Rongeurs
Etude et manipulation du micro-environnement tumoral dans les méningiomes de haut grade chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
Une grille en cinq critères, notée de 0 à 15, doit déterminer le moment où les souris atteintes de méningiome seront tuées avant le terme prévu. 276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une chirurgie crânienne d'une heure pour recevoir dans le crâne des cellules de méningiome ou un virus recombinant, puis jusqu'à six injections sous la peau du crâne, et peut développer perte de motricité, amaigrissement et crises convulsives. Le projet vise à établir le rôle des cellules immunitaires des méninges dans la progression de ces tumeurs, en vue de futures immunothérapies chez l'être humain.
Objectifs
Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutation d'un gène particulier ( NF2). Ces formes représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une survie réduite sans option médicamenteuse ou d’immunothérapie disponible. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire . Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes non graves par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire méningé régule la progression maligne des méningiomes et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité et d'évaluer le rôle des populations immunitaires méningées dans l'initiation et la progression du méningiome.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes-NF2 en manipulant les cellules immunitaires des méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme
Procédures
Pour chaque expérience, les souris vigiles adultes seront d’abord injectées en sous cutanée avec un antidouleur 30 mn avant, puis en intra-péritonéal avec du chlorure de sodium pour hydratation avant l’anesthésie. Ces gestes rapides et maitrisés par l’opérateur ne sont pas douloureux à part la piqure de l’aiguille. Puis les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse avant la procédure chirurgicale. La procédure chirurgicale sera d’injecter en intra- cranial des lignées cellulaires de méningiome ou de virus recombinant afin d’induire les méningiomes. Durée 1h préparation 30 mn. Puis une semaine après l’intervention : - les souris de la procédure 2 seront seront injectées en sous-cutanée au niveau de la peau du crâne (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) répétée 3 fois (1 par semaine pendant 3 semaines ) ou 6 fois (tous les 2 jours sur 12 jours) suivant le produit injecté pour la déplétion en cellules immunitaires. Les souris de la procédure 3 seront injectées en intra péritonéal (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) une seule fois pour l’activation d’une sous population de cellules immunitaires. A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements. .
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet incluent les nuisances suivantes : les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale tels que dépression cardio-vasciulaire, hypothermie, hypocvolémie, sécheresse cornéenne et douleurs post-opératoires. Les animaux pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous- cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires. Les signes cliniques potentiels seront soulagés par l'administration d'anti-douleurs et le suivi des points limites par du personnel qualifié. Aucune nuisance ne sera liée au génotypage. Le génotypage s’effectuera grâce à des techniques non invasives : soit en associant un prélèvement de tissu pour le génotypage (poinçon d’oreille)qui sera confondu avec la méthode d’identification , soit l’identification par bague à l’oreille et le prélèvement de follicule pileux. Dans les deux cas ces techniques sont considérées comme étant sous le seuil réglementaire.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifiée par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles murins déjà existants. La complexité du cerveau des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau humain.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 276 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Nous aurons des résultats d’animaux expérimentaux à comparer aux résultats obtenus sur les animaux dits « contrôles ». Cela permet d'avoir une évaluation rationnelle du nombre d'animaux pour pouvoir effectivement observer l'effet escompté.
Raffinement
A la réception des animaux en provenance de l’extérieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Au courps de la procédure ,les souris seront réchauffées sur tapis chauffant pendant la chirurgie, elles auront un accès facile à de la nourriture humide (contenant 70% d’eau) , des antidouleurs et des bâtonnets à ronger pour améliorer leur rétablissement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zootechnique et par un des membres de l’équipe de recherche. Le bien- être et la douleur des animaux seront évalués par une grille de score selon 5 critères pour donner un score global d’évaluation de la douleur noté entre 0 et 15 : 1-Apparence et Grimace 2- Comportement naturel 3- Evolution pondérale 4-Comportement provoqué 5- Site de la chirurgie. Une surveillance post opératoire dédiée est réalisée afin d’identifier des signes de souffrance physique ou morale, l’apparition des points limites, et également l’apparition de signes d’infection générale ou du site opératoire.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement.
Comprendre comment un dysfonctionnement mitochondrial conduit à une atteinte de la régénération musculaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale ou un gavage chaque jour pendant cinq jours, puis une injection de toxine ou de chlorure de baryum dans le muscle de la patte, qui le paralyse le temps que dure l'effet. Le projet cherche à comprendre comment un dysfonctionnement des mitochondries perturbe la régénération du muscle, avec en ligne de mire les dystrophies musculaires et la sarcopénie. Le porteur qualifie sa propre étude de "menée de manière éthique" et affirme utiliser "judicieusement des modèles animaux" avec des "stratégies d'intervention humaines".
Objectifs
L’ensemble du projet vise à apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la mise en place des muscles squelettiques au cours du développement, de la régénération musculaire et des pathologies. Nous souhaitons comprendre comment les mitochondries sont impliqués dans le développement de muscles des membres. Ces études sont essentielles pour comprendre l’origine des maladies qui touchent le muscle squelettique, appelées dystrophies musculaires, ainsi que la sarcopénie. Pour cette étude, il est essentiel de recourir à des modèles murins génétiquement modifiés qui i) nous permettent de marquer et suivre spécifiquement leur devenir ou éliminer des cellules d’intérêts pour comprendre leur origine et leur fonction et ii) nous permettent d’altérer les fonctions mitochondriales. Le deuxième aspect que nous étudions est le développement du muscle post-natal et sa capacité à régénérer après une blessure ou dans des cas de dystrophies musculaires. Ces processus font intervenir des cellules souches adultes. Les cellules souches ont la propriété de générer des cellules différenciées (les myofibres) qui assurent la fonction contractile du muscle, et de s’auto-renouveler afin d’assurer leur maintenance. La compréhension du fonctionnement normal des cellules souches est nécessaire pour définir l’origine de leur dysfonctionnement dans les pathologies musculaires ou le vieillissement. Notre étude vise à comprendre les propriétés des cellules souches musculaires, les myofibres et les populations interstitielles des muscles des membres. Pour cela, il est essentiel d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent d’identifier et d’isoler les cellules souches musculaires, les myofibres et les populations mutantes afin de les étudier aux niveaux cellulaires, moléculaires et fonctionnels. Si certaines expériences d’analyse peuvent être établies in vitro, d’autres doivent impérativement être réalisées in vivo car aucun système in vitro ne permet à ce jour de reproduire fidèlement les conditions naturelles et complexes d’un tissu.
Bénéfices attendus
Cette recherche s'efforce d'explorer la relation complexe entre la dysfonction mitochondriale, les cellules souches adultes et les fibres musculaires, en mettant particulièrement l'accent sur les implications pour la sarcopénie et la dysfonction musculaire. En comprenant les mécanismes moléculaires impliqués, cette étude vise à élucider comment les dommages mitochondriaux contribuent à la dégénérescence et à la régénération du muscle squelettique. La compréhension de ces processus complexes offre d'énormes perspectives pour faire progresser les stratégies thérapeutiques ciblant des conditions telles que la sarcopénie et les maladies musculaires génétiques, visant finalement à améliorer la qualité de vie des personnes concernées. Les avantages potentiels vont au-delà de l'amélioration des pathologies liées aux muscles, car les connaissances acquises grâce à cette recherche pourraient avoir des implications plus larges pour atténuer la fragilité liée à l'âge, réduire le risque de chutes et de fractures, et améliorer l'homéostasie générale du muscle squelettique. Menée de manière éthique, cette étude utilise judicieusement des modèles animaux, mettant en œuvre une surveillance rigoureuse, des statistiques prédictives et des stratégies d'intervention humaines, garantissant que les connaissances acquises contribuent de manière éthique et efficace à la compréhension plus large de la communauté scientifique de la dysfonction mitochondriale dans le contexte des cellules souches adultes et des fibres musculaires. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’apporter des informations nouvelles sur les bases moléculaires qui contrôlent la prédisposition des muscles aux pathologies musculaires et de ce fait, des informations essentielles pour les thérapies à développer.
Procédures
- La procédure comporte essentiellement des injections intrapéritonéales ou intramusculaires. - La procédure comporte en général une injection intrapéritonéale (quelques secondes) ou un gavage (de l’ordre d’une minute) chaque jour, pendant 5 jours, avec optionnellement 4 injections intrapéritonéales supplémentaires avant mise à mort (1 injection/jour) et d’une injection intramusculaire (quelques secondes) sous anesthésie. - La procédure dure au maximum 1 mois
Impact sur les animaux
Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement en des injections intrapéritonéales ou intramusculaires sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour injection de toxine ou chlorure de baryum entraine une douleur légère de courte durée. Les effets indésirables attendus est une boiterie transitoire de courte durée (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, selon les critères énoncés pour la procédure, à la fin de des expériences, pour collecter les tissus nécessaires à nos travaux de recherche.
Remplacement
La formation et la régénération des muscles squelettiques impliquent une multitude de réponses et d’interactions cellulaires entre les progéniteurs/cellules souches musculaires et leur environnement au sein d’une ultrastructure tridimensionnelle complexe. L’environnement ou la niche, est composé de multiples facteurs comme une matrice extracellulaire tridimensionnelle et des types cellulaires interstitiels variés. Les cultures in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité de ces interactions. Néanmoins, l’approche in vitro pour les stratégies d’analyses moléculaires sera mise en place toutes les fois où cela sera possible afin de limiter le recours à l’animal en utilisant des lignées cellulaires ou des cellules primaires amplifiées in vitro.
Réduction
Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, par des biostatisticiens.
Raffinement
Un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. L’effet local de l’injection de toxines peut être une paralysie transitoire du muscle tibial antérieur injecté et donc une incapacité pour l’animal de s’appuyer sur son membre inférieur durant le temps de paralysie. Au réveil de l’anesthésie, l’animal présente une boiterie transitoire (
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est basée sur plusieurs critères : - Les souris sont des petits Mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme notamment au niveau des mitochondries. - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les acteurs de la régénération notamment la souris transgénique étudiée qui permet d’isoler une population pure de cellules souches musculaires. Adulte. Les animaux sont considérés comme adulte après 6 semaines et âgés à partir de 20 mois. Au-delà de 6 mois, le nombre de cellules satellites décroit chez les souris. Pour ces raisons, nous utilisons essentiellement des souris de 6 à 12 semaines.
Etude de l’association de sources cellulaires autologues à un substitut phosphocalcique pour la régénération osseuse : application en défauts osseux sur calvaria de rats
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Un substitut osseux en poudre, développé pour être réhydraté par le chirurgien avec le liquide de son choix, va être testé sur 133 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une chirurgie du crâne d'au plus vingt minutes, pendant laquelle un ou deux trous sont percés dans les os pariétaux puis comblés avec le matériau. Les animaux sont gardés trois, sept ou huit semaines, avec un risque de douleurs postopératoires et de gêne au site d'implantation, avant d'être tués pour récupérer les échantillons. Présentée comme une démonstration d'efficacité, l'étude vise à moyen terme, selon le porteur, "la mise sur le marché d'un produit innovant".
Objectifs
Le traitement de la fragilisation osseuse liée au vieillissement, ainsi que des maladies et des traumatismes touchant le tissu osseux, est un enjeu sociétal majeur et nécessite dans la plupart des cas une intervention chirurgicale pour régénérer le tissu osseux lésé. Plusieurs procédés permettent de restituer l’intégrité osseuse mais l’utilisation d’os venant du patient lui-même reste le traitement de référence dans la majorité des cas (autogreffe). Les substituts osseux synthétiques sont développés et utilisés en clinique depuis plusieurs décennies. Leurs propriétés sont améliorées, tant au niveau de la facilité d’utilisation que de l’efficacité en terme de régénération osseuse. A l’heure actuelle, les solutions synthétiques proposées se limitent à des formes solides (granules ou blocs) ou à des « pâtes » prêtes à l’usage ou à hydrater à des ratios stricts. Nous avons récemment développé une formulation sous forme de poudre sèche composée de granules de calcium, constituants de l’os, et d’un polymère formant un gel une fois hydraté. Cette formulation permet au clinicien de réhydrater cette dernière par le liquide de son choix (sérum physiologique, sang, moelle osseuse mais également antibiotiques ou autres molécules). Ces réhydratations/mélanges sont possibles dans des quantités modulables afin d’obtenir une pâte dont les propriétés de manipulation sont supérieures à celles des produits présents sur le marché. Ces mélanges apportent des cellules du patient dans le matériau, visant ainsi à améliorer les propriétés de notre produit . L’objectif de ce travail est donc de démontrer l’efficacité de ce produit sous forme de poudre à réhydrater avec des ratios/solution de réhydratation sélectionnés suite à des essais préalables. Nous nous questionnerons aussi sur l’impact de l’espacement des granules dans la préparation ainsi que des propriétés de surfaces des biomatériaux sur la régénération osseuse.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de déterminer l’efficacité des granules contenus dans notre produit dans le cadre de la régénération osseuse. Nous étudierons leur répartition dans le défaut grâce à la présence d’un gel pour les maintenir à distance . Elle nous permettra aussi d’évaluer l’efficacité des différents produits présents sur le site opératoire en combinaison avec notre produit. Cette étude pourra nous apporter de nouvelles connaissances sur les phénomènes impliqués dans la régénération osseuse chez l’Homme lors de l’utilisation de cellules du patient combinées à un substitut. A moyen terme, la mise sur le marché d’un produit innovant est envisagée.
Procédures
Les rats seront chacun soumis à une unique procédure chirurgicale consistant à la réalisation et d’un ou deux défauts osseux (en calvaria). Ces défauts seront comblés avec nos substituts osseux afin d’observer les propriétés de régénération osseuse. Cette chirurgie n’excédera pas 20 minutes, durant lesquelles les animaux seront endormis. Suite à celle-ci les animaux seront surveillés et leur bien-être sera assuré jusqu’à leur euthanasie après 3, 7 ou 8 semaines.
Impact sur les animaux
Au vu des précédentes études menées au laboratoire avec les composants de notre matériau, peu de souffrances sont attendues lors des manipulations prévues grâce aux anti-douleurs injectés aux animaux. Il est possible que des douleurs post-opératoires adviennent, comme des difficultés de récupération suite à l’anesthésie, une gêne fonctionnelle ou des douleurs au site d’implantation. Pour éviter cela, les animaux seront médicamentés les jours suivants l’opération
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire afin de récupérer et analyser les échantillons.
Remplacement
A l’heure actuelle, l’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux en terme de capacité à promouvoir la formation d’os. De plus, afin de développer des techniques et protocoles chirurgicaux chez le gros animal avant d’aller en clinique chez l’homme, la démonstration d’une preuve de concept sur le petit animal est nécessaire pour sélectionner la ou les meilleures formulations
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les composants présents dans le biomatériau utilisé ont été sélectionnés en amont et déjà testé s pour leur biocompatibilité et bioactivité in vitro. De même les mélanges sélectionnés pour cette étude ont été étudiés et choisi s préalablement pour leurs propriétés texturales. Pour la première procédure les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rat, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs une approche statistique nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude.
Raffinement
Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillée . Selon les points limites identifiés, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée ou seront retirés de l’étude. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux de 3 individus par cage avec enrichissement sous forme de frisottis et recevront une nourriture standard et de l’eau à volonté. Nous raffinerons les conditions d'hébergement des animaux par un enrichissement des milieux dans chaque cage. Les animaux seront observés de manière quotidienne par les animaliers de l’unité expérimentale pour s’assurer du bien-être des animaux.
Choix des espèces
Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique de calvaria chez le rongeur. Le modèle de régénération osseuse chez le rongeur est bien décrit dans la littérature. Le choix du rat permet de travailler sur des proportions convenables d’os à régénérer et les outils d’analyses chez animaux sont très développés : scanner du petit animal, outils de chirurgie adaptés. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats d’environ 8 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans maladies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance de l’animal.
Optimisation de la méthode d’administration d’un traitement antitumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 864 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, quatre injections de traitement, et pour une partie quatre séances d'électroporation sous anesthésie, la peau ayant été tondue et dépilée à la crème. Les tumeurs peuvent s'ulcérer, gêner les déplacements et provoquer douleur et détresse, et le cancer peut se propager jusqu'à perturber la respiration. Le porteur indique que l'interaction entre tumeur et système immunitaire mobilise trop de cellules d'organes différents pour être reproduite hors de l'animal, et présente ces données comme "essentielles" pour les futurs essais cliniques.
Objectifs
Chaque tumeur est différente, il est donc important de prendre en compte ces différences, les mutations, afin de proposer un traitement adapté à chaque patient et ainsi maximiser les chances de guérison. En ce sens, nous avons développé un traitement personnalisé composé d’un virus atténué, un fragment d’ADN comprenant les mutations spécifiques de la tumeur du patient à traiter et un anticorps déjà utilisé en immunothérapie actuellement. Notre traitement permet donc d’éduquer le système immunitaire du patient à reconnaître sa tumeur et ainsi pouvoir la détruire. Ce traitement personnalisé a déjà fait ses preuves sur des modèles tumoraux de souris mais jusque-là nous n’avons utilisé qu’une seule méthode d’administration. Nous souhaitons donc à présent optimiser l’efficacité antitumorale de notre traitement en testant différentes méthodes d’administration chez l’animal pour sélectionner la plus efficace.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices à deux niveaux à la suite de l’exécution de ce projet : - Améliorer notre traitement en sélectionnant une méthode d’administration plus efficace que l’injection sous-cutanée simple et en testant une nouvelle version de notre formulation pouvant présenter plus d’efficacité que la précédente - Ces données sont essentielles pour les futurs essais cliniques chez l’humain et tester la sureté et l’efficacité de notre traitement pour soigner des patients atteints de cancer.
Procédures
Etude préliminaire : - 1x dépilation (tondeuse et crème dépilatoire) sous anesthésie générale (12 minutes) - 1x injection sous-cutanée sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 1x électroporation sous anesthésie générale (2 à 3 minutes) Etudes de survie et études de mécanistiques Groupes sans électroporation (injection sous-cutanée simple ou avec composé d’encapsulation) - 1x tatouage à l’aide de pâte à tatouer et d’aiguille sous anesthésie générale (6 minutes) - 1x injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 4x injections sous-cutanées de traitements (30 secondes) Groupes avec électroporation (injection sous-cutanée directement suivie d’une électroporation) - 1x tatouage à l’aide de pâte à tatouer et d’aiguille sous anesthésie générale (6 minutes) - 1x injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 1x dépilation (tondeuse et crème dépilatoire) sous anesthésie générale (12 minutes) - 4x injections sous-cutanées sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 4x électroporation sous anesthésie générale (1 par injections sous-cutanée - 2 à 3 minutes)
Impact sur les animaux
Il est possible d’observer des rougeurs passagères ou des brûlures légères et transitoires à l’endroit où le traitement a été administré avec la procédure d’électroporation. Chez les souris porteuses de tumeur, la tumeur peut gêner au déplacement de l’animal en fonction de sa localisation. La tumeur peut aussi ulcérer et causer douleurs et détresse à l’animal. Le cancer peut se propager dans l’organisme, ce qui peut alors perturber le comportement de l’animal, sa respiration ou sa locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder au prélèvement des organes où s'initie la réponse immunitaire et des tumeurs. Ces divers échantillons nous permettront d’effectuer des analyses au niveau cellulaire et moléculaire afin de caractériser la réponse immunitaire induite par notre traitement.
Remplacement
Nous voulons étudier les mécanismes mis en œuvre par notre système immunitaire d’une part et par la tumeur d’autre part, ainsi que l’interaction entre ces deux entités. Cette interaction nécessite l’intervention de nombreuses cellules différentes provenant d’organes différents. Cette complexité requiert pour l’heure des études chez l'animal pour évaluer et comprendre les phénomènes mis en jeu.
Réduction
Pour l’étude pilote chez les souris saines, pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes en utilisant les tests adéquats, nous avons besoin de 6 échantillons par groupe. Cela représente 3 souris par groupe, car nous réaliserons la procédure d’électroporation sur le flanc gauche et sur le flanc droit de chaque animal. Si, et seulement si, lors de l’étude de survie sur le modèle de cancer de la peau notre traitement administré par une ou les deux nouvelle(s) méthode(s) d’administration a montré une efficacité en comparaison à l’injection sous-cutanée simple, nous réaliserons une étude de survie sur le modèle de cancer du côlon. Pour les études de survie chez les souris atteintes de cancer, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 20 selon un test statistique adéquat. Pour chaque modèle de cancer testé, si et seulement si, lors de l’étude de survie correspondante notre traitement administré par une ou les deux nouvelle(s) méthode(s) d’administration a montré une efficacité en comparaison à l’injection sous-cutanée simple, nous réaliserons une étude mécanistique. Pour ces études mécanistiques, en utilisant un test statistique adéquat, nous avons besoin de 7 souris par groupe. Le dosage des composés de notre vaccin est basé sur l’art antérieur issu de la littérature et de nos données propres.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe afin de préserver les interactions sociales et hébergés dans des cages disposant de matériel de nidification, de bâton à ronger et de tunnels de transfert transparents. Les actes expérimentaux susceptibles d'entraîner une angoisse pour l'animal sont réalisés sous anesthésie générale légère. L’observation des animaux sera effectuée tous les jours et un suivi approfondi des animaux porteurs de tumeurs sera assuré trois fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et des examens réguliers du bien-être de la souris et de l’évolution de sa tumeur nous permettront, le cas échéant, de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris est un animal qui comporte un système immunitaire largement décrit dans la littérature qui est proche de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet. Il s’agit d’un modèle de référence en immunologie ainsi qu’en immuno-oncologie et de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles pour cette espèce. Par ailleurs cette espèce dispose de nombreuses ressources en oncologie telles que les modèles de cancer utilisés dans ce projet. Les souris seront de jeunes adultes (6-8 semaines) ce qui correspond à un stade où le système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel. Les animaux ne sont pas choisis plus âgés pour limiter les effets de la dégénérescence immunitaire.
Modèle expérimental de décollement rétinien chez le lapin et le rongeur.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1600
Lapins : 1600
Pour installer dans l'établissement un modèle de décollement de la rétine, 1 600 lapins, 1 600 rats et 1 600 souris vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Le décollement est provoqué par une injection sous la rétine, suivie d'examens oculaires hebdomadaires, d'instillations quotidiennes, d'injections dans l'œil une à deux fois par semaine et de prises de sang. Le porteur affirme que le décollement de rétine n'est pas douloureux chez l'être humain et transpose ce constat aux autres animaux, tout en indiquant que l'œil injecté subira une altération permanente de la vision. Les animaux qui suivent la procédure entière sont tués pour analyse des tissus, les autres, environ 10 %, sont gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure.
Objectifs
La rétine est un tissu photo sensible nécessaire à la vision. Elle tapisse l’intérieur de l’œil, reçoit les informations lumineuses, les transforme en signaux nerveux et les transmet au cerveau. Certains troubles de la vision peuvent être dus à un décollement de rétine. Les causes du décollement rétinien peuvent être variées (myopie, opérations de la cataracte, diabète, tumeurs de l’œil, forte inflammation, vieillissement des structures de l’œil, un coup porté à l’œil, ou encore hérédité…). Le mécanisme impliqué est le plus souvent une accumulation de liquide sous la rétine, qui pénètre par des trous ou des déchirures de la rétine. Lors de ce décollement la rétine est séparée physiquement de son support, si cette séparation persiste les cellules de la rétine meurent, la zone décollée ne fonctionne plus. Sans traitement par l’ophtalmologiste le décollement s’étend, pouvant ainsi entrainer des lésions irréversibles de la rétine et même la cécité. L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle de décollement rétinien chez les rongeurs et le lapin, afin de tester des traitements qui vont permettre la survie de la rétine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine dans les cas de décollement rétiniens.
Procédures
Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection sous rétinienne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour. Les injections peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt.
Impact sur les animaux
Les maladies neurodégénératives de la rétine et les décollements ne sont pas douloureux chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animal en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.
Caractérisation, diagnostique, et traitement des atteintes auditives centrales dans les formes génétiques de surdité
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Exposées à des sons assez forts pour déclencher une crise d'épilepsie réflexe, immobilisées par une pièce fixée chirurgicalement sur le crâne pour enregistrer leur activité cérébrale tous les deux jours pendant huit semaines, 15 385 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, une partie par perfusion intracardiaque, et au moins 675 d'entre elles reçoivent en plus une injection de vecteur thérapeutique dans la cochlée. Le projet porte sur les atteintes auditives du cerveau associées aux formes génétiques de surdité, dans la perspective d'améliorer les résultats de la thérapie génique et des implants cochléaires. Le porteur écrit qu'aucune nuisance majeure n'est attendue et que la surdité est "largement compensée" chez la souris, tout en décrivant des crises convulsives provoquées, des chirurgies crâniennes et des infections postopératoires traitées aux antibiotiques.
Objectifs
L’étude des atteintes auditives héréditaires a conduit à l'identification de leurs gènes causaux. Les gènes responsables de plus de 140 formes et d'environ 400 formes génétiques de surdité ont déjà été découverts. L'étude de modèles murins de ces formes monogéniques de surdité a permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'audition, en particulier ceux impliqués dans le développement et/ou la physiologie de l'organe sensoriel auditif, la cochlée. Parallèlement, l'étude de ces modèles a également permis de déchiffrer les mécanismes physiopathologiques à l'origine des atteintes auditives. Ceci a conduit plusieurs laboratoires à s'intéresser au potentiel de la thérapie génique pour guérir ces formes de surdité. Des preuves de concept ont été obtenues pour le traitement de plusieurs formes de surdité chez la souris, ouvrant la voie à des essais cliniques de thérapie génique cochléaire chez des patients. Néanmoins, la surdité périphérique peut également être associée à des dysfonctionnements auditifs centraux et peut s'étendre bien au-delà du système auditif lui-même, à la suite d'altérations des entrées sensorielles ou de l'implication des gènes responsables de la surdité dans le développement et/ou le fonctionnement des circuits auditifs centraux. L'étude de la diversité, des causes et des mécanismes sous-jacents de ces dysfonctionnements centraux, de la manière dont ils pourraient entraver les avantages escomptés de la restauration de l'audition par la thérapie génique périphérique, et la détermination de la manière dont ces problèmes pourraient être résolus sont devenus un domaine de recherche à part entière. L’objectif du projet est de caractériser les deux grands types de troubles centraux auditifs, i) ceux induits indirectement des suites d’une surdité périphérique, et ii) ceux qui ont pour origine un rôle intrinsèque de gène dans le développement et/ou le fonctionnement des voies auditives centrales. Afin de déchiffrer les mécanismes physiopathologiques induisant ces atteintes auditives centrales, nous caractériserons sur les plans histologiques, transcriptomiques, fonctionnels et comportemental deux grandes classes de modèles de souris mutantes, une première avec des modèles présentant des troubles auditifs périphériques et une seconde avec des modèles pour des gènes de surdité particulier qui induisent une hyperexcitabilité auditive chez l’animal.
Bénéfices attendus
En caractérisant les atteintes auditives centrales directes et indirectes dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les conséquences vasculaires et neuronales des pertes auditives dans les formes génétiques de surdité. Ce travail contribuera au déchiffrage des mécanismes pathologiques impliqués dans le lien entre perte auditive et risque ultérieur de développer une maladie neurodégénérative. Enfin, notre projet testera la réversibilité de ces déficits vasculaires et neuronaux suite à une récupération auditive. Ce travail sera essentiel pour montrer de quelle façon la pose d’aides auditives est bénéfique afin protéger le système auditif central des patients. - La qualité de la récupération auditive suite à la pose d’un implant cochléaire est variable d’un patient à l’autre. Certains facteurs comme l’âge d’apparition de la surdité et sa durée sont connus pour influer sur le résultat. Cependant, les potentiels troubles centraux auditifs liés à des rôles multiples des gènes de surdité dans la cochlée et le cerveau sont pour le moment mal compris. Notre travail permettra tout d’abord d’identifier les formes génétiques de surdité pour lesquelles il existe des déficits centraux intrinsèques masqués par le déficit périphérique. Puis, il permettra d’étudier les conséquences de ces déficits, de développer de nouveaux outils de diagnostiques et enfin le développement éventuel de thérapies réparatrices ou compensatrices.
Procédures
Les interventions seront: - Une biopsie sera effectuée sur tous les animaux du projet afin de les marquer et de les génotyper. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée par des expositions sonores pouvant générer un début de crise audiogène, i.e. une crise d’épilepsie réflexe (réversible) en réponse à un son fort, ou en effectuant des tests de sursaut. Cette procédure impliquera des tests d’une durée d’1h tous les deux jours sur 1 à 3 mois. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée par la susceptibilité aux crises audiogènes (2 min de test), puis les tissus seront fixés par perfusion intracardiaque. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée au cours du développement par la susceptibilité aux crises audiogènes (2 min de test), puis l’activité du cerveau auditif sera testée en réponse à des sons sur des animaux profondément anesthésiés. Les enregistrements durent 4 à 8h. -Des animaux auront une chirurgie afin de fixer une pièce de maintien sur leur tête en vue de les immobiliser lors des enregistrements ultérieurs de l’activité intracérébrale sur animal éveillé. Ces enregistrements intracérébraux auront lieu tous les 2 jours pendant 2 à 8 semaines sur 870 animaux. A noter qu’une partie de ces animaux aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition. -Nous effectuerons un suivi audiologique de modèles de souris pour des atteintes auditives du cerveau impliquant parfois des anesthésies légères pour immobiliser l’animal. Ces tests dureront environ 2h et seront répétés tous les 2 semaines pendant 6 à 9 mois de vie de l’animal. Enfin, les tissus seront fixés par perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde. A noter qu’une partie de ces animaux (270 souris) aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition. -Nous effectuerons un suivi comportemental de modèles de souris pour des atteintes auditives du cerveau. Ces tests perceptifs auditifs seront effectués dans une chambre opérante connectée à la cage de vie des animaux. L’expérience dure 4 à 6 semaines. A noter qu’une partie de ces animaux (405 souris) aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système somatosensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores à forte intensité mais de courte durée pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies classées modérées visant à injecter un gène médicament ou à enregistrer l’activité cérébrale, les animaux bénéficient de traitements antalgiques et antidouleurs adaptés afin de limiter les effets indésirables. Les animaux récupèrent de ces chirurgies généralement en quelques jours. Parfois, ces chirurgies sont susceptibles d’entrainer des infections. Dans ce cas, ces animaux suivent un traitement antibiotique adapté
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés empêchant tout replacement ou adoption. Par ailleurs, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations de physiologie, de transcriptomique ou d’histologie. Les autres procédures impliquent des interventions comme des injections de produits ou des entraînements comportementaux auditifs ou des chirurgies. On ne peut donc pas considérer ces animaux comme naïfs expérimentalement. De plus, la plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par exemple par d’autres équipes, encore plus difficile. Leur réutilisation pourrait donc mettre en péril les conclusions des nouvelles expériences car trop de paramètres ne pourraient pas être contrôlés. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles. Ces partages se font typiquement à l’échelle de l’Institut au-delà de notre équipe de recherche.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Nous utilisons des tests statistqiues classiques pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant.
Raffinement
Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des chirurgies, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures, comme par exemple après les chirurgies. Notre projet comporte plusieurs procédures chirurgicales toutes effectuées sous anesthésie. Un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures douloureuses (chirurgie), une analgésie sera administrée en combinaison avec l'anesthésie. Une surveillance postopératoire avec administration d'analgésiques sera assurée pour garantir le confort total de l'animal. Le Dietgel et l'amélioration de la température des cages seront fournis pour certains protocoles. Des points limites précoces spécifiques sont définis pour les différentes étapes de chaque procédure afin d'éviter toute douleur et tout inconfort inutiles.
Choix des espèces
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades très différents. En effet, la plupart des molécules que nous étudions sont directement impliquées dans le développement du système auditif central (à partir du jour embryonnaire 9). Nous étudierons leur rôle au cours du développement mais aussi les conséquences de leur absence plus tard pendant le développement et la maturation du système auditif. L’étude utilisera donc des animaux âgés de 9 jours embryonnaires à l’âge adulte (15 mois maximum).
Validation de l’effet de la molécule Ma sur la production d’anticorps après immunisation par un antigène modèle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, quatre-vingts d'entre elles subissant jusqu'à neuf prélèvements sanguins et deux injections sous la peau au cours d'une expérience de soixante-dix jours. Le traitement testé est ajouté à l'eau de boisson, ce qui peut en dégrader le goût au point que les souris boivent moins, et modifier leur transit. L'objet immédiat reste modeste : vérifier qu'une molécule freine la production d'anticorps après une vaccination à l'ovalbumine, modèle retenu comme moins invasif qu'une greffe. Le bénéfice avancé pour les patients transplantés, la prévention des rejets tardifs, est renvoyé au moyen et au long terme, après d'autres expériences sur des animaux non-humains greffés.
Objectifs
Les transplantations d’organes améliorent et sauvent la vie de nombreux patients. La survie des greffons est possible grâce à des traitements qui bloquent la réponse immunitaire responsable des rejets. Les traitements actuels sont souvent bien tolérés et efficaces, notamment pour le contrôle des rejets aigus. Cependant, les rejets tardifs sont responsables de perte de greffons que les traitements actuels ne parviennent pas à juguler. Le mécanisme responsable de ces rejets tardifs implique la production par le système immunitaire d’anticorps qui attaquent les greffons. C’est cette réponse anticorps qui est imparfaitement contenue par les traitements immunosuppresseurs actuels. Il existe donc un besoin de nouveaux traitements pour prévenir les rejets tardifs par un contrôle de la production d’anticorps anti-greffons. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet d’une nouvelle molécule sur la réponse anticorps dans un modèle de souris. Ces études sont des préalables obligatoires avant d’envisager un passage en clinique de nouveaux traitements. La preuve de concept de l’efficacité de la molécule sera étudiée dans ce projet avec un modèle moins invasif que la transplantation, à savoir un modèle de vaccination faisant intervenir les mêmes réactions immunitaires. Les souris seront vaccinées avec une molécule modèle et seront traitées via l’eau de boisson par la molécule candidate pour évaluer la réponse immunitaire vaccinale en présence ou non de cette molécule. Différents dosages sanguins seront réalisés au cours des expériences pour suivre la réponse immunitaire. Ce projet sera découpé en 3 étapes :1) s’assurer que l’ajout de la molécule n’affecte pas l’appétence des animaux pour leur eau de boisson ; 2) valider la dose dans l’eau de boisson pour obtenir une concentration sanguine efficace et 3) valider l’effet de cette molécule sur la réponse anticorps suite à une immunisation par un antigène modèle. Au total, ce projet nécessite 190 souris sur une durée de 3 ans.
Bénéfices attendus
A court terme, cette étude nous permettra de valider in vivo l’efficacité de la molécule candidate sur un modèle de vaccination (protéine vaccinale modèle Ovalbumine) A moyen terme, l’étude de l’effet thérapeutique de la molécule candidate permettrait de valider son utilisation pour réduire le risque de rejet de greffe associé aux anticorps dans des modèles vivo de greffe pour in fine, à long terme, etre utilisée en clinique chez les patients.
Procédures
Toutes les souris subiront un changement d’eau de boisson (+/- sucre) et +/- molécule dans des biberons opaques tous les 2 ou 3 jours maximum Elles seront pesées tous les 3 jours à toutes les semaines selon l'étape du projet. Pour 30 souris : elles subiront maximum 3 prélèvements sanguins (sous anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (pour la récolte sang + organes). Experience de maximum 14 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 5 prélèvements sanguins (anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 21 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 2 Injections sous la peau (vaccination) sous anesthésie gazeuse et au maximum 9 prélèvements sanguins (avec anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 70 jours
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau (vaccination) et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress et une douleur. L’ajout de la molécule dans l’eau de boisson des souris peut entraîner une perte d’appétence pour l’eau et donc une diminution de la prise hydrique. L’ajout de la molécule dans l’eau peut également entraîner des modifications du transit des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des protocoles afin de prélever le sang et collecter les tissus pour réaliser les analyses et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires nécessaire pour étudier les réponses vaccinales ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs avec des analyses statistiques définies selon les paralètres étudiés. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 190 souris (mus musculus).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général) . Différents traitements seront administrés : - anesthésie générale avant le prélèvement final - Analgésie locale pour les prélèvements sanguins - Anésthésie gazeuse avant l’injection du vaccin sous la peau. Le suivi se fait 2 à 3 fois par semaine et la fréquence est augmentée selon l’apparition des signes cliniques précoces et anticipés qui ont été définis pour éviter toute souffrance animale. Une semaine d’habituation à l’eau est prévue avant tout début de procédure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature. Age maximum 12 mois en fin de projet (les animaux plus agés ne seront pas utilisés pour éviter une variabilité trop important due à l’age entre les souris jeunes et > 12 mois).
Production d’anticorps prophylactiques anti-Klebsiella pneumoniae après immunisation et évaluation de l’efficacité de candidats vaccins dans un modèle de sepsis à Klebsiella pneumoniae chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par Klebsiella pneumoniae jusqu'au sepsis, 232 souris vont être utilisées, dont 172 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit six injections dans les cuisses sous anesthésie volatile, deux prélèvements de sang à la veine de la mâchoire, puis les bactéries. Le porteur range la septicémie parmi les nuisances aux côtés du "geste technique", et indique ne pas connaître les effets secondaires des dix candidats vaccins testés. Toutes sont tuées, y compris celles qui servent uniquement à produire des anticorps, prélevés par ponction directe dans le cœur.
Objectifs
S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Plusieurs candidats vaccins dirigés contre Klebsiella pneumoniae sont actuellement à l’étude et ont déjà montré des résultats intéressants in vitro. L’objectif du projet est de déterminer si ces potentiels candidats vaccins entraineraient une production d’anticorps permettant la prévention d’une infection septicémique à Klebsiella pneumoniae. A cette fin, un protocole d’immunisation sera testé chez la souris infectée afin d’évaluer l’efficacité potentielle de 10 candidats vaccins sur la prévention du sepsis ; également, les 4 candidats les plus actifs seront administrés chez la souris non infectée dans le but d’obtenir une quantité importante d’anticorps post-immunisation. Le développement de vaccins prophylactiques contre K. pneumoniae constitue une nouvelle stratégie thérapeutique à fort potentiel d'applications cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un ou plusieurs candidats vaccin prophylactique contre une infection à K. pneumoniae. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces différentes solutions. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Une administration IP de 3 secondes (500µL) dans la phase 1 et 2 avec une aiguille de 26G - 6 administrations IM de 5 secondes (cuisse droite et gauche) de 50µL avec une aiguille de 26G et sous isoflurane 5% - 2 prélèvements de 100µL de sang via la veine mandibulaire de 15 secodes avec une aiguille de 26G et sous anesthésie volatile (isoflurane 5%).
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur : - La phase pilote consistera à injecter des bactéries. La nuisance principale sera liée ici au geste technique et à l’apparition du sepsis. - Dans la phase 2, les nuisances attendues seront liées à l’administration des différents vaccins dans la cuisse droite et gauche (J0, J14 et J28 = 6 injections par souris) et au prélèvement sanguin à J0 et J31. Ces souris seront ensuite infectées par les bactéries. Ici une phase de sepsis est également attendue chez certains animaux - Dans phase 3, les nuisances attendues seront liées à l’administration des différents vaccins (J0, J14 et J28 = 6 injections par souris). Le prélèvement intracardiaque aura lieu 7 jours après la dernière injection de vaccin sous anesthésie générale.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (232). Les animaux seront tous infectés et ne pourront donc pas être réutilisés.
Remplacement
L’évaluation de l’efficacité d’un candidat vaccin ne peut être réalisée sans le concours complexe d’un modèle animal. La reproduction des différentes étapes menant au sepsis ne peut être réalisée in vitro. Également, la production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. Aussi, il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Dans la phase pilote les groupes ont été réduits à 8 animaux au lieu de 10, sur la base d’expériences similaires menées au laboratoire. Cet effectif permet d’avoir une analyse statistique robuste. Dans la deuxième phase, 10 animaux par groupe seront également nécessaires afin d’obtenir une analyse statistique robuste pour évaluer l’efficacité ou non de ces différents traitements. Dans la troisième phase, 10 souris seront utilisées par groupe (4 candidats vaccin, témoin positif et un témoin négatif) afin de récupérer le maximum d’anticorps à la suite du protocole d’immunisation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Des phases d’habituation ont été prévues. Ils seront suivis étroitement (toutes les 4h) durant les différentes phases de l’étude. Les souris seront hébergées soit 8 ou 10 par cage. La fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. De plus, ne connaissant pas les effets « secondaires » de ces vaccins, des critères d’interruption de l’étude supportés par une grille de score de douleur ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. L’administration des vaccins par voie intramusculaire se fera sous anesthésie volatile (isoflurane 5%).
Choix des espèces
La souris C57/Bl6 est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point d’un modèle de sepsis à Klebsiella pneumonia dans d’autres projets. Des souris femelles de 5 semaines (+ 1 semaine de stabulation) seront nécessaires pour la phase de pré-immunisation. L’infection aura donc lieu sur des souris de 11 semaines, la phase pilote demandera donc des souris de 10 semaines (+ 1 semaine de stabulation)
Etude de l’effet antidépresseur du LSD chez le rat et la souris: rôle de la médiation des récepteurs 5-HT2B et 5-HT1A
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 240
Cinq semaines d'hébergement en isolement, des chocs électriques répétés et jusqu'à trois injections sur animal vigile : 240 rats et 120 souris vont être utilisés dans des procédures allant de la souffrance modérée à sévère, soixante d'entre eux étant anesthésiés puis tués sans reprendre conscience. Les tests comportementaux mesurent l'anxiété, l'apathie, le désespoir et la perte de goût pour le sucre, autant d'états provoqués délibérément avant l'administration de LSD. Le projet cherche à comprendre par quels récepteurs le LSD produit un effet antidépresseur rapide. Le porteur justifie le choix des rongeurs par le fait qu'il s'agit des plus petits mammifères dont le cerveau reste assez proche de celui de l'être humain, et reconnaît calibrer ses effectifs aussi pour éviter "tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication".
Objectifs
La dépression majeure concerne environ 17 % de la population française, ce qui en fait le trouble psychiatrique le plus fréquent. La classe d’antidépresseur prescrite en première intention sont les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, mais 50% des patients déprimés ne répondent pas correctement à ce type de traitement, d'où l'importance de chercher des molécules capables de potentialiser leur effet. L’acide lysergique diéthylamide (LSD) est une substance psychédélique qui induit des états de conscience altérés caractérisés par des changements dans la perception sensorielle et l’humeur. De manière intéressante, à faible dose, il a été montré qu’une seule injection de LSD a un effet antidépresseur pouvant durée un mois. Toutefois, l’interaction du LSD avec presque tous les récepteurs 5-HT souligne sa pharmacologie assez complexe. Le LSD est un agoniste de la plupart des récepteurs de la sérotonine. Notre projet est de rechercher les modalités d'action du LSD pour mieux discerner sa nouvelle propriété d'antidépresseur à action rapide et sa susceptibilité à augmenter la réponse antidépressive des antidépresseurs classiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de notre étude est de mieux comprendre les raisons pour lesquelles de nombreux antidépresseurs couramment utilisés produisent une rémission des symptômes dépressifs chez seulement un tiers des patients. Notre projet vise à identifier les mécanismes par lesquels le LSD aurait un impact majeur sur l’humeur et la réponse antidépressive. La perspective à plus long terme sera de proposer de nouveaux traitements anxiolytiques et/ou antidépresseurs plus efficaces que ceux actuellement disponibles.
Procédures
Les animaux subiront des administrations systémiques de substances actives sur animal vigile : 1 à 3 injections avec une contention d'environ 10 à 20 secondes. Les animaux seront soumis à des stimulations électriques (4 secondes) répétés ou non. Certains subiront 5 semaines d’hébergement en individuel lors du modèle stress répété suivi des tests comportementaux et 1 à 3 injections (10-20 secondes). Les tests comportementaux utilisés ont pour finalité l’évaluation des conséquences de type anxieux (1 test de 5 min), d’apathie (10 min), dépressif (1 test de 6 min) et d’anhédonie (3 jours) chez des modèles de dépression.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Les animaux subiront des administrations de substances actives comme le LSD entrainant des ébrouements. 2) Certains animaux recevront des injections de substance active induisant une inflammation. 3) Certains animaux seront exposés au modèle de stress répété pharmaco-résistant qui induit un stress important pendant 6 minutes. 4) Certains animaux seront soumis à un hébérgement individuel, à des injections intrapéritonéales répétées (contention de 10-20 secondes), à des stimulations électriques entrainant un l’émission d’ultrasons.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations. Ayant subi un protocole pharmacologique et/ou de stress chronique, les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans une autre étude pour éviter tous biais.
Remplacement
L'objectif de ce projet est la mise au point de nouveaux traitements antidépresseurs destinés à être utilisés chez l'homme. L'étude préclinique doit prévoir une administration sur l'animal entier, d'autant que leurs effets comportementaux ne peuvent être évalués que chez l'animal vigile, tandis que leurs effets sur l'activité électrique neuronale résultent de l'intégration de nombreux signaux émis par une variété de régions cérébrales différentes. En termes de bénéfice/risque, notre étude pharmacologique chez le rat anesthésié reste plus appropriée que chez le rat vigile. Des approches in vitro sont déjà réalisées au laboratoire (évaluation de la neurogénèse, électrophysiologie in vitro). Cependant, l'utilisation de modèles complexes, i.e. d'animaux vivants, est incontournable afin d'analyser les réponses antidépressives dans des modèles de dépression pharmaco-résistants.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance suffisante pour les analyses statistiques. Pour les analyses comportementales nous comptons donc 15 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 13 dans l'analyse, sachant que les différences interindividuelles sont plus fortes dans les analyses comportementales. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes de dépression seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de limiter le nombre total de tests à 2. Pour les expériences d'électrophysiologie, nous comptons 10 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 8-9 dans l'analyse. Le nombre d'animaux est réduit à une valeur minimale (test statistique PS de Dupont et Plummer) permettant d'une part d'atteindre une significativité statistique pour la validation et l'évaluation des réponses mesurées et d'autre part d'éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. Pour pallier à l'hébergement individuel de certains animaux, facteur indispensable à l’induction du modèle de résistance, plusieurs enrichissements sont apportés dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton, igloo et buchette). Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière afin de vérifier le bon développement du modèle. Un monitoring du poids sera entrepris. En cas de problème d’alimentation, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupelle dans la cage. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci (une grille de score et des points limites seront mis en place).
Choix des espèces
Les rongeurs sont choisis car il s'agit des plus petits mammifères ayant un cerveau encore suffisamment homologue à celui de l'homme pour mener des études expérimentales en neuropsychiatrie. Ce rôle sera notamment déterminé dans deux modèles de dépression, l'un d'origine inflammatoire et l'autre induit par des stress répétés afin d’évaluer l'impact de l'étiologie sur la thérapeutique. Le modèle de stress répété, validé chez la souris, présente la particularité de conduire à une résistance aux traitements antidépresseurs conventionnels. Enfin, le modèle d’anxiété par émission d’ultrason n’a été validé/utilisé que chez le rat par notre équipe. Des animaux adultes seront utilisés car chez l'homme, les antidépresseurs sont majoritairement prescrits chez l'adulte. De plus, nous envisageons l’utilisation d’un modèle de résistance aux antidépresseurs chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.
Elevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude des syndromes myélodysplasiques, maladies avec un développement anormal des cellules du sang et pouvant progresser en leucémies (cancer du sang).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées quand elles ne portent pas la mutation recherchée, quand elles sont trop âgées pour la reproduction ou quand elles n'ont plus donné de portée depuis deux mois, même sans aucun signe de mal-être, 8 500 souris vont être utilisées dans un élevage de six lignées génétiquement modifiées. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. À trois ou quatre semaines, l'extrémité de la queue de chaque petit est coupée aux ciseaux pour vérifier la présence de la mutation, et certaines lignées développent des tumeurs à partir de deux mois. L'établissement affirme que seul un animal vivant et entier permet d'étudier la réponse immunitaire, et présente ce projet comme la fourniture d'animaux à d'autres protocoles déjà autorisés.
Objectifs
Les syndromes myélodysplasiques (SMD) marquent une étape préalable à la leucémie, caractérisée par une moelle osseuse défaillante qui entraine une production insuffisante de cellules sanguines saines. Lorsque des mutations génétiques perturbent le renouvellement, la multiplication et la maturation des cellules souches (= cellules à l'origine de toutes les cellules du sang) dans la moelle osseuse, cela conduit à la leucémie myéloïde aigue (LAM). Parmi les mutations décrites dans la littérature scientifique, nous nous intéressons tout particulièrement à deux d'entre elles pour lesquelles nous disposons de souris génétiquement modifiées (modifications génétiques reproduisant celles observées chez les patients atteints de ce type de cancer). Notre projet consiste à identifier (mise en place d'une boucle numérotée à l'oreille) et à vérifier la présence des modifications génétiques chez ces souris afin de disposer d'animaux pouvant ensuite être inclus dans des projets de recherche faisant l'objet d'une autorisation délivrée par les instances.
Bénéfices attendus
Les modèles murins utilisés sont essentiels pour comprendre les mécanismes impliqués mais aussi pour évaluer le développement de nombreuses pathologies comme dans notre projet SMD/LAM. Cela pourrait nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques en testant des drogues et ce, pour aider les patients souffrant de ces maladies souvent encore incurables.
Procédures
Ce projet consiste en l'élevage de 6 lignées de souris génétiquement modifiées. Afin de caractériser les souris, issues des différents croisement, exprimant les gènes modifiés, l’extrémité de la queue (moins de 5 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce geste, réalisé à l'âge de 3-4 semaines, est très rapide et ne dure pas plus de quelques secondes. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi s'assurer de la présence de la mutation génétique d'intérêt. Certaines lignées de souris peuvent développer des tumeurs (à partir de l'âge de 8-9 semaines). Nous réaliserons donc un suivi clinique une fois par semaine afin de détecter l'apparition de ces pathologies, se caractérisant par un affaiblissement général de l'animal.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) nécessite une contention de courte durée, pouvant entrainer un stress, et peut conduire à une légère perte de sang. Une partie des animaux génétiquement modifiés peuvent développer (à partir de l'âge de 8-9 semaines) des tumeurs conduidant à un affaiblissement général.
Devenir
Les animaux comportant la mutation d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus post- mortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le ministère. Les animaux ne comportant pas la mutation d’intérêt ou trop âgés (pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche) ou n'ayant plus donnés de portées depuis 2 mois seront euthanasiés, même s'ils ne présentent pas de signes de mal-être. Les souris seront euthanasiées de manière anticipée si elles présentent des signes de souffrance. Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales, conformément au protocole autorisé.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire et l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale, ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte physiologique ou pathologique. Cela est impossible à reproduire in vitro (dans des cultures de cellules) en raison de la complexité des interactions entre les différents types de cellules jouant un rôle dans le développement et la progression de la maladie.
Réduction
Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Nous avons déterminé le nombre de souris inclus dans ce projet afin de ne produire que le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de nos projets de recherche.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents pathogènes. Elles sont maintenues en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnel en carton, papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Pour les souris pouvant développer une pathologie (type cancer), la surveillance sera renforcée par un suivi clinioque hebdomadaire afin de détecter de manière anticipée l'affaiblissement de l'animal. Les souris seront utilisées autant que possible avant l'âge d'apparition de la maladie. Après coupure de l'extremité de la queue de la souris, nous surveillerons qu'il n'y a pas de saignement et dans le cas contraire, un point de compression sera fait pour favoriser la coagulation.
Choix des espèces
L'utilisation de ces différentes lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des SMD/LAM est largement décrit dans la littérature scientifique. Ces modèles sont robustes et reproductibles et leur élevage permettra d'inclure ces souris dans des projets de recherche permettant de mieux comprendre le développement de ces maladies et de trouver de nouvelles pistes de thérapie. Les souris seront mises en accouplement à l'âge adulte (8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle. Le sevrage, l’identification et le prélèvement de tissu en vue de l’analyse génétique seront réalisés entre 3 et 4 semaines.
Etude de l’implication des cellules gliales dans le développement d’une hypersensibilité cutanée faciale dans la migraine chez le rat femelle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Injectées tous les deux jours pendant neuf jours avec une molécule qui déclenche une crise migraineuse, 320 rates subissent ensuite l'application d'un filament sur la face pour mesurer leur hypersensibilité à la douleur. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les rates sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever leurs tissus nerveux. L'objectif porte sur le rôle des astrocytes dans le déclenchement de l'allodynie, avec la perspective annoncée de nouvelles cibles contre la douleur chez l'être humain. Les nuisances attendues sont estimées à partir de travaux menés sur des rats mâles, alors que le projet porte sur des femelles.
Objectifs
La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’allodynie correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à une inflammation. En temps normal, les informations tactiles et douloureuses n’aboutissent pas au même niveau de la moelle épinière ou du tronc cérébral, les deux modalités sensorielles (tact et douleur) sont donc normalement séparées. En conditions pathologiques, par exemple lors d’une allodynie, l’information tactile devient capable d’activer des neurones nociceptifs, grâce à un circuit qui implique plusieurs cellules. Le tact va alors devenir douleur (allodynie mécanique). Ce processus va provoquer l'activation de plusieurs populations neuronales et implique également une population spécifique de cellules gliales, les astrocytes. Cependant, peu de choses sont connues sur ces cellules et leur implication dans le déclenchement de l’allodynie .L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des astrocytes et plus précisément des canaux potassiques astrocytaires dans un modèle de migraine chronique .Ce projet combinera des études comportementales et d’expression protéique. Il présente donc un intérêt fondamental, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les douleurs pathologiques chez l’homme.
Bénéfices attendus
La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.
Procédures
Les injections intra péritonéales (fréquence: 1 injection tous les 2j pendant 9j/ durée: 30s) et les perfusions (fréquence: 1/ durée 30min/ sans réveil) seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal. Après une phase d'habituation, des tests comportementaux (test d'allodynie suite à l'application d'un filament au niveau de la face) seront réalisés (habituation+test: 35min/ test de la face tous les 2 jours).
Impact sur les animaux
Les résultats obtenus des travaux des autres laboratoires avec le modèle NTG ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que la développement d'une allodynie. Ce modèle a été réalisé sur des rats mâles, dont les nuisances sont le développement de l'allodynie mécanique au niveau de la zone péri orbitale après l'application de filament de vF (modérée). Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.
Devenir
A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de NTG.
Réduction
Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales et moléculaires est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux par groupe: habituation, injection,comportement, prélèvements et préparation des échantillons. C'est un modèle que le laboratoire veut mettre en place, donc, pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05. Les groupes non stimulés (NS) seront réalisés en priorité; si les résultats obtenus sont significatifs, nous ne réaliserons pas les groupes stimulés (St).
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats seront préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie. Si au cours de l’expérimentation, l’animal a de grosses difficultés à se déplacer, se relever pour se nourrir, l’animal sera euthanasié par dose létale de pentobarbital.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 7-10 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.
Rôle des cellules des vaisseaux sanguins dans la survie et le maintien des monocytes en condition physiologique et inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Irradiées puis greffées de moelle osseuse par une injection dans la veine située derrière l'œil, saignées jusqu'à sept fois à la veine de la mâchoire, 240 souris vont être utilisées dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère. Soixante d'entre elles reçoivent un agent inflammatoire par voie intraveineuse avant une série de prélèvements étalés sur une semaine, et l'irradiation laisse leur système immunitaire incomplet pendant quinze jours. Le projet cherche à établir quels facteurs produits par les parois des vaisseaux maintiennent en vie les monocytes du sang, avec l'espoir déclaré de retombées sur les maladies cardiovasculaires. Toutes sont tuées à la fin des procédures pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Les monocytes sont des cellules immunitaires présentes dans le sang qui surveillent et préservent la santé des vaisseaux sanguins. Leur travail consiste à se fixer aux parois des vaisseaux pour éliminer les cellules mourantes et prévenir l'accumulation de débris ou de graisses. Les monocytes se caractérisent par leur mouvement constant, dû à leur localisation dans le sang, soulevant des interrogations sur les signaux nécessaires à leur survie. Grâce à des modèles murins innovants, nous avons découvert que des facteurs de croissance, qui sont des substances produites par les cellules et qui stimulent la croissance, la différenciation, ou la survie d'autres cellules, dérivés des cellules constituant les vaisseaux sanguins sont indispensables au maintien des monocytes dans la circulation sanguine. De plus, nous avons constaté que lorsque les monocytes se fixent aux vaisseaux sanguins, ils sont mieux à même de capter ces facteurs de croissance. Cette étude vise à clarifier par quel mécanisme (prolifération, différenciation, ou la survie) ces facteurs de croissance influent sur le nombre de monocytes dans le sang. Bien que notre attention se soit principalement portée sur le rôle physiologique des facteurs produits par les vaisseaux sanguins, l’un de nos autres objectifs est également de comprendre leur rôle dans la réponse des monocytes à l'inflammation.
Bénéfices attendus
Les monocytes sont fortement associés au développement de pathologies cardio-vasculaires. Par exemple, les souris déficientes en monocytes souffrant d’athérosclérose présentent des vaisseaux plus endommagés que leurs homologues contrôles. Notre étude sur les mécanismes régissant la survie des monocytes vise à mieux contrôler leur nombre dans certaines pathologies dans lesquelles leur présence (ou leur absence) serait bénéfique. En outre, ce projet va générer de nouveaux modèles murins pour manipuler les monocytes, ce qui est essentiel pour étudier leur rôle dans des contextes pathologiques et homéostatiques. Enfin ce projet met en évidence les voies moléculaires mises en jeu dans l’interaction entre les endothéliums et les monocytes. La manipulation de ces voies pourrait contrôler le développement de certaines maladies cardio-vasculaires, aboutissant in fine à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques immunomodulatrices.
Procédures
Procédure 1 : - 20 souris vigiles recevront une injection d'anesthésique, puis seront irradiées partiellement pendant 8 min et recevront une injection intraveineuse via la veine située derrière l’œil de cellules de moelle osseuse. - 40 souris vigiles seront complètement irradiées, puis anesthésiées afin de recevoir une injection intraveineuse via la veine qui se trouve derrière l'œil de cellules de moelle osseuse. Procédure 2 : 60 souris anesthésiées recevront du sang par voie intraveineuse par la veine qui se trouve derrière l'œil. Puis 4 prélèvements sanguins à la veine située près de la mâchoire seront effectués à jour 0, 1, 3, 5 et 8 post-injection de sang. Procédure 3 : 40 souris seront injectées pendant 4 jours (1 injection/par jour) avec un facteur de croissance (20 souris) ou avec une solution contrôle (20 souris) Procédure 4 : 60 souris vigiles seront injectées avec un agent inflammatoire par voie intraveineuse par la veine située dans la queue. Puis 7 prélèvements sanguins à la veine située près de la mâchoire seront effectués à jour 0, 1, 2, 3, 4, 5 et 7 post-injection de l’agent inflammatoire. 20 souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale l’agent inflammatoire et seront euthanasiées 24h après cette injection.
Impact sur les animaux
-le stress à court terme lié à la contention et aux différentes injections, - Le système immunitaire des souris est incomplet pendant 2 semaines suite à irradiation, ce qui les rendra plus susceptibles aux infections -Des blessures légères ou symptômes d’irritation cutanée sont des effets secondaires de l'irradiation, - Une perte de poids attendue sur 3j liée à l’injection d’un agent inflammatoire
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de prélever le sang total ainsi que les organes dans le but de les analyser.
Remplacement
La complexité des interactions entre les monocytes sanguins et les différents types de cellules composant les vaisseaux sanguins présentes dans l'organisme ne peut par définition pas être reproduite in vitro puisque ces dernières ont lieu dans la circulation sanguine. L'ensemble des modèles murins générés dans ce projet permet d'étudier le maintien des monocytes dans un environnement où seulement quelques sous-types de cellules formant les vaisseaux sanguins ne sont plus capables de produire de facteur de croissance, tandis que le reste de l'organisme est toujours capable de le produire. Ceci permettra d'identifier spécifiquement les sous-types de vaisseaux sanguins impliqués dans la production du facteur de croissance essentiel à la survie des monocytes. D'autre part nous savons que la différentiation, l’identité et les fonctions spécifiques des monocytes dépendant d’une multitude de facteurs produits par les cellules formant les vaisseaux sanguins mais aussi pour les autres types cellulaires de l'organisme. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait donc pas de refléter cet environnement complexe et dynamique impliqué dans le maintien des monocytes. Le projet vise également à comprendre quelles sont les conséquences de l'absence de monocytes sur l'organisme. Là encore, seule l’étude d’un animal entier nous permettra d’observer des phénotypes à l’échelle de l’organisme.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide du logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/souffrance et veiller à ne pas dépasser des points limites. Les conditions d'hébergement des souris respectent les règles suivantes : - Les cages utilisées peuvent héberger 5 souris adultes. Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. – Les cages seront supplémentées en enrichissement tel que du coton, ou un dôme pour confectionner des nids - Les animaleries bénéficient d'une température régulée, d'une hygrométrie ainsi que d'une photopériode contrôlée. -Les animaleries sont calmes. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. L’utilisation d’analgésiques sera également proposée quand cela sera possible et jugé nécessaire.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour répondre aux questions scientifiques posées. Des animaux âgés de 6 semaines seront utilisés, puisque nous nous intéressons aux monocytes chez l’adulte.