Rongeurs
Effets de différents pré-traitements sur la calcification de péricardes bovins et porcins dans un modèle d’implantation chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
1 100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Implantés dès l'âge de douze jours, ils reçoivent sous la peau du dos des disques de péricarde bovin ou porcin, gardés jusqu'à deux mois, avec un risque de gonflement et de pus au site d'implantation. Le porteur affirme que l'étude de la calcification ne peut se faire que sur un organisme vivant, faute de modèle in vitro. Les ratons sont mis à mort avant le retrait des implants, décrit comme trop mutilant pour les laisser en vie.
Objectifs
La sclérose valvulaire aortique, c'est-à-dire le rétrécissement de l'ouverture de la valve aortique, est un enjeu majeur de santé publique qui touche 2 à 6 % des personnes âgées de plus de 65 ans. Sa prévalence est susceptible de doubler au cours des 50 prochaines années en raison du vieillissement croissant de la population. La sclérose valvulaire aortique est maintenant principalement considérée comme un processus incluant une calcification de la valve. Actuellement, cette pathologie est traitée par remplacement valvulaire avec une valve bioprothétique constituée de péricarde bovin ou porcin. Néanmoins, comme pour la valve native, une calcification des valves bioprothétiques au bout de 10-15 ans d'implantation a été mise en évidence, dégénérescence qui peut conduire à une ré-intervention. Ce travail permettra de valider l’efficacité de traitement des péricardes (notamment avec moins de calcification) afin de proposer une nouvelle valve bioprothétique. Nous évaluerons différents prétraitements cellulaires et moléculaires du péricarde servant à faire une bioprothèse. Nous implanterons des disques de péricarde bovin et porcin en sous-cutanée sur le dos de ratons pour une durée allant d’une semaine à 2 mois. Cette étude portera sur 1100 rats au total (550 rats immunocompétents et 550 rats immunodéprimés) implantés à l’âge de 12 jours.
Bénéfices attendus
A terme ce travail permettra de mieux comprendre le devenir des implants de péricarde in vivo et leur intégration dans les tissus (calcification, colonisation) ou leur dégradation et surtout de proposer un essai clinique humain avec une nouvelle valve cardiaque à base de péricarde porcin génétiquement modifié.
Procédures
Les animaux subissent une implantation en sous cutanée de disques de péricarde et sont gardés de 1 semaine à 2 mois avant la récupération des disques de péricarde.
Impact sur les animaux
Les ratons peuvent avoir au niveau de la zone d’implantation un gonflement, du pus. Les animaux peuvent être gardés jusque 60 jours.
Devenir
Malgré le repérage des implants par palpation la recherche des implants nécessite deux grandes cicatrices au niveau dorsal. De plus le retrait des implants abime la chair de l’animal. Ces deux points constituent une nuisance très importante pour l’animal tant au niveau de la cicatrice que de la chair ce qui nous conduit à la mise à mort de tous les animaux avant retrait des implants de péricarde.
Remplacement
L’étude du devenir du matériel à base de péricardes bovin et porcin après implantation ne peut être réalisée que sur un organisme vivant en raison des multiples interactions qui existent entre les différents types cellulaires ainsi que leur environnement et le matériau implanté. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro pour faire calcifier le péricarde. De plus, des tests préliminaires in vitro nous ont permis de mettre en évidence une protéine d’intérêt dans la calcification des valves. En effet, en faisant une recherche de différentes molécules d’intérêt au niveau du sang circulant de patients opérés d’une dégénérescence de bioprothèse, nous avons pu mettre en évidence la spécificité d’une molécule vis-à-vis de la calcification de ces bioprothèses.
Réduction
Dans un objectif de réduction, quatre disques de péricarde seront implantés par animal afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le chiffre de 10 péricardes est choisi suite à l’expertise du laboratoire. 2 disques sont gardés pour analyse histologique. 2 disques sont gardés pour congélation et il nous reste 6 disques pour dosage de calcium ce qui permet une analyse robuste et répétable. La taille des échantillons est réduite au minimum mais suffisante pour valider la significativité des taux de calcification. Ce nombre a été calculé selon l'expérience acquise dans notre équipe en tenant compte de la variabilité observée lors d'expériences similaires et les données de la littérature.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et les conditions d’hébergement sont optimisées avec des enrichissement systématique des cages avec du coton, maisonnettes et / ou bâtonnets de bois. De plus, les implantations en sous cutanée et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale. A l’’implantation des ratons, un analgésique leur sera administré afin de réduire la douleur pouvant résulter de l’implantation. Ils seront remis immédiatement après leur réveil avec leur mère afin de limiter le stress. Les animaux seront surveillés de façon hebdomadaire avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance.
Choix des espèces
L’implantation en sous-cutanée chez le rat Wistar est communément admise comme modèle d’étude de calcification pour les biomatériaux dans la littérature. Le rat Nude permettra de s’affranchir de la réponse immunitaire et de tester l’implantation de péricardes contenant des cellules progénitrices endothéliales humaines. Les ratons sont âgés de 12 jours, car leur métabolisme en développement est optimal pour observer une réaction et une calcification rapide notamment en raison de l'allaitement.
Etude du rôle des cellules stellaires hypertrophiées dans la fibrose hépatique sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises jusqu'à vingt semaines à un régime gras destiné à provoquer une fibrose du foie, elles reçoivent jusqu'à onze injections intraveineuses sous anesthésie, avec un risque de lésion ou de douleur de l'œil. Le porteur indique que le régime entraîne une perte de poids les premières semaines puis une reprise, et que toutes les souris développent la fibrose. Leur foie est prélevé après la mise à mort pour récolter les cellules étudiées.
Objectifs
La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Or il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de ce projet est d’étudier un type de cellules du foie, connu pour être impliqué dans la fibrose hépatique, les cellules stellaires hépatiques. Il a été récemment découvert que certaines de ces cellules prenaient une forme particulière lors de la maladie hépatique, qualifié de cellules stellaires "hypertrophiées". Ces cellules ont été découvertes à la fois sur des modèles animaux et sur des biopsies de patients atteints de fibrose hépatique. Nous évaluerons dans un modèle murin qui mime la fibrose hépatique chez l’homme, l’efficacité d’un traitement sur la disparition de la fibrose et la forme des cellules stellaires. L’étude approfondie de ces cellules au cours de ce projet permettra de mieux comprendre leur rôle dans la fibrose hépatique et de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la fibrose du foie.
Bénéfices attendus
La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude pourra permettre d’identifier des cibles potentielles pour le développement de médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.
Procédures
Les administrations de molécules thérapeutiques seront réalisées par voie intraveineuse sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie 10 min, durée de l’injection 30 secondes) toutes les 2 semaines pendant 5 mois maximum, soit 11 injections au maximum. A la fin de l’expérience, une anesthésie profonce de l’animal est réalisée (injection de l’anesthésique = 20s) et un prélèvement sanguin est réalisé (30 secondes). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique (riche en gras et à quantité contrôlée en acides aminés) pendant 20 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. Les injections répétées peuvent induire un stress, une lésion ou des douleurs potentielles de l’œil.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin des expériences car il est indispensable de récupérer le foie pour récolter les cellules d’intérêt ou de récolter leur foie et leur sang pour étudier les effets du traitement testé sur la fibrose hépatique.
Remplacement
Les expérimentations nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations de notre molécule in vitro pour ne tester chez l’animal que celles optimales.
Réduction
Ce modèle de fibrose hépatique présente une très faible variabilité d’apparition de la maladie entre les souris (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Mais la qualité des cellules d’intérêt obtenues à partir du foie des souris ayant développée une fibrose peut être variable. Ainsi le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour pour obtenir un nombre suffisant de résultats exploitables. De plus suivant les durées de régime, l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins variable. Ainsi, le nombre d’animaux nécessaire pour étudier l’efficacité d’agents thérapeutiques a été calculé pour pouvoir exploiter les résultats statistiquement. Toutes les expériences seront réalisées d’abord sur un premier petit groupe d’animaux, la validité statistique des résultats sera testée, et l’expérience sera poursuivie sur des animaux supplémentaires si nécéssaire. Ainsi, le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Dans un souci de réduction, certains animaux âgés de 6 à 18 mois seront des anciens reproducteurs issus de fournisseurs agrées.
Raffinement
Ce régime entraine une perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines. Les souris reprennent ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des expériences. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.
Choix des espèces
Pour ce projet, l’espèce animale choisie est la souris. Les modèles de maladie hépatique chez la souris, en particulier de fibrose hépatique, ont été très largement décrits dans la littérature et sont bien connus. La souris présente en effet les mêmes étapes de développement de la maladie que la fibrose humaine, ce qui en fait une espèce de choix pour l’étude de nos cellules d’intérêt et l’élaboration de nouveaux agents thérapeutiques. Comme cela est largement décrit dans la littérature, les animaux malades utilisés devront être des souris âgées de 6 semaines (1,5 mois) afin de s’assurer que leur système gastro-intestinal soit bien développé. Et les souris contrôles devront être âgées de 6 mois à 18 mois pour obtenir un nombre suffisant de cellules d’intérêt (car plus les souris sont âgées plus le nombre de ces cellules augmente).
Tests de virulence de mutants bactériens dans un modèle murin d’infection
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de la bactérie responsable de la tularémie et subissent des prises de température rectale, pour comparer la virulence de mutants bactériens à une souche de référence. Le porteur affirme que l'analyse in vivo est "indispensable" et que les modèles in vitro ne miment pas la complexité des interactions hôte-pathogène. Toutes les souris sont mises à mort pour mesurer la multiplication bactérienne dans leurs organes.
Objectifs
La tularémie est une maladie zoonotique (c'est à dire que se transmet des animaux vers l'homme) qui est fréquente en Scandinavie (pays du Nord de l'Europe: Norvège, Suède, Finlande). Cette maladie se traduit par un syndrome de type grippal (c'est à dire ressemblant beaucoup à une grippe) mais peut évoluer vers des formes sévères voire létales (c'est à dire entraînant la mort). Cette maladie est une maladie infectieuse causée par un microbe (ou microorganisme) et plus précisément une bactérie. Cette bactérie est dite pathogène car elle peut causer une maladie. L'objectif du projet est de valider l'importance de certains facteurs d'une bactérie pathogène dans un modèle murin (i.e. chez la souris) de la maladie. Pour cela des mutants bactériens sélectionnés et validés au préalable dans des expériences in vitro seront testées en compétition avec une bactérie virulente de référence pour déterminer leur virulence dans la souris. L'objectif est de vérifier le role clef des facteurs testés en vue de faire progresser la connaissance sur cette bactérie et sur la maladie et à long terme de les cibler par des médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de faire progresser la connaissance sur une bactérie pathogène qui cause une maladie appelée tularémie. Cette maladie peut tuer des humains et touche une centaine de patients par an en France et beaucoup plus en Scandinavie. A terme ce projet devrait permettre de mettre en place des thérapies innovantes pour lutter contre cette bactérie.
Procédures
prise de température rectale (durée < 1min, 3 fois: jour 0 et 24h, 30h, J0 sous anesthésie gazeuse, 24h-30h animaux vigiles, pour tous les animaux) Injection de bactéries sous la peau (durée < 1 min) sous anesthésie gazeuse (c'est à dire que les souris sont endormies pendant cette procédure), 1 fois à j0 pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
L'injection de bactéries sous la peau sous anesthésie gazeuse est une source potentielle de douleur locale et/ou de stress transitoire (qui ne perdure pas) pour les animaux. Pendant les deux jours d'infection, les souris pourraient resentir les effets de l'infection même si les doses et les temps d'étude devraient limiter les effets indésirables.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour anayse de la multiplication des bactéries dans les différents organes en vue de faire progresser la connaissance sur la bactérie et la maladie qu'elle cause et à long terme de développer des traitements.
Remplacement
L'analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet et valider l'importance des facteurs étudiés dans la virulence de la bactérie. En particulier, les modèles in vitro étudient la réplication de la bactérie dans un seul type de cellule dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôte-pathogène rencontrées lors d'une infection.
Réduction
Les expériences in vivo arrivent en fin de projet après une sélection fine des mutants in vitro de façon à limiter le nombre de mutants à tester in vivo et donc le nombre d'animaux. De plus, la technique utilisée dite "index de compétitivité" diminue la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Finalement, la chronologie des expérimentations a été définie de façon à ajuster et à limiter le nombre d'animaux requis pour obtenir une information fiable.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants: 1) anesthésie lors de l'inoculation des bactéries 2) Les points limites sont définis spécifiquement pour ce projet de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux 3) les doses de bactéries inoculées sont non-létales sur la durée de l'expérimentation et ont été choisies avec soin sur la base d'expérimentations passées et de la litérature 4) les signes de fièvre sont suivis régulièrement par la prise de température 5) en cas de fièvre, un analgésique est administré aux souris avec un suivi de l'efficacité du traitement.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé est le modèle standard (car il mime très bien la maladie humaine) dans le domaine (comme en atteste de nombreuses publications scientifiques validées par des pairs) pour tester la virulence de mutants bactériens. Les animaux utilisés seront de 6 à 12 semaines (age adulte pour la souris avec donc un système immunitaire mature).
Rôle des adipocytes médullaires dans la toxicité osseuse de l’insuffisance rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent deux chirurgies destinées à provoquer une insuffisance rénale chronique, accompagnée de désordres cardiovasculaires et osseux, les mâles étant isolés quinze semaines pour éviter les bagarres. Le porteur anticipe une prise de poids réduite et, dans de rares cas, une mortalité de l'ordre de 10 %, intégrée au calcul des effectifs. Les tibias et fémurs sont prélevés après la mise à mort pour étudier la fragilité osseuse.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une fragilité osseuse multipliant par 4 l’incidence des fractures et doublant le risque de mortalité chez les patients dialysés. A ce jour, les mécanismes responsables de la fragilité osseuse liée à l’IRC restent mal connus. Aucun des traitements testés jusqu’ici n’a montré de réelle efficacité dans ce contexte. L’identification de nouveaux traitements est d’autant plus difficile que la plupart des molécules actuellement disponibles sont contre-indiquées en cas d’IRC. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette fragilité osseuse apparaît donc nécessaire afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Des observations cliniques récentes suggèrent que les patients souffrant d’IRC ont un niveau de graisse dans la moelle osseuse (adiposité médullaire) significativement plus élevé que les sujets ayant une fonction rénale normale. L’adiposité médullaire (AM) correspond à une accumulation de cellules graisseuses, appelées adipocytes médullaires (AdMed), au niveau de la moelle osseuse. Les études menées ces dix dernières années montrent que l’élévation de l’AM est associée à des altérations de la structure osseuse qui favorise le risque de fracture. Les études menées in vitro montrent que les AdMed sécrètent des facteurs modulant la fonction des ostéoblastes (formant l’os) et des ostéoclastes (résorbant l’os). Ils pourraient donc avoir un rôle clé dans la régulation du remodelage osseux. Nous avons émis l’hypothèse que l’élévation d’AM pourrait être à l’origine de la fragilité osseuse observée dans l’IRC. Ce projet présente deux objectifs principaux : 1- identifier les mécanismes par lesquels l’IRC amplifie l’AM, 2- évaluer l’influence des AdMed issus de conditions IRC sur l’activité des ostéoblastes, des ostéoclastes, et sur la qualité osseuse.
Bénéfices attendus
Nous espérons que cette étude nous permettra de conclure quant à l’existence ou non d’un lien de causalité entre AM et fragilité osseuse dans l’IRC. Les résultats que nous obtiendrons offriront une source très importante de pistes mécanistiques à explorer afin d’identifier les voies impliquées dans le développement des altérations osseuses observées chez les souris IRC. Cela pourrait conduire à l’identification de cibles thérapeutiques/diagnostiques prometteuses pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge de la fragilité osseuse chez ces patients.
Procédures
Tous les animaux subiront deux procédures chirurgicales, d'une durée inférieure à 15 minutes, et réalisées sur animaux anesthésiés, à deux semines d'intervalle. Pour la motitié de l'effectif, ces chirurgies auront pour but d'induire une insuffisance rénale chronique. L'autre moitié des animaux subira une chirurgie blanche, n'altérant pas la fonction des reins (souris contrôles). Certains animaux recevront des injections qui permettront d'étudier l'os post-mortem. Ces injections seront réalisées sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris des groupes IRC développeront une insuffisance rénale chronique associée à des désordres cardiovasculaires et osseux. Elles devraient donc prendre moins de poids que les souris contrôles sur toute la durée du protocole. Les animaux mâles seront hébergés seuls durant les 15 semaines de l'étude pour éviter le stress et les blessures liées aux bagarres. Cet isolement social pourrait générer un stress. L'état d'IRC peut être associée dans de très rares cas à une mortalité de 10% dont nous avons tenu compte dans le calcul l'effectif afin de s'assurer de pouvoir conclure fermement.
Devenir
Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés. Une partie des tibias et fémur des animaux sera utilisée pour étudier l’impact de l’insuffisance rénale chronique sur l’AM, la microarchitecture et la fragilité osseuse. L’autre partie des tibias et des fémurs des animaux sera utilisée pour récupérer les précurseurs d’adipocytes présents dans la moelle osseuse des souris afin de comparer in vitro leur capacité de différenciation en adipocytes et leur impact sur l’activité des cellules formant (osteoblastes) et résorbant (osteoblastes) l’os.
Remplacement
La complexité des désordres métaboliques liés à l’IRC (désordres minéraux, inflammation, stress oxydant et accumulation de toxines urémiques (déchets non excrétés par le rein malade)) est partiellement modélisable in vitro. Ainsi, des études préliminaires menées par notre équipe ont permis de démontrer que l’exposition à du sérum provenant de patients IRC amplifie la différenciation adipogénique des cellules de la moelle osseuse. Cependant, aucun système n’existe à notre connaissance permettant d’étudier l’impact de cet environnement pathologique sur le remodelage, la microarchitecture, la qualité et la fragilité osseuse. La complexité de ce système ne peut actuellement être appréhendée que par l'usage de modèles animaux.
Réduction
Le design de notre étude permettra d’obtenir un niveau élevé d’informations à partir d’un seul animal. Les données relatives à l'analyse des gènes seront déposées sur un site d’archive ouverte afin d'être accessibles au plus grand nombre. Ceci permettra à l’avenir à d’autres chercheurs du domaine de profiter de cette base de donnée sans avoir à reproduire le protocole d’expérimentation animal. Les cœurs et les aortes des animaux de toutes les procédures seront récupérés post-mortem pour alimenter la bio-banque d’organes du laboratoire servant aux mises au point des protocoles d’extraction et d’histologie.
Raffinement
Une période d'acclimatation de 7 jours sera mise en place à l'arrivée des souris, avant leur entrée dans le protocole. Les conditions d'élevages seront optimisées afin d'offrir aux animaux un maximum d'éléments environnementaux leur permettant de reproduire la majorité de leurs comportements naturels qu'ils soient hébergés seuls ou en groupe (enrichissement du milieu de stabulation avec des frisettes pour la confection de nids, des cylindres en cartons pour se cacher, et des bûchettes). Les chirurgies seront réalisées sur des souris anesthésiées. Suite aux chirurgies, les souris recevront une analgésie adaptée. Cette analgésie sera maintenue aussi longtemps que nécessaire. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, afin de s'assurer de leur bien-être et d'identifier les animaux susceptibles d'avoir atteint le point limite. Pour cela, un score bien-être, basé sur une pesée et la recherche de signes de souffrance, sera réalisé de manière journalière dans la semaine post-chirurgie puis de façon semi-hebdomadaire. Les animaux montrant des signes de souffrance recevront une analgésie et des soins adaptés. Les seront animaux ayant atteint le point limite seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle murin d’IRC que nous utiliserons a été validé sur des souris C57BL6J mâles et femelles agées de 8 semaines au moment de la première chirurgie. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle invertébré permettant de reproduire le syndrome cardio-rénal. La compléxité des désordres minéraux, métaboliques, endocriniens, vasculaires et osseux liés à l'induction de la maladie réanle chronique ne peut être reproduite par des systèmes de culture in vitro.
Exploration du métabolisme du fer en physiologie et dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires_1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Modèle d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, la maladie de Sanfilippo, 160 d'entre elles reçoivent une injection de fer et l'ensemble subit des prélèvements sanguins avant une euthanasie terminale pour nécropsie. Le porteur indique remplacer quand c'est possible l'animal par des cultures cellulaires, qui restent issues des souris, et affirme que la complexité physiologique du projet ne peut être reproduite in vitro. Il justifie l'espèce par la disponibilité d'une souche mutée et d'outils développés de longue date.
Objectifs
Les héparanes sulfate (HS) sont des sucres complexes. Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des HS provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de sucres partiellement dégradés dans un compartiment cellulaire spécifique; le lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée mucopolysaccharidose de type III. Cette maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux essentiellement dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. La poursuite de l’amélioration de cette approche prometteuse continue et des essais précliniques avec le vecteur sont en cours dans notre équipe. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris. Les dépôts de fer s’accumulent progressivement avec l’âge aussi bien chez les patients que dans le modèle de souris. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose dans la maladie, en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose dans cette maladie et identifier les populations cellulaires touchées dans le contexte de la maladie de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Sanfilippo . A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes de la ferropotose associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précision aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. l'étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
80 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 80 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. Toutes les 368 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanalise réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture). 160 souris vont avoir une injection non douloureuse de fer en solution ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. c'est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
160 souris de ce projet recoivent une injection unique en intrapéritonéale d'une solution tamponnée contenant du fer. L'observation de l'animal en continu dans l'heure qui suit permet de déceller toute anomalie synonyme de douleurs (prostration, changement dans l'aspect de l'animal). Le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement peut détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Il n'est pas attendu d'effets particulier car nous avons une euthanasie de l'animal qui se déroule 7 jours après l'injection de fer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure expérimentale
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui reste issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant. des tests statistiques adaptés seront utilisés. Les résultats avec p
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Pour les injections IP, elles seront réalisées par un personnel compétent et habitué. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animale. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées, etc…), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra l’euthanasie de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborée sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche mutée pour l’enzyme alpha-N acetylglucosaminidase (Naglu) est adaptée pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo B et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux (Ac, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des ages assez précoce qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie + ou- en présence de fer exogène. A 2 mois ces animaux ont les 1er influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Etude des mécanismes de réparation tissulaire de la jonction anorectale et de leurs conséquences sur le développement des cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
109 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines, génétiquement modifiées, développent spontanément un cancer anorectal accompagné d'une inflammation intestinale, avec perte de poids, prostration et diarrhée à partir de six ou sept mois. D'autres subissent des microlésions de la jonction anorectale qui provoquent des saignements de l'anus, ainsi que des injections rétro-orbitaires et une phalangectomie. Le porteur évoque les organoïdes comme alternative mais affirme qu'aucun ne reproduit aujourd'hui cette région, et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Avec plus de 40 000 cas par an en France, le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Les services de santé publique s’accordent tous sur le fait que ce nombre de cas sera plus que doublé d’ici 2035. Faute de connaissance des mécanismes précoces conduisant à ce cancer, son diagnostic est très souvent tardif expliquant une prise en charge à un stade trop avancé de la maladie et donc le fort taux de mortalité. Il y a donc urgence de comprendre les étapes précoces de la maladie pour la soigner à son début. Ce cancer se localise préférentiellement dans la partie basse du rectum dans la région entre le rectum et l’anus, appelé la jonction anorectale. Chez l’Homme plusieurs arguments suggèrent que des micro-cassures spontanées de la région anorectale notamment lors du passage de selles, provoqueraient une entrée des bactéries qui vivent dans le rectum et donc créeraient une inflammation à l‘origine du cancer. Ce projet de recherche vise à comprendre comment la région anorectale se répare pour prévenir l‘entrée des bactéries et de l’inflammation. L’hypothèse basée sur des études antérieures suggère que le système immunitaire et plus particulièrement certains globules blancs contribuent à la réparation de la jonction anorectale.
Bénéfices attendus
Ainsi, en validant que certains globules blancs sont capables réparer les micro-cassures de la jonction anorectale, ce projet devrait permettre de considérer les patients présentant un défaut de ces globules blancs comme des sujets à risque de développer un cancer colorectal et ainsi de mettre en place une prise charge à un stade très précoce la maladie afin d’augmenter leur survie.
Procédures
Certains animaux servent à l’élevage et ne subissent pas de gestes techniques autres qu'une phalangectomie, d’autres subissent au maximum une unique procédure avant la mise à mort, consistant à réaliser des microlésions de la jonction anorectale, cette intervention sera réalisée une unique fois par animal.
Impact sur les animaux
Les souris ayant une réponse incomplète à la molécule d'intérêt développe un cancer anorectal, associé à une inflammation intestinale qui se manifeste par la perte de poids de la souris, sa prostration et la présence de diarrhée, à partir de 6-7 mois de vie. La procédure de microlésions de la jonction anorectale peut provoquer des micro saignements de l’anus, observables par tapotement avec un mouchoir en papier blanc (petites traces rouges). Ces micro saignements ne durent pas plus de 30 minutes. L’injection intra- veineuse par voie retro-orbitaire est une procédure courante, mais qui peut toutefois causer une douleur courte. Dans l’ensemble des procédures, les contentions des souris sont également une source de stress à ne pas négliger.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort soit suite à la fin des procédures, soit lorsqu’un point limite est atteint.
Remplacement
Une alternative à l’utilisation d’animaux pour des pathologies intestinales serait la génération d’organes in vitro, appelé organoïdes qui, en théorie, impliquerait un seul animal. Si ces organoïdes de côlon sont facilement mis en place dans les laboratoires, il n’existe pas aujourd’hui de méthode permettant la génération d’organoïdes comprenant l’anus, le rectum et la jonction anorectale. La génération de tels organoïdes reste encore un challenge technologique qui impliquerait plusieurs dizaines d’animaux du fait que cette région est unique. Par ailleurs, des bactéries commensales devraient être placées dans la lumière. Une telle approche alternative demanderait dans ses mises au point plus de 30 souris. Par ailleurs, les facteurs physiologiques tels que les tensions physiques dues au passage des selles ne seraient pas prises en compte, excluant toutes conclusions physiologiques des observations qui pourraient être faites in vitro.
Réduction
Le développement de la pathologie dans les souris développant un cancer anorectal est standardisé. 100% des animaux développent spontanément un cancer. Par ailleurs, le site de transformation est très précis et spécifiquement localisé à la jonction entre l’anus et le rectum. Ces conditions font que nous obtenons une puissance statistique forte avec 6 animaux par groupe par rapport aux modèles d’injection de cellules tumorales ou d’agents oncogéniques communément utilisés en cancérologie (le nombre de souris a été calculé à l'aide d'un logiciel de statistique). Le genre n’ayant pas d’effet sur la pathologie observée, les animaux des deux sexes seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux générés Par ailleurs, les moelles osseuses des animaux mis à mort seront systématiquement congelées. Elles permettront de recréer un système immunitaire génétiquement modifié dans des souris receveuses. Une moelle pouvant générer un système immunitaire dans plus de 20 souris, ces moelles seront partagées avec des chercheurs du monde entier, évitant la génération d’animaux.
Raffinement
Les procédures de microlésions impliqueront en plus d’une anesthésie gazeuse, une injection d’analgésique et une pommade anesthésiante, appliquée en région anale 5 min avant les microlésions. Ces 2 produits sont efficaces dès les premières minutes et durent entre 1h30 et 4h, délai au-delà duquel la fonction de défécation doit être revenue. Par ailleurs, le geste de microlésion est maitrisé par les expérimentateurs qui ont été formés par l’équipe ayant décrit la méthode des microlésions. Les animaux ne seront jamais isolés directement afin d’éviter tout stress et si un isolement est obligatoire il se fera via un système de plexiglass assurant un maintien olfactif et visuel. En plus des observations faites par les responsables de protocoles et le personnel technique, une observation quotidienne des animaux par les responsables bien être sera réalisée. Les expérimentateurs surveilleront le moindre signe de souffrance de l'animal selon un système de score, ce qui permettra une réponse adaptée à la douleur en question.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire impose que cette étude ne se fasse que dans un système proche de celui de l’Homme. La souris, apparaît comme un modèle d’expérimentation animale de choix. De plus la physiologie de la jonction anorectale est identique à celle de l’Homme et correspond à une région à fort potentiel de transformation. Enfin, les outils d’analyse indispensables à ce projet de recherche, sont développés chez cette espèce animale. Pour les souris dont le phénotype est potentiellement dommageable, les premiers signes cliniques sont observés après l’âge de 6-7 mois de vie. Dans ce contexte, y compris pour les accouplements, aucun animal au-delà de 6-7 mois de vie ne sera utilisé. La maturité du système immunitaire au niveau de l’intestin est établie après 2 mois. Tous les animaux utilisés en procédure auront entre 2 et 6 mois de vie.
Psoriasis et dysbiose vaginale, sont ils des déclencheurs des spondyloarthrites ?
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la majorité tuée à l'issue et 560 mâles susceptibles d'être réutilisés dans d'autres projets. Porteuses d'un déficit immunitaire, elles reçoivent des injections destinées à déclencher une arthrite qui se traduit par un gonflement des articulations, une baisse d'activité et une perte de poids pouvant être importante. Le porteur décrit aussi l'induction d'une inflammation cutanée de type psoriasis et d'une infection vaginale, croisées pour tester l'apparition de spondyloarthrites. Les femelles sont mises à mort pour examen des tissus articulaires, tandis que les mâles en excès sont tués au sevrage ou orientés vers d'autres protocoles.
Objectifs
Les spondyloarthrites sont des rhumatismes inflammatoires fréquents (0,3% de la population française) touchant les articulations, les tendons mais aussi d’autres organes (inflammation des yeux, de la peau et du tube digestif). Les spondyloarthrites entrainent une altération de la qualité de vie. Les raisons du déclenchement de cette maladie sont à ce jour mal comprises. Il y a parfois l’association d’une susceptibilité génétique et d’un environnement déclencheur comme une infection, parfois l'influence de la flore intestinale est suspectée, parfois la présence de lésions de psoriasis sur la peau, mais la relation de cause à effet reste non prouvée. 2% de la population française est touchée par le psoriasis, maladie inflammatoire chronique de la peau. 30% de ces patients développeront au cours de leur vie un rhumatisme psoriasique, en moyenne 10 ans après le début du psoriasis. Comparativement au psoriasis isolé, le rhumatisme psoriasique, comme toutes les autres spondyloarthrites, entraîne un surcoût important pour le système de santé, notamment du fait des traitements biologiques utilisés au long cours pour contrôler cette maladie. Notre premier objectif est d’étudier sur modèle animal la transition entre psoriasis local et le rhumatisme psoriasique. La dysbiose vaginale, est une perturbation de l'équilibre de la flore vaginale. C’est la maladie génitale la plus fréquente au monde chez les femmes en âge d'être sexuellement actives, avec une fréquence de 23 à 29 %. Elle est associée à une susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles et à un risque accru de maladie inflammatoire. Nous suspectons une plus grande susceptibilité aux spondyloarthrites chez les femmes atteintes de dysbiose vaginale. Notre second objectif est d’établir une relation causale entre une dysbiose vaginale et la survenue d’une spondyloarthrites, dans notre modèle de souris. Le troisième objectif est d’élever les souris avec un déficit immunitaire les rendant susceptibles aux spondyloarthrites afin de pouvoir mener ces études.
Bénéfices attendus
Entre les premières lésions de psoriasis et le déclenchement du rhumatisme psoriasique, il y a l’opportunité de traiter par des médicaments afin d’éviter la survenue de ce dernier. Notre recherche, une fois le modèle de cette transition établie permettra d’identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition, voire de tester des médicaments. De même, si nous arrivons à démontrer le lien entre dysbiose vaginale et spondyloarthrites, nous pourrons identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition puis tester des médicaments.
Procédures
Les diamètres des chevilles et poignets des souris seront mesurées toutes les semaines, parfois deux fois par semaine. Suivant le protocole pour induire la maladie, elles auront une injection intrapéritonéale d’hormone pour synchroniser leurs chaleurs, et quelques jours plus tard un dépôt intravaginal, pour induire la maladie. Ce sera fait sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes) et couplé à une prise de sang. Elles pourront avoir jusqu’à 5 autres prises de sang. Il y aura aussi jusqu'à sept écouvillonnages vaginaux. Dans l’autre protocole, elles subiront jusqu’à 5 injections sous cutanées (éventuellement répété une fois après plus d’un mois) pour induire la maladie. Elles auront des prises de sang (maximum 6) sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes). Selon l’avancée de nos connaissances, elles pourront avoir des injections de traitements en intrapéritonéal, dont les fréquences pourront varier de 1 par jour pendant 4 semaines à 1 par semaine pendant 20 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des contentions pour les peser et mesurer le diamètre de leurs poignets et de leurs chevilles, une à deux fois par semaine. Le stress de ces mesures disparait après 2 à quatre mesures. Ils subiront des courtes anesthésies (3-15 min) pour l’injection qui déclenche la maladie et les prises de sang. Ils pourront aussi subir des injections (ip) jusqu’à une par jour, pour favoriser le déclenchement (synchronisation du cycle oestrale), induire un traitement, une atténuation des symptômes, ou de façon inattendue une exacerbation de ceux-ci. Il y aura une irritation et une inflammation locale après induction du psoriasis. Cette irritation sera inférieure à celle qui déclenche une réaction de grattage nuisible. L’infection vaginale déclenchera une inflammation de l’utérus (décrite en post mortem dans la littérature sans qu’il soit fait mention d’altération de l’état général). L’arthrite que nous cherchons à induire se traduit par un gonflement des articulations (chevilles et poignets), une baisse de l’activité (détectable par actimétrie continue sur une journée, il ne s’agit pas d’une prostration), une rougeur transitoire des oreilles, une possible conjonctivite. La perte de poids peut être importante quand la maladie est installée.
Devenir
Les femelles de la procédure d’élevage sont gardés en vie soit comme reproducteurs soit pour servir dans les expériences. A la fin des expériences, nous avons besoin de faire des examens sur les tissus articulaires des animaux donc ils sont mis à mort, tant pour les malades que pour les contrôles. Il y aura un excès d’animaux mâles (610-50, nos expériences se feront quasi-exclusivement sur des femelles). La majorité sera mise à mort au sevrage, mais la totalité de ces 560 animaux mâles pourront être potentiellement réutilisés dans d'autres projets. Il faudra que les conditions sanitaires de cette réutilisation permettent de les utiliser sans que leur déficit immunitaire les handicape.
Remplacement
Actuellement, il n’existe aucun modèle in vitro capable de mimer les spondylarthrites ou de comprendre son mécanisme, son déclenchement cellulaire ou moléculaire. Le développement de cette maladie complexe et donc son étude nécessitent l’intervention d’un système immunitaire complet en plus d'un tissus cartilagineux, voire d'une articulation, et des autres organes dont nous voulons démontrer l’implication (peau ou utérus). Nous faisons des expériences en complément de celles décrites ici ; in vivo : mesures d’activités enzymatiques, calibrage des inoculum bactériens ; ex vivo : mise en culture des cellules immunitaires, cytométrie sur les cellules immunitaires, analyses sanguines, histologie, PCR…
Réduction
Les effectifs des expériences ont été calculés afin de réduire le nombre d’animaux. Dans les expériences longues durée, nous tenons compte du taux de réussite habituel d’induction de la maladie, et de la variabilité de la grosseur des articulations. Nous synchronisons les chaleurs des femelles par une injection d’hormone afin d’augmenter les chances d’induction de la maladie. D’autres expériences seront faites sur des temps plus court pour explorer les mécanismes mis en jeu, elles se feront sur des effectifs très réduits car nous voulons alors détecter des effets tout ou rien et non des variations sur le diamètre des articulations Enfin, nous mettrons en commun les animaux contrôles sur la première expérience entre les procédures 1 et 2 et nous répéterons cela chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires très strictes (air filtré, nourriture et eau stériles) qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. L'enrichissement sera conforme aux préconisations de la structure de bien-être animal de l’établissement. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation qui est contraignante pour elles en termes de durée de contention et afin de réduire cette durée de contention. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale. Un analgésique sera administré après. Les anesthésies générales seront de courte durée (3 à 15 minutes) afin que la perturbation du rythme de vie soit de moins de 24h (l’équivalent d’un examen sous anesthésie générale en ambulatoire chez l’homme). Nous avons une grille d’évaluation des souffrances subies par les animaux. Les critères intermédiaires entrainent des mesures d’aide : ainsi en cas de perte de poids de 10%, pour un individu ou pour tout le groupe si plus de 4 en sont à ce stade, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles. Les critères terminaux de cette grille correspondent à une mise à mort pour éviter des souffrances inutiles et ces critères sont atteints avant que la détérioration de l’état général ou la perte de poids n’atteignent un stade sévère.
Choix des espèces
Nous élevons une lignée de souris avec un déficit immunitaire qui les rend susceptibles à des maladies auto-immunes. Ces souris sont un bon modèle de spondylarthrite car elles vérifient assez bien ou très bien les trois critères d’un modèle animal de maladie humaine : - Elles développent des symptômes qui sont très proches de la maladie humaine. - La mutation génétique à l’origine de leur auto-immunité n’est pas décrite chez l’homme (donc ce modèle n’est pas parfait), mais la perturbation des cellules immunitaires qui en découle est retrouvée dans la maladie humaine. - Une des biothérapies efficaces en clinique est aussi efficace sur les spondyloarthrites classiques induites chez ces souris. Nous avons donc un grand espoir que pour les variantes de spondyloarthrites que nous voulons induire chez ces souris, leurs réponses aux médicaments seront prédictives de ce qui sera efficace dans l’espèce humaine. L’âge des souris au début des expériences est compris entre 5 et 10 semaines pour 1) avoir des animaux adultes ; et 2) ne pas avoir des animaux vieillissant en fin d’expérience. Pour l’élevage nous aurons des animaux de leur naissance à la réforme (à 6-8 mois).
Rôle de la toxicité cellulaire dans le remodelage cardiaque après l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
9 830 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit un infarctus du myocarde provoqué chirurgicalement, suivi d'échocardiographies sous anesthésie, de prélèvements sanguins par voie sous-mandibulaire sur animal vigile et d'injections répétées, dont certaines par voie rétro-orbitaire. Le porteur affirme que ces modèles murins sont une étape "indispensable" et un préalable absolu à la validation de stratégies thérapeutiques, les modèles in vitro ne pouvant selon lui recréer l'ensemble des interactions cellulaires. Les souris sont mises à mort pour analyses histologiques du cœur.
Objectifs
L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde est en augmentation constante, et la mortalité à court et moyen terme reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le rôle délétère de certaines cellules de l’immunité, après un infarctus du myocarde chez la souris. Nous utiliserons des modèles de déplétion cellulaires pour étudier la contribution de ces populations. L’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées nous permettra d’analyser spécifiquement le rôle de ces cellules et de certaines protéines associées. Ces animaux subiront un infarctus du myocarde induit chirurgicalement accompagné d'injection d'anticorps, de cellules ou de molécules pharmacologiques. Nous analyserons la fonction cardiaque des souris par échocardiographie et étudierons également le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus. Ce projet est constitué de 4 procédures impliquant au total 9830 souris sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre, à court terme, une meilleure compréhension des mécanismes du remodelage cardiaque après infarctus. En particulier, l’identification des mécanismes moléculaires activés au sein de ces cellules est essentielle pour le développement à plus long terme de stratégies thérapeutiques innovantes visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, limiter le développement de l’insuffisance cardiaque et réduire la mortalité post-infarctus.
Procédures
Ce projet comporte une partie d'élevage de souris déficientes pour certains gènes d'intérêt. Lors du sevrage, ces animaux subiront une biopsie de queue ou d'oreille pour génotypage. Une partie des animaux va subir une procédure chirurgicale de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé. Quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intrapéritonéale d'une durée maximale de 30 seconde ainsi qu'un prélèvement sanguin hebdomadaire par voie sub-mandibulaire en étant vigile, d'une durée maximale d'une minute (4 prélèvements maximum); une autre partie des animaux va subir des injections intrapéritonéales pour traitement d'une durée maximale de 30 secondes (au maximum une par jour pendant 7 jours soit 7 injections au total) ; une dernière partie des animaux va subir une injection intraveineuse par voie rétro-orbitaire, d'une durée maximale de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures). Bien que l'infarctus induise une perte de fonction cardiaque, il n’altère cependant pas la mobilité des souris dans leur cage ni leur comportement.
Devenir
Les animaux issus de la procédure 1 seront utilisés pour constituer les groupes expérimentaux des autres procédure ou au sein de la procédure 1 pour contribuer au maintien de l'élevage des lignées de souris s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux en fin de procédure 2, 3, et 4 seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Nous avons évalué nos hypothèses in vitro avant de les étudier dans nos modèles murins. Ces derniers sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal. En ce qui concerne l'élevage, nous aurons une stratégie de croisement des animaux permettant d'optimiser la génération des animaux en fonction des groupes nécessaires pour les expériences et pour la gestion des lignées, à l'aide des tableaux de croisement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées, et par, l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des protéines que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles souris, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes non sénescentes, âgées de 10 semaines minium et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie est fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.
Impact de la malnutrition maternelle sur le risque d’infection par le streptocoque du groupe B chez le nouveau-né, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes soumises à des régimes de dénutrition ou de suralimentation subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires, et leurs souriceaux sont infectés par gavage avec le streptocoque du groupe B avant d'être eux aussi prélevés. Le porteur indique que la dose bactérienne rapportée dans la littérature n'a pas d'incidence grave chez les nouveau-nés, et que le gavage comporte un risque de fausse route ou de perforation de l'œsophage. Femelles et petits sont mis à mort pour collecter leurs organes.
Objectifs
Le Streptocoque du groupe B (SGB) est une bactérie appartenant à la flore vaginale et digestive, présente chez 15 % des individus. Cette bactérie est inoffensive pour l’adulte en bonne santé, mais elle est la première cause d’infection bactérienne néonatale dans les pays industrialisés. La première étape dans l’infection par cette bactérie est le franchissement des muqueuses et notamment de la muqueuse digestive pour atteindre la circulation sanguine. Les infections néonatales avec cette bactérie sont rares (300 cas par an en France), mais sont associées à un taux de mortalité important et à des séquelles significatives, notamment sur le plan neurologique. Les facteurs de risque d’infection par cette bactérie sont peu connus. Ce projet vise à étudier l’impact de la malnutrition maternelle sur le risque de développer des infections d’origine digestive chez le nouveau-né. Plus particulièrement nous étudierons l’impact de la malnutrition maternelle (à la fois sur- et sous-nutrition) sur le risque d’infection par la bactérie. La complexité de la barrière intestinale est difficilement simulable in vitro. De même les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions hôte/pathogène à différents stades de développement (nouveau-né/jeune vs adulte). Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra d’étudier les mécanismes permettant à la bactérie de franchir la barrière intestinale chez le nouveau-né. La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale par le SGB. Par ailleurs, nous utiliserons des modèles de malnutrition maternelle validés. Le projet utilisera des souris adultes (femelles gestantes), ainsi que des nouveaux-nés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des facteurs de risque des infections néonatales par une bactérie Streptocoque de groupe B et permettra de sensibiliser aux risques de la malnutrition sur la santé, en particulier pendant la période périnatale.
Procédures
Un prélèvement de sang sera réalisé sur les femelles en gestation, chaque semaine soit 3 fois. Ce geste durera 20 secondes max. Les souriceaux seront gavés 2 fois au total : le 1er gavage durera 10 secondes puis le 2è gavage 6h après prendra également 10 secondes. Ces souriceaux auront 2 prélèvements de sang et ce geste durera 20 secondes max.
Impact sur les animaux
Les régimes alimentaires utilisés dans ce projet sont maitrisés par la communauté scientifique et ont déjà fait l’objet de publications. Cependant, un suivi des femelles gestantes mises sous ces régimes sera réalisé par des personnes qualifiées et expérimentées, tout au long de la gestation (pesée, observation) afin de contrôler les effets pouvant être liés à la malnutrition (stress, agressivité des animaux). Par ailleurs, les expériences d’infection chez le nouveau-né seront très courtes, 24h maximum. La dose de bactéries utilisée pour l’infection est rapportée dans la littérature comme n’ayant pas d’incidence grave chez les nouveaux-nés de souris Balbc. Une attention particulière sera portée sur nos animaux tout au long de l’expérimentation. Les gavages (bactéries ou marqueur fluorescent) seront réalisés par une personne expérimentée en vue de réduire et/ou identifier un risque de fausse route, de perforation de l’œsophage ou un léger stress.
Devenir
A l’issue des premières expérimentations, les souris femelles ayant eue une gestation et sous traitement seront mises à mort pour collecter différents organes et effectuer des analyses ex vivo. Les souriceaux intégreront la suite des expérimentations et seront mis à mort à l’issue de celles-ci pour collecte des tissus (intestins, foie, rate, …) et effectuer des études bactériennes, protéiques et sur l’ADN.
Remplacement
Les modèles in vitro ne peuvent restituer ni la complexité des barrières physiologiques, ni l’intégralité du processus infectieux allant de la colonisation digestive jusqu’à la méningite, ni les interactions bactéries-hôte mises en jeu lors de l’infection. Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra de déterminer l’impact de l’infection bactérienne sur la perméabilité intestinale et différentes cellules du tissu intestinal, comme le système nerveux entérique. La souris, et en particulier la lignée Balbc, est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections avec notre bactérie d’intérêt et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable. Nous prévoyons d'utiliser les mêmes souris mâles pour chacun des cycles de reproduction. Nous estimons à 5 petits par portée. Nous avons prévu 15 animaux/groupe pour la procédure d’infection bactérienne et ce nombre a été déterminé par rapport à notre expérience dans le domaine de l’expérimentation animale (gestation, nombre d’animaux par portée et nombre d’animaux minimum pour effectuer nos expériences).
Raffinement
Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Un enrichissement sera apporté par l’ajout de frisottis. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude. La prise de poids sera suivie tout au long de l’étude (3 fois/semaine). Des points limites seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront mis à mort par une personne compétente.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections avec notre bactérie d’intérêt et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale. Nous utiliserons des souris femelles de 7-10 semaines au moment de l’accouplement et des mâles de 7-10 semaines également. Les souriceaux issus de ces accouplements seront infectés par voie orale par la bactérie à l’âge de 2 semaines. Ceci est un modèle d’infection néonatale, comme ce qui est rencontré chez l’Homme
Élevage et maintien de modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington à phénotype dommageable (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées pour reproduire la maladie de Huntington, elles portent une mutation qui provoque en vieillissant des symptômes neurologiques et moteurs que le porteur décrit comme visibles uniquement lors de tests comportementaux dédiés, sans les détailler. Maintenues sous forme hétérozygote, elles sont mises à mort à la fin de leur vie reproductive, vers huit mois, et leur cerveau est prélevé. Le porteur indique qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité d'un organisme vivant et revendique la nécessité de générer ces animaux pour plusieurs projets.
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage et de maintien dans 2 établissements utilisateur de differents modèles de souris génétiquement altérés avec des mutations qui entrainent l'apparition de la maladie de Huntington comme dommage. Le but de ce projet est donc de générer les animaux nécessaires pour étudier cette maladie. L'utilisation de ces animaux est essentielle pour mener à bien plusieurs projets de recherche, qui vont nous permettre de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'élevage et le maintien de ces lignées de souris ont pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à plusieurs projets de recherche tout en surveillant l'apparition de phénotypes dommageables et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets visant à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes.
Procédures
Les animaux de ce projet seront mis en reproduction et/ou maintenus en vie jusqu'à la fin de leur vie reproductive. Ces animaux vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisé par de symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive.
Impact sur les animaux
Les animaux de ce projet ont un phénotype qui peut devenir dommageable avec l’âge. Pour la prise en charge de ce phénotype, les animaux seront toujours maintenus sous forme hétérozygote, qui se caractérise par l’expression de symptômes légers. Les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer des altérations significatives de la qualité de vie des animaux, ni de morts prématurées dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères potentielles: 1) un stress léger pendant leur transport d'un établissement à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements; 3) un stress pour les mâles reproducteurs lors de leur isolement pour les mettre en croisement jusqu'à la fin de leur vie reproductive.
Devenir
Étant donné qu'il s'agit d'élevage d'organismes génétiquement modifiés, l'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur vie reproductive.
Remplacement
Nous avons précédemment démontré que les modèles murins actuelles reproduisent plusieurs des principales caractéristiques pathologiques de la maladie de Huntington in vitro et in vivo, ce qui nous a permis de répondre à des questions majeures sur les mécanismes moléculaires de la maladie et d'aboutir à des innovations thérapeutiques dans les dernières années. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs de nos projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, nous avons développé de nouveaux modèles murins afin de pouvoir étudier le rôle de la protéine responsable de la maladie de Huntington en conditions physiologiques et pathologiques.
Réduction
Nous allons générer 2880 animaux pendant les 5 années du projet pour le maintien de 3 lignées différentes. Le nombre d'animaux a été determiné de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé tout en gardant suffisamment d'individus pour ne pas compromettre la validité des expériences et nous permettre d’obtenir des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des projets de recherche. L'ensemble du schéma d'élevage et de maintien des animaux proposé est en accord avec les recommandations des organismes compétents en matière d'élevage de souris. De plus, nous prélèverons le cerveau de tous les animaux générés à la fin de leur vie reproductive. Ainsi, nous pourrons les utiliser afin de mettre au point de futures expériences sans devoir générer d'autres animaux, dans un principe de réduction du nombre d’animaux utilisés pour nos projets.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement prévu par l'animalerie permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Pour reduire au maximum leur stress lors de la manipulation pendant la mise en place des croisements, un seul manipulateur (zootechnicien ou utilisateur) réalisera ce geste. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de leur poids jusqu'à leur mise à mort. En particulier pour les mâles reproducteurs isolés, nous surveillerons plus attentivement l'apparition de signes de stress (comme l'alopécie) et, si nécessaire, ils seront remplacés avant la fin de leur vie reproductive pour minimiser leur stress. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Les modèles murins permettent de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les mâles et femelles reproducteurs hétérozygotes seront maintenus en vie jusqu’à l'âge de 8 mois, quand leur fertilité diminue de manière considérable. À ce stade, les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de tests comportementaux conçus à cet effet mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive.
Etude du lien entre les cellules immunitaires intestinales et cutanées dans le développement de tumeur.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
516 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une inflammation puis des tumeurs cutanées vers 8 à 10 mois, elles subissent des fibroscopies par voie rectale, une phalangectomie pour le génotypage et des applications répétées d'adhésif sur l'oreille destinées à provoquer une inflammation. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les échanges entre intestin, microbiote, système immunitaire et peau à l'échelle de l'"organisme entier", et conclut que le recours à la souris est "indispensable". Les retombées annoncées, de nouvelles cibles contre les cancers de la peau, restent renvoyées à une étape ultérieure.
Objectifs
Les tumeurs présentent des caractéristiques et capacités particulières qui sont essentielles à leur développement. Parmi celles-ci, on peut retrouver leur capacité à proliférer indéfiniment, leur capacité à muter et à échapper au système immunitaire. De nouvelles études suggèrent que le microbiote, micro-organismes vivants dans notre corps, impacte aussi la croissance tumorale. Dans le cas du mélanome par exemple, un déséquilibre du microbiote intestinal est lié à une meilleure progression de la tumeur, de plus, le remplacement du microbiote « malsain » par un microbiote "sain" chez les patients atteints de mélanome permet d’améliorer l’efficacité des traitements par immunothérapie. De même, les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI telle que la maladie de Crohn), maladie où le microbiote intestinal joue une rôle important, présentent régulièrement des symptômes cutanés tels que des dermatites, de l’acné, une rosacée. Ceci suggère un lien entre microbiote intestinal, efficacité du système immunitaire et développement tumoral cutané ou d’une inflammation cutanée. Le projet proposé ici vise à étudier le lien qui peut exister entre ces trois acteurs. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire afin de pouvoir étudier les interactions, échanges et influences du microbiote et système immunitaire sur le développement tumoral à distance.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment notre système immunitaire agit dans nos intestins et sur notre peau. Le but est de découvrir les mécanismes permettant la mise en place d’une inflammation cutanée qui mène au développement de tumeurs ; ainsi que l’impact du microbiote sur ces mécanismes et réponses. Ceci nous permettra ensuite d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cancers de la peau et de proposer une nouvelle approche pour soulager les problèmes de peau chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI).
Procédures
Une fibroscopie, comparable à une coloscopie chez l’Homme, sera effectuée sur certains animaux afin d’étudier la communication immunitaire entre intestins et peau. Cette fibroscopie ne durera pas plus de 10 min par animal et sera réalisée 1 fois sur les animaux, à l’exception des animaux d’une manipulation où le geste sera répété 3 fois en 20 jours. Avant chaque fibroscopie, une injection d’analgésique sera faite sur les animaux. Celle-ci durera 10 secondes au total par animal. Les animaux seront anesthésiés avant la fibroscopie. Certains animaux seront traités par antibiotiques par voie orale. L'identification et le genotypage des animaux se fera par phalangectomie distale donc en un seul geste avant calcification. Certains animaux auront une application d’adhésif sur l’oreille permettant de mimer l’apparition de lésions cutanées. Cette application sera répétée 3 fois sur une oreille et entrainera une inflammation au site de « l’épilation ».
Impact sur les animaux
Le projet implique l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui développent une inflammation et des tumeurs cutanées. Ces animaux vivent normalement pendant les 6 premiers mois de vie sans aucun symptôme. Ils commencent à développer une inflammation cutanée vers 6 mois de vie et des tumeurs cutanées vers 8/10 mois de vie. Certaines expérimentations impliquent l’insertion d’une fibre optique par voie rectale dans l’animal. Celle-ci ne devrait normalement pas générer de lésions ou de gêne puisque cela s’apparente à l’insertion d’un thermomètre rectal chez l’Homme. Certains animaux auront un endommagement de la barrière cutanée de l’oreille des souris, à l’aide d’un ruban adhésif.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort soit suite à la fin de la procédure afin de prélever les organes, soit lorsqu’un point limite est atteint et qu’aucun geste ne permet un retour à l’état normal et ce afin d’éviter toute souffrance.
Remplacement
L’étude de la migration des cellules immunitaires entre deux organes ne peut se faire, pour le moment, qu’à l’échelle de l’organisme entier. Aucune technologie actuelle n'est capable de mimer les interactions entre le système digestif, le microbiote, le système immunitaire et la peau. Cette étude ne peut se faire qu'à l'échelle d'un organisme entier. De plus, la complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation imposent que cette étude se fasse dans un système intégré, à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation d’animaux est donc indispensable à l’avancée de ce projet.
Réduction
De précédentes études montrent que 100% des animaux développent une inflammation intestinale/colorectale ainsi qu’une transformation tumorale cutanée. L’effet étant indépendant du sexe de l’animal, tous les animaux générés pourront être utilisés. Cela permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, lors de la mise à mort des individus, certains organes pourront être collectés afin de servir à un autre projet développé dans le laboratoire, permettant ainsi de ne pas utiliser d’autres souris pour cet autre projet. Également, les animaux des groupes contrôles seront mutualisés, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés ici. Afin de réduire encore plus le nombre d’animaux, une formation au geste de « fibroscopie » a été réalisée en suivant un protocole établi et utilisé en routine par d’autres manipulateurs. Pour le calcul du nombre de souris utilisables par groupe, nous avons réalisé des simulations statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour la validation des objectifs.
Raffinement
Des éléments d’enrichissement seront systématiquement mis dans les hébergements afin de favoriser le bien-être animal. Les animaux qui seront anesthésiés feront l’objet d’une surveillance accrue post-anesthésie. Pendant la période d’anesthésie, un gel hydratant et protecteur sera appliqué sur leurs yeux afin d’éviter toute déshydratation et donc toute gêne pour l’animal. Un analgésique sera également administré aux animaux en prévention de tout geste. Afin d’augmenter le raffinement, l’application d’une pommade anesthésique et d’un lubrifiant au niveau anal sera faite pour tous les animaux qui auront une endoscopie/fibroscopie afin de faciliter la fibroscopie (amélioration du protocole). En plus de la surveillance mise en place pour assurer le bon réveil des animaux, une surveillance supplémentaire 1 heure après le réveil des animaux sera faite afin de détecter de potentiels saignements chez les animaux ayant subi la fibroscopie. Si des saignements sont détectés et durent plus d’une heure, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation font que l’étude ne peut se faire que dans un système intégré et donc à l’échelle de l’organisme entier. L’étude de la transformation tumorale cutanée, sous l’influence du microbiote intestinal, implique que les expérimentations soient menées à l’échelle physiopathologique sur un modèle animal de choix. La souris (mus musculus) correspond à ces critères. Premièrement, les souris présentent un système immunitaire similaire à celui de l’Homme. De plus, le rôle de la molécule d’intérêt est conservé à plus de 97% entre l’Homme et la souris, ce qui permet de transposer facilement les études réalisées sur la souris chez l’Homme et inversement. Également, le microbiote de cette espèce est particulièrement bien caractérisé et peut-être facilement contrôlé et étudié, ce qui est important pour le projet que l’on souhaite mettre en place. Enfin, l’ensemble des outils nécessaires à l’étude, comme les anticorps, protocoles et kits, sont développés sur le modèle murin depuis plus de 20 ans. La souris est donc le modèle le plus adapté pour l’exécution de ce projet. Le but du projet est de comprendre l’impact de la signalisation de la molécule d’intérêt sur la réponse du système immunitaire au microbiote et le lien avec le développement tumoral cutané. Cette transformation peut commencer vers 6 mois de vie mais est complétement visible à 8-10 mois de vie. De plus, la maturité du système immunitaire intestinal est établie après 2 mois et l’intestin de souris est mature après 45 jours de vie. De ce fait, seules des souris adultes seront utilisées. Elles seront utilisées à 2, 6 et 8/10 mois de vie (la sortie des animaux entre 8 et 10 mois de vie dépendra des signes cliniques observés lors de la surveillance quotidienne dont feront l’objet les souris).
Neuroprotection des photorécepteurs à cone chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des yeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation dégradant les photorécepteurs dès la naissance, elles reçoivent une injection quotidienne pendant trente-deux jours puis un électrorétinogramme sous anesthésie, pour cribler jusqu'à quarante molécules censées protéger la vision. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une inflammation et une douleur, l'animal étant tué s'il souffre. Il précise avoir testé les molécules sur cellules et tissus mais affirme que leur fonctionnalité "ne peut être évaluée que sur un modèle vivant".
Objectifs
La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie chronique de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine et centrale. S’ils dégénèrent, le patient perd l’information visuelle et aperçoit des scotomes (tâche noire) qui comble ce manque d’information. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans le monde. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif, seulement quelques traitements permettant de ralentir la propagation de la forme humide. Pour la forme sèche, qui représente 80pourcents des cas de DMLA, de nouveaux traitements sont actuellement en phase clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou bien des traitements agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ciblent spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs à cônes. Ainsi, le but du projet est de trouver une/des molécule(s) protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence lorsqu’un patient est atteint de DMLA. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissus rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets potentiels neuroprotecteurs des molécules.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou des molécule(s) est, sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de DMLA (dégénérescence maculaire lié à l'âge) dans le monde.
Procédures
Injection intrapéritonéale : Nous allons procéder à des injections intrapéritonéales quotidiennement sur animal vigile, pendant 32 jours. Chaque injection dure moins d’une minute par animal. Anesthésie générale : Au bout du 33ème jours, une anesthésie générale sera effectuée sur chaque animal afin de réaliser l’ERG. L’anesthésie générale sera injectée en intrapéritonéale. Electrorétinogramme (ERG) : Cet examen clinique permet de mesurer l’activité des photorécepteurs suite à un stimulus lumineux. Ainsi, cet examen nous permettra de déterminé si l’animal à une vision restauré ou non selon les molécules injectées. Pour cela, la cornée sera anesthésiée localement et la pupille sera dilatée par médication. Des électrodes seront placées afin d’enregistrer l’activité électrique généré par la rétine suite à un stimulus lumineux. Les deux yeux seront soumis à cette procédure. L’ERG dure environ 40 minutes par animal. Les souris passeront 1 fois par cette étape expérimentale. Les souris seront placées en chambre de réveil chauffée à 32 degrés et seront surveillées jusqu’à leur complet réveil après l’anesthésie. Les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien afin de réaliser le prélèvement des yeux et les analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Une inflammation peut être entraînée par les injections intrapéritonéales au niveau abdominal ainsi qu’un léger stress et une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). Risque faible de mauvaise réaction à l’anesthésie générale lors de l’électrorétinogramme.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés (après euthanasie) pour permettre des analyses histologiques complémentaires. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Remplacement
Les molécules qui seront injectées in vivo ont été préalablement sélectionnées. En effet, celles-ci ont été testées sur deux modèles différents : l’un cellulaire et l’autre tissulaire dont tous deux présentaient une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles nous avons sélectionné des molécules ayant une double action,1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant. Dans le cas présent nous effectuerons les tests sur un modèle murin présentant une dégénérescence similaire à celle de l’Homme.
Réduction
Suite à un calcul de puissance, nous estimons que 10 souris par groupe (1 groupe correspondant à 1 molécule ou 1 véhicule) est suffisant pour réaliser des tests statistiques. Nous prévoyons de tester un maximum de 40 molécules sur les 5 ans. Soit un total de 800 souris. Les lots seront composés de la manière suivante : souris et molécule ou souris et véhicule (témoin). Pour une interprétation fiable des résultats, ces derniers seront soumis à des tests statistiques. De plus, dans un esprit de réduction du nombre d’animaux, nous regrouperons les témoins pour les molécules aillant le même véhicule.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, maison en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale de la cornée. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéale. Nous appliquerons une noisette de pommade anti-inflammatoire et antibactérienne à la fin de l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, maison en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux utilisés dans ce projet naissent dans notre animalerie. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire une douleur chez les animaux. Si cela se produit, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris utilisée dans ce projet est un modèle lié à une mutation spontanée induisant une dégénérescence précoce des photorécepteurs. Ce modèle est très utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de rétinopathie pigmentaire récessive très utilisé par la communauté scientifique. Ces molécules seront injectées sur ces sourisqui , présentent une dégénérescence précoce des photorécepteurs dès leur naissance.. La dystrophie des photorécepteurs à cône débute aux alentours de 14 jours après la naissance (P14) des animaux et se termine à 90 jours après leur naissance. D’après une étude, nous pouvons réduire la fenêtre de dégénérescence de P14 à P45, où moins de 50 pourcents des corps cellulaires et moins de 25 pourcents des segments externes sont encore présent chez les photorécepteurs à cônes. Donc, nous injecterons les animaux entre P14 à P45, soit la période à laquelle les photorécepteurs à cône dégénèrent.