Rongeurs

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de douze heures, une diarrhée est provoquée par gavage d'huile de ricin, puis chaque animal est isolé quatre heures dans une cage à métabolisme pour recueillir ses selles, le porteur reconnaissant un inconfort et un stress liés à l'isolement. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le projet teste deux souches de probiotiques et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut remplacer l'animal, dans la perspective d'un futur essai clinique.

Objectifs

La diarrhée est trouble digestif qui touche près de 4,5 milliards de personnes dans le monde chaque année et qui se manifeste notamment par l’émission de selles généralement liquides ou molles, dans une quantité et à une fréquence plus élevée que la normale. Les épisodes de diarrhées aiguës peuvent être la conséquence d’une infection bactérienne, virale ou parasitaire, ou survenir suite à une intolérance alimentaire ou médicamenteuse, notamment suite à la prise d’antibiotiques. Ces épisodes peuvent s’accompagner de déshydratation, de douleur abdominale, de fièvre ... Des médicaments peuvent faire cesser la diarrhée en ralentissant les mouvements intestinaux mais peuvent entrainer par la suite une constipation. D’autres diminuent la secrétion d’eau dans les intestins. Au besoin, des antibiotiques peuvent venir à bout d’une diarhhée causée par une bactérie ou un parasite. Les probiotiques sont des bactéries ou des levures qui modulent la prolifération bactérienne de l’intestin. Ils sont largement utilisés comme compléments alimentaires et comme médicaments dans le traitement et la prévention des diarrhées. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer les effets sur la diarrhée et sur la douleur induite de 2 nouvelles souches de probiotiques chez des rats soumis à l’induction d’une diarrhée. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un médicament de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et les intestins seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets de 2 nouvelles souches de probiotiques chez le rat soumis à l’induction d’une diarrhée expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un médicament de référence utilisé pour le traitement de la diarrhée aigüe. Les données des différents paramètres observés au cours de la mise en cage spéciale, temps de latence d’émission des premières selles, nombre et consistance des selles émises, ainsi que les données comportementales concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur les intestins et le colon prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ces 2 nouvelles souches de probiotiques sur leur activité anti-diarrhéique et sur les effets sur la douleur perçue chez le rat. Cela permettra d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec l’une ou l’autre de ces 2 nouvelles souches de probiotiques, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de diarrhée aigüe.

Procédures

Les rats seront placés à jeun pendant 12 heures avant la réalisation des essais. Après cette mise à jeun, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué, geste effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Une heure après le traitement, la diarrhée sera induite par administration par voie orale d’un composé induisant une diarrhée expérimentale (huile de ricin), geste également effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Après induction de la diarrhée, les rats seront placés individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 4 heures afin de recueillir les selles émises par chacun d’entre eux et d’observer leur comportement, permettant ainsi d’évaluer l’effet des composés administrés.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des animaux la veille au soir de la réalisation des traitements et de l’induction de la diarrhée, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques, va induire une légère perte de poids des animaux. Cette perte de poids sera en effet peu importante car les animaux étant placés en cycle de lumière inversé, la période de jeûne correspondra à la phase lumineuse du cycle au cours de laquelle les animaux sont peu actifs voire inactifs, avec une prise alimentaire très limitée voire nulle. L’induction de la diarrhée va quant à elle induire un inconfort des animaux, se traduisant par l’émission plus ou moins rapide et importante de selles au cours des 4 heures de mise en cage spéciale, et par des modifications du comportement des animaux se traduisant par une baisse de l’activité, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée, et des yeux moins ouverts. Le traitement avec les 2 souches de probiotiques devraient limiter cet inconfort. La mise en cage spéciale, nécessaire pour recueillir individuellement les selles de chaque rat et observer individuellement le comportement de chaque rat pendant 4 heures suivant l’induction de la diarrhée, va induire un stress modéré par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 32 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des intestins pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets anti-diarrhéiques et comportementaux de composés. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de diarrhée, dont certains ont été publiés. Une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée à l’issue des expérimentations.

Raffinement

Au cours de la semaine d'acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux seront placés à 2 par cage avec de l'enrichissement pour assurer leur bien-être, et avec accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après la réalisation des traitements, l’induction de la diarrhée et la mise en cage spéciale, les animaux étant observés en continu pendant les 4 heures de mise en cage spéciale. L’expérimentation étant de très courte durée, sur 5 heures le jour des essais, les seuls points limites identifiés seraient des convulsions, tremblements ou paralysie des animaux suite à l’administration orale des produits à tester. Cela ne serait pas le cas après administration orale du médicament de référence et du composé induisant la diarrhée car nous avons une très bonne expérience de ce modèle et nous n’avons jamais observé de trouble des animaux traités avec ces composés. Ce modèle étant validé et ayant été utilisé de nombreuses fois en plaçant les animaux individuellement en cage spéciale pour une durée de 4 heures sans habituation à ces dispositifs, aucune habituation des animaux aux cages spéciale n’est envisagée. Les rats seront placés dans une salle d’expérimentation attenante à leur pièce d’hébergement, placée en lumière blanche attenuée pour ne pas les perturber et maintenir des conditions proches de celles de leur hébergement.

Choix des espèces

Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée et majoritairement utilisée pour la mise en évidence des effets anti-diarrhéiques de candidats médicaments et de compléments alimentaires. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de diarrhée.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, la trachée est disséquée puis suturée pour y injecter une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, avant des prélèvements sanguins et des injections de cellules et de molécules thérapeutiques, le porteur reconnaissant des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort. Des cultures de cellules humaines sont utilisées en parallèle, mais le porteur conclut qu'aucune alternative ne modélise l'"organe entier" et qualifie la souris d'animal "incontournable".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique, évolutive et mortelle caractérisée par le remplacement du tissu pulmonaire normal par un tissu cicatriciel (fibrose) ne permettant plus les échanges gazeux au niveau des alvéoles pulmonaires. Les patients atteints souffrent d’une dyspnée (difficulté à respirer) qui peut s’aggraver dramatiquement au décours d’une maladie infectieuse respiratoire (exacerbation). Il n’existe actuellement aucun traitement pour stopper la progression de la maladie. Les mécanismes aboutissant à la FPI ne sont que partiellement connus. La FPI résulte d’un processus de cicatrisation excessive des alvéoles pulmonaires en réponse à des agressions répétées (tabac, infections virales, pollution…), et sa progression est probablement favorisée par un dérèglement des cellules immunitaires présentes dans les poumons (inflammation). Parmi ces cellules immunitaires, nous nous intéressons à une population de cellules X qui participent en temps normal à la lutte contre les infections bactériennes et virales. Cependant, ces cellules X constituent une arme à double tranchant car elles sont également capables d’amplifier l’inflammation et la fibrose. Nos résultats préliminaires chez l’homme et chez la souris montrent qu’il existe un lien entre ces cellules X et la progression ou la sévérité de la fibrose pulmonaire. En outre, des publications récentes ont montré leur rôle délétère dans la fibrose du foie. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser le comportement des cellules X dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence des cellules X sur la progression de la fibrose, et 3) d’étudier le potentiel thérapeutique de trois molécules capables de bloquer ou activer les fonctions des cellules X. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider les cellules X comme nouvelle piste thérapeutique dans la FPI.

Bénéfices attendus

La FPI est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions fonctionnelles multi-directionnelles entre tissu pulmonaire et cellules immunitaires. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle d’un type de cellules immunitaires dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes) sur animaux vigiles. Entre J9 et J20, les souris recevront deux doses d’une molécule thérapeutique dont on veut évaluer l'action sur la fibrose pulmonaire. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’oesophage au lieu de la trachée. Avant l’administration de la molécule thérapeutique, les souris recevront à l’état vigile une injection de cellules X par voie intraveineuse (veine caudale, durée 30 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids (entre le 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection). Une mise à mort est prévue en cas d'atteinte des points limites inférieur à 10% des effectifs selon notre expérience).

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Afin de limiter l’utilisation de modèles animaux, des méthodes alternatives sont déjà utilisées dans notre projet, comme des cultures ex-vivo de cellules pulmonaires humaines et une lignée de cellules X humaines. Cependant, ces méthodes alternatives ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ces modèles n’intègrent pas 1- la complexité de la physiopathologie de la fibrose pulmonaire, 2- le système immunitaire dans sa globalité et 3- ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement cellulaire vers d’autres tissus/organes via la circulation sanguine. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes immunitaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules immunitaires issues.

Réduction

D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal tout en respectant l’hypothèse scientifique. Le nombre d’animaux, calculé par un test statistique, est de 24 en moyenne par groupe. Ce chiffre tient également compte du risque d'atteindre les points limites définis selon notre grille de score amenant à la sortie précoce des animaux du protocole (habituellement entre 0% et 10% des effectifs entre les jours 7 et 14 après traitement). D’autre part, dans le but de réduire le nombre d’animaux élevés, nous prévoyons d’utiliser non seulement les souris transgéniques portant le gène d’intérêt (enrichies en cellules X), mais également les souris issues des mêmes portées mais ne portant pas le gène d’intérêt (ces dernières seront incluses dans des groupes contrôles). De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules d’intérêt ex vivo

Raffinement

Les contraintes induites par les conditions expérimentales seront réduites par plusieurs approches. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment du sacrifice. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur afin de détecter précocément et réduire toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux . Cette surveillanve clinique évalue l’apparence de l’animal, son comportement, la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. Afin de prévenir une douleur légère, détectée par l’un de ces critères (moindre déplacement ou mauvaise posture ou toilettage excessif ou état défensif ou plissement des yeux) un analgésique sera administré aux animaux. Les souris seront mises à mort dès la détection de points limites.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle animal murin dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et ainsi de cibler le rôle d’un type de cellules immunitaires en particulier dans le poumon. Les cellules X sont très conservées entre espèces et présentent de nombreux points communs chez l’homme et la souris, permettant la mise en place de modèles pré-cliniques bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

20 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ovariectomie, l'implantation d'une capsule hormonale et des injections destinées à induire une endométriose, avec des douleurs post-chirurgicales et abdominales attendues. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Ce projet pilote vise seulement à mettre au point le modèle, le porteur affirmant qu'aucune méthode in vitro ou ex vivo n'existe et envisageant, en cas de succès, de tester ensuite une molécule sans refaire "toutes les étapes de toxicité".

Objectifs

L'endométriose est une affection gynécologique peristante qui se caractérise par la présence anormale de glandes endométriales et de tissu conjonctif en dehors de l'utérus. Ces lésions sont accompagnées d'une inflammation chronique. L'endométriose touche principalement les jeunes filles et les femmes en âge de procréer. Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Récemment, le rôle dans l’endométriose d’une protéine impliquée dans le développement du système nerveux central a été suggéré. Ce projet pilote qui utilisera au maximum 20 animaux a pour objectif de mettre en place un modèle murin d’endométriose afin d'étudier dans un prochain projet le rôle de cette protéine dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Il existe actuellement peu de solution thérapeutique pour les patientes souffrant de formes sévères de l’endométriose. En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Cette demande d’expérimentation a pour objectif la maitrise d’un modèle murin d’endométriose permettant de tester des nouvelles thérapies. Ainsi, nous devrions à terme être capables de tester un candidat médicament ciblant une protéine impliquée dans l’endométriose. A terme, nous proposerons un projet visant à tester l’effet d’une molécule thérapeutique ayant déjà montré un rôle prometteur dans une pathologie gynécologique : le cancer de l’endomètre. Il est important de noter que beaucoup de mécanismes cellulaires décrits dans l’endométriose rappellent ceux observés dans le cancer (multiplication cellulaire, migration à distance). Par conséquent, si nous montrons un effet de cette molécule dans un modèle murin d’endométriose, nous pourrons rapidement prévoir de faire des tests cliniques chez l’homme sans avoir à réaliser toutes les étapes de toxicités.

Procédures

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Ils subiront une ovariectomie qui visera à retirer les ovaires pour éviter la production d’hormones sexuelles. Les animaux seront également implantés avec une capsule délivrant des hormones. Enfin, les animaux recevront des injections sous-cutanées et une injection intrapéritonéale lors de l’induction de l’endométriose

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les douleurs post-chirurgicales. En effet, chaque animal subira l’ovariectomie. Ensuite, les animaux qui développeront l’endométriose pourraient être soumis à des douleurs abdominales liées à la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose.

Remplacement

L’endométriose est une maladie multifactorielle qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence d’un tissu anormalement localisé. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie chez l’animal en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou ex vivo.

Réduction

Afin de réaliser ce projet de mise au point de ce modèle murin d’endométriose, nous avons décidé de réaliser 5 expériences avec 4 souris par expérience. La taille de l’échantillon testé ne repose sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la difficulté expérimentale. C'est une procédure pilote. Dans le cas où nous maitrisons le geste au bout de 3 essais, nous ne réaliserons pas les essais supplémentaires.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, nous réaliserons l’intégralité des opérations chirurgicales sous anesthésie avec injection pré et post opératoire d’anti-douleur. Nous réaliserons les interventions de chirurgie dans des conditions d’antisepsie (application d’un produit antiseptique sur la région incisée. Avant de commencer la réalisation des chirurgies, il est important de noter que nous nous entrainerons pour la réalisation de ces gestes chirugicaux sur des cadavres (animaux mise à mort surnuméraires ou avec un mauvais génotype).

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement, c’est un organisme modèle en biologie. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de ceux observés chez les patientes touchées par l’endométriose. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 reproduisant une épilepsie infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt molécules candidates par gavage, injection ou alimentation, certaines étant implantées d'une puce sous anesthésie, et le porteur indique que des crises spontanées peuvent provoquer leur mort. Le système nerveux central est prélevé en fin de procédure. Le porteur revendique un modèle "premier et seul" disponible pour tester des traitements sur "organisme entier", les bénéfices pour les enfants restant renvoyés à une éventuelle demande d'essai clinique.

Objectifs

Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.

Procédures

Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Les animaux qui passent dans le test LMT seront anesthésiés et implantés avec une puce RFID. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.

Impact sur les animaux

Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des animaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.

Devenir

Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 (5 souris maximum), avec 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant l'implantation des puces RFID. Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.

114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent un anticorps et une sonde radioactive par voie intraveineuse, suivis de séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste une radiothérapie interne visant à irradier sélectivement la tumeur. Le porteur fixe des points limites, une perte de poids de plus de 20 % ou une tumeur de plus de 1 500 mm3 déclenchant la mise à mort.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer une approche thérapeutique du cancer colorectal. Cette approche repose sur le principe de la radiothérapie interne, visant à sélectivement irradier les tumeurs afin de les détruire. Une stratégie consiste à injecter au patient un anticorps ciblant la tumeur, et sur lequel a été greffé un atome radioactif dont l’énergie du rayonnement est suffisante pour causer des dommages importants aux cellules cancéreuses. Cependant, cette stratégie peut engendrer une toxicité au niveau d’autres tissus de l’organisme, car les anticorps restent longtemps dans la circulation sanguine. Aussi, l’approche thérapeutique que nous souhaitons évaluer ici consiste à séparer l’injection de l’anticorps (ciblage de la tumeur) de celle de la radioactivité (action thérapeutique). Dans ce contexte, l’anticorps est dans un premier temps administré et va se fixer au niveau de la tumeur (préciblage de la tumeur). Dans un second temps, une sonde radioactive est administrée et va spécifiquement reconnaître l’anticorps fixé sur la tumeur et ainsi, délivrer son énergie à cette dernière (action radiothérapeutique). Cela permet d’irradier sélectivement les tumeurs tout en limitant la toxicité périphérique. Malgré les excellents résultats observés au niveau préclinique, il n’existe à ce jour aucun essai clinique de cette approche en raison d’une ingénierie difficile. Pour remédier à ces verrous scientifiques, nous proposons d’évaluer de nouveaux outils (optimisation des temps entre l’injection de l’anticorps et l’injection de la radioactivité et amélioration de la reconnaissance entre l’anticorps et la sonde radioactive grâce à la synthèse de nouvelles molécules) dans un modèle préclinique de cancer colorectal.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra d’évaluer l’intérêt de l’optimisation d’une approche par radiothérapie interne dans la prise en charge des cancers colorectaux avec pour objectif à plus long terme d’améliorer la prise en charge clinique de cette pathologie, en augmentant l’eefficacité de la radiothérapie. Par ailleurs, cette approche sera extrapolable à d’autres type de cancer.

Procédures

Les animaux subiront deux types d'intervention: - inoculation de cellules tumorales par voie sous-cutanée, sous anesthésie générale. Chaque souris ne subira cette intervention qu'une fois. La croissance tumorale sera alors suivie, avec une mesure du volume tumoral 2 fois par semaines pendant 3 semaines, toujours sous anesthésie générale afin de réduire l'angoisse de la manipulation. - injection intraveineuse sur animal vigile placé dans un système de contention: au maximum, une souris subira cette intervention 2 fois, 1 fois pour l'injection de l'anticorps, 1 seconde pour l'injection de la sonde radioactive. Ces 2 injections seront espacées d'au moins 24 heures. Ces injections seront réalisées par du personnel compétent et ne dureront que quelques minutes. Suite à l'injection de molécules radioactives, les animaux seront placés sous anesthésie générale pour l'évaluation de la distribution de ces molécules par imagerie. L'acquisition des images sous anesthésie durera au maximum 45 minutes et sera répétée au maximum 3 fois, à 24 heures d'intervalle, pour l'évaluation de la pharmacocinétique des anticorps.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles sont le stress dû aux manipulations et la douleur engendrée par les procédures, principalement les injections (réduites à quelques dizaines de secondes car réalisées par un expérimentateur expert). Aucune nuisance liée à l’imagerie in vivo ou aux anesthésies n’est attendue. Pour les animaux porteurs de tumeur, les nuisances peuvent être relatives à une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur ou encore une nécrose précoce de la tumeur. Dans tous les cas, un suivi régulier des animaux permettra de réagir rapidement en cas d’apparition d’une souffrance pour l’animal. L’arbre décisionnel viendra orienter les actions à mener jusqu’à l’atteinte de points limites. Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne).

Devenir

Tous les animaux seront porteurs de tumeurs sous-cutanées et ne pourront être réutilisés. Aussi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure

Remplacement

Plusieurs sondes radioactives seront évaluées au cours de ce projet. Ces sondes ont été testées dans un premier temps in vitro afin de sélectionner les plus adaptées. La culture cellulaire ne permet pas de mimer la distribution et le métabolisme des molécules étudiées. A ce stade, le passage sur un modèle préclinique est donc inévitable pour juger de façon optimale l’effet des molécules étudiées.

Réduction

Les molécules évaluées ont dans un premier temps été caractérisées et sélectionnées par des méthodes in vitro afin de réduire le nombre de groupe d’animaux requis pour le projet. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en étant certain d’obtenir le matériel tumoral suffisant pour réaliser des études de caractérisation du modèle et atteindre une validité statistique. Sur ce plan, nous utiliserons des groupes de 6 souris.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). Lors des procédures expérimentales (inoculation des cellules et imagerie), les souris seront placées sous anesthésie générale gazeuse afin d’éliminer toute douleur potentielle et de réduire l’angoisse générée par la manipulation. De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués si besoin. Une surveillance régulière des animaux consistera à observer et évaluer la présence de certains critères signes d’une dégradation de l’état général : prostration, œil clos, diarrhées, nécrose, infection au niveau de la tumeur…. Le poids sera régulièrement suivi ainsi que le volume tumoral. Une perte de poids supérieure à 20 % du poids maximal ainsi qu’un volume tumoral supérieur à 1500 mm3 sont deux signes cliniques imposant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale en imagerie préclinique comme en cancérologie. En ce qui concerne le modèle tumoral, les études préliminaires réalisées ont pu mettre en évidence une croissance plus homogène chez les souris balb/c nude, décrite dans la littérature pour ce modèle. Les animaux utilisés seront des souris adultes de 5 semaines, pesant environ 20 g ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liée à la puberté. Le développement des xénogreffes que nous comptons utiliser est relativement rapide (environ 3 semaines), ce qui implique que les animaux seront inclus dans les procédures d’imagerie à l’âge de 7-8 semaines (20-25g).

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.

Objectifs

La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.

Procédures

- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.

Réduction

A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.