruit et des vibrations, manipulation des animaux avec soin, vérification des points limites, etc..). Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux expérimentations et validations réalisées in vitro par les partenaires industriels. Actuellement, il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : kraft, dôme en carton + brique aspen ainsi qu’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Ils seront systématiquement pesés le jour de la chirurgie et le lendemain.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponibles dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
Plateforme préclinique de modélisation des réactions allergiques chez la souris [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
14 500 souris sont utilisées sur trois ans pour 465 études précliniques, soit 100 à 400 souris par molécule testée, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles sont sensibilisées à des allergènes puis soumises à une épreuve qui peut déclencher un choc anaphylactique, avec hypothermie, démangeaisons, gonflements et troubles respiratoires, certaines lignées étant humanisées par greffe de cellules humaines. 12 400 sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général" après avoir reçu des candidats médicaments, et 2 100 passent au projet de formation interne aux gestes techniques, ce qui évite d'en commander pour la formation. L'effectif ne repose sur aucun calcul de puissance, le porteur écrivant qu'"Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'estimation venant des études des années antérieures et d'une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Les allergies médiées par les immunoglobulines E (IgE), ou hypersensibilités, sont des réactions immunitaires exagérées à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que des allergènes alimentaires, des pollens, des acariens ou encore des venins. Ces réactions peuvent aller de simples manifestations locales (urticaire, rhinite) à des manifestations systémiques graves telles que l’anaphylaxie. L’hypersensibilité de type I, aussi appelée réaction allergique immédiate, est une réponse immunitaire excessive qui se produit rapidement (quelques minutes) après l’exposition à un allergène chez une personne sensibilisée. Conséquences : inflammation, rougeur, démangeaisons, œdème, bronchoconstriction, etc. L’hypersensibilité de type IV, aussi appelée hypersensibilité retardée, est une réaction immunitaire cellulaire qui se manifeste 24 à 72 heures après l’exposition à un antigène. Conséquences : infiltration cellulaire, œdème, rougeur, induration. La compréhension des mécanismes de l’hypersensibilité de type I et IV et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques nécessite le développement de modèles précliniques fiables, reproductibles et transposables à l’homme. L'objectif principal de ce projet est de développer et caractériser différents modèles murins d’allergie médiée par les IgE et les lymphocytes T, en utilisant des souris conventionnelles non-humanisées ou humanisées (système immunitaire ou foie) ou doublement humanisées (système immunitaire + foie ). Les modèles développés serviront à mimer les différentes formes de réactions allergiques, systémiques ou localisées, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires et d’évaluer à terme des outils préventifs, prophylactiques ou thérapeutiques. Des souris « non allergiques » (non sensibilisées) pourront être utilisés afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamique des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une plateforme complète de modélisation préclinique des allergies médiées par les IgE, adaptée à l'étude des mécanismes immunologiques et à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. On entend par « une plateforme complète » toute la chaîne de valeur préclinique, dans une logique de personnalisation, qualité et efficacité scientifique, ne se limitant pas à la simple exécution technique d’un modèle. Cela repose sur une approche progressive, car les expériences peuvent débuter si nécessaire par l’utilisation de modèles murins classiques pour les phases exploratoires, puis intégrant des modèles humanisés uniquement lorsque cela est nécessaire pour affiner la pertinence des résultats dans un contexte proche de l’humain.
Procédures
Identification par puce électronique :2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Administration : la fréquence dépend du protocole d’étude sauf pour les injections d’anticorps qui sera de 2 fois maximum. Chaque injection durera entre 10 et 15 secondes. Administration orale de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration orale durera 20 secondes. Administration par nébulisation : la fréquence dépend du protocole d’étude, durée de 5 min maximum. Administration locale, par contact cutané, de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration locale durera 20 secondes. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal. Le nombre d’administration dépendra du traitement et de la voie d’administration choisie. Le suivi de la réponse anaphylactique se fera par un scoring allergique dans le cas d’allergie systémique active ou passive. Dans le cas d’allergie passive cutanée le suivi de la réponse allergique se fera par mesure de l’épaississement des oreilles, sous anesthésie, ainsi que par l’évaluation de la perméabilité vasculaire. Durée de 10 à 15 secondes. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’anémie, d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Le challenge est également susceptible d’induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester notamment par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l’activité de la souris. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour les patients.
Réduction
Un total de [MODIFICATION] 14 500 souris seront utilisées, couvrant une période de [MODIFICATION] 3 ans, permettant de réaliser 465 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe (pour faire face à la variabilité du modèle), avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Ce nombre total d’animaux inclut les groupes contrôles, les tests pilotes de validation de modèle, les répétitions inter-expérimentateurs et les pertes éventuelles. Il est prévu de tester approximativement entre 50 et 60 molécules de nature différente sur la durée de validité de ce projet. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum. Cette estimation permet de garantir la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction, grâce à une mutualisation des groupes contrôles et des revalidations de modèles précédents. Chaque molécule nécessite entre 100 à 400 animaux selon le protocole expérimental (modèle local ou systémique, voie d’administration, durée, nombre de groupes, etc.)
Raffinement
En début d’étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées en cage ventilée, préférentiellement par groupe social stable composé de 5 individus. Des compléments alimentaires (ex : Diet Gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Entre autres, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. A leur entrée dans l’animalerie, les souris recevront une période d’acclimatation de 4 jours minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, du score d’allergie et de la perte de poids. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique et allergique ainsi que perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. L’utilisation de modèles murins d’allergie au pollen a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. De plus, lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur system immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Étude de l’effet des dérivés indoliques produits par une bactérie intestinale spécifique et par ses vésicules extracellulaires chez un modèle de souris atteint de colite.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Colonisées par une seule bactérie et hébergées en isolateur, les souris de ce projet sont inoculées à trois ou quatre semaines, avant la maturation de leur immunité. 104 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent jusqu'à sept gavages, un tous les deux jours, et 80 d'entre elles reçoivent pendant une semaine un traitement dans l'eau de boisson qui provoque une inflammation intestinale, avec diarrhées, déshydratation, perte de poids importante et hypothermie. Toutes sont mises à mort pour prélever des organes, et le porteur range parmi les débouchés attendus, à côté de la maladie de Crohn et de l'entérocolite nécrosante du nouveau-né, le "développement de compléments alimentaires".
Objectifs
De nombreuses bactéries de l’intestin sont capables de produire de petites particules appelées vésicules extracellulaires (EVs) capables de transporter des molécules au sein de l’organisme. Nous supposons que certaines molécules transportées par les EVs s pourraient avoir des effets bénéfiques notamment sur la résorption des colites chez la souris. Nous savons que certaines bactéries peuvent résorber les colites chez la souris notamment via l’acide indole-3-lactique (ILA). Cela a été démontré chez plusieurs bactéries, mais pas chez la bactérie étudiée qui est la bactérie prépondérante chez les nourrissons en bonne santé. L’objectif sera de démontrer que l’ILA produit par la bactérie étudiée favorise la résorption des colites tout en évaluant le potentiel postbiotique des EVs à compenser la carence en dérivés indoliques synthétisés par le microbiote intestinal dans le modèle murin. Un postbiotique est une préparation de microorganismes inanimés et/ou leurs composants qui confèrent à son hôte un bénéfice de santé.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment certaines molécules bénéfiques produites par les bactéries intestinales sont transportées dans l’organisme grâce aux vésicules extracellulaires. Ainsi, nous pourrons en apprendre davantage sur leurs bénéfices en santé, notamment dans les pathologies affectant l’intégrité et l’inflammation de l’intestin. Ces EVs pourront alors être utilisées comme postbiotique (préparation venant d’un micro-organisme inanimé ou leurs composants ayant un effet bénéfique sur la santé) afin de protéger l’intestin contre des pathologies qui le fragilisent (ex. maladie de Crohn, intestin irritable) ou qui peuvent conduire au décès chez les nouveau-nés (entérocolite nécrosante)… De plus, ces données pourraient permettre le développement de compléments alimentaires.
Procédures
Tous les animaux vigiles seront soumis à des gavages réguliers (tous les 2 jours et avec un maximum de 7 gavages). Cela peut entraîner un stress de courte durée (1 à 2 min). 80 animaux (au maximum) seront également soumis à un traitement dans l’eau de boisson entraînant une inflammation intestinale pendant 1 semaine. Cela peut entraîner une perte de poids et une déshydratation. Les prélèvements de fèces, seront effectués 4 fois sur 64 animaux. Ils entrainent un léger stress de 2 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’inflammation intestinale induite par l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson est associée à des effets indésirables attendus (douleurs). Elle peut entraîner des diarrhées entraînant une déshydratation et une perte de poids importante ainsi qu’une hypothermie. Ce traitement durera une semaine. Le gavage (moins de 2 minutes) et la mise dans les pots transparents pour prélever les pellets fécaux (moins de 5 minutes) peuvent entraîner un léger stress de courte durée. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet. La bactérie étudiée et ses vésicules extracellulaires sont présentes naturellement dans le microbiote intestinal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélèvements d’organes.
Remplacement
Ce projet vise à déterminer l’effet de l’inoculation d’une souche bactérienne produisant ou non des dérivés indoliques, ainsi que l’effet compensatoire des vésicules extracellulaires de cette même souche sur différents organes lors d’une inflammation intestinale. Des études préliminaires in vitro sur une lignée épithéliale inflammée ont montré que les EVs de cette bactérie avaient des effets anti-inflammatoires. Pour connaître leurs capacités à résorber ou freiner le développement d’une inflammation liée à une pathologie, ainsi que leur circulation dans le corps, l’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour atteindre notre objectif. En effet, à ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico assez complexe n’est disponible pour analyser ces effets, notamment sur le cerveau qui est un organe très complexe. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour atteindre notre objectif.
Réduction
Pour les études préliminaires nous utiliserons 8 animaux par groupe, ce qui sera un nombre suffisant pour observer les effets du composé testé et pour la détection de la fluorescence. Le nombre minimal d’animaux à utiliser pour répondre aux questions posées a été déterminé par une analyse de puissance basée sur un test statistique. En considérant un risque alpha de 5% et une puissance statistique de 80%, un effectif de 16 animaux par groupe est nécessaire pour le projet. Chaque groupe comprend 8 mâles et 8 femelles afin de tenir compte de l’effet potentiel du sexe. De plus, il s’agit d’un projet utilisant des souris colonisées par une seule bactérie donc en cas de contamination nous devrions recommencer totalement un lot expérimental. Pour cela, nous ajoutons 16 animaux afin de pouvoir refaire un groupe en cas de contamination. Cela fait un total de 104 animaux utilisés pour ce projet.
Raffinement
Avant le début de chaque procédure, les souris auront une semaine d’acclimatation aux isolateurs expérimentaux pendant laquelle ils seront habitués aux manipulations. Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (change des cages, etc…) et une observation accrue (plusieurs fois par jour) durant les inoculations orales et l’inflammation intestinale susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress. L’enrichissement de nidification sera également augmenté, et de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage pendant le traitement inflammatoire. Une grille de score a été définie pour évaluer l’état des souris. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués si nécessaire. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupe de sexe identique (4 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique seront ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
La souris à microbiote contrôlé est un modèle établi pour les recherches sur le microbiote intestinal avec une pertinence démontrée pour la physiologie humaine. Les animaux utilisés seront agés de 3-4 semaines lors de l’inoculation de la bactérie car l’objectif est d’étudier l’impact de molécules et vésicules dérivées du microbiote chez les jeunes individus avant la maturation de leur immunité pour privilégier la réponse spécifique au DSS.
Effets d’une combinaison thérapeutique : Stimulation magnétique trans-spinale répétitive et rééducation locomotrice dans le cadre des lésions médullaires traumatiques.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À J0, 100 des 120 souris femelles subissent une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, puis, sept jours plus tard, deux semaines de stimulation magnétique pour quarante d'entre elles et quatre semaines de tapis roulant, deux fois dix minutes par jour, pour quarante autres. Toutes passent huit sessions de tests comportementaux, champ libre, corridor à barreaux et tapis roulant, d'environ 45 minutes chacune, reçoivent des injections de traceurs au cours d'une chirurgie de 50 minutes, et sont mises à mort à J42 pour prélever la moelle et l'encéphale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère, et visent à savoir si la combinaison des deux traitements améliore la récupération motrice plus que chacun pris séparément. Sur les atteintes subies, le résumé tient en deux lignes, "Paralysie des membres postérieurs" et "Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s'abreuver après le réveil", pour une lésion médullaire suivie pendant six semaines.
Objectifs
La moelle épinière joue un rôle essentiel dans le fonctionnement du système nerveux central. Elle permet la transmission des informations entre le cerveau et le reste du corps. Lorsqu’elle est lésée, les conséquences peuvent être majeures, entraînant une perte partielle ou totale de fonctions en dessous du niveau de la lésion. Ces lésions représentent ainsi des atteintes neurologiques graves, responsables de handicaps importants et durables pour les patients. La rééducation locomotrice constitue actuellement l’une des principales approches utilisées pour favoriser la récupération fonctionnelle. Toutefois, les améliorations obtenues restent souvent limitées. Dans ce contexte, de nouvelles approches capables de renforcer ces mécanismes de récupération sont activement recherchées. Parmi les stratégies prometteuses figure la stimulation magnétique trans-spinale répétitive, une technique non invasive et non douloureuse. Nous émettons l’hypothèse que la combinaison de la stimulation magnétique trans-spinale répétitive et de la rééducation locomotrice pourrait permettre d’améliorer davantage la récupération motrice que chacune de ces approches utilisées séparément. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets de ces stratégies thérapeutiques combinées chez la souris.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet permettra de mieux caractériser les effets combinés de la stimulation magnétique trans-spinale répétitive et de la rééducation locomotrice sur la récupération fonctionnelle après lésion traumatique de la moelle épinière. Si les effets observés dans ce projet confirment son potentiel thérapeutique, cette approche pourrait constituer une stratégie intéressante pour améliorer la récupération fonctionnelle des patients après lésion médullaire, notamment en complément des protocoles de rééducation actuellement utilisés.
Procédures
120 souris femelles agées de 8 semaines seront utilisées. • Sur celles-ci, à l’exception du groupe control sans lésion, soit 100 souris, sera réalisée, à J0, une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 30 min. • L’ensemble des souris, soit 120 souris, réalisera des tests comportementaux (champ libre, corridor à barreaux et tapis roulant), aux jours -7, 1, 7, 14, 21, 28, 35 et 42 post chirurgie. La réalisation de ces tests représentera un temps d’environ 45 minutes par souris et par session. • 7 jours après la lésion et ce pendant 14 jours, sous anesthésie générale, un tiers des souris (soit 40 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). • 7 jours après la lésion et ce pendant 28 jours, sur un tiers des souris (soit 40 souris), sera mis en place un protocole de rééducation par tapis roulant. Chacune de ces souris sera entrainée deux fois 10 minutes par jour à raison de cinq jours d’entrainement par semaine. • L’ensemble des animaux (120 souris), sous anesthésie générale, recevra des injections de traceurs rétrogrades au niveau de la moelle lombaire, en dessous du site de lésion. Cette chirurgie sera réalisée en 50 minutes. • L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié, 42 jours après la lésion afin de récupérer la moelle épinière.
Impact sur les animaux
- Paralysie des membres postérieurs - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le réveil
Devenir
L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (42 jours après la lésion médullaire) afin de procéder aux prélèvements de la moelle et de l’encéphale.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécessaire pour mesurer les effets de ces traitements après lésion médullaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des données issues des études précédemment réalisées dans notre laboratoire ainsi que de la variabilité observée pour les paramètres comportementaux étudiés. Les analyses comportementales nécessitent un effectif de 20 animaux par groupe afin de permettre la mise en évidence de différences significatives entre groupes à l’aide de tests statistiques adaptés (test de Mann-Whitney). Par ailleurs, les analyses histologiques seront réalisées en post-mortem sur un sous-groupe de 10 animaux issus de cet effectif de 20 animaux, nous affranchissant ainsi du recours à un lot supplémentaire d’animaux dédié à ces analyses. Cette stratégie permet d'obtenir la puissance statistique nécessaire tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie et tapis chauffant, et des points-limites adaptés à l’étude seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse aux effets combinés de deux thérapies dans le cadre des lésions médullaires. Les études préalablement réalisées l’ont été chez la souris. De ce fait, il est important de continuer ces travaux chez la souris. Les lésions médullaires chez l’Homme concerne en premier lieu le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Etude chez la souris des mécanismes responsables de la formation de caillots sanguins suite à l’ablation de la rate
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésiées pour une ablation de la rate d'environ trente minutes, réveillées, puis suivies pendant quarante jours, une partie des 930 souris subit ensuite la formation provoquée d'un caillot dans une artère ou dans la circulation pulmonaire. D'autres reçoivent deux prélèvements sanguins rétro-orbitaux sous anesthésie puis un prélèvement intracardiaque terminal, et celles qui servent à l'apprentissage d'un geste technique sont opérées sans réveil, prises sur les "surplus" d'élevages couverts par d'autres autorisations. Les niveaux de souffrance déclarés vont de la procédure sans réveil au modéré, l'obstruction aiguë de la circulation sanguine pouvant selon le porteur avoir "des conséquences sévères sur l'état de l'animal", certaines souris pouvant mourir en cours d'expérimentation. Toutes sont mises à mort à l'issue, le volume de sang requis ne permettant pas de les maintenir en vie et les organes étant prélevés pour les analyses.
Objectifs
Ce projet s’intéresse à une maladie rare du sang associée à des anomalies des globules rouges. Chez les personnes atteintes, ces anomalies peuvent entraîner des douleurs et des complications. Par le passé, l’ablation de la rate était parfois proposée pour soulager les symptômes, mais cette intervention a été abandonnée car elle peut augmenter le risque de formation de caillots sanguins, dont le délai d’apparition reste imprévisible. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement satisfaisant pour ces patients. Des résultats préliminaires suggèrent que plusieurs types de cellules sanguines pourraient participer à ce phénomène, notamment les globules rouges, qui peuvent favoriser la coagulation dans certaines conditions. La rate jouant normalement un rôle de filtre en éliminant les cellules anormales, son absence pourrait permettre à ces cellules de rester plus longtemps dans la circulation et ainsi favoriser la formation de caillots. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment cette anomalie et l’absence de la rate peuvent, ensemble, augmenter le risque de formation de caillots sanguins. Pour cela, l’étude sera réalisée chez la souris, en comparant des animaux présentant des anomalies du sang à des animaux sans anomalie, avec ou sans ablation de la rate. Ce modèle permet d’étudier l’ensemble des interactions entre les cellules du sang dans un organisme vivant, ce qui n’est pas possible avec d’autres approches. Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur cette maladie et pourrait, à terme, contribuer à une meilleure prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi le risque de formation de caillots sanguins augmente chez certains patients après l’ablation de la rate. Il aidera à identifier le rôle des différentes cellules du sang dans ce phénomène. À terme, ces résultats pourraient améliorer la prise en charge des patients et orienter de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Pour cette étude, nous utiliserons un modèle d’ablation de la rate réalisé sous anesthésie générale et analgésie chez la souris. La chirurgie dure environ 30 minutes. Ce modèle sera combiné à trois interventions permettant d’étudier la formation de caillots sanguins : soit par application locale d’un agent chimique sur une artère, soit par injection intraveineuse de substances favorisant la formation de caillots, soit par prélévement sanguin intracardiaque permettant une analyse ex vivo des fonctions cellulaires. Selon la procédure, chaque animal sera soumis à l’une des séquences d’interventions suivantes : • une seule intervention terminale, sans réveil, pour l’apprentissage d’un geste technique ; • une chirurgie avec réveil — ablation de la rate ou chirurgie simulée — suivie, 40 jours plus tard, d’une procédure terminale de formation d’un caillot dans une artère ; • une chirurgie avec réveil — ablation de la rate ou chirurgie simulée — suivie, 40 jours plus tard, d’une procédure terminale de formation de caillots dans la circulation pulmonaire ; • une ablation de la rate avec réveil, associée à deux prélèvements sanguins rétro-orbitaux de faible volume, l’un avant la chirurgie et l’autre à J40, puis à un prélèvement intracardiaque terminal à J40 ; • ou un unique prélèvement intracardiaque terminal, sans chirurgie préalable. Les procédures de formation de caillots et les prélèvements intracardiaques sont réalisés sous anesthésie générale profonde, sans réveil. Les prélèvements rétro-orbitaux sont également réalisés sous anesthésie générale et durent environ deux minutes. Les animaux opérés sont suivis pendant une période maximale de 40 jours avant la procédure terminale. Toutes les interventions invasives sont réalisées sous anesthésie et avec une analgésie adaptée. Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure terminale. Les poumons sont prélevés après la procédure de formation de caillots dans la circulation pulmonaire afin de réaliser les analyses histologiques prévues.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des effets liés aux différentes interventions réalisées. La chirurgie d’ablation de la rate entraîne une douleur post-opératoire modérée et transitoire, pouvant s’accompagner d’une diminution de l’activité et d’une perte de poids temporaire. Des complications rares, telles qu’un saignement ou une atteinte d’organes proches, peuvent également survenir. Les anesthésies générales peuvent induire un stress physiologique transitoire et une altération temporaire de l’état général. Les injections peuvent provoquer une douleur légère et de courte durée ainsi qu’un stress passager. Les modèles de formation de caillots peuvent entraîner des effets plus marqués : une atteinte locale des vaisseaux sanguins dans le cas d’une induction ciblée, ou une obstruction aiguë de la circulation sanguine dans le cas d’une induction systémique, pouvant avoir des conséquences sévères sur l’état de l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures. Dans les procédures d’induction de thrombose, certains animaux peuvent décéder au cours de l’expérimentation en raison des effets induits ; les animaux survivants seront ensuite mis à mort afin d’éviter toute souffrance prolongée. Pour les autres procédures, le volume de sang requis pour la caractérisation des différents mécanismes étudiés est important et ne permet pas de maintenir les animaux en vie à l’issue des prélèvements. Les animaux sont donc mis à mort afin de permettre également le recueil d’organes indispensables aux analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Des études préalables ont été réalisées sur des cellules humaines du sang en utilisant une molécule chimique qui mime l’anomalie observée chez les patients. Elles ont mis en évidence un état cellulaire qui favorise la formation de caillots sanguins. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les différentes cellules et organes impliqués dans la formation de ces caillots, notamment après ablation de la rate. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet d’étudier ces phénomènes à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation d’un modèle animal reste donc indispensable pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en s’appuyant sur notre expérience, les données déjà disponibles et des calculs statistiques adaptés. Les expériences sont organisées de manière séquentielle afin d’éviter les répétitions inutiles et de ne poursuivre les étapes suivantes que lorsqu’elles restent nécessaires. Les analyses sont également concentrées sur un nombre limité de conditions et sur un seul temps d’étude. Lorsque cela est possible, plusieurs analyses sont réalisées à partir des prélèvements et des organes obtenus chez un même animal, afin d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Enfin, les animaux utilisés pour l’acquisition des gestes techniques dans la procédure 1 proviennent des surplus issus des élevages couverts par d’autres autorisations et qui ne peuvent pas être inclus dans les procédures principales.
Raffinement
Afin de limiter la douleur et le stress, toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie adaptée, associée à un traitement antalgique. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après les procédures, avec un suivi régulier de leur état général. Une attention particulière sera portée à la détection de tout signe de souffrance. L’application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra d’identifier rapidement les animaux en difficulté, qui seront alors retirés de l’étude sans délai. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi, et les procédures seront réalisées par du personnel formé afin de réduire au maximum la durée des interventions et les risques de complications.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé pour étudier les maladies du sang et la formation de caillots, car son fonctionnement est proche de celui de l’être humain pour ces mécanismes. Elle permet également d’utiliser des modèles reproduisant certaines caractéristiques de la maladie étudiée, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. De plus, les phénomènes étudiés nécessitent un organisme vivant intégrant l’ensemble des interactions entre les cellules du sang et la circulation, ce qui ne peut pas être reproduit par d’autres approches. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), car les fonctions du sang et de la circulation sont alors stabilisées, permettant une étude fiable. Les stades précoces de développement ne seront pas utilisés, car les mécanismes étudiés ne dépendent pas de la croissance ou du développement de l’animal.
MODIFICATION Evaluation de la tolérance induite par des antigènes en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins pour la prévention des troubles allergiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les souris dont le score clinique atteint un seuil jugé critique sont mises à mort avant la fin de l'étude, le porteur écartant les analgésiques au motif qu'ils "modifient la réponse immune étudiée". 5 200 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un allergène alimentaire, arachide ou œuf, jusqu'à quatre fois pour les sensibiliser, puis subissent une épreuve allergique par voie orale, cutanée ou respiratoire, dont les effets déclarés vont jusqu'aux signes neurologiques et aux troubles respiratoires. Une partie sert de donneuse de cellules immunitaires ou de sérum à des souris receveuses déjà sensibilisées, l'ensemble visant l'essai clinique puis la mise sur le marché de préparations vaccinales.
Objectifs
Les allergies sont des réactions d’hypersensibilité à des substances, appelées allergènes, présentes dans l’environnement et qui sont normalement inoffensives car tolérés par le système immunitaire. Les réactions peuvent être diverses, des plus bénignes aux plus sévères. Les allergies correspondent à une perte de tolérance envers ces substances. La tolérance immunitaire se définit par la capacité du système immunitaire à ne pas manifester de réaction agressive vis-à-vis de certains antigènes avec lesquels il a été au préalable en contact. Le projet s’organise en 3 étapes, le développement des modèles d’allergie et l’évaluation, sur l’animal, de l’efficacité d’un candidat vaccin contre les troubles allergiques alimentaires connues chez l’homme. 1/Mise en place des modèles d’allergie alimentaire dit de sensibilisation à l’allergènes : dans un premier temps des études seront réalisées pour établir les modèles animaux afin de représenter la maladie d’intérêt dite « allergique » par exemple l’allergie aux arachides. Ces études permettront de définir entre autres les doses d’allergène générant d’une part la sensibilisation à l’allergène et d’autre part la réaction d’hypersensibilité qui seront inoculées chez l’animal ou encore la voie d’administration. 2/ étude d’évaluation des vaccins anti-allergies Une fois ces modèles d’allergies établies, des études d’évaluation de la capacité d’un vaccin à restaurer la tolérance contre ces allergènes alimentaires seront effectuées. Pour cela, les animaux recevront le candidat vaccin dont l’efficacité sera mesurée par le degré d’efficacité induit contre l’inoculation de l’allergène. ---------------- AJOUT :3/ Comprendre et documenter le mécanisme d’action d’un vaccin thérapeutique en opérant le transfert de populations de cellules immunitaires ou sérum d’une souris dite « donneuse », qui aura reçu préalablement le candidat vaccin ou un « placebo », vers une souris dite « receveuse », laquelle aura préalablement été sensibilisée à un allergène alimentaire (ex l’arachide, œufs...) La souris « receveuse » sera alors éprouvée par cet allergène. La réaction allergique sera monitorée et la réponse immunitaire sera analysée ex vivo. Il est attendu que le transfert de certaines cellules immunitaires ou sérum de la souris donneuse permettrait à la souris receveuse sensibilisée de ne pas développer de manifestations cliniques allergiques à la suite d’une épreuve.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont l’utilisation en essai clinique, et éventuellement la mise sur le marché, de différentes préparations vaccinales permettant de protéger efficacement les patients contre les troubles allergiques alimentaires et répondre aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin tolérogène. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire dans le cadre d’hypersensibilité. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre les phénomènes croissants d’allergie alimentaire et de sauver des vies humaines dans le monde. ---------------------------------- AJOUT : Le développement de candidats vaccins tolérogènes constituerait une avancée majeure dans la lutte contre l’augmentation continue de la prévalence des allergies alimentaires. À terme, ces approches innovantes pourraient améliorer significativement la qualité de vie des patients, tout en réduisant le risque de réactions allergiques sévères, voire potentiellement mortelles, à l’échelle mondiale.
Procédures
Les études de tolérance consistent à administrer des vaccins dont la dose peut être unique ou multiple (un à six fois) sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve d’hypersensiblité par un allergène. La sensibilisation à l’allergène se fait par des doses répétées (deux à quatre fois). L'épreuve allergique est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve allergique en fonction du type d’allergie (orale, topique, respiratoire) peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). ---------------AJOUT / L’injection de cellules ou sérum par voie intraveineuse génère des signes cliniques légers FIN.-------------- Dans le cas de l’induction de l’allergie, en fonction du protocole appliqué, les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyper/hypothermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%). ------------AJOUT Ces signes seront surtout attendus dans les groupes de souris qui ne seront pas vacciné ou encore dans le cadre ayant reçu les cellules ou le sérum des souris « placebo ». FIN ---------------------Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après épreuve allergique afin d’évaluer la réponse immune. Les volumes sanguins prélevés nécessaires ou le prélèvement d’organes ne permettant pas le maintien en survie des animaux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques la réponse immunitaire ainsi que l'effet tolérogène doivent être évalués sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un traitement anti-allergique à induire une tolérance contre un allergène, et reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un allergène. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élaborent le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction de l’allergène, une grille d'évaluation des signes cliniques post-induction sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques de l’allergène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur décrites dans le module interne de formation aux manipulations. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés.
Choix des espèces
La souris est sélectionnée du fait des modèles d’allergie décrits dans la littérature et des connaissances scientifiques. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux, disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…).
Evaluation de l’activité anti-tumorale de composés chez la souris immunocompétente ou immunodéprimée porteuse de tumeurs implantées par voie intracérébrale
- Recherche appliquée
- Cancers
Une chirurgie de 45 minutes implante des cellules tumorales dans le cerveau de souris, suivie de trois mois de traitement, avec jusqu'à trois administrations par jour, douze séances d'imagerie sous anesthésie et six prélèvements sanguins en 24 heures. 7 320 souris, immunocompétentes ou immunodéprimées, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente le suivi par imagerie comme une méthode "non invasive pour l'animal et sans douleur", alors qu'il décrit par ailleurs l'injection du substrat bioluminescent et la contention comme pouvant "générer du stress et de la douleur légère". Toutes sont mises à mort en fin d'étude pour prélever le sang, la tumeur et d'autres organes, échantillons qui pourront servir à des études ultérieures.
Objectifs
Les glioblastomes sont des cancers du cerveau dont l’incidence augmente avec l’âge mais qui sont également décrits chez l’enfant et l’adolescent. Ces tumeurs se forment à partir des cellules gliales, des cellules qui soutiennent et protègent les neurones dans le cerveau. Il existe trois types de gliomes : l'astrocytome, l'épendymome et l'oligodendrogliome. Le glioblastome représente la forme la plus agressive ; il correspond à l'évolution d'un astrocytome vers un stade de malignité avancé. Le pronostic de ces cancers reste difficile, et leur localisation dans le cerveau rend l'accès à la tumeur particulièrement complexe pour les médecins. Le traitement actuel repose sur trois approches, chirurgicale pour retirer la plus grande partie possible de la tumeur, radiothérapie, et pour certaines tumeurs, chimiothérapie. L'opération seule guérit rarement le patient et d'autres traitements sont souvent nécessaires. Ces raisons nous poussent à nous consacrer au développement de solutions thérapeutiques innovantes. Notre projet vise à évaluer de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. Le cerveau est protégé par la barrière hémato-encéphalique (BHE), un mécanisme physiologique qui restreint l'accès de nombreuses substances présentes dans le sang au tissu cérébral dans le but de le préserver. Afin de reproduire fidèlement cette contrainte, nous implantons les cellules tumorales dans le cerveau de souris, par voie chirurgicale. Cette approche permet de recréer la tumeur dans son environnement d'origine et d'en respecter les spécificités biologiques. L'efficacité des traitements à évaluer est mesurée par bioluminescence, une technique d'imagerie de haute précision permettant de détecter des tumeurs invisibles à l'œil nu. Un suivi hebdomadaire et un suivi clinique quotidien est instauré pour suivre l'évolution tumorale durant 3 mois. En parallèle, nous effectuons des analyses sanguines pour identifier des biomarqueurs et réalisons des prélèvements d'organes en fin d'étude afin de confirmer que les molécules modulent effectivement leurs cibles thérapeutiques. Nous testons ces médicaments en monothérapie ou en association avec les chimiothérapies, en optimisant les dosages et la fréquence d'administration. Notre objectif ultime est d'obtenir une régression tumorale partielle ou totale en développant de nouveaux médicaments efficaces, tout en améliorant significativement la qualité de vie des patients atteints de glioblastome.
Bénéfices attendus
Dans le processus de développement d’un nouveau candidat médicament, ce type d’étude intervient après les phases de présélection in vitro sur des lignées cellulaires et de modélisation informatique in silico. Des études sont préalablement réalisées pour caractériser la croissance tumorale et définir les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, sélection de la souche de souris, etc.) dans un autre projet que celui-ci. Ces étapes permettent également de déterminer les fenêtres thérapeutiques optimales pour chacune des lignées tumorales constituant nos modèles de pharmacologie. Dans le cadre de ce projet des greffes de tumeurs humaines ou murines sont réalisées chez des souris immunodéprimées afin d’évaluer l’impact du système immunitaire sur nos candidats médicaments sans risque de rejet de greffe mais également immunocompétentes ce qui pourra nous permettre d’évaluer des candidats médicaments sur des tumeurs humaines. L’objectif à court terme est de pouvoir tester et sélectionner les meilleurs candidats médicaments dans un contexte de passage de la barrière hématoencéphalique. Les bénéfices attendus sont : -A court terme évaluer chez la souris l’efficacité de ces candidats médicaments seuls ou en combinaison pour à moyen terme justifier les choix de dose et de candidats chez l’homme -Etablir une relation entre la quantité de candidat médicaments détecté dans le sang ou la tumeur et l’efficacité observée et ainsi mieux comprendre et exploiter les données générées -Investiguer la persistance d’efficacité du traitement après observation d’une régression tumorale. A plus long terme l’objectif est de mettre à disposition des patients une nouvelle option thérapeutique et d’améliorer leur survie après diagnostic et leur qualité de vie.
Procédures
- Chirurgie : cette chirurgie durera 45 minutes maximum par animal et sera réalisée une seule fois avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, anesthésie, protocole analgésique pré et post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Prélèvements de sang : Faible volume, tout au long de l’étude pour une durée maximale de 3 mois pendant environ 20 secondes/souris. Réalisable plusieurs fois sur un même individu (jusqu’à 6 prélèvements maximum/24h). En fonction de l’intérêt, le prélèvement de sang ou la cinétique peuvent être réitérés à 2 semaines d’intervalle, en respectant les recommandations de la structure chargée du bien-être animal (SBEA). - Imagerie sous anesthésie : Une fois par semaine, 12 fois maximum au cours de l’étude. - Administration d’un composé ou d’une association de composés au maximum 3 administrations par jour (environ 30 secondes par administration, Exceptionnellement 4 administrations/jour avec dans ce cas un suivi par la structure de bien-être animal), durée de traitement de 3 mois maximum. - Prélèvement terminal de sang réalisé sous anesthésie générale profonde en fin d’étude (une seule fois, environ 30 secondes/souris).
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress ou douleur peut survenir lors : − de la phase chirurgicale sous anesthésie nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 45 minutes) et la phase post-opératoire : Stress et douleur modérée durant les 24 premières heures -de la phase de pousse de la tumeur (évaluée durant 90 jours maximum). Stress et douleur légère. L’évolution de la tumeur pourrait potentiellement avoir des effets neurologiques (Stéréotypie , trouble locomoteur) liés à la pousse de la tumeur et la structure cérébrale ciblée, ce qui pourrait engendrer une douleur et un stress légers. - de l’évaluation hebdomadaire par imagerie réalisée après induction d’une anesthésie gazeuse et injection du substrat bioluminescent d’une durée de 20 min à chaque mesure (Stress léger). -des injections nécessaires à l’administration de substrat bioluminescent pour chaque mesure par imagerie et d’anesthésiques et d’analgésiques lors des soins pré- péri-, post-opératoire, et également lors de la mise à mort : chaque contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent générer du stress et de la douleur légère − de l’administration répétée de candidats médicaments testés. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress et douleur modérée − des prélèvements de sang sur animal vigile. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et une douleur modérée − des signes cliniques observables associés à des effets des composés testés / candidats médicaments étudiés pendant une durée maximale de 3 mois (troubles du comportement, altération de l’état général) qui peuvent générer du stress et une douleur modérée
Devenir
A la fin de chaque étude, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes d’intérêt pour analyse selon la question scientifique posée. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacité et d’engagement de cible.
Remplacement
Ce projet a pour but l’évaluation de l’activité anti-tumorale de composés sur des tumeurs implantées par voie intracérébrale chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau présentant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l’évaluation de l'activité vivo, une sélection in vitro sur culture de cellule sera réalisée, qui a pour objectif de vérifier le passage de la BHE. Les produits capables de passer la barrière seront sélectionnés selon leur devenir dans l’organisme pour être testés in vivo sur des modèles greffés dans le cerveau, site d’origine de la tumeur afin de vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les paramètres pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux et notamment la relation entre le devenir du médicament dans l’organisme et son action biologique.
Réduction
Avant d’être évalués chez l’humain, ces candidats médicaments font l'objet d'une évaluation initiale in vitro en laboratoire, avant d'être testés sur des modèles murins (souris) porteurs de tumeurs. Ces phases de pré sélection in vitro vont permettre d’identifier au préalable les molécules inhibant la cible de manière spécifique et ayant une efficacité antitumorale in vitro importante afin de ne tester in vivo que les composés prometteurs qui ont les bonnes propriétés. • L’évaluation de la capacité du composé à passer la BHE est également un critère évalué afin de restreindre les composés investigués chez l’animal au strict composé remplissant les critères de passage de la BHE. La tolerabilité de ces composés sera également un critère pris en compte afin de réduire au maximum les composés évalués et donc le nombre d’animaux. • Les conditions et cinétique de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminées au préalable dans un projet dédié et permettent de définir les conditions optimales de greffe, la fenêtre de traitement et le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe après une modélisation statistique rigoureuse. • En fin d’étude, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études complémentaires (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Des prélèvements de fluides, organes et structures du cerveau seront réalisés également. Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • De plus, afin d’inclure dans les études toutes les souris greffées, nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence pour randomiser les animaux, au fur et à mesure du développement de la tumeur, sur la base d’une croissance tumorale similaire permettant ainsi de maximiser le taux d'inclusion. • Le design expérimental sera revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de souris dans chaque groupe et étude selon la lignée cancéreuse étudiée. L’objectif est d’obtenir des conclusions fiables en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.
Raffinement
La procédure de greffe dans le cerveau est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. • Les souris seront replacées en hébergement groupé après la chirurgie après leur réveil. • Mise en place d’un gel alimentaire nutritif préventif systématiquement 3 à 5 jours avant la chirurgie pour habituation des animaux à cet aliment pour une meilleure prise en post chirurgie et tout au long de l’étude. • L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude via l’utilisation d’une grille de scoring par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe d’altération de l’état général de l’animal, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la structure de bien-être des animaux et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement pourra permettre de suivre, au cours de l'étude, d’éventuelles altérations de l’activité cumulée des souris dans une cage. Avec ce système l’analyse des résultats fournira une meilleure documentation des modèles et du bien-être des animaux mais également des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans avoir à euthanasier les animaux à chaque temps de mesure.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe dans le site initial de développement du cancer, donc ici dans le cerveau chez la souris, est couramment utilisée dans les études précliniques visant à étudier les cancers du cerveau. La souris constitue en effet un modèle de choix grâce à l’accessibilité pour l’implantation des tumeurs et la maturité précoce du cerveau murin. Les animaux utilisés seront des souris immunocompétentes ou immunodéprimées pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Le phénotype dommageable lié à l’absence génétique de système immunitaire de ces dernières est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie du fait de l’atteinte d’un poids corporel suffisant pour la récupération post opératoire et de la maturité cérébrale adaptée.
Etude des effets de vésicules extracellulaires dans différents modèles de tumeurs cérébrales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
528 souris subissent l'implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie générale, 456 reçoivent trois séances d'irradiation de 4 Gy sur trois jours consécutifs, et 120 une injection intracardiaque pour provoquer des métastases cérébrales. 648 souris en tout sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur attend chez les souris porteuses de glioblastome une perte de poids, de motricité et de sensibilité, qu'il annonce limitée à 24 heures par le respect des points limites. L'injection intracardiaque, elle, apparaît dans la liste des procédures sans durée ni mention d'anesthésie, et les séances d'IRM sans nombre ni durée.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer les effets de vésicules extracellulaires (EV) sur les tumeurs cérébrales hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels et notamment à la radiothérapie. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, l’efficacité des thérapies actuelles. L’objectif dans la première procédure est de déterminer, dans un modèle de glioblastome murin, le mode d’administration le plus pertinent et la dose d’EV les plus efficaces. Puis dans les procédures suivantes, d’analyser l’efficacité des EV dans 3 autres modèles animaux de glioblastome murin ou humain ou métastatique, présentant des spécificités différentes.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu à court terme est une amélioration des stratégies thérapeutiques conventionnelles du glioblastome en utilisant des EV qui ont montré, par des études précédentes dans d’autres pathologies, leur capacité à améliorer les thérapies actuelles. A long terme, le bénéfice attendu est l’administration de ces EV lors des stratégies thérapeutiques conventionnelles chez l’Homme.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : -Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 528 animaux sont concernés. -Injection intracardiaque pour les 120 animaux des procédures concernées par les métastases cérébrales. -Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 456 animaux sont concernés. -Injection d’analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la chirurgie et 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale
Impact sur les animaux
Les séances fractionnées de radiothérapie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Le degré de sévérité de ces interventions est donc léger. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeurs cérébrales et la procédure d’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Ces nuisances sont atténuées par l’utilisation d’un agent anesthésique et l’administration d’analgésiques et leur durée est de quelques minutes. Ces interventions sont donc de sévérités modérées. Nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h . A ce titre la procédure dans son ensemble de suivi d'efficacité thérapeutique a été classée modérée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer des organes pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et aux réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures EV (taille, aspect de toxicité,) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. De plus, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence qu’il faudrait un maximum de 12 animaux par groupe afin d’obtenir une différence significative . Ce nombre d’animaux pourra être revu à la baisse durant l’étude après une analyse statistique séquentielle.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissements des cages. Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 2 à 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids due aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.
Choix des espèces
Afin d’étudier l’effet des traitements sur les cellules tumorales au sein même de leur microenvironnement, il est nécessaire d’utiliser des modèles murins, les modèles in vitro ne répliquant pas toutes les composantes étudiées (hypoxie, inflammatoire et vasculaire). Les modèles animaux de tumeurs sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la croissance tumorale tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes car ces souris présentent la composante inflammatoire. Les modèles de tumeur cérébrale murin utilisés repose sur l’implantation de cellules de gliome issues de ces souris immunocompétentes. De plus, l’efficacité du traitement sera évaluée sur des modèles de tumeurs cérébrales humaines et métastases qui seront alors implantés chez des souris immunodéficientes permettant ainsi le développement de la tumeur d’origine humaine. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire.
Rôle de la sérotonine et de la microglie dans la connectivité neuronale au cours du développement et à l’âge adulte chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à dix séances de tests comportementaux, que le porteur qualifie de non invasifs, évaluent la sociabilité, l'anxiété et la mémoire de souris vigiles. 4 080 souris sont utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 18 administrations de composés, une chirurgie intracérébrale de 45 minutes au plus pour certaines, et des prises de sang. Ces mêmes tests sont ensuite décrits comme une source de stress modéré, liée à "la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables". Toutes sont mises à mort pour prélever le cerveau, y compris celles retirées de l'étude après trois jours de douleur manifeste, qui pourront servir à des mises au point de protocoles d'analyse.
Objectifs
Notre cerveau contient des cellules appelées microglies. On peut les comparer à des « gardiennes » du cerveau : elles aident les neurones (les cellules qui transmettent les informations dans le cerveau) à bien se connecter entre eux pendant la croissance, et elles interviennent aussi quand le cerveau doit se défendre, par exemple en cas d'inflammation. Ce projet a pour but de mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent, et quel rôle elles jouent dans le comportement. Des recherches, chez l'animal et chez l'humain, montrent que lorsque les microglies fonctionnent mal, cela pourrait favoriser l'apparition de certains troubles, comme la dépression, l'anxiété, ou l'autisme. Ces cellules semblent aussi jouer un rôle dans la mémoire et dans des maladies comme Alzheimer, ainsi que dans d'autres maladies du cerveau comme la sclérose en plaques. Il est donc important de comprendre comment ces cellules sont contrôlées, et quels sont les éléments, dans leur fonctionnement interne, qui influencent la façon dont le cerveau se construit et s'adapte. Ce projet comporte deux parties. La première partie cherche à comprendre comment la sérotonine, une substance produite par le cerveau qui sert à transmettre des messages entre les cellules, agit sur les microglies pendant les premières semaines de vie, et quelles conséquences cela peut avoir plus tard, à l'âge adulte. Nous regarderons l'effet sur le comportement habituel (par exemple la sociabilité, l'anxiété, la mémoire) et sur la réponse du cerveau face à une inflammation. Pour cela, nous utiliserons des médicaments qui agissent sur la sérotonine, comme certains antidépresseurs bien connus. La seconde partie cherche à comprendre le rôle de certains éléments internes aux microglies, déjà repérés lors d'études précédentes. Pour cela, nous modifierons leur fonctionnement uniquement dans ces cellules, chez des souris, puis nous observerons les conséquences, à la fois sur les microglies elles-mêmes et sur le comportement, en conditions normales et lors d'une inflammation. Ces expériences seront réalisées chez des animaux jeunes et chez des animaux adultes, afin de voir si les effets sont différents selon l'âge. Ce projet vise donc à mieux comprendre comment les microglies et la sérotonine agissent ensemble pour le bon fonctionnement du cerveau, afin, à terme, de mieux comprendre l'origine de certaines maladies psychiatriques humaines.
Bénéfices attendus
La microglie est un acteur essentiel du développement et du fonctionnement du système nerveux central, notamment par son implication dans la mise en place, la maturation et la plasticité des circuits neuronaux. Des altérations précoces de ses fonctions peuvent entraîner des perturbations durables de l’organisation de ces circuits, susceptibles de contribuer à l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Par ailleurs, plusieurs gènes associés à des pathologies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, sont majoritairement exprimés dans la microglie et interviennent également au cours du développement cérébral, suggérant l’existence de liens entre altérations précoces et vulnérabilité ultérieure. Le présent projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la microglie, en particulier en lien avec la signalisation sérotoninergique. Les données obtenues permettront de préciser le rôle de cette interaction dans la formation et le fonctionnement des circuits neuronaux, ainsi que dans la réponse à des stimuli inflammatoires. À court terme, ce projet contribuera à l’acquisition de connaissances fondamentales sur les déterminants moléculaires et fonctionnels de l’activité microgliale au cours du développement et à l’âge adulte. À plus long terme, ces résultats pourraient favoriser l’identification de nouvelles cibles d’intérêt pour la compréhension, la prévention et la prise en charge de pathologies neurodéveloppementales, psychiatriques et neurodégénératives. Enfin, le développement et l’utilisation d’approches innovantes, telles que les nanoparticules lipidiques pour la modulation ciblée de l’expression génique dans la microglie, pourraient à terme permettre de limiter le recours à des modèles génétiques complexes, contribuant ainsi à une réduction du nombre d’animaux utilisés en expérimentation.
Procédures
Les animaux pourront recevoir des administrations de composés pharmaceutiques par différentes voies (injection ou administration orale), de manière ponctuelle ou répétée selon les groupes expérimentaux. Une injection par jour est réalisée sur des animaux vigiles. Le protocole peut comporter jusqu’à 18 administrations successives réparties sur plusieurs semaines. Chaque injection ne dure que quelques secondes. Certains animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs (10 au maximum) permettant d’évaluer leur sociabilité, leur anxiété, leur mémoire. Ces évaluations sont réalisées sur des animaux vigiles et chaque séance dure environ 15 minutes. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale afin d’administrer un composé dans une région précise du cerveau. Cette intervention, réalisée sous anesthésie générale et analgésie-anesthésie locale de la zone concernée par la chirurgie, dure au maximum 45 minutes. Une prise de sang pourra également être réalisée chez certains animaux, soit vigiles lorsqu’il s’agit d’étudier la réaction à un stimulus inflammatoire, soit anesthésiés profondément quand le prélèvement est réalisé en fin d’étude. Les prélèvements durent moins d’une minute. À l’issue des procédures expérimentales, des euthanasies par une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale profonde et analgésie seront réalisées afin de permettre les analyses scientifiques nécessaires à l’étude.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont : lors des injections, une douleur de courte durée ; lors de l’administration du composé pharmacologique par voie orale, un stress lié à la contention de l’animal et un risque mineur de fausse route ; lors des prélèvements de sang, un risque d’hémorragie si l’animal a un problème de coagulation ; lors des anesthésie générales et analgésies, un risque de détresse respiratoire du fait de l’injection des anesthésiants et analgésiques ; pendant et après la chirurgie, un risque de douleur liée à l’acte d’incision et d’injection. Par ailleurs, les tâches comportementales génèrent un stress modéré, du fait d’un nouvel environnement et de la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables).
Devenir
À l'issue des différentes étapes du projet, l'ensemble des animaux utilisés sera euthanasié. Cette étape est nécessaire pour permettre les analyses qui constituent le cœur de notre étude. En effet, pour comprendre comment la sérotonine agit sur la microglie, ou comment certains gènes influencent le fonctionnement de ces cellules, il est indispensable d'examiner directement le cerveau des animaux. Ces analyses portent notamment sur l'observation des cellules microgliales elles-mêmes (leur nombre, leur forme, leur état d'activation), sur l'expression de gènes spécifiques dans le tissu cérébral, ou encore sur la structure des connexions entre neurones. Ce type d'examen nécessite de prélever le cerveau, ce qui implique l'euthanasie préalable de l'animal. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative permettant d'obtenir ces informations chez l'animal vivant : les techniques d'imagerie actuelles ne permettent pas d'observer les microglies avec la précision cellulaire et moléculaire requise pour ce projet. Le prélèvement du tissu cérébral post-mortem reste donc l'unique moyen d'accéder à ces données. Par ailleurs, les animaux étant étudiés à différents âges (de la période néonatale à l'âge adulte) afin de distinguer les effets sur le développement du cerveau de ceux observés chez l'animal mature, chaque groupe d'animaux ne peut être analysé qu'à un stade donné : un même animal ne peut donc pas servir de son propre témoin à plusieurs âges, ce qui justifie également le nombre d'animaux prévus dans le projet. L'euthanasie sera pratiquée selon des méthodes conformes à la réglementation en vigueur, choisies pour limiter au maximum toute douleur ou détresse chez l'animal.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales induites par un apprentissage, une mémorisation (de l’association contexte ou stimulation). En préparation et en parallèle de ce projet sur l’animal éveillé, nous faisons des expériences sur des cultures primaires de cellules, pour des mises au point ou pour tester des hypothèses. Cependant, l’apprentissage et la mémorisation, de l’association contexte ou stimulation (et donc « peur »), comme le test pour déterminer le niveau de mémorisation de cette association, reposent sur le comportement de l’animal, qui doit être éveillé et pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (vue, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, dont on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux processus mnésiques. De plus, il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère afin d’obtenir des résultats transposables à l'Homme car les structures cérébrales impliquées et étudiées (ex : l’hippocampe) ne sont pas présentes chez les invertébrés. La souris représente un modèle de choix car le fonctionnement du cerveau et les tests comportementaux que nous allons utiliser sont bien caractérisés. L’autre avantage du modèle souris est qu’il existe des lignées transgéniques permettent de modifier les cellules microgliales pour étudier leur rôle, en invalidant ou en exprimant des gènes spécifiquement dans ces cellules.
Réduction
Afin de déterminer le nombre minimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles, une analyse statistique utilisant des tests de puissance a été effectuée. D’une manière générale, nous estimons qu’avec notre type d’expériences où nous comparons différents génotypes, il faut au moins 12 animaux de chaque sexe (soit 24 animaux) par condition expérimentale et/ou génotype pour avoir une puissance statistique correcte. De plus, nous devons prévoir des animaux pour ajuster les protocoles, car même si les expériences ont déjà été réalisées au laboratoire précédemment, il est important de refaire des expériences test pour que les nouveaux expérimentateurs amenés à faire l’expérience se familiarisent avec les différentes étapes. Cela permet que les expériences avec les animaux d’intérêt se déroulent bien et soient fiables, donc au total cela limite les répétitions et le nombre d’animaux utilisés. En tout nous estimons l’utilisation de 4080 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Conditions d’hébergement : Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximum et ils disposent dans chaque cage d’un à deux enrichissements de nidification. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) la douleur et ou le stress. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations et prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. En ce qui concerne la chirurgie sans réveil, afin de réduire les nuisances, les animaux seront injectés avec l’anesthétique et l’analgésique dans une pièce séparée, et apportés dans la salle juste pour la chirurgie, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux règlementations, et de manière particulièrement rapprochée après les administrations, les tests comportementaux, et les prélèvements de sang. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant et après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, enrichissement, injection de solution saline et ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste (dégradation de l’état du pelage, manque d’intérêt pour la nourriture, posture anormale), ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par une chirurgie sans réveil. Ils ne seront alors pas forcément utilisés pour l’étude en elle-même mais pourront être utilisés pour des mises au point expérimentales (optimisation des protocoles d’analyse des cerveaux).
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle pour ce projet en raison des grandes similarités entre son cerveau et celui de l'humain, notamment dans le fonctionnement de la microglie et du système sérotoninergique. Les mécanismes que nous cherchons à comprendre – comment ces cellules et cette molécule influencent le développement du cerveau et le comportement – sont largement conservés entre la souris et l'humain, ce qui rend cette espèce particulièrement pertinente pour notre étude. Un autre atout majeur de la souris est la possibilité de modifier précisément son patrimoine génétique. Grâce à des techniques bien établies chez cette espèce, il est possible d'agir sur un gène donné uniquement dans certaines cellules – ici, la microglie – et à un moment précis du développement. Cette précision est essentielle pour notre projet : elle nous permet d'étudier le rôle d'un gène spécifiquement dans le cerveau, sans perturber son fonctionnement dans le reste de l'organisme, ce qui limiterait les effets indésirables et compliquerait l'interprétation des résultats. Aucun autre modèle expérimental ne permet aujourd'hui d'étudier le cerveau avec un tel niveau de précision. Les interventions seront réalisées à différents âges, depuis les premières semaines de vie jusqu'à l'âge adulte. Ce choix est directement lié à notre objectif scientifique : la microglie et la sérotonine jouent des rôles différents selon le stade de développement du cerveau, et seule une comparaison entre plusieurs âges permet de distinguer les effets propres à la maturation cérébrale de ceux observés chez l'animal adulte déjà formé. Enfin, la souris est une espèce dont les besoins physiologiques et comportementaux sont bien connus, ce qui permet d'adapter au mieux les conditions d'élevage et d'expérimentation afin de limiter autant que possible toute douleur, souffrance ou inconfort durant les procédures.
Lésion médullaire et régulation de la pression artérielle : rôle du segment thoracique 2 et modulation sérotoninergique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
33 rates subissent une lésion chirurgicale de la moelle épinière et présenteront une paralysie des pattes arrière, parfois des épaules au bas du corps, avec une vessie vidée à la main chaque jour. 88 rates en tout sont utilisées, 25 anesthésiées environ 4 h 30 sans jamais se réveiller, les 30 dernières opérées deux fois puis hébergées seules et sans enrichissement pendant 48 heures, isolées encore cinq jours, et placées chaque semaine sur un tapis roulant pour mesurer la reprise de la marche. Le niveau de souffrance déclaré est sévère, et toutes sont mises à mort pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur cherche à savoir comment la position de la lésion modifie la pression artérielle dans les heures et le jour qui suivent, et clôt les bénéfices attendus sur une phrase, "Les bénéfices sont à long termes".
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière représentent un problème majeur de santé publique. Au-delà des paralysies et des pertes sensorielles bien connues, elles entraînent souvent de graves troubles du fonctionnement automatique de l’organisme, en particulier au niveau cardiovasculaire. Les patients peuvent ainsi présenter des anomalies de la pression artérielle et du rythme cardiaque, des difficultés de régulation de la température corporelle ou des troubles urinaires et digestifs. Chez les personnes atteintes d’une lésion à la moelle épinière au-dessus de la 6ᵉ vertèbre thoracique, ces complications cardiovasculaires sont particulièrement sévères et constituent une cause majeure de mortalité. Tout de suite après la lésion, la chute importante de la pression artérielle associée à un ralentissement du cœur, représente un risque vital immédiat. Si les mécanismes d’adaptation qui apparaissent à long terme sont aujourd’hui mieux compris, les premières heures et les premiers jours après la lésion restent encore peu étudiés, alors qu’ils sont déterminants pour la survie et le pronostic des patients. Certaines régions de la moelle épinière jouent un rôle clé dans le contrôle cardiovasculaire. La zone de la moelle épinière lésée joue un rôle prépondérant dans les symptômes observés chez les patients et dans la capacité des traitements pharmacologiques à être efficaces. Ce projet vise à comprendre comment la position d’une lésion de la moelle épinière peut modifier la pression artérielle chez le rat, immédiatement après la blessure et le lendemain, et à identifier les régions de la moelle qui sont importantes pour réguler le cœur et la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche a pour but d’approfondir nos connaissances sur les problèmes cardiovasculaires qui surviennent après une lésion de la moelle épinière, notamment au niveau des vertèbres cervicales ou thoraciques hautes. L’objectif est aussi d’étudier comment des médicaments agissant directement sur la moelle épinière pourraient atténuer ces troubles. Même si cette étude est avant tout fondamentale, les résultats obtenus pourraient, à terme, ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques et aider à mieux soigner les patients atteints de lésions médullaires, en améliorant la prise en charge de leurs troubles autonomes. Les bénéfices sont à long termes.
Procédures
25 animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse pendant environ 4h30 sans se réveiller de cette chirurgie (animaux non vigile). 33 animaux subiront une lésion médullaire. La chirurgie de la lésion durera environ 40 minutes. Ces animaux présenteront une paralysie des pattes arrière et pour certains une paralysie allant des épaules au bas du corps. Enfin, leur vessie sera vidangée manuellement et quotidiennement (animaux paralysés vigiles pendant 24h puis enregistrement sur animaux non vigiles). 30 animaux seront soumis à 2 chirurgies successives de maximum 1h chacune. Ils seront soumis ensuite à un hébergement individuel sans enrichissement pendant 48h pour permettre leur traitement post-lésionnel, puis encore 5 jours pour suivre leur reprise de la fonction digestive (reprise spontanée). 15 jours après la 2ème chirurgie, ils seront soumis à un test de score moteur pour évaluer la reprise de la marche (marche sur un tapis roulant afin d’évaluer la récupération locomotrice des pattes arrière grâce à notre molécule test) de 3 à 5 minutes sur un tapis roulant toutes les semaines pendant 4 semaines. Ces mêmes rats seront injectés quotidiennement (moins d’une minute) en sous-cutanée et sous lésionnel (traitement chronique) (animaux paralysés vigiles pendant 28 jours).
Impact sur les animaux
Des animaux présenteront une paralysie des pattes arrière et pour certains une paralysie allant des épaules au bas du corps. Cette paralysie entrainera un stress lié à leur condition pendant 3 à 4 jours, le temps de s’adapter à leur environnement. Enfin, leur vessie sera vidangée manuellement et quotidiennement et pourra engendrer un stress transitoire de quelques minutes. Pendant 2 jours post-lésionnel, ils seront placés en hébergement individuel sans enrichissement pouvant induire de l’inconfort. Après la réintroduction de l’enrichissement, ils resteront isolés 5 jours maintenant le stress de la séparation avec un congénère. Toutes les semaines pendant 5 minutes les animaux subiront un stress car ils seront placés sur un tapis roulant pour évaluer leur marche
Devenir
Les animaux seront prélevés post-mortem pour analyses histologiques et biochimiques
Remplacement
Ce projet de recherche vise à étudier les troubles cardiovasculaires qui apparaissent après une lésion de la moelle épinière. La régulation de la pression artérielle et du rythme cardiaque repose sur des interactions complexes qui se désorganisent profondément suite à une lésion médullaire. Sans données expérimentales obtenues directement sur des modèles animaux, il est impossible de créer des modèles informatiques précis ou d'évaluer l'effet de médicaments ciblant ces circuits. Ainsi, l'utilisation de modèles animaux reste essentielle pour atteindre les objectifs de cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour permettre des analyses statistiques robustes et se base sur le n des lots enregistrés dans le précédent projet. Par ailleurs, une pré-étude exploratoire sera réalisée sur un nombre restreint d’animaux afin d’évaluer la pertinence du traitement pharmacologique en fonction du niveau de lésion. Cette approche permettra de cibler le niveau lésionnel le plus pertinent et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les interventions chirurgicales et les soins réalisés s’appuient sur l’expérience de l’équipe avec ce modèle de lésion de la moelle épinière, ainsi que sur les recommandations publiées par d’autres équipes spécialisées. L’ensemble du protocole a été validé par l’équipe vétérinaire du site, et des ajustements ont été mis en place au fur et à mesure des difficultés rencontrées, toujours en concertation avec le vétérinaire. Les animaux seront opérés sous anesthésie générale par inhalation. Des traitements contre la douleur seront systématiquement administrés pendant et après l’intervention, en combinant plusieurs types d’antalgiques, et seront poursuivis pendant au moins trois jours afin de limiter l’inconfort. Après la lésion, l’environnement des animaux sera spécialement adapté : accès facilité à l’eau et à la nourriture, revêtements antidérapants pour aider aux déplacements, et alimentation liquide pendant les premiers jours afin de prévenir les troubles digestifs. Lorsque les animaux ne peuvent pas uriner seuls, la vessie sera vidée manuellement plusieurs fois par jour, et un traitement antibiotique sera administré pour prévenir les infections. Des critères d’arrêt stricts, définis avec l’équipe vétérinaire, seront appliqués tout au long de l’étude afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle dont la physiologique reste malgré ses différences, proches de celle de l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière suite à une lésion. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets, correspondant à des rats femelles âgés de 6 à 7 semaines au moment de l’implantation, et donc de 8 à 9 semaines au moment de la lésion.
Évaluation de nouveaux produits développés par l’industrie pour prévenir ou traiter le diabète et le foie gras chez la souris mâle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Percées à l'oreille pour identification, pesées seize fois en seize semaines, 360 souris mâles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 270 rendues obèses par une alimentation riche en graisses et en sucres. Viennent jusqu'à 80 injections sous-cutanées ou 80 gavages par animal, deux passages de moins de deux minutes dans un tube d'analyse corporelle, six périodes de jeûne de six heures, des injections de glucose puis d'insuline, et six incisions au bout de la queue pour prélever le sang, aucun test comportemental n'étant prévu au-delà d'un contrôle de l'état général et du comportement trois fois par semaine. Les molécules évaluées viennent de l'industrie et trois d'entre elles sont déjà en phase avancée d'essai clinique chez des patients, le porteur justifiant le passage par la souris par l'impossibilité de pratiquer des biopsies hépatiques chez l'être humain. Toutes reçoivent en fin de protocole un analgésique puis un anesthésique, le temps d'un prélèvement de sang au niveau du foie, avant d'être mises à mort pour la collecte des tissus.
Objectifs
Le diabète de type 2 et la stéatose hépatique d’origine métabolique (appelée aussi « foie gras ») sont des maladies très fréquentes qui représentent aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique. Ces deux maladies sont souvent associées : de nombreux patients atteints de diabète présentent également une accumulation excessive de graisse dans le foie. Même si plusieurs traitements existent déjà, ils ne permettent pas toujours de contrôler efficacement la maladie et peuvent parfois provoquer des effets indésirables. Il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le modèle de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisses et en sucres reproduit les principales caractéristiques observées chez les patients atteints de diabète de type 2 et de stéatose hépatique. Dans ce projet, l’efficacité de plusieurs molécules prometteuses sera évaluée. Trois d’entre elles sont actuellement en phase avancée d’évaluation clinique en mode curatif chez l’Homme pour le diabète de type 2 et/ou le foie gras et seront comparées à un traitement déjà utilisé en pratique médicale. Deux autres molécules d’origine végétale, identifiées lors de nos travaux de recherche, seront également étudiées. L’objectif est de déterminer si ces traitements améliorent les troubles métaboliques associés à ces maladies et de mieux comprendre leurs mécanismes d’action au niveau hépatique (biopsie hépatique trop invasive chez l’homme). Les traitements seront administrés selon deux approches : soit dès le début de l’alimentation riche en graisses et en sucres afin d’évaluer leur capacité à prévenir l’apparition de la maladie, soit après l’installation de la maladie afin d’évaluer leur capacité à la traiter. Cette stratégie permettra d’étudier leur intérêt à la fois en prévention et en traitement, ce qui n’est pas le cas des études cliniques en cours qui sont réalisées chez des patients déjà malades.
Bénéfices attendus
À court terme, ces études permettront de mieux comprendre comment agissent de nouveaux traitements prometteurs contre le diabète de type 2 et la stéatose hépatique. Elles aideront notamment à déterminer si leurs effets bénéfiques sont associés à une amélioration de certaines molécules circulant dans l’organisme ainsi qu’à une restauration du bon fonctionnement des cellules du foie. À plus long terme, ces travaux contribueront à l’évaluation de ces candidats médicaments avant leur utilisation chez l’Homme. Les connaissances acquises pourront soutenir leur développement clinique et participer à l’identification de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de ces maladies.
Procédures
Les 360 animaux subiront un perçage de l’oreille pour leur identification (- de 30 sec avec contention) et seront pesés 1X/semaine pendant 16 semaines, soit 16 pesées/animal (- de 30 sec chacune). Parmi eux, 270 animaux recevront pendant 16 semaines une alimentation riche en graisses et en sucres induisant une prise de poids progressive. Concernant les traitements, 75 animaux recevront une injection sous la peau quotidienne (hors week-ends) pendant 16 semaines, soit 80 injections/animal, et 75 autres pendant 6 semaines, soit 30 injections/animal. Chaque injection durera moins de 30 secondes, contention comprise. Par ailleurs, 105 animaux recevront un gavage dans l’estomac quotidien (hors week-ends) pendant 16 semaines, soit 80 administrations/animal, et 105 autres pendant 6 semaines, soit 30 administrations/animal. Chaque gavage durera moins de 30 secondes, contention comprise. Les 360 animaux bénéficieront de deux mesures de composition corporelle, espacées de 13 semaines. Pour chaque mesure, ils seront placés moins de 2 minutes dans un tube cylindrique permettant leur introduction dans l’appareil d’analyse. Les 360 animaux subiront six périodes de jeûne (de 7 h à 13 h), espacées d’au moins une semaine. Ils recevront ensuite une injection dans le ventre de glucose pour évaluer la tolérance au glucose puis, une semaine plus tard, une injection dans le ventre d’insuline pour évaluer la sensibilité à l’insuline (- de 30 sec par injection, contention comprise). Les 360 animaux subiront six petites incisions à l’extrémité de la queue (- de 1 mm, - de 30 sec, sans contention), espacées d’au moins une semaine, afin de permettre les prélèvements sanguins. Ces prélèvements comprendront six gouttes de sang lors du test de tolérance au glucose, six gouttes lors du test de sensibilité à l’insuline et une goutte lors du suivi de la glycémie (- de 30 sec par prélèvement, sans contention). En fin de protocole, les 360 animaux recevront une injection d’analgésique puis, 30 minutes plus tard, une injection d’anesthésiques permettant le prélèvement sanguin au niveau du foie, suivi de la mise à mort (- de 30 sec par injection, contention comprise).
Impact sur les animaux
Les pesées entraînent un stress léger et temporaire. La consommation d’un régime riche en lipides entraîne une prise de poids sans altération de la mobilité ou du comportement. Lors des mesures de composition corporelle, les souris sont placées pendant moins de deux minutes dans un tube adapté à leur taille, ce qui génére un stress temporaire. Trois molécules sont administrées quotidiennement par injection. Ces injections répétées sur plusieurs semaines provoquent un stress lié à la manipulation et à la contention, ainsi qu’un inconfort local au point d’injection. Trois molécules seront administrées quotidiennement par gavage. Cela engendre un stress et un inconfort liés à la contention et à l’introduction de la sonde. Les tests métaboliques réalisés au cours de l’étude entraînent un inconfort ponctuel. Les périodes de jeûne de six heures sont source de stress. Les injections de glucose ou d’insuline utilisées lors de ces tests sont associées à une douleur légère et transitoire. Les prélèvements sanguins sont réalisés à partir d’une petite incision de moins d’un millimètre à l’extrémité de la queue, provoquant une légère douleur momentanée. À la fin de l’étude, les animaux recevront deux injections (antidouleur puis anesthésique) pour permettre le prélèvement de sang terminal. Ces injections provoquent une légère douleur et un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des expériences afin de collecter les tissus d’intérêt et de procéder aux analyses permettant de répondre à l’objectif du projet.
Remplacement
Des méthodes alternatives, réalisées sur cellules en laboratoire ou à l’aide d’outils informatiques, ont été utilisées dans un premier temps pour sélectionner et étudier les molécules. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet d’un organisme vivant ni les interactions entre les différents organes, tels que le foie, les muscles, le tissu graisseux et l’intestin. Or, le diabète de type 2 et la maladie du foie gras résultent de mécanismes complexes impliquant l’ensemble de l’organisme. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer de manière fiable l’efficacité et les effets des traitements dans des conditions proches de celles observées chez les patients. Bien que certaines des molécules étudiées soient actuellement évaluées chez l'Homme dans des essais cliniques, ces essais ont pour objectif principal de démontrer leur efficacité et ne permettent pas d'explorer de façon approfondie leurs mécanismes d'action. Le modèle souris permet la réalisation d'analyses invasives impossibles chez l’Homme (nous ne pouvons pas faire de biopsies hépatiques) mais indispensables pour caractériser les mécanismes d'action hépatiques de ces traitements.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’une méthode statistique permettant d’utiliser le plus petit effectif possible tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. Ce calcul s’est appuyé sur la capacité à détecter des différences de glycémie lors d’un test évaluant la tolérance au glucose. Cette approche a conduit à retenir un effectif de 15 souris par groupe, soit le nombre minimal nécessaire pour répondre aux objectifs de l’étude tout en limitant l’utilisation d’animaux. Les données recueillies seront ensuite analysées à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin de déterminer si les différences observées entre les groupes sont réelles et non dues au hasard.
Raffinement
L’état général et le comportement des animaux seront contrôlés trois fois par semaine. Le poids corporel sera mesuré individuellement une fois par semaine et la consommation alimentaire sera suivie pour chaque cage. Une surveillance renforcée sera mise en place au début des traitements ainsi qu’au cours des tests métaboliques. Les différents tests seront espacés d’une semaine afin de laisser aux animaux un temps de récupération suffisant. Une attention particulière sera portée aux animaux pendant les tests et dans les heures qui suivent. Les prélèvements sanguins seront réalisés en limitant au maximum les manipulations et les quantités de sang prélevées. Une anesthésie de la queue sera réalisée avant les prélèvements de sang. Les administrations de traitements par gavage ou par injection seront réalisées avec du matériel adapté et les plus petits volumes possibles. Les animaux seront systématiquement surveillés après chaque administration afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront progressivement habitués au dispositif utilisé afin de réduire leur stress. En fin de procédure, les animaux recevront un traitement antidouleur puis une anesthésie profonde avant le prélèvement terminal, garantissant l’absence de douleur lors de cette intervention. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et expérimenté afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Des points limites précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance et angoisse chez les animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé pour étudier l’obésité, le diabète de type 2 et la stéatose hépatique (« foie gras »). Son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’Homme pour ces maladies, ce qui permet d’obtenir des résultats pertinents pour la recherche biomédicale. De plus, une alimentation riche en lipides et en sucres permet de reproduire de manière fiable les principales caractéristiques de ces pathologies. Ce modèle est largement utilisé par la communauté scientifique ce qui facilite la comparaison des résultats. Les souris seront âgées de 5 semaines au début de l’étude. À cet âge, elles sont particulièrement sensibles aux effets d’une alimentation riche en lipides et en sucres. Ce choix permet de reproduire de manière fiable les principales caractéristiques de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique observées chez l’Homme. Il est également conforme aux pratiques couramment utilisées dans la recherche scientifique.