Rongeurs

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection sous-cutanée d'une formulation à libération prolongée puis onze prélèvements sanguins à la veine de la queue, pour comparer le profil pharmacocinétique de six formulations d'un "laboratoire pharmaceutique client". Le porteur reconnaît que les prélèvements répétés stressent les animaux et peuvent léser leur queue. Il présente le recours à l'animal entier comme "nécessaire et obligatoire d'un point de vue réglementaire" et retient le rat plutôt que la souris pour son volume sanguin plus élevé.

Objectifs

Le laboratoire pharmaceutique client a développé des matrices de type gel qui peuvent être complexées avec des composés thérapeutiques et être administrées par voie sous-cutanée afin d'induire une libération prolongée du composé complexé. Ce type de formulation (ou galénique) permet ainsi, en théorie, de réduire très sensiblement la fréquence d'administration de médicaments dont la voie d'administration est sous-cutanée. Néanmoins, il est nécessaire de tester, pour chaque composé à complexer, sa stabilité à moyen long terme dans la matrice afin que ce dernier conserve son efficacité. Par ailleurs, la durée de libération va également dépendre étroitement de la composition du gel. Le présent projet vise ainsi à explorer le profil pharmacocinétique de 6 formulations à libération prolongée du médicament X administrées par voie sous-cutanée chez le rat, dans le but d'optimiser son développement. Les données obtenues seront comparées aux profils pharmacocinétiques obtenus après administration d'une galénique classique du composé X par voie intraveineuse et sous-cutanée. La formulation permettant la meilleure stabilité du compose X et de ses paramètres pharmacocinétiques sera conservée pour la suite du développement, notamment dans un cadre clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de catégoriser les formulations à libération prolongées du médicament X de notre client en fonction de leur paramètres pharmacocinétiques et de prioriser les meilleures formulations pour la suite du développement préclinique et clinique. La formulation à libération choisie prolongée devrait à terme permettre de réduire considérablement la fréquence d'administration du composé X qui est déjà utilisé en clinique humaine sous sa forme galénique classique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Pesée (1min ; 2 fois). Habituation aux boîtes de contention (5min ; 2 fois). Anesthésie gazeuse (5min ; 1 fois). Administration sous-cutanée du composé d'intérêt (1min ; 1 fois). Prélèvements sanguins (5min ; 11 fois).

Impact sur les animaux

La répétition des prélèvements sanguins via la veine de la queue est de nature à induire un stress aux animaux. Par ailleurs, ces prélèvements répétés pourraient s'avérer générateurs de lésions problématiques au niveau de la queue. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés de façon quotidienne par les expérimentateurs et habitués aux systèmes de contention utilisés au cours des prélèvement. Afin de se prémunir de lésions potentielles au niveau du site de prélèvement sanguin, ceux-ci seront pratiqués à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Une attention particulière sera portée à la queue des animaux. Si un hématome venait à apparaitre, les prélèvements suivants seraient pratiqués sur le côté opposé de la queue. Par ailleurs, le volume de sang prélevé pour chaque point est limité au volume minimum possible pour la réalisation des analyses pharmacocinétiques (PK) ultérieures.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Après euthanasie, certains organes seront prélevés (coeur, poumons, cerveau...) afin d'étudier une accumulation éventuelle à leur niveau du composé X ou d'éléments constituants de la matrice de libération prolongée.

Remplacement

Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques de formulations à libération prolongée d'un médicament X. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour ce type d'étude. Le choix du modèle rat a été préféré à la souris du fait des capacités accrues de prélèvements sanguins sur ce modèle (volémie plus importante).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 6 animaux par groupe a été choisi en tenant compte d'une possibilité de variabilité plus importante de la biodisponibilité des drogues progressivement libérées par la matrice en sous-cutanée par rapport à une administration classique (libération immédiate).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études pharmacocinétiques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les volumes des prélèvements sanguins en série seront limités au strict nécessaire pour l'élaboration des dosages. Par ailleurs, les prélèvements seront réalisés par ponction de la veine de la queue à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Les animaux seront hébergés avec un enrichissement du milieu de vie qui sera assuré par l'ajout de petites briquettes en bois et de tubes cartons spécifiques pour rat. Enfin, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis (administration d'analgésiques; cf annexes).

Choix des espèces

Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des molécules actives déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de formulations, permettant d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter le développement ultérieur aux formulations présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes (300 g à réception/350g env. au démarrage des expérimentation). Ce stade de développement a été choisis: - en se basant sur le recommendations d'un ouvrage de référence. - en considérant le nombre de prélèvements et les volumes sanguins nécessaires à la bioanalyse.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", ce volet étant la seconde partie d'une étude sur une enzyme des cellules souches du sang.

Objectifs

La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.

Bénéfices attendus

Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.

Procédures

Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25µL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200µL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) pour les analyser.

Remplacement

Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", pour étudier une enzyme des cellules souches du sang.

Objectifs

La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.

Bénéfices attendus

Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.

Procédures

Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25μL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200μL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, thymus) pour l'analyser.

Remplacement

Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.

1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ablation d'un rein, des administrations répétées de composés jusqu'à deux fois par jour, des prélèvements sanguins, des échographies cardiaques et des séjours en cage métabolique, pour mettre au point un modèle de maladie rénale chronique. Le porteur qualifie la chirurgie d'induction d'invasive et douloureuse et décrit un stress chronique lié aux gestes répétés. Il reconnaît que des modèles in vitro à base de sphéroïdes ou d'organoïdes sont en développement dans la société, tout en concluant à l'usage du rat, la finalité restant le développement de thérapies pour les patients.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques peuvent avoir diverses origines : inflammatoires, insuffisances aigues, associées au diabète, infectieuses, …. Elles ont pour conséquence d’induire une perte de fonctionnalité rénale dont les traitements envisagés actuellement se résument à la dialyse ou la transplantation rénale. De plus, ces maladies peuvent induire des altérations cardiaques graves menant à l’insuffisance cardiaque. L'objectif de ce projet est de développer des modèles mimant les maladies rénales chroniques pour permettre le développement de thérapies moins impactantes pour la vie du patient que celles dont on dispose actuellement.

Bénéfices attendus

Seuls la dialyse ou la transplantation rénale sont envisagées pour traiter ces maladies rénales. Ce sont des traitements lourds qui impactent de façon importante la vie du patient. Ainsi, il est nécessaire de trouver de nouveaux axes thérapeutiques pour éviter d’arriver à ces thérapies relativement lourdes. La mise en place de ce type de modèle préclinique le permettra. De plus, des thérapies ciblant les conséquences au niveau du cœur peuvent être également testés.

Procédures

1 – l’induction de l'insuffisance rénale aigue : La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure 1h30. 2 - Les composés à tester/de référence seront administrés jusqu’à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutannée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié (pendant maximum 2 semaines). L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. 3- Des prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (quelques jours avant la chirurgie, puis 24h, 48h et 72h après la chirurgie et une fois par semaine pour les projets chroniques ) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. 4 - Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies et des mesures de pression artérielle sur animal anesthésié en début et fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration du rein (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang.)

Impact sur les animaux

1 – l’induction d'une insuffisance rénale aigue : cette chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. En induisant la pathologie, une différence de production d’urine peut être attendue. De la même façon, une différence de prise hydrique peut être attendue. 2 - Les prélèvements de sang peuvent engendrer des hématomes, les sites de prélèvements seront observés de près. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. L'echographie et la mesure de la pression artérielle sont non invasives mais nécessite une anesthésie légère, le reveil des animaux sera surveillé de près. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le rein, paramètres métaboliques et de fonction rénale dans le sang...)

Remplacement

L’insuffisance rénale aigue pourrait être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Des modèles in vitro à partir de système sphéroïde ou organoïde sont en cours de développement au sein de la société.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains (non néphrectomisés).

Raffinement

Lors de la chirurgie et en post-chirurgie, des stratégies analgésiques locales et systémiques seront utilisées pour réduire la douleur. L'animal est placé sur tapis thermorégulé avec sonde rectale de température avec mesure instantanée de la température corporelle, garantissant le maintien de l'animal à 37°C pendant la chirurgie. Un concentrateur à dioxygène est couplé à l'appareil à isoflurane pour favoriser la respiration des animaux anesthésiés. Les rats seront hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière pourra être déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisé la procédure et la SBEA. Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points suivants : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier sera euthanasié. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, les animaux seront visités de façon biquotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne surprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, un gel d'hydratation peut être ajouté ou une injection sous cutanée de solution saline peut être envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme pour limiter le stress de l'animal. De la même façon, la prise hydrique sera monitoré plusieurs fois par semaine.

Choix des espèces

L’utilisation de rat permet d’étudier à la fois le pan rénal et le pan cardiaque de façon robuste. De plus, les traits de la pathologie sont comparables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux utilisés seront étudiés à l’âge adulte afin que la maturation de leur physiologie (hormonale, immunitaire) soit stable et garantir une homogénéité des résultats.

2 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent notamment une séparation maternelle quotidienne de trois heures pendant les trois premières semaines de vie, l'injection d'un composé perturbant la puberté, des prélèvements vaginaux quotidiens et jusqu'à seize prélèvements sanguins par coupure de la queue. Le porteur décrit la séparation maternelle comme une "situation de fort stress pour la mère et les petits" et reconnaît que les prélèvements répétés génèrent douleur et stress. Il affirme que l'animal vivant "ne peut être remplacé" faute de conserver le lien cerveau-gonades et qu'il n'existe "pas d'autre méthode ni de modèle alternatif" pour étudier l'âge de la puberté.

Objectifs

La puberté est une étape cruciale du développement qui permet d’assurer le maintien des espèces par la reproduction sexuée. Cette période se caractérise par l’acquisition de caractères sexuels secondaires et dépend de l’activation de neurones localisés dans une région spécifique du cerveau : l’hypothalamus. Une fois activés, ils sécrètent dans le sang une neurohormone : la GnRH ou gonadolibérine et sont donc appelés neurones GnRH. Cette sécrétion de GnRH est l’élément déclencheur de la maturation des gonades et de la puberté. L’activation des neurones GnRH, jusque-là en dormance, est donc une étape clé dont le moment est finement régulé. En général, la puberté débute entre 8 et 13 ans chez la fille, et entre 9 et 14 ans chez le garçon. Cependant, certains enfants souffrent de dysfonctionnement du développement cérébral altérant l’activation des neurones GnRH et entrainant une puberté qui survient trop précocement (puberté précoce centrale) ou bien qui ne démarre pas. Les causes de ces altérations sont encore largement méconnues. Notre projet a pour objectifs d’identifier les mécanismes permettant de contrôler l’activation des neurones GnRH et leurs perturbations lors de troubles de la puberté. Pour cela nous utilisons tout d’abord des approches in vitro sur des cultures de cellules neurales humaines reproduisant des mutations retrouvées chez des enfants atteints de troubles pubertaires soit des cellules directement issues de ces patients. Néanmoins, cette approche n’est pas suffisante car elle ne permet pas une observation intégrée. L’analyse in vivo de l’activité du système GnRH chez la souris est donc nécessaire afin de déterminer 1/ l’impact de l’environnement et 2/ le rôle des gènes mutés identifiés chez les patients, sur le fonctionnement des neurones GnRH, l’initiation de la puberté et les capacités reproductives. Ce projet permettra in fine de comprendre les mécanismes d’activation des neurones GnRH et le rôle combiné des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté. Les résultats apporteront des données précieuses sur le contrôle par le cerveau de la reproduction et plus généralement renforcera nos connaissances du développement cérébral durant l’enfance.

Bénéfices attendus

Les capacités de reproduction s’acquièrent lors de la puberté, un moment clé du développement qui permet la transition de l’enfance à l’adulte. Il existe différents troubles pubertaires dont les répercussions peuvent être variables : allant de l’altération de l’âge de la puberté (précoce ou retardée) avec des retombées importantes sur la croissance et la psychologie de l’enfant, à des atteintes plus graves conduisant à l’infertilité. Nombreuses de ces atteintes ont pour origine un défaut du développement cérébral et plus précisément touchent le fonctionnement des neurones GnRH. Pour la plupart les causes et les mécanismes de ces dysfonctionnements restent incertains. Notre projet se base sur une approche multifactorielle (environnement externe et génétique) et interdisciplinaire alliant recherche clinique et fondamentale. Il permettra 1/ de développer des modèles murins reproduisant des troubles de la puberté similaires à ceux observés chez l’enfant 2/ d’identifier des facteurs génétiques et environnementaux important pour la puberté et la reproduction et 3/ de déterminer les mécanismes d’activation des neurones GnRH et ainsi de mieux contrôler la puberté et le moment de son initiation. Puisque la mise en place des neurones GnRH et leur activation font parties du développement cérébral, nos découvertes pourront apporter des connaissances plus larges et précieuses pour la compréhension du neurodéveloppement et de ces atteintes lors de pathologies neurologiques. Ce projet aura des retentissements importants dans le domaine de la santé publique puisqu’il y a une baisse de l’âge de la puberté depuis le milieu du 19ème siècle dont les causes restent incomprises. De nombreux facteurs semblent pouvoir être impliqués, le surpoids, les perturbateurs endocriniens et l’adoption. Notre projet permettra d’apporter des réponses cruciales sur les rôles de ces différents paramètres sur le développement cérébral et l’initiation de la puberté. Il est important de souligner que notre projet aura des impacts multiples et interdisciplinaires. En effet, plusieurs études ont montré que les pubertés précoces chez la femme sont plus souvent associées à la survenue de pathologies communes chez l’adulte telles que le cancer du sein ou le diabète, suggérant qu’il puisse exister des mécanismes communs. Ce projet pourrait ainsi identifier ces mécanismes et participer à la mise en place d’actions de prévention.

Procédures

Ce projet vise à déterminer le rôle de l’environnement et des gènes dans l’âge de la puberté et la reproduction. 4 facteurs seront testés : l’injection d’un composé qui perturbe le fonctionnement des régions cérébrales impliquées dans la puberté et la reproduction, la séparation maternelle et deux mutations génétiques. Les interventions seront réalisées sur des groupes d’animaux différents : -Injection unique ou deux injections espacées de 5h à 6h d’un composé qui perturbe la puberté à 8 jours après la naissance -Séparation maternelle quotidienne pendant 3h de 1 jour après la naissance à 21 jours de vie -Manipulation, observation et pesée quotidienne de 8 jours après la naissance jusqu’à l’âge adulte : Analyse de l’âge de la puberté. Ces manipulations n’excèderont pas 5 min par animal. Pour les femelles, dès l’ouverture vaginale (environ 30 jours après la naissance), des prélèvements vaginaux seront réalisés tous les jours jusqu’à l’âge adulte (environ 60 jours après la naissance). -Mise en accouplement durant 8 semaines -Prélèvements sanguins répétés à partir d’une coupure unique de l’extrémité de la queue préalablement analgésiées (lidocaïne en crème), puis massage (10 à 30 s / prélèvement). 16 prélèvements sanguins pour dosages hormonaux a différents temps, espacés de 20 à 60 min. Ce groupe sera soumis à une injection unique d’un composé activant les sécrétions hormonales, répétée deux fois à 15 jours d’intervalle. -Prélèvements rapide de queue (un prélèvement unique fait à 6 jours après la naissance)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, différents effets nuisibles sont à prévoir : La séparation maternelle prévue est une situation de fort stress pour la mère et les petits. Les souris pourront ressentir un état de stress lié à la manipulation quotidienne par l’expérimentateur lors des mesures anatomiques (pesée, vérification de l’ouverture vaginale, de la séparation préputiale) Les souris pourront ressentir de l‘inconfort et stress durant les prélèvements vaginaux Une douleur légère de courte durée sera induite lors du prélèvement d’un bout de queue pour identifier la nature génétique des souris La coupure unique de l’extrémité de la queue lors des dosages hormonaux répétés pourra également être source de stress et d’inconfort. L’absence de cicatrisation lors d’une série de 16 prélèvements permet d’éviter la douleur lors des prélèvements répétés. Le volume total prélevé est très faible (moins de 3% du volume sanguin total) et aura été récupéré entre les deux séries espacées de 15 jours. La deuxième série qui a lieu après 15 jours de récupération, se fera sur une queue cicatrisée donc plus sensible ce qui pourra générer de la douleur et du stress lors de la première et unique incision.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à différents temps afin de pouvoir prélever les tissus en fin de procédure et analyser les cellules et leur fonctionnement. Cela permettra de mieux comprendre le rôle de l’environnement et des gènes sur le développement après la naissance des cellules cérébrales et l’impact sur l’âge de la puberté.

Remplacement

La puberté est un processus physiologique complexe et progressif qui débute lors de l’activation de neurones localisés dans le cerveau. Une fois activés, ces neurones sécrètent une neurhormone qui va agir au niveau des gonades. En réponse les gonades sécrètent des hormones stéroides sexuelles qui excercent en retour un effet sur le cerveau. Il s’agit d’une boucle cerveau-hormones-gonades dont le terme est la maturation totale de la fonction de reproduction. Afin de comprendre les rôles des facteurs environnementaux et génétiques sur la puberté, l’animal vivant ne peut être remplacé, car cela necessite de conserver le lien entre le cerveau et les gonades. Ce projet est mis en place pour apporter une analyse complémentaire et indispensable aux études in vitro réalisées dans l’équipe, à partir de lignées de cellules humaines et de cellules neurales produites à partir de cellules prélevées chez les patients. Il permettra de faire le lien entre les mécanismes purement cellulaires décrits in vitro et l’effet sur la physiologie de l’animal. L’ensemble de ces résultats apportera des données cruciales pour la compréhension des mécanismes d’initiation de la puberté et la contribution des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté et la reproduction. Il n’y a pas d’autre méthode ni de modèle alternatif.

Réduction

LLe projet a été établi de manière à limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux. Pour cela, les études in vivo font suite à des analyses préliminaires in vitro (culture cellulaire) qui certifient l’intérêt de l’utilisation de l’animal. Les expériences pour chaque procédure, seront réalisées séquentiellement et seules les expériences préalablement réalisées sur un groupe restreint d’animaux (124 souris) et qui montrent une altération de la puberté ou de la reproduction, seront reconduites pour une analyse plus poussée des mécanismes. Pour cela, une partie du projet utilise des souris génétiquement modifiées, dont le fond génétique est contrôlé et homogène avec des souris contrôles provenant des mêmes croisements que les souris mutées. Cela permet de réduire la différence de résultats entre les individus, donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer des modifications significatives. En utilisant les mêmes animaux dans différentes expérimentations au cours d’une procédure (les animaux utilisés pour l’observation anatomique, la détermination de la puberté et l’étude des capacités reproductives seront également utilisés pour l’analyse des tissus, des cellules et des molécules), nous augmentons les mesures multiples sur un seul animal et réduisons le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. La taille de l’échantillon est basée sur des études précédentes réalisées dans le domaine et tient compte : de la variabilité entre les différents individus et au sein du même animal ainsi que de la baisse d’effectif en cours de procédure (euthanasies expérimentales). Cet échantillon permet d’obtenir en fin de procédure un nombre d’animaux suffisant, en accord avec les études précédentes, pour une analyse statistique fiable.

Raffinement

Afin de prévenir tout mal être des animaux utilisés dans cette étude, ils seront quotidiennement monitorés par les membres qualifiés de l’animalerie pour s’assurer de leur bien-être. Tout comportement anormal est directement communiqué à la personne responsable du projet ou personnel formé participant au projet, qui fournira l’ensemble des soins nécessaires en concertation avec l’équipe vétérinaire. Les animaux seront également monitorés quotidiennement par les expérimentateurs confirmés responsables du projet et connaissant bien le modèle murin. Les animaux en cours d’expérimentation auront un double suivi : une surveillance quotidienne visuelle à heure fixe et une surveillance plus approfondie avec grille d’évaluation adaptée à l’âge de l’animal. Cette grille permettra d’évaluer par des critères objectifs le bien-être animal et de décider, en cas de souffrance s’il est préférable pour l’animal d’être euthanasié. Les protocoles expérimentaux ont été mis au point afin de prendre toutes les mesures nécessaires pour atténuer et à minimiser la douleur, la souffrance ou le stress subis par l’animal, ils incluent des périodes d’habituation, un renforcement positif, l’utilisation de crème analgésique et de produits anesthésiants. Ils permettront d’assurer le bien-être animal au cours de cette étude. Pour limiter le stress lié aux manipulations, les animaux seront préalablement habitués et seul l’expérimentateur ayant réalisé l’habituation sera en charge de réaliser les mesures. Afin de réduire le stress lié aux prélèvements sanguins et permettre l’habituation des animaux à cette procédure, une friandise pour rongeur de 2g morcelée au préalable en 16 petits morceaux sera apportée aux animaux après chaque prélèvement. Il n’y a pas de conséquence digestive. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi (sopalin, maisons en plexiglas autoclavable rouge) pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

A ce jour, la souris est le modèle mammifère le plus propice aux modifications génétiques. L’ensemble des modèles mutants et transgéniques indispensables à la faisabilité du projet ont déjà été développé, ce qui permet de faciliter et accélérer de façon considérable la réalisation du projet. Il existe une grande littérature sur la physiologie de la puberté et le fonctionnement des neurones de l'hypothalamus chez la souris contrôle. Cela permet d’avoir des références de comparaisons indispensables à l’étude, qui limiteront les besoins expérimentaux et le nombre d’animaux. Le laboratoire a une grande expertise dans le modèle murin et les travaux précédents de l’équipe ont ainsi permis d’identifier des gènes responsables troubles pubertaires et de comprendre les mécanismes impliqués. Les nombreuses collaborations de l’équipe avec des chercheurs travaillant sur la souris permettent de faciliter l’étude et d’assurer son accomplissement éclairé par le partage de connaissances et d’expertises. L’ensemble du projet est axé sur l’étude d’un phénomène développemental, qui justifie l’utilisation de souris à différents âges après la naissance. La puberté se fait relativement rapidement chez la souris autour de P30 chez la souris femelle et P40 chez le mâle. Enfin la durée de gestation relativement courte (environ 20 jours) et la facilité d’accouplement en fait un modèle de choix pour l’étude des capacités reproductives.