Rongeurs

Deux à quatre injections sous anesthésie et un prélèvement de sang qui expose à une infection de l'œil : 566 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort ensuite pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales, qui forment une tumeur rejetée en quatorze jours, ou une infection virale, afin de comparer les cellules immunitaires mémoires produites dans les deux cas. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du développement d'un cancer. L'effectif de 566 animaux n'est justifié que par un "minimum nécessaire et suffisant" à l'analyse statistique, sans autre précision.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer si une tumeur transitoire, rapidement éliminée de l’organisme par le système immunitaire, est suffisante pour altérer la réponse immunitaire mémoires. Pour cela, les cellules mémoires générées en réponse à un virus ou un tumeur transitoire seront comparées.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes mise en place lors du développement d'un cancer.

Procédures

Chaque animal reçoit : 2 à 4 injections (15 secondes) sous anesthésie / 1 prélèvement sanguin (150 uL) sous anesthésie (10 secondes) / Anesthesie : 3 minutes pour anesthésie gazeuse , 30 minutes pour anesthésique injecté

Impact sur les animaux

Injection intraveineuse de cellules ou prélèvements : possibilité d'infection au niveau de l'oeil (très rare) Infection virale : Aucun signe clinique attendu Injection de tumeur : La tumeur n’est pas métastatique, n’excède pas 200 mm3 et est rejetée par les animaux en 14 jours.

Devenir

Mis à mort pour prélèvements des organes

Remplacement

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différents organes. Les procédures ne peuvent donc être reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et en condition stérile afin de prévenir tout risque d’infection. Un collyre anesthésique est administré avant chaque prélèvement sanguin en prévention d'éventuelles infections. Des points limites bien définis et suffisament précoces permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 7-12 semaines au moment de l’immunisation, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

Injectées d'acroléine directement dans un ventricule du cerveau, gavées six jours sur sept pendant quatre semaines, puis soumises à des injections quotidiennes dans le nez ou l'abdomen pendant deux semaines, 484 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tests comportementaux sont annoncés à raison d'un par jour, sans que le RNT dise lesquels. L'objectif est de vérifier si une molécule dérivée d'un polyphénol protège du déclin cognitif un modèle de maladie d'Alzheimer construit par intoxication chimique. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leur tissu cérébral.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la maladie. En effet, l’oxydation des lipides et du glucose favorise l’accumulation d’espèces carbonylées réactives (ECR, stress carbonylé) dont la réaction avec les acides aminés entraîne des modifications et pertes de fonctions irréversibles des protéines cellulaires. Parmi les molécules capables de combattre ce phénomène, les polyphénols, métabolites secondaires du règne végétal, présents dans de nombreux fruits et légumes de notre alimentation, ont été largement étudiés. L'obstacle majeur à l'utilisation de ces composés en thérapeutique est leur très faible biodisponibilité. Pour contourner ce problème, une équipe de chimistes a synthétisé un composé capable de réduire à la fois le stress oxydant et le stress carbonylé. Un polyphénol naturel, le phloroglucinol (Phloro) a été modifié chimiquement afin de pouvoir piéger les espèces responsables du stress carbonylé. Afin d’augmenter sa biodisponibilité, le phloroglucinol modifié a ensuite été couplé à un acide gras à longue chaîne (DHA) pour donner le Phloro-OiP-DHA. Son activité a été validée in vitro et in vivo dans un modèle murin présentant une dégénérescence des photorécepteurs induite par la lumière. L'objectif de ce projet est de déterminer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle de stress carbonylé induit par une exposition chronique à une ECR (l'acroléine), mimant le développement de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : -de confirmer que l'exposition chronique à l'acroléine, conduisant à l'apparition d'un stress carbonylé, s'accompagne de troubles comportementaux et de neurodégénérescence. -de déterminer le potentiel thérapeutique du lipophénol Phloro-OiP-DHA dans ce modèle. Avec cette étude, nous posons donc l'hypothèse d'un mécanisme reliant le stress carbonylé aux processus neurodégénératifs asssociés à la maladie d'Alzheimer, et en particulier ceux associés à la formation des dépôts amyloïdes et l'hyperphosphorylation de la protéine tau. Ce projet nous permettra d'en appréhender les mécanismes biochimiques sur le long terme et de tester le potientiel thérapeutique d'une molécule ciblant le stress carbonylé, le Phloro-OiP-DHA.

Procédures

Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -un gavage quotidien pendant 4 semaines (6j/7) -une injection intracérébroventriculaire d'acroléine -des injections intrapéritonéales ou intranasales quotidiennes pendant 2 semaines - des tests comportementaux (un test par jour) - ils seront euthanasiés en fin de projet.

Impact sur les animaux

La dose d'acroléine utilisée est basée sur des travaux précédemment publiés . Les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer les potentiels effets indésirables. L'inconfort lié au traitement peut provenir de la répétition quotidienne du gavage pendant 4 semaines et/ou des administrations intranasales pendant 2 semaines. Ces administrations seront toutefois effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation à l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses biochimiques et immunohistologiques du tissu cérébral.

Remplacement

De manière générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveau sur des modèles simplifiés (in vitro ou in silico) et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs (in vitro ou in silico) validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans leur globalité. Il est primordial d’avoir des circuits neuronaux in vivo associés aux cellules gliales et vasculaires, pour caractériser les modifications moléculaires liées à la maladie d’Alzheimer d’un point de vue spatiotemporel. Les modèles utilisés sont acceptés, bien documentés, et très utilisés par la communauté des neurosciences.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes. Pour les analyses comportementales, histologiques et biochimiques, les tests seront de type non appariés, paramétriques sur les moyennes à variances égales ou différentes suivants les résultats des analyses précédentes. Ici, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress qui pourraient fausser les résultats (en particulier sur les analyses comportementales), mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant la procédure expérimentale. Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental.

Choix des espèces

Il s'agit d'une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. La maladie d'Alzheimer étant une maladie se déclarant chez l'adulte voire la personne âgée, les animaux seront utilisés et sacrifiés à l'âge adulte (6 mois). De plus, la caractérisation du modèle de souris transgéniques a déjà été effectuée dans notre laboratoire et nous avons montré que : -les déficits comportementaux commencent à partir de 3 mois -les modifications biochimiques (augmentation de la charge amyloïde, de la phosphorylation de la protéine tau, principaux marqueurs de la maladie d’Alzheimer) et histologiques (formation des plaques amyloïdes) sont visibles à l’âge de 6 mois

Pour établir le rôle d'une enzyme dans la résistance des mélanomes aux traitements, 1 728 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau ou dans les poumons une greffe de cellules de mélanome, puis un gavage trois fois par semaine pendant cinq semaines ou des injections d'immunothérapie, avec un suivi de la rechute jusqu'à trois mois. Les tumeurs peuvent s'ulcérer et se nécroser, le gavage peut léser l'œsophage, et toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus tumoraux. Le porteur conclut qu'en l'absence de système artificiel reproduisant l'environnement d'une tumeur, la souris constitue "un modèle sans alternative".

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau qui reste difficile à traiter malgré les progrès récents grâce aux thérapies ciblées et aux immunothérapies. Globalement, plus de 50% des patients ont besoin de traitements supplémentaires, justifiant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La fonction des enzymes appelées déubiquitinases dans la réponse des mélanomes aux thérapies actuelles est très mal connue. Dans ce contexte, l’objectif du projet est de montrer l’importance de certaines enzymes comme RPN11 dans la réponse et la résistance thérapeutique des mélanomes.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra d’apporter la preuve de concept pré-clinique de l'importance de l’enzyme RPN11 dans la réponse des mélanomes aux thérapies ciblées et aux immunothérapies (bénéfices à court terme). A plus long terme, notre projet doit permettre d’identifier de nouveaux biomarqueurs de la réponse des patients aux thérapies actuelles ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des stratégies innovantes permettant de combattre le mélanome métastatique résistant.

Procédures

Pour les greffes sous-cutanées, les animaux sont anesthésiés et reçoivent sur un flanc une injection de cellules de mélanome (1 minute/animal). La croissance des tumeurs est suivie trois fois par semaine par mesure au pied à coulisse (1 minute/animal) jusqu'à 3 mois après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Pour les greffes pulmonaires, les animaux sont anesthésiés puis injectées avec des cellules de mélanome bioluminescent (1 à 2 minutes/animal). La croissance des tumeurs est suivie par analyse de la bioluminescence sur les animaux anesthésiés le jour de l’injection puis une fois par semaine pendant le traitement (durée de l'analyse 30 min/groupe d'animaux). L’expérience est poursuivie jusqu’à 12 semaines après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Une partie des souris reçoivent les traitements par gavage oral (1 minute/animal). L’administration des substances se fait trois fois par semaine pendant 5 semaines. Une autre partie des souris sera traitée par l’immunothérapie par injection en intrapéritonéale (1 minute/animal) à raison de 3 injections pendant 1 semaine.

Impact sur les animaux

- Ulcération/nécrose des tumeurs sous-cutanées - Les injections intrapéritonéale peuvent provoquer une inflammation locale - Perte de poids anormale suite au traitement - Risque de lésion de l’œsophage lors du gavage oral.

Devenir

Dans tous les cas, à la fin de l’expérience ou lorsque les points limites sont atteints, il est nécessaire de prélever post-mortem les tissus tumoraux afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de confirmer l’intérêt des cibles thérapeutiques identifiées. Tous les animaux sont donc mis à mort et ne seront pas réutilisés.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement, nous avons réalisé un certain nombre d'expériences in vitro qui ont permis de déterminer les conditions optimales pour cibler l’enzyme RPN11 dans le mélanome. Cependant, en l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il est nécessaire de confirmer nos résultats dans des modèles pré-cliniques de réponse thérapeutique chez la souris. La combinaison de nos modèles permettra d’apporter une solide preuve de concept in vivo de l'importance de RPN11 pour l’amélioration des thérapies ciblées et des immunothérapies. En ce sens, le modèle murin constitue un modèle sans alternative pour les études pré-cliniques visant à valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Nos études sont réalisées dans le souci d'utiliser un nombre minimum d'animaux sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaires au projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables. Le recours à des techniques d'imagerie non invasive réduit de façon importante le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe expérimental. Dans tous les cas, les tissus tumoraux sont prélevés post-mortem à la fin de l’expérience afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de valoriser au mieux les expériences chez la souris.

Raffinement

Nous hébergerons les animaux dans des conditions enrichies d’hébergement prenant en compte leur bien-être et de soins afin de réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable. L’hébergement et la manipulation en condition stérile permettra d’éviter toute contamination des animaux. Les souris seront observées quotidiennement et très attentivement par du personnel qualifié pour permettre la détection très précoce des signes de souffrance ou de mal-être, une réaction immédiate si le point limite est atteint, et une surveillance accrue en cas de doute. Le personnel participant à ce projet maîtrisent les expériences de greffe et les modes d'administration des drogues. Les transplantations de mélanome réalisées sont bien supportées par les animaux. Afin de réduire le stress ou la souffrance éventuelle, une anesthésie est effectuée avant les injections. Le risque d'inflammation associée aux injections intrapéritonéales est diminué en alternant les sites d'injection ou en privilégiant l’administration des drogues par gavage oral. Le gavage est amélioré par l’utilisation d’une canule courbée terminée par une olive qui permet de minimiser le risque de lésion de l’œsophage. Tout changement de comportement significatif, modification physique, variation anormale de poids ou signes de douleur conduiront à l’euthanasie des souris. Si des ulcérations des tumeurs sont observées, la tumeur est traitée avec une solution antiseptique jusqu'à la résolution de la plaie. L’ensemble de ces procédures nous permettra d'intervenir au plus tôt en cas de souffrance des animaux dans les phases avancées de la maladie.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, systématiquement utilisée dans les études précliniques visant à étudier l'efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court et une natalité importante. Nos expériences seront réalisées sur des modèles de souris permettant d'éviter le rejet des greffes de cellules tumorales humaines et sur des modèles de souris permettant d’étudier la réponse immunitaire contre la tumeur. En l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les expériences de greffes de mélanome seront réalisées sur des animaux âgés de 6 semaines, un âge auquel la prise tumorale est particulièrement efficace d'après les données de la littérature. Les souris sont commandées à l'âge de 5 semaines. A leur arrivée, elles sont acclimatées pendant une semaine à l'animalerie avant d'être utilisées.

58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par traitement, avec inflammation de l'intestin et perte de poids possibles, et chacune subit cinq injections intrapéritonéales et six pesées. Le porteur indique que les données obtenues hors de l'animal ne suffisent pas, faute d'y retrouver le système immunitaire et les facteurs circulants. Le bénéfice annoncé se limite à identifier "potentiellement" des cibles thérapeutiques pour les troubles digestifs liés au stress.

Objectifs

Le système nerveux entérique (SNE) régule la motricité digestive et les fonctions de la barrière épithélio-intestinale. Il est admis que le stress altère l’axe cerveau-intestin et contribue à un large éventail de troubles gastro-intestinaux, incluant le syndrome de l’intestin irritable. La survenue d’évènements stressants ou traumatisants affecte les fonctions digestives, qui en pratique se manifestent par des flatulences, des douleurs abdominales, plus ou moins associées à une accélération ou à une diminution de la vidange gastrique. La réponse biologique au stress implique l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien, initiant une sécrétion de glucocorticoïdes. Bien que la synthèse de glucocorticoïdes ait lieu principalement au niveau des glandes surrénales, il a été décrit de nombreux autres sites de production, associés à une action locale des glucocorticoïdes via le récepteur aux glucocorticoïdes. Dans l’intestin, le système nerveux exprime le récepteur des glucocorticoïdes ainsi que l’enzyme responsable de leurs synthèses. Une étude préliminaire in vitro de notre équipe de recherche a permis de mettre en évidence une synthèse de corticostérone par le système nerveux entérique et une augmentation de la synthèse de corticostérone en conditions inflammatoires. De plus, des modifications de l’expression de protéines impliquées dans l’activité neuronale ont également été mises en évidence en conditions inflammatoires et lorsqu’on bloque l’effet des glucocorticoïdes. L’objectif de ce projet est d’étudier comment l’inflammation module le système nerveux entérique in vivo, et si les conséquences fonctionnelles de l’inflammation passent par l’action des glucocorticoïdes.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes de la synthèse locale des glucocorticoïdes au niveau de l’intestin afin de pouvoir potentiellement identifier des cibles thérapeutiques pour améliorer les troubles digestifs intestinaux liés au stress et à l’inflammation.

Procédures

Pesée quotidienne des animaux – 10 sec sur la balance – 6 au total Contention + injection intrapéritonéale – 30 sec – 5 au total

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent avoir une inflammation des intestins à l’issue du traitement et cela peut générer une perte de poids. Ils peuvent également avoir peur au moment des injections intrapéritonéales.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus d’intérêt (tube digestif) pour analyser les échantillons ex vivo.

Remplacement

Les données préliminaires obtenues dans un modèle ex vivo ne sont malheureusement pas suffisantes pour extrapoler les résultats obtenus à un individu entier. Plusieurs acteurs comme le système immunitaire et la présence de facteurs circulants sont absents de nos modèles ex vivo. C’est pourquoi il n’est pas possible de remplacer ce modèle d’induction de colite aigüe par un modèle ex vivo ou in vitro.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d’animaux minimum nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables (n=9 pour une augmentation de 40 % de la production de corticostérone). Pour s’assurer de la réussite de ce projet, nous avons prévu un lot d’animaux « pilote » de 10 souris qui permettra de valider les expérimentations in vitro sur les échantillons issus de nos animaux. Comme une partie des animaux va recevoir une injection intrapéritonéale d’antagoniste et que ce type d’injection peut rater malgré un personnel compétent, nous avons prévu un lot supplémentaire (n=3 par groupe) qui sera réalisé seulement si certains animaux doivent être exclus. L’utilisation d’un tel nombre (58 au total) devrait nous éviter de devoir répéter l’expérience.

Raffinement

Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. Elles seront également surveillées quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les souris seront habituées à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.

Choix des espèces

La colite expérimentale provoquée par le traitement chez les rongeurs est un modèle reconnu d’affections inflammatoires chroniques humaines. La souris représente un très bon modèle d’étude (plus petit) et est plus adapté à nos besoins qu’un modèle rat et nous permettra de faire un parallèle avec l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines) puisque ce projet s’intéresse à la régulation de la production de glucocorticoïdes à l’âge adulte.

48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant 26 pesées, 12 injections dans l'abdomen, 39 injections sous la peau, cinq prises de sang et deux séjours de 96 heures en cage de mesure. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et les souris sont hébergées seules pendant toute l'étude, ce que le porteur reconnaît comme une nuisance pour une espèce sociale. Un jeûne de quatre heures précède chaque prise de sang, et l'obésité elle-même réduit leur capacité de mouvement. L'étude est menée pour un client, à un stade précoce du développement d'un candidat médicament anti-obésité, avec la perspective déclarée d'une mise sur le marché.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépense énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieures molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (26 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (12 administration; durée de la mesure : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de sémaglutide par voie sous-cutanée (39 administrations; durée de la mesure : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 96h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (28 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Les femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, six semaines avant la suite du protocole, pour reproduire la forme d'insuffisance cardiaque qui touche surtout les femmes. 156 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une pompe implantée sous la peau qui diffuse des molécules provoquant hypertension et hypertrophie du cœur, puis trois échographies sous anesthésie et trois mesures de pression artérielle sur animal vigile, sur huit semaines. Le porteur écrit que l'ovariectomie n'induit pas d'effets indésirables, et décrit par ailleurs une dyspnée qui peut être sévère en phase terminale, moment où les souris sont tuées.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque (IC) se caractérise par une incapacité du coeur à assurer sa fonction de pompe circulatoire et donc à remplir les besoins de l’organisme en perfusion de sang oxygéné. Ce projet porte sur une forme d’IC qui se caractérise par des défauts de relaxation du cœur. Cette forme d’IC touche un peu plus les femmes que les hommes, ; elle est fortement associée à l’âge et aux autre maladies cardiovasculaire (ex : hypertension) et touche près de 50 % des patients en IC. Ces patients souffrent d’une sévère perte de qualité de vie et d’hospitalisations répétées avec une mortalité importante. Actuellement, très peu de traitements efficaces ont été identifiés. Notre projet général d’équipe a pour but de tester de nouveaux médicaments pour ce syndrome sur un modèle murin. Nous testerons des molécules induisant l’hypertension artérielle et l’hypertrophie du cœur pour établir ce modèle au sein de notre laboratoire et comparer la réponse entre les mâles et les femelles. Le but de ce projet est donc de mettre en place ce modèle spécifique d’insuffisance cardiaque afin d’établir un protocole reproductible et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos investigations futures.

Bénéfices attendus

La capacité fonctionnelle et la qualité de vie chez les sujets souffrant de l’IC avec une fraction d’éjection systolique préservée sont gravement altérées. En effet, le cœur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relaxer suffisamment durant la phase de relaxation. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles squelettiques. Les traitements développés depuis plusieurs décennies ne sont pas ou peu efficaces pour ces patients. L'IC est une maladie affectant plus d’ 1 million de personnes en France et environ la moitié de ces patients souffrent ICFEp ce qui représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche thérapeutique dans ce domaine. Le bénéfice principal attendu de projet pilote est l’établissement d’un modèle murin reproductible et bien caractérisé qui pourra ensuite être utilisé par différentes équipes au niveau de notre laboratoire et au niveau national.

Procédures

Souris mâle: durée de la procédure 8 semaines Les animaux auront une injection (environ 15 secondes) sous anesthésie locale (environ 1heure) 6 semaines avant l'implantation d'une mini pompe osmotique qui permettra l'administration des produits (durée 20 minutes) sous anesthésie générale (30 minutes). Au cours des 8 semaines: 3 échocardiographies sous anesthésie générale (durée environ 15 minutes) et 3 mesures de la pression artérielle sur animaux vigiles seront réalisées. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première de pression artérielle,mesure qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure. Souris femelles: durée de la procédure 8 semaines Les ovariectomies seront réalisées 6 semaines avant l'implantation de la minipompe (deux chirurgies :durée 20 minutes chacunes sous anesthésie générale (environ 30 minutes)). Les injections (environ 15 seconde) sous anesthésie locale (environ 1h) débuteront le jour d'après l'ovariectomie. Au cours des 8 semaines: 3 échocardiographies sous anesthésie générale (durée environ 15 minutes) et 3 mesures de la pression artérielle sur animaux vigiles seront réalisées. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première de pression artérielle,mesure qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation de la micropompe osmotique au niveau sous-cutanée correspond à une chirurgie minimale, très souvent source d'un niveau de douleur très limitée et relativement bien tolérée par les animaux. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protrusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaite. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement. Le syndrome d’insuffisance cardiaque lui-même, induit une dyspnée qui peut être sévère et une incapacité à l’effort. Ces deux symptômes peuvent induire un stress psychique sur la souris en phase terminale. Cet effet n’est pas prolongé dans le temps puisque les animaux sont sacrifiés lorsqu’ils arrivent dans cette phase terminale. L’ovariectomie elle-même n’induit pas d’effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux du projet sont euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine avec pression artérielle, une régulation neurohormonale du rythme et de la contractilité cardiaque et une étude du retentissement sur différents organes majeurs impliqués dans l’évolution de l’IC tels que les poumons, les reins et les muscles squelettiques notamment. Les modèles cellulaires ne permettent pas d’étudier le fonctionnement physiologique intégré du cœur et l’effet de l’ICEFp sur d’autres organes. Une légère douleur peut être associée à l’ovariectomie correspondant à l'incision musculaire et cutanée, de plus l’absence d’ovaire n’est pas associée à une douleur.

Réduction

Une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu l’altération de la fonction diastolique (critère principal retenu dans cette étude). Les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux car on peut les mesurer à différents temps sur le même animal. Alors que les méthodes invasives sont des procédures terminales. De plus, afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés. Les analyses statistiques seront la comparaison de moyennes entre deux groupes, le groupe contrôle est implanté avec une pompe remplie de sérum physiologique et le groupe ICFEp est implanté avec une pompe diffusant la combinaison diluée dans le sérum physiologique. La variation séquentielle des doses est une procédure par étape qui permet de ne pas nécessairement réaliser l’étude de tous les groupes si une des doses convient. Cela limite potentiellement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Après implantation de la minipompe osmotique, les souris seront observées tous les jours. Les cages sont changées 1 fois par semaine. Les animaux sont hébergés selon les conditions fixées par l'arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs. Les opérations chirurgicales (pose de minipompe et ovariectomie) sont induites en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. L’expérimentateur, le personnel de l’animalerie seront informés des critères d’observation des animaux qui seront : l’état général, l’état de la cicatrice, le comportement de prostration, la courbure de la colonne vertébrale, l’état du poil (manque d’hygiène), et un critère propre à l’étude de l’IC qui est la manifestation d’une dyspnée sévère. Le poids des animaux sera également relevé quotidiennement. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement ainsi une pommade de protection sera appliqué. Après son réveil complet, l'animal il est remis dans sa cage. Pour les opérations chirurgicales, les animaux sont anesthésiés, pour les maintenir immobiles. Une fois anesthésiés et endormis, ils reçoivent une injection en sous-cutanée d'analgésique. Au réveil, chaque souris est isolée dans une cage pendant quelques heures, au calme et au chaud puis stabulé à 4 ou 5 souris /cage. En post opération, la cicatrisation cutanée de la zone opérée est surveillée régulièrement. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaire. Un traitement antalgique est alors donné en complément. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première mesure de pression artérielle qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proches de celle de l’homme. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études en IC ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées. Les souris seront utilisées à l’âge de 2 mois pour avoir la taille minimum pour procéder à implantation de mini pompe osmotique.

Anesthésiées pour recevoir un virus par injection derrière l'œil, puis une heure durant pour une IRM, 1 920 souris porteuses de la mutation de Huntington vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont transportées entre trois établissements, dont un en Belgique, et toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet teste deux approches censées restaurer un transport de molécules défaillant dans les neurones, validées jusqu'ici sur des cellules. Sept tests comportementaux sont annoncés, un par jour, sans que le RNT précise lesquels, alors que deux d'entre eux sont décrits comme des stress modérés, un jeûne de 24 heures et un isolement de 48 heures.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester in vivo 2 approches thérapeutiques qui ont été validées in vitro contre la maladie de Huntington. Ces approches thérapeutiques sont développées dans le but de restaurer un manque de transport de molécules dans les neurones. Ce projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le but du projet est de tester 2 nouvelles approches therapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Nous avons récemment mis en place un outil nous permettant de tester cette approche sur des cellules et de valider son effet bénéfique. Ces résultats prometteurs nécessitent désormais une validation sur des animaux en vue de proposer des thérapies aux patients atteints par cette maladie.

Procédures

Les animaux de ce projet vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisée par des symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. L'élevage des animaux utilisés dans ce projet pourra être réalisé dans 2 établissements utilisateurs. À l'âge d'un mois, les animaux seront transportés dans le troisième établissement utilisateur pour y être manipulés comme suit: 1) les animaux seront anesthésiés deux fois, une fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus qui sert à apporter la molécule d'intérêt dans le cerveau des animaux (durée de l'injection 30 secondes), et une autre fois pendant 1h le temps de l'acquisition des images IRM; 2) 7 tests comportementaux seront réalisés avec ces animaux (1 test par jour, répartis sur une durée de 1 à 2 semaines en fonction du nombre d'animaux testés).

Impact sur les animaux

Les modèles de souris utilisés dans cette étude sont des modèles largement utilisés dont le phénotype devient dommageable avec l’âge, par l’expression de symptomes modérés. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Avec l’âge, les symptômes neurologiques (anxiété, dépression, désinhibition) et moteurs (perte d’équilibre, manque de précision dans les mouvements) sont de plus en plus visibles lors des tests comportementaux mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons pas à observer de points limites ni de mort prématurée chez ces animaux dus au phénotype. Nous pouvons identifier plusieurs effets indésirables sur les animaux lors de l’expérimentation : 1) un stress léger pendant leur transport dans établissement utilisateur à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation pour les injections rétro-orbitales pendant lesquelles les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus (durée de l'injection = 30 secondes); 3) un stress modéré lors du test de l'alimentation supprimée par la nouveauté, impliquant une mise à jeun de 24h; 4) un stress modéré lors du test d’actimétrie impliquant un isolement prolongé de 48h; 5) un stress modéré pendant leur transport en Belgique; 6) un stress léger pour les expériences d'IRM pendant lesquelles les souris seront anesthésiées pendant 1h avec un anesthésique volatile.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études histologiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes des approches thérapeutiques évaluées dans ce projet.

Remplacement

Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il nous est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques. Nos résultats in vitro nous ont déjà permis de valider les constructions virales et donc de réduire les nombre d'animaux testés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et des matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec leurs nids et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Nous laisserons aux souris au moins une semaine d'acclimatation avant de commencer les expériences. Lors des injections de virus, les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus (durée de l'injection = 30 secondes). Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à ce type d'injection n'a pu être observé. Bien que la procédure est peu invasive et très rapide (5 min), des points limites suffisamment précoces et adaptés ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en place. Pour limiter leur stress lors du test d'alimentation supprimée par la nouveauté, la nourriture sera remise à volonté dans les cages dès que chaque animal aura terminé le test. Pour éviter que le test de mesure d'activité n’impacte le reste des expérimentations, il sera réalisé en dernier, avant le sacrifice des animaux. Durant toute la procédure d'imagerie IRM, les souris seront anesthésiées pendant 1h et leur température corporelle sera maintenue à 36.5°C. Les souris seront envoyées avec un transporteur agréé avec un délai de livraison de maximum 24h après leur enlèvement. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles souris choisis permettent de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le but du projet est de tester 2 nouvelles approches thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 10-12 mois car c’est à partir de 6-8 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et de mémoire observables en étude de comportement.