Rongeurs
Effet de la radiothérapie sur le rôle immunosuppresseur du microenvironnement tumoral – EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées ou greffées par chirurgie dans la glande mammaire, puis une partie des animaux est irradiée sous anesthésie, le porteur reconnaissant des risques de nécrose, d'ulcération tumorale et d'érythèmes cutanés. Les tumeurs et organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le microenvironnement tumoral et présente une protéine comme cible thérapeutique potentielle.
Objectifs
Le cancer, dont les cancers du sein et des voies aérodigestives supérieures, reste un problème majeur de santé publique. La radiothérapie est actuellement appliquée dans plus de 70% des traitements contre le cancer et fait partie de l’arsenal antitumoral incontournable. Cependant, la radiothérapie possède comme effets secondaires l’augmentation de l’immunosuppression du microenvironnement tumoral, en ciblant notamment un composant de ce microenvironnement, ce qui a pour conséquence de diminuer les chances de rémission complète chez les patients. Ce composant, une protéine de la matrice extracellulaire produite non seulement par les cellules cancéreuses mais également et majoritairement par des cellules fibroblastiques appelées FRC, joue un rôle primordial dans la genèse d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur favorisant la progression et la malignité des tumeurs. Il est suggéré que ce composant lorsqu’il est produit par les cellules FRC contrecarre la mort des cellules cancéreuses induite par la radiothérapie et empêche une rémission tumorale complète. La présente étude s’attachera à analyser dans des modèles d’expérimentation in vivo l’impact de cette protéine, présente dans le microenvironnement tumoral, sur le traitement par radiothérapie de tumeurs mammaires et des voies aérodigestives supérieures et à définir l’effet de la protéine produite par les cellules cancéreuses par rapport à celui de la protéine produite par les cellules FRC sur le développement d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. Il est attendu qu’en diminuant l’expression de cette protéine, et donc son effet immunosuppresseur, on améliore l’efficacité de la radiothérapie et ainsi qu’on puisse atteindre une rémission complète de la tumeur.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de cette étude est d'évaluer et caractériser, grâce à des modèles d'expérimentation in vivo, l’impact d'une protéine cible fortement produite dans les tissus tumoraux, et du traitement par radiothérapie sur le développement des cancers mammaires et des carcinomes de la tête et du cou. Le but in fine étant de déterminer si cette protéine pourrait être une cible thérapeutique potentielle en santé humaine. En effet, nous prévoyons qu’une réduction ou absence de cette protéine dans les tissus tumoraux entraînera une diminution de l’aspect immunosuppressif du tissu tumoral et de ce fait améliore la rémission des tumeurs induite par le traitement de radiothérapie.
Procédures
Un groupe d’animaux subira une injection unique en sous-cutanée et sous anesthésie générale pendant 10 minutes maximum, de cellules au niveau de la nuque. Un second groupe subira une greffe par chirurgie sous anesthésie générale pendant 15 minutes maximum, de cellules au niveau de la glande mammaire. Une partie de ces animaux subiront également une irradiation soit à faible dose soit à forte dose (5 minutes maximum) sous anesthésie générale d’une durée maximum de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables que nous pourrions observer sur nos modèles murins de tumeurs mammaires et de tumeurs des voies aérodigestives supérieures (VADS) sont : inflammation, nécrose ou ulcération tumorale, problème d’alimentation ou de déplacement dû au développement de tumeur, infection ou mauvaise cicatrisation post-chirurgie, perte de poids, variation de la fréquence respiratoire. L’irradiation peut induire des érythèmes cutanés et des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des différentes procédures pour effectuer un prélèvement et une analyse des tumeurs et de différents organes.
Remplacement
Le modèle animal est nécessaire car il n'existe pas de modèle in vitro pour reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans la tumeur, comme l'environnement tumoral, la réaction du système immunitaire, les mécanismes physiologiques impliqués et l'impact sur la survie de l'animal, entre autres exemples. Un des objectifs de notre étude est de développer et valider un modèle 3D in vitro et le modèle animal est indispensable à l’obtention d’échantillons tumoraux issus d’animaux irradiés et non irradiés qui serviront de base à la caractérisation et à la validation de modèles tumoraux 3D in vitro en cours de développement dans le laboratoire..
Réduction
Un outil de calcul de la taille des échantillons biologiques a été utilisé afin de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire, mais néanmoins suffisant, pour pouvoir atteindre les objectifs et réaliser une analyse statistique pertinente.
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés et maintenus en groupes sociaux dans des cages agrémentées avec de la litière, de maisonnette et rouleaux de coton (nidification), de frisures de papier kraft et tunnel (cachette) et de bâtons à ronger pour diminuer leur stress et favoriser leur activité. Les protocoles expérimentaux seront réalisés par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement une semaine avant de démarrer les procédures expérimentales. L’implantation des cellules tumorales et l’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien des souris sur un tapis chauffant et avec du gel ophtalmique sur leurs yeux pour les protéger. Une analgésie pré- et post-opératoire ainsi qu’une analgésie locale seront effectuées lors des greffes par chirurgie. Pour les trajets entre le site d’hébergement et le site d’irradiation (effectués en voiture, < 5 min), les souris seront mises dans des boites de transport dédiées avec un filtre sanitaire, de la nourriture et de l’eau gélifiée, de la litière, de la frisure de papier kraft et des rouleaux de coton. Des chaufferettes seront ajoutées sous les boites pour éviter tout risque d’hypothermie des souris. Des points limites ont également été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris seront pesées et leur état général évalué tous les jours durant les trois premiers jours post-greffe (ou jusqu’à cicatrisation complète) et post-irradiation puis au minimum 3 fois par semaine. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans une grille d’évaluation de la souffrance/points limites permettant la surveillance des animaux. Tout signe anormal (points limites : perte de poids excessive, comportement ou apparence/état de l’animal anormal, respiration anormale, etc.) sera signalé aux responsables. De plus, si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs, une injection d’un analgésique sera effectuée. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chercheurs. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin car celui-ci possède de multiples avantages dont celui d'être un modèle animal déjà validé dans le laboratoire depuis de nombreuses années. De plus, la souris récapitule de manière très similaire à l’homme l'ensemble des mécanismes moléculaires et des paramètres impliqués dans le développement tumoral : microenvironnement, réaction du système immunitaire, dissémination des métastases, mécanismes physiologiques impliqués et/ou associés, impact sur la survie. Les souris seront utilisées adultes à partir de 8 semaines d'âge minimum, ceci afin de mimer la pathologie chez l’homme adulte. L’utilisation de souris plus jeune n’est pas pertinente car les mécanismes physiologiques impliqués seraient potentiellement différents, le jeune individu étant encore en cours de développement.
Evaluation de la bioaccumulation d’un édulcorant artificiel (sucralose) dans l’organisme dans un modele de colitis par consommation de Dextran Sulfate Sodium chez des souris mâles, induisant une permeabilité intestinale augmentée.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Une colite sévère est provoquée pour augmenter la perméabilité intestinale, le porteur reconnaissant des saignements rectaux, une diarrhée, une anémie et une perte de mobilité, tandis qu'un édulcorant, le sucralose, est administré par gavage pendant quatorze jours. Les tissus sont prélevés après la mise à mort pour doser le sucralose. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la digestion et la bioaccumulation.
Objectifs
Ce projet vise d’une part à étudier l’impact d’une consommation d’édulcorant artificiel (sucralose) de 14 jours sur sa bioaccumulation dans différents compartiments tissulaires tels que le sang, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux et le cœur dans un modèle de souris dont la perméabilité intestinale est augmentée ou non par traitement entrainant le développement d’une colitis sévère. D’autre part, l’état inflammatoire du tissu adipeux sera étudié, en réponse à la prise de sucralose en condition de perméabilité intestinale induite ou non.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer la bioaccumulation de sucralose dans les différents compartiments tissulaires (en particulier dans le plasma sanguin et le tissu adipeux) suite à une consommation de 14 jours car très peu d’informations à ce jour sont disponibles dans la littérature. Ce projet permettra également d’étudier le profil inflammatoire du tissu adipeux pour mieux comprendre les effets de ce régime.
Procédures
Les animaux seront pesés quotidiennement et soumis à une administration orale subchronique (1 traitement par jour pendant 2 semaines) en eau ou en sucralose (185mg/kg). Ces tests nécessitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage.
Impact sur les animaux
Les pesées quotidiennes peuvent être source d’un stress léger pour les animaux. Le traitement pendant une semaine induit une source de stress et de douleurs sévères chez l’animal. Ce traitement peut provoquer plusieurs effets indésirables, à savoir : saignements rectaux, perte de poids, diarrhée, anémie et perte de mobilité. L’administration de sucralose par voie orale (gavage, sonde métallique rigide) peut également être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (quantification sucralose).
Remplacement
Les mécanismes de digestion, d’absorption et de bioaccumulation de molécules sont complexes. Aucune méthode in vitro ne permet de remplacer de manière exhaustive les mécanismes de digestion in vivo. Il convient donc d’étudier in vivo sur une faible population la bioaccumulation du sucralose dans différents tissus d’intérêt.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de réaliser les mesures de biodisponibilité et bioaccumulation tout en s’assurant de la répétabilité du résultat. Pour cela, un nombre minimum de 10 animaux par condition apparaît comme nécessaire. (G Power, Differences between two groups, A priori: Compute required sample size; Effect size d. 2 30%; puissance statistique= 0,80, risque alpha=0,05)
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à leurs conditions d’hébergement pendant les 11 jours suivant leur arrivée, avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les animaux sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (igloos, tubes, et coton). Pour permettre aux souris de ronger, de petits bâtonnets en bois sont également proposés. La température et l’hygrométrie sont contrôlées dans des conditions constantes de température (21°C±1°C) et d’humidité (55±5%) avec des cycles jour/nuit de 12 heures et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une table de score intégrant les différents points limites et mesures médicamenteuses ou non à mettre en place (annexe en pièce jointe). Au-delà d'un score de 5 sur cette fiche l'utilisation un analgésique sera utilisé (buprénorphine 0,5 mg/kg/j et 3mL/kg en sous-cutané) afin de garantir le bien-être de l'animal. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Enfin, avant de réaliser tout type de prélèvements, une dislocation cervicale sera réalisée.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent afin d’étudier les mécanismes de digestion car son système digestif est proche de celui retrouvé chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 8 semaines à l’achat et de 9 semaines au début du protocole. Cet âge a été défini conformément à la littérature et aux guidelines de référence liés au traitement comme moyen d’induire une colitis sévère et in fine une perméabilité intestinale augmentée. De plus, ces animaux correspondent à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Etude du rôle de molécules antimicrobiennes dans une myopathie métabolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie métabolique, elles reçoivent des injections d'un peptide antimicrobien et développent une faiblesse musculaire progressive, avec une biopsie de la queue pour le génotypage. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que seuls les modèles in vivo reflètent la complexité de la maladie et annonce des expériences sur cellules pour limiter le recours à l'animal.
Objectifs
Certaines myopathies héréditaires sont causées par un déficit en une enzyme conduisant à une accumulation progressive d'un sucre et à une dégénérescence des muscles (myopathie métabolique). Le seul traitement spécifique à ces maladies est la thérapie substitutive avec l'enzyme manquante qui vise à stopper l'évolution naturelle de la maladie. Cependant, les limites de la thérapie incitent la communauté scientifique à approfondir ses recherches sur la maladie. Nous souhaitons explorer si une molécule antimicrobienne joue un rôle dans la physiopathologie de la maladie. Nos études préliminaires et la littérature montrent que cette molécule est exprimée dans le muscle sans que son rôle soit connu. Notre projet a pour but de comprendre ce rôle dans un modèle préclinique de la maladie.
Bénéfices attendus
mise en évidence du rôle thérapeutique d’une molécule antimicrobienne dans une myopathie métabolique.
Procédures
-Injections intrapéritonéales de cathélicidine (douleur de quelques secondes) -Développement de la maladie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive sans paralysie invalidante. -Risque d'aggravtion du phénotype dans la lignée nouvellement générée. -Biopsie de queue pour génotypage.
Impact sur les animaux
-Injections intrapéritonéales d'un peptide antimicrobien (douleur de quelques secondes) -Développement d'une myopathie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive. Douleur légère pour la biopsie de queue.
Devenir
-Mise à mort à la fin de la procédure pour collecte des tissus post-mortem.
Remplacement
Pour étudier la physiopathologie de la maladie de Pompe, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre le systéme immunitaire et le muscle. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Des expériences in vitro sur des cellules primaires seront réalisées pour remplacer autant que possible les expériences in vivo.
Réduction
L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses biologiques et extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.
Raffinement
-nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris présentant les symptômes de la myopathie (faiblesse musculaire) : nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris C57BL/6 mutantes seront utilisées à 4, 12 et 24 semaines pour étudier les différents stades de développement de la myopathie.
Rôle du récepteur nucléaire FXR dans l’homéostasie énergétique (glucidique, lipidique et des acides biliaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
6 908 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des gavages, des injections virales par voies intracrânienne, intranasale et intra-orbitaire, un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose, pour étudier un récepteur nucléaire du métabolisme énergétique. Le porteur précise qu'aucun animal n'est réutilisé ni adopté. Il justifie ce volume par l'activité de tout un laboratoire sur cinq ans et affirme le caractère de "stricte nécessité" du recours à l'animal vivant.
Objectifs
L'étude du rôle du récepteur nucléaire FXR dans l'homéostasie énergétique implique l'étude ce récepteur nucléaire au sein de différents organes clé, impliqués dans la régulation de la balance énergétique (système nerveux central, foie, tissu adipeux banc et brun, pancréas et intestin). Ce projet concerne 5 chercheurs. Cette étude sera réalisées grâce à des approches in vivo (modèles murins d'invalidation tissu spécifique de FXR ou activation pharmacologique) et des approches in vitro (culture primaire de neurones, d'astrocytes, d’hépatocytes, de cellules non-parenchymales primaires, de pré-adipocytes ou de fibroblastes embryonnaires).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet cont une meilleure compréhensuin du rôles des recepteurs nuclaires aux acides biliares dans l'homéostasie énergétique mais également dans le contrôle central de cet dernière, avec l'utilisation de modèles intégrés et le souhait d'évaluer la communication interorganes.
Procédures
administration par gavage : 1-3x, moins de 5 minutes injection intracrâniale de virus : 1-2x, moins de 5min, procédure entière moins de 60 min administration intranasale de virus : 4 administrations/narine sur une session, moins de10 min) injection intraveineuse : 1-5x, moins de1 minute injection intrapéritonéale pour anesthésie : 1, moins de1 min injection intrapéritonéale de virus 1-6x, moins de 1 min injection en intra-orbital de virus: 1-2x, moins de 1 minute injection intrapéritonéale des animaux soumis à un régime obésogène (moins de20 semaines): 1-6x, moins de 1 min (glycémie : 1x/mois au maximal ; tolérance au glucose et a l’insuline : moins de 2 minutes ; 8x/session) des prélèvements de sang des animaux soumis à un régime obésogène : au maximum 4 fois, espaces d’au moins 3 semaines.Biopsie de queue: 1x , moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les nuisances des procédures chirurgicales de classe modérée (procédure 2 et 15 - stéréotaxie) peuvent concerner 1/ la douleur lors du placement de l’animal dans la cadre stéréotaxique ; 2/ l’incision de la peau ; 3/ le conditions de réveil de l’animal. les nuisances énumérées seront minimisées par l’ anesthésie et l’analgésie et le suivi post-opératoire réalisé par du personnel forme au bien-être animal.
Devenir
Nn dehors de la procedure de generation et de genotypage, l'ensemble des animaux sera mis a mort en fonction des objectifs annonces. Aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de désordres métaboliques en ciblant les réaux acides bilaires, mettant en jeu une communication inter-organes. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques et intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire (16 chercheurs, 8 ITA statutaires, 4 post-docs, 10 étudiants) sur les 5 ans à venir est estimé à 6888. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R à l’aide du site https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, pesés régulièrement, par du personnel spécialement formé. Durant les différents protocoles, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition, par exemple coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par une combinaison de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Cette espèce est utilisée parce que les souris peuvent être évaluées par méthodes comportementales et être génétiquement modifiées par injections virales ou transgénèse. La lignée présentant une séquence floxée pour le récepteur nucléaire FXR permet son invalidation conditionnelle. La délétion dans une structure cérébrale précise sera obtenue par injection stéréotaxique ou intra-nasale d'AAV2/9-Cre, la délétion hépatique, intestinale sera obtenue par le croissement des souris FXR-flox avec des souris albumine-cre, des souris dont l'expression de la Cre sera dépendante d'un promoteur spécifique des cellules entéro-endocrines, respectivement. Si un phénotype dommageable apparait au cours des expérimentations, les études seront interrompues. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 2 mois à 12 mois. Etant donné que l'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il est nécessaire d'utiliser des souris adultes (càd 2 mois minimum et en dehors de la courbe de croissance). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes (de 2 à 12 mois) et ce, en accord avec les 3R.
Evaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique couplant l’utilisation d’ultrasons à des thérapies ciblées innovantes dans un modèle de gliome chez des souris et rats.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 298
810 souris et 298 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des cellules de gliome sont implantées dans le cerveau par chirurgie, puis les animaux reçoivent des injections thérapeutiques répétées et des ultrasons pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique, avec des sessions d'imagerie sous anesthésie, le porteur reconnaissant une toxicité possible sur les organes sains. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas le flux sanguin ni l'infiltration immunitaire et revendique un fort potentiel de transfert clinique.
Objectifs
De nouvelles innovations thérapeutiques à base d’anticorps et de peptides spécifiques pourraient améliorer significativement les conséquences des cancers du cerveau les plus graves : les gliomes. Ces thérapies ciblent spécifiquement des molécules exprimées principalement par les gliomes et diminuent considérablement les effets secondaires tout en augmentant l’efficacité thérapeutique. Malheureusement l’efficacité de ces traitements est freinée une barrière naturelle, appelée « barrière hémato-encéphalique » (BHE), qui limite la diffusion dans le cerveau des médicaments qui pourraient être efficaces contre ces tumeurs. Les gliomes, qui sont des tumeurs cérébrales très agressives, restent essentiellement incurables même si la BHE est partiellement compromise par la présence de cette tumeur. L’objectif du projet est d’évaluer une stratégie thérapeutique qui vise à surmonter la limitation de la diffusion des médicaments dans la tumeur, en combinant des ultrasons focalisés à des médicaments innovants, associés ou non avec des isotopes thérapeutiques. Les isotopes directement injectés dans la circulation sanguine, agissent comme une radiothérapie interne. Ils ont aussi été montrés stimuler le système immunitaire en plus de leur effet thérapeutique sur les cellules tumorales. Les ultrasons focalisés ont prouvé leur capacité à faciliter la diffusion de divers médicaments dans le cerveau grâce à une ouverture transitoire et sécurisée de cette barrière sans causer de lésions cérébrales. Nous exploiterons cette perturbation de la BHE pour adresser les médicaments directement dans la tumeur, tout en y associant une radiothérapie interne. Cette stratégie sera évaluée sur des modèles de rongeurs (souris et rats) présentant soit un statut immunitaire normal soit une immunorésistance, pour évaluer toutes les conditions pouvant se présenter en clinique humaine. . Ce projet sera réparti entre deux établissements pour réaliser d’un côté la thérapie et de l’autre le suivi par imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques en utilisant des traitements innovants et des ultrasons focalisés. Ces approches thérapeutiques présentent un fort potentiel de transfert chez les patients. Dans le cadre de ce projet, une évaluation des thérapies par imagerie TEP est également envisagée. Cette méthodologie, associée à l'utilisation de radioligands, pourrait bénéficier aux patients de deux manières : en améliorant la sélection des patients pouvant bénéficier des traitements innovants et en optimisant la dose médicamenteuse afin de réduire les effets toxiques potentiels.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place du modèle tumoral (45 minutes d’intervention chirurgicale, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées sous anesthésie générale dans une sous-structure du cerveau : le striatum pour la formation de tumeurs o L’injection de molécules permettant l’imagerie chez l’animal sous anesthésie générale pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 3). o L’injection des agents thérapeutiques qui aura lieu tous les deux à trois jours pendant deux semaines environ (temps d’injection de la thérapie 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 6). o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 6 sessions d’imagerie. o Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 5 maximum au total ). Le diagnostic et la thérapie seront réalisés dans un premier établissement utilisateur alors que le suivi par imagerie sera réalisé dans un autre établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (70 minutes maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical lors de la mise en place du modèle tumoral induira une douleur au niveau de la boite crânienne. L’acte chirurgical durera 30 min. Les traitements peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour des analyses ex vivo de biomarqueurs d’intérêt tumoraux et au niveau du système immunitaire.
Remplacement
Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont évaluées sur des cultures cellulaires et des tumoroides pour déterminer leur pertinence, ainsi que pour identifier une éventuelle surexpression de biomarqueurs au niveau des tumeurs. Un travail impliquant plusieurs équipes spécialistes des gliomes et de la BHE porte notamment sur l’élaboration de modèles tumoroides couplant gliomes et microenvironnement tumoral pour évaluer in vitro les différentes stratégies thérapeutiques. Les tests in vitro préliminaires sont mis en place afin de définir la stratégie qui sera appliquée in vivo, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour l'évaluation sur un modèle murin. Cependant, nos modèles in vitro sont limités quant à l’interaction entre les cellules tumorales et le microenvironnement tel que les différentes populations du système immunitaire.Afin de valider les thérapies et la stratégie associée par imagerie, il est nécessaire d'implanter les tumeurs dans l'organe cible, en l'occurrence le cerveau. L’ouverture de la BHE par l’utilisation d’ultrasons thérapeutiques ne peut être que testée dans un environnement complexe récapitulant le flux sanguin, les jonctions de la barrière cérébrales, l’infiltration immunitaire et les flux lymphatiques cérébraux uniquement observable in vivo. Cette approche permet de mieux simuler le contexte physiologique et de fournir des données plus pertinentes pour le transfert clinique de ces stratégies.
Réduction
L’imagerie TEP permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux étant donné que l’impact des traitements sera suivi de manière longitudinale sans avoir recours à des euthanasies à différents temps d’imagerie. Cette évaluation nécessitera d’avoir recours à un traitement des images et l’utilisation de modèles mathématiques pour extraire un maximum de données directement transférables en clinique. En tenant en compte les différentes données préliminaires et les données bibliographiques, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé entre 10 et 12 afin d’être statistiquement significatif. Les données quantitatives issues de l’imagerie seront exprimées en moyenne avec un écart-type associés.
Raffinement
Toutes les interventions invasives à savoir les injections de radioligands, les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux seront entrainés à la manipulation pour éviter tout stress. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Si une souffrance est observée, un antalgique pourra être administré en accord avec le/la vétérinaire référent-e. sera administrée. Les rongeurs seront transportés dans des cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le transport sera réalisé dans un véhicule dédié aux transports des animaux avec une climatisation. Le parcours entre les deux sites est de 20 minutes maximum.
Choix des espèces
Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux axes thérapeutiques qui peuvent être directement transférables à l’humain. En fonction de la lignée cellulaire tumorale utilisée, la souris ou le rat sont des animaux de choix pour la mise en place de modèle tumoraux. Ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers cérébraux chez les patients majoritairement à l’âge adulte.
Clearence du potassium par des astrocytes dans le cerveau de souris normale et épileptique.
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Une partie subit un état de mal épileptique provoqué par injection, maintenu trente minutes, que le porteur reconnaît douloureux et impossible à réaliser sous anesthésie, avant que le cerveau ne soit prélevé pour des analyses ex vivo. Les souris qui ne se réalimentent pas ou perdent plus de 15 % de leur poids sont exclues et tuées. Le porteur présente la modélisation informatique comme une piste future tout en concluant que seul l'animal permet aujourd'hui d'étudier l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet de recherche découle d'un projet plus vaste que notre équipe mène depuis cinq ans, visant à comprendre comment les rythmes naturels du corps influent sur le fonctionnement normal et anormal du cerveau. Cette question revêt une importance particulière pour la santé humaine, car toutes les fonctions de notre organisme suivent un rythme quotidien, et ces rythmes sont perturbés en cas de maladies telles que l'épilepsie, la deuxième maladie neurologique la plus répandue après la migraine. Environ 30% des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux actuels. Les recherches sur l'épilepsie ont traditionnellement ciblé les neurones, mais notre projet se concentre sur les cellules gliales, en particulier les astrocytes, qui jouent un rôle crucial dans le soutien métabolique du cerveau. Les études ont montré des fluctuations importantes dans les concentrations d'ions essentiels (sodium, potassium, chlorure) chez les sujets épileptiques, en particulier une augmentation du potassium. Notre objectif est de comprendre pourquoi cette régulation est perturbée, si elle est liée au dysfonctionnement des astrocytes, et quels mécanismes astrocytaires de la clairance du potassium sont affectés. Nous cherchons à répondre à ces questions pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Lors des crises épileptiques, on observe une augmentation temporaire du potassium à l'extérieur des cellules du cerveau, aussi bien chez les patients que dans des modèles animaux (rats, souris) et des préparations du cerveau de rongeurs en laboratoire. Cette élévation de potassium est ainsi un marqueur universel de la crise épileptique. Bien que les mécanismes précis de cette perturbation puissent varier entre différentes espèces, son origine commune semble être les astrocytes, des cellules gliales du cerveau. En étudiant comment les astrocytes éliminent le potassium dans les tranches du cerveau de souris, nous cherchons à comprendre comment cette fonction est normalement assurée dans le cerveau humain et comment elle est altérée lors de l'épilepsie. Actuellement, aucun traitement antiépileptique ne cible spécifiquement les astrocytes. Les résultats de notre projet ouvriront des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre collaboration avec l'équipe des Neurosciences Théoriques est essentielle. Ces chercheurs modélisent l'activité des réseaux neuronaux dans différentes parties du cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. La régulation du potassium extracellulaire est une variable clé dans leurs modèles. Pour que leurs simulations reflètent la réalité, elles doivent s'appuyer sur des données expérimentales. Les expériences que nous prévoyons dans le cadre du projet fourniront ces données, permettant d'améliorer la précision des modèles. Ces modèles améliorés offriront ensuite la possibilité de prédire le comportement du réseau neuronal dans différentes conditions, y compris en réponse à des médicaments, sans recourir à des expérimentations sur des animaux de laboratoire. Ainsi, notre projet contribuera à développer et exploiter une approche informatique (in silico) pour mieux comprendre et traiter l'épilepsie.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs injections intrapéritonéales : 1 à 3 injections d'une molécule pro-convulsante ou de sérum physiologique dans le cas des souris témoins, et une injection d'une molécule anti-convulsive.
Impact sur les animaux
Le projet s'appuit sur l'utilisation du modèle animal d'épilepsie généralisée qui reproduit les caractéristiques principales de l'épilepsie du lobe temporal (ELT) chez les humains, y compris les crises épileptiques et les problèmes de mémoire. Malheureusement, pour induire cette épilepsie, nous devons provoquer un état convulsif initial chez les souris non affectées, appelé "status epilepticus". Cet état est douloureux, mais nous ne le laissons durer que 30 minutes, puis nous l'arrêtons en administrant un médicament anti-convulsivant. Il n'est pas possible d'anesthésier les animaux pendant cette induction, car le status epilepticus est défini par des mouvements et des comportements spécifiques qui seraient complètement supprimés par une anesthésie. La classification de la gravité de cet état de mal est cruciale, car elle nous permet de déterminer précisément quand il commence, nous donnant ainsi un contrôle sur sa durée. L'induction de l'épilepsie en déclenchant cet état de mal est la seule méthode disponible pour créer un modèle animal de l'épilepsie du lobe temporal.
Devenir
Après le déclenchement du "status epilepticus" les souris deviennent épileptiques et elles seront utilisées pour les expérimentations ex vivo qui cible à étudier la clairance du potassium dans les tranches de cerveaux épileptiques et sains.
Remplacement
Les dernières décennies ont été marquées par d'importants progrès dans le domaine de la modélisation des fonctions cérébrales. Des projets internationaux tels que The Virtual Brain et le Human Brain Project ont considérablement enrichi nos connaissances sur les mécanismes de la mémoire et du traitement de l'information dans le cerveau humain. Les nouvelles procédures informatiques permettent aux médecins neurologues d'extraire davantage d'informations de l'EEG et de l'imagerie cérébrale. Les modèles mathématiques récents peuvent décrire certains aspects du fonctionnement d'une cellule nerveuse ou d'un réseau neuronal. Cependant, aucun outil informatique ne permet de modéliser l'ensemble du répertoire de l'activité cérébrale, qu'elle soit physiologique ou pathologique, car les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ne sont pas encore connus. La seule voie pour les découvrir passe par l'exploration du modèle animal. Le foyer de la crise épileptique est localisé dans une région du cerveau, mais une fois déclenchée, la crise peut se propager et envahir plusieurs régions, voire l'ensemble du cerveau. Étant donné que le cerveau contrôle toutes les fonctions de l'organisme, son dysfonctionnement peut affecter d'autres organes vitaux tels que le cœur ou l'estomac, qui à leur tour influent sur le fonctionnement du cerveau. Ainsi, l'épilepsie dépasse le cadre d'une pathologie purement neurologique, c'est pourquoi son exploration requiert l'accès à l'organisme entier, une possibilité que aucune autre approche ne nous offre pour l'instant.
Réduction
Un cerveau (une souris) sera utilisé pour la préparation de plusieurs tranches (4-6) qui seront ensuite utilisées simultanément sur deux postes expérimentaux ce qui permettra soit d'obtenir lors de la même session les données de deux types (deux protocoles expérimentaux différents, un par poste), soit de cumuler plus de données d'un type (le même protocole appliqué sur deux postes expérimentaux).
Raffinement
Ce projet présente des approches pertinentes visant à réduire la douleur, la souffrance, le stress et l'inconfort chez les animaux de laboratoire, en particulier les souris. Une procédure d'induction du statut épileptique individualisée a été mise en place. Après la première injection d'une substance épileptogène, ne représentant qu'un tiers de la quantité totale, le comportement de chaque souris est surveillé. La décision d'administrer les injections suivantes est basée sur la réaction individuelle de la souris à la première injection, réduisant ainsi le temps de souffrance et accélérant le rétablissement post-induction. Le suivi quotidien des animaux est également adapté à chaque individu. Les souris qui ne parviennent pas à se nourrir se voient fournir de la nourriture par l'expérimentateur jusqu'à ce qu'elles puissent le faire elles-mêmes. Si une souris n'est pas capable de se nourrir seule dans les deux jours suivant l'induction du statut épileptique, elle est exclue du projet et euthanasiée par inhalation de CO2. Le bien-être des animaux est privilégié en ce qui concerne leurs conditions d'hébergement. Ils sont regroupés par 3 à 5 selon la taille de la cage, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. L'environnement est enrichi de maisonnettes et d'objets divers. Des observations indiquent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu'ils sont hébergés en groupe (DOI: 10.1523/ENEURO.0179-18.2019). Pour minimiser le stress, les animaux sont manipulés et pesés 3-4 fois par semaine avant la procédure d'induction de l'épilepsie et pendant la phase latente. Cependant, une fois devenus épileptiques, toute manipulation non nécessaire est évitée, car elle peut augmenter leur niveau de stress et déclencher des crises épileptiques. Les animaux sont observés quotidiennement, leur état étant évalué à l'aide de la grille d'expression faciale (DOI: 10.1038/nmeth.1455). Une souris présentant des signes de souffrance de niveau 1 ou 2 est pesée. Si son poids a diminué de plus de 15 % par rapport à celui observé pendant la phase latente, elle est exclue du projet et euthanasiée. Si le poids reste constant mais que la souris montre des signes de souffrance de niveau 2 pendant plus de deux jours consécutifs, elle est également exclue du projet et euthanasiée.
Choix des espèces
Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail. Ce projet utilise les souris comme modèle animal, qui, avec le rat, sont l'espèce le plus pertinentes car des nombreuses études montrent que les régions cérébrales impliquées dans l'épilepsie sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Parce que ce modèle reproduit les caractéristiques principales de l’épilepsie, les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cette pathologie chez l’Homme. Les modèles d'épilepsie chez les souris sont déjà validés par les travaux antérieurs de notre équipe (doi: 10.1126/sciadv.aat5979, doi: 10.1073/pnas.2013972118) Nous utiliserons les animaux adultes, à partir de 5 semaines. Nous allons étudier l'épilepsie de l’adulte, donc il nous faut utiliser les animaux qui ont passé la phase de croissance rapide qui dure, selon la documentation technique de Charles River les cinq premières semaines de vie (www.criver.com/products-services/find-model/fvb-mouse?region=29www.criver.com /products-services/findmodel/fvb-mouse?region=29). Donc nous allons utiliser les souris âgées de plus de 5 semaines.
Analyse moléculaire et histochimique du role de MLC1 à interface gliovasculaire du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection intracérébrale de virus par stéréotaxie, avec ouverture de la peau du crâne, avant une perfusion intracardiaque, le porteur reconnaissant des effets modérés liés à la chirurgie et une perte de poids transitoire. Le cerveau est prélevé pour les analyses histologiques. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne peut recréer les interactions entre astrocytes, neurones et vaisseaux.
Objectifs
Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du cerveau. Ils possèdent une interface vasculaire qui consiste en des prolongements ou "pieds" qui vont au contact des vaisseaux sanguins cérébraux. A cette interface, appelée l’unité gliovasculaire, les astrocytes régulent les fonctions vasculaires cérébrales. Cependant les modalités de ces régulations astrocytaires sont très mal connues alors même qu'elles sont altérées dans un grand nombre de pathologies cérébrales. L'intérêt d'étudier les interactions entre les astrocytes et le système vasculaire est donc in fine de pouvoir comprendre les mécanismes de ces pathologies et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans une étude récente, nous avons montré que MLC1, une protéine des astrocytes très enrichie dans les pieds astrocytaires périvasculaires controle le développement postnatal de plusieurs fonctions vasculaires cérébrales. Le but de notre projet est de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu en comparant des souris transgéniques MLC1KO a des souris WT issues des mêmes portées (littermates). Nous avons identifié 50 marqueurs à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire à 15 jours postnatal (stade immature) 2 mois (stade intermédiaire) 4 mois (stade mature) et 1 an (stade âgé). Ces investigations seront réalisées sur des coupes histologiques de cerveau . Pour pouvoir étudier les marquages spécifiquement dans les astrocytes, nous avons prévu de les marquer par une protéine fluorescente telle que la GFP (Green fluorescent protein) qui sera induite par une approche virale administrée par stéréotaxie. Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de MLC1.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de la protéine MLC1 dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentielles sur les modalités des régulations astrocytaires et apportera un éclairage essentiel sur denombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les interventions sous anesthésie générale (injection stéréotaxique puis perfusion intracardiaque) durent 30 minutes et ne sont réalisées qu’une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas de nuisance liée au génotype des animaux MLC1KO qui est une modification génétique non dommageable. Les animaux subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie pendant laquelle une ouverture de la peau du crane est pratiquée. L'opération peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire.
Devenir
L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Cependant, le nombre d'animaux utilisés (800 animaux au total) sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entreles différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la surutilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 5 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux en général que nous avons observée lors d’une étude précédente sur le modèle MLC1KO.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement (présence dans la cage de coton pour faire un nid et objets en carton) et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal en accord et en dialogue avec notre SBEA et notre vétérinaire référente. Nous n’attendons pas d’effet particulier lié au génotype des animaux MLC1KO qui est une modification génétique non dommageable (phénotype étudié dans une étude précédente). Dans nos expériences où une anesthésie profonde est réalisée, la qualité de l'anesthésie sera systématiquement contrôlée par l'absence de reflexe réponse au pincement de la patte. Les souris subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie (ouverture de la peau du crane). Les animaux opérés feront donc l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. Une procédure avec des points limites gradés a été mise en place pour la surveillance des animaux post opération. Elle est basée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux seront respectés évitant l'euthanasie des animaux. La cicatrisation de la peau sera surveillée par l'expérimentateur. La chirurgie peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire qui sera surveillée en pesant les animaux avant et après (pendant les 5 jours post chirurgie).
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 50 marqueurs à étudier (variation d'expression de gènes identifiés lors d'une étude transcriptomique issue de la littérature) à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire au jour postnatal 15, à 2 mois, à 4 mois et à 1 an. Ces stades ont été choisis sur la base de nos études préalables qui montrent que les pieds astrocytaires et les vaisseaux ont formés mais immatures à P15 et continuent leur maturation moléculaire entre P15 et 4 mois. Le stade d’un an correspond à un stade âgé pour comprendre les effets de l’absence de MLC1 dans le contexte du vieillissement.
Élevage de souris modèle d’une maladie neurodégénérative.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
950 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce projet est un élevage d'une lignée transgénique modèle d'Alzheimer à phénotype dommageable, dont les animaux développent une paralysie progressive entre sept et dix mois et une mortalité élevée, avec tatouage des phalanges et coupe de la queue pour le génotypage. 800 souris sont transférées vers un autre établissement pour d'autres projets, 150 étant tuées en fin de reproduction ou pour atteinte des points limites. Le porteur présente cet élevage comme le support d'une future méthode de diagnostic.
Objectifs
Le but du présent projet est de faire un élevage d’une colonie de souris modèle. Il s’agit d’un modèle murin de la maladie d’Alzheimer à phénotype dommageable. La production de cette colonie servira ensuite à caractériser le phénotype rétinien chez ce modèle dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic précoce non-invasive de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Élevage de la colonie de souris modèle à phénotype dommageable. Cette colonie de souris servira par la suite à mettre en place une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer et aussi améliorer le parcours de soin des patients.
Procédures
Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir de déficit moteur à partir du 7ème mois. Au 7ème jour après la naissance, les souris seront identifiées par tatouage au niveau des phalanges à l'aide d'une pince Aramis. Dans le même temps, un prélèvement caudal coupé au ciseau chirurgical à bout pointu sur animal vigile pour génotypage sera réalisé. Quelques secondes seront nécessaires pour réaliser ces actes. Tous les animaux naissants seront soumis à ces deux actes une seule fois dans leurs vies.
Impact sur les animaux
Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Une infection locale et une douleur pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage.
Devenir
Les 800 animaux produits dans le cadre de ce projet seront transférés dans un autre établissement et impliqués dans différents projets dédiés à la mise en place d’une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer. En revanche, 150 animaux seront euthanasiés en fin de période de reproduction ou pour atteinte des points limites (estimation)
Remplacement
Les souris issues de cet élevage serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de cette étude concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la rétine.
Réduction
La production d’animaux a été estimée à 950. Le nombre d’animaux nécessaire pour les différentes études scientifiques a été définis en tenant compte des éventuelles pertes dues à une atteinte des points limites.
Raffinement
Les animaux en provenance d’éleveurs agrées seront hébergés par trois (Un mâle reproducteur et deux femelles reproductrices) dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (papier kraft, bâton à ronger et éventuellement maisonnettes rouges). Les animaux seront stabulés dans un environnement avec une alternance jour (7h-19h) /nuit (19h-7h), une température de 22+/-2 degrés Celsius et une hygrométrie à 50 +/- 10. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Avec une mise en place d’étiquettes au niveau des cages pour un meilleur suivie (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance). Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Un raffinement spécifique tel qu’un apport de nourriture à hauteur de la souris, un suivie du poids hebdomadaire à partir du 7 ème mois ainsi qu’une surveillance quotidienne par un personnel qualifié seront mis en place. Une infection locale pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage. Dans ce cas, les souris seront traitées par vétédine.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus cette souris présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les animaux seront étudiés à partir de 3, 6 et 9 mois dans une autre animalerie agrée. Les animaux seront répartis par âge. Les souris seront étudiées à trois différents âges : - 3 mois : âge où un début de gliose et de perte synaptique sont observé - 6mois : âge auquel les enchevêtrements sont observés avec un début de déficit cognitif - 9 mois : âge correspondant à une perte neuronale Ces âges ont été bien définis dans la littérature.
Modèle murin de syndrome de détresse respiratoire aiguë ( SDRA)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
575 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Toute la colonie subit une phalangectomie, ablation d'une phalange, et 280 souris reçoivent une instillation d'acide chlorhydrique ou de lipopolysaccharide dans la trachée pour provoquer un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Ces 280 souris sont tuées pour les prélèvements, tandis que 295 sont gardées vivantes pour la reproduction ou d'autres procédures. Le porteur affirme que seul le modèle animal permet une véritable translation vers la clinique.
Objectifs
Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une affection fréquente en réanimation et responsable d’une mortalité élevée. Il se caractérise par des lésions alvéolaires diffuses et une hypoxémie sévère. Actuellement, seule une approche protectrice de la ventilation mécaniques a permis de réduire la mortalité associée au SDRA au cours des derniers années. Le récepteur des produits avancés de la glycation (RAGE pour Receptor for Advanced Glycation End-products) est ubiquitaire et est largement retrouvé dans les cellules alvéolaires . Il a de nombreux ligands et son activation entraine divers mécanismes de régulation intra cellulaire : apoptose, inflammation ou prolifération. Nous avons participé à démontrer que RAGE joue un rôle dans la pathogénie du SDRA. D’autre part, notre équipe a pu mettre en évidence les effets bénéfiques d’une sédation inhalée par sévoflurane chez des patients présentant un SDRA à travers un essai monocentrique, contrôlé et randomisé. En effet, le sévoflurane, un agent halogéné largement utilisé pour l'anesthésie générale en salle d'opération, améliorait l’oxygénation, diminuerait les niveaux alvéolaires et plasmatiques de sRAGE, forme soluble de RAGE, par rapport à une sédation par agent intraveineux. Nos objectifs sont multiples et visent à mieux comprendre et caractériser l’utilisation de la sédation inhalée en réanimation au travers d'une approche translationnelle via des études de recherche clinique et de recherche fondamentale. Ce projet a pour but d'améliorer notre compréhension des mécanismes physio-pathologiques mis en jeu lors de l’utilisation de sévoflurane et de mieux caractériser le rôle de la voie de signalisation liée à RAGE. Les modèles murins de SDRA décrits dans ce projet ainsi que des modèles cellulaires in vitro d’agression épithéliale réalisés en parallèle, permettront de caractériser l’effet du sevoflurane lors de l’agression pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’instillation intra-trachéale d’acide chlorhydrique ou de lipopolysaccharide reproduit dans le modèle murin, les caractéristiques majeures du SDRA humain. Les concentrations des formes solubles de RAGE dans le plasma et le lavage brocho-alvéolaire (LBA) sont des bons marqueurs de l’atteinte pulmonaire et de sa résolution au cours du SDRA expérimental. L'utilisation de souris knock-out pour RAGE (déjà disponibles à l'animalerie) permettra de mieux décrire les implications de la voie RAGE au cours du SDRA et de sa résolution. L'exposition au sévoflurane pourrait mettre en évidence les effets de cet halogéné sur l'atteinte pulmonaire et pourrait ainsi être une possible stratégie thérapeutique pour les patients en réanimation.
Procédures
L'ensemble de la colonie subira une phalangectomie = 575 animaux. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à plusieurs procédures: -anesthésie générale pour l'ensemble des animaux constituant les groupes expérimentaux (140 animaux utilisés dans le modèle murin de SDRA par instillation d'acide chlorhydrique (HCl) et 140 dans un modèle murin de SDRA par instillation de lipopolysaccharide (LPS) = 280 animaux. Sur les 140 animaux pour chaque modèle, 80 animaux subiront chacun, une instillation intra-trachéale soit d'HCl, soit de LPS sous anesthésie générale afin de créer un SDRA expérimental. Un animal de chaque condition expérimentale sera imagé à j0-j1-j2 et j4 = 6 animaux pour chaque modèle de SDRA donc, un ensemble de 12 animaux seront imagés : injection en rétro-orbital sous anesthésie générale d'un agent de contraste couplé à une fluorescence. Ces 12 animaux seront soumis à une injection par jour donc ils subiront 4 injections. Ces 12 animaux seront euthanasiés à j4.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une détresse respiratoire aigüe à j0 après instillation d'HCl ou LPS.
Devenir
Dans le cadre de la procédure de phalangectomie, les animaux seront tous garder en vie car ils seront destinés aux autres procédures ou aux futures reproductions. Dans les 2 procédures d'instillation, les animaux seront euthanasiés par injection de penthobarbital afin de réaliser les prélèvement post-mortem.
Remplacement
Des alternatives non animales sont disponibles au sein de notre équipe. L'axe de recherche translationnelle de notre équipe sur les implications du récepteur membranaire RAGE au cours du syndrome de détresse membranaire aigüe (SDRA) comporte des investigations cliniques et des expérimentations sur modèles cellulaires. Pourtant, seule l'utilisation de modèles animaux nous permet d'envisager une véritable translation entre les données obtenues in vitro et les données cliniques.
Réduction
En accord avec les principes éthiques des 3Rs, il a été convenu de considérer un nombre minimal d’animaux pas groupe pour réduire le nombre total d’animaux utilisés mais permettant d'établir la significativité statistique. Nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles pour nos expériences. En prenant en compte ces considérations, le nombre d'animaux nécessaires à ce projet sera de 575 souris.
Raffinement
La douleur sera réduite au minimum. En effet, les souris seront sous anesthésie générale tout le long de l'expérimentation. L'utilisation d'hypnotiques à action analgésique permet de couvrir l'analgésie per- et post-procédurale. Les animaux non sacrifiés à j0 seront replacés dans leur cage de stabulation avec nourritue et boisson à volonté, sur tapis chauffant en salle de réveil. Ils seront remis en salle de stabulation dès qu'ils seront en mesure d'exprimer les comportements normaux de leur espèce. Les animaux seront examinés 1 fois/jour (comportement global, paramètres vitaux, détresse respiratoire) jusqu'à leur sacrifice à j1; j2 ou j4. Quoiqu'il en soit, la procédure d'anesthésie engendrera un stress dû à la contention de l'animal que l'on ne peut pas éliminer.
Choix des espèces
Par rapport à d'autres modèles animaux, notre Choix du modèle murin est justifié d'une part car ce modèle est translationnel, qui permet à la fois l'étude de la phase aigüe d’agression alvéolaire et la phase de résolution de l'atteinte, n'est à ce jour décrit et validé que chez la souris (Patel B et al, Eur Respir J 2012; Jabaudon M et al, Am J Respir Crit Care Med2015), ensuite, il s'agit de l'espèce la plus appropriée pour l'étude des effets d'une absence d'expression du gène de RAGE au cours du SDRA. En effet, notre projet comporte à la fois l'étude de souris sauvages et celles de souris knockout pour RAGE.
Evaluation des effets anti-allodyniques ou anti-hyperalgésiques d’un ou plusieurs composés dans différents modèles de douleur inflammatoire associés à différents tests chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
9 660 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plus grande part en catégorie sévère. Une douleur inflammatoire est provoquée par injection ou chirurgie, pouvant aller jusqu'à une polyarthrite, puis les animaux subissent des stimulations mécaniques, thermiques et chimiques répétées à l'état vigile pour tester des candidats analgésiques. Le porteur indique que ces modèles douloureux et stables interdisent de réutiliser les animaux, tous tués en fin de phase. Il évoque des effectifs qui pourront être "revus à la baisse par nos clients", signe d'une activité de prestation.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur inflammatoire et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). Ces modèles et tests sont couramment décrit au sein de la communauté scientifique. La douleur inflammatoire est associée à des phénomènes d’inflammation qui perdurent anormalement. Il s’agit par exemple de douleurs articulaires. Dans des conditions normales, l’inflammation aiguë est essentielle pour protéger l’organisme contre les agents pathogènes ainsi que pour favoriser la réparation des tissus. À l’inverse, une inflammation chronique, qui dure 6 semaines ou plus, entraîne des lésions tissulaires et des douleurs indésirables. Les modèles in vivo, aident à comprendre les mécanismes physiopathologiques responsables de la génération de douleurs inflammatoires chroniques et permettent l’identification de nombreux candidats médicaments analgésiques L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs inflammatoires et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires anti-inflammatoires non-stéroidiens : ulcères, …). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
- Induction des modèles : chirurgie ou injection sous cutanée plantaire qui dure moins d’une minute en contention ou d’une injection intra-articulaire (genou/cheville) sous anesthésie gazeuse qui dure moins d’une minute. - Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. - Test : stimulation chimique : environ 40min - Répétitions des tests :plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. - Contention et isolement de l’animal. - Administration de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire), durée de quelques secondes. - Répétitions des traitements : ils peuvent être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux). Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. - prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les modèles décrits dans ce projet sont des modèles de douleur inflammatoire ou post opératoire. Les autres nuisances liées au développement de ces modèles sont des gonflements (procédures 1 et 4 à 7, nuisances modérées à sévères selon l’inflammation), le développement éventuel d’une polyarthrite (procédures 4 et 6, nuisances sévères) . De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé.
Devenir
Une grande partie des modèles utilisées ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Certains modèles montrent un retour au seuil de base mais les mécanismes inflammatoires ont une mémoire, réinduire ces animaux pourraient entrainer une réponse différente, ils deviendraient difficiles de les comparer entre eux. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces modèles sont couramment mis en place au sein du laboratoire. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclut ou limiter à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse par nos clients. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de tests themiques, le choix des températures est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du monde scientifique. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés dans l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents lors de l’induction de la pathologie (28-45 jours ). Pour le modèle de méniscectomie partielle, les animaux utilisés sont au stade adulte (12semaines). Ces stades ont été choisis car ils sont adaptés au développement des modèles. Ils permettent un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Evaluation pharmacologique et pharmacodynamique d’un anticorps activateur de récepteurs ayant une fonction dans la résolution de l’inflammation chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
210 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections d'un anticorps et subissent des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à sept le premier jour, pour mesurer la pharmacocinétique de la molécule, le porteur reconnaissant le stress lié à ces prélèvements. 160 rats pourront être réutilisés dans un autre projet après contrôle vétérinaire, tandis que 50 sont tués pour prélever des organes lors de l'étude de biodistribution. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un "système immunitaire complet".
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d’une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d’auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Dans le cas du cancer, le blocage de points de contrôle inhibiteurs a eu de très bons résultats en essais cliniques. Ces essais ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques murins. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires et pour cela les approches sont plus spécifiques de populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. Une nouvelle approche consiste à cibler une étape de l’inflammation récemment décrite et nommée la résolution de l’inflammation. En effet, cette étape fait suite à la réponse inflammatoire et permet d’éteindre de manière active la réponse immunitaire tout en permettant la mémoire de celle-ci. Il a été identifié des récepteurs spécifiques de cette étape qui jouent un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie mais aussi dans le contrôle de l’inflammation qui pourrait alors devenir chronique. Celle-ci étant responsable des maladies inflammatoires, d’une mauvaise réponse immunitaire contre les pathogènes, voire du développement tumoral. Nous avons développé une thérapie ciblant ces voies et aimerions évaluer sa pharmacocinétique, c’est-à-dire sa demi-vie, et sa pharmacodynamie qui est le reflet de son activité sur nos cellules, étude indispensable pour définir un protocole de traitement ajusté à la demi-vie du traitement.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de définir le profil pharmacocinétique du médicament ainsi que la meilleure voie d’administration. Ceci sera déterminant pour le design du protocole d’injection de la molécule dans un but thérapeutique.
Procédures
L’ensemble des animaux seront soumis à une injection intraveineuse, ou intrapéritonéale, ou sous-cutanée estimée à environ 2 minutes au maximum par injection si pas d'anesthésie, et de 6 minutes si l'anesthésie est requise. Le nombre maximum d'injections sur l'animal sera de 4 injections (2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étude de biodistribution, plusieurs organes seront collectés pour analyse (intervention sans réveil). Les prélèvements seront au nombre maximal de 11 sur animaux vigiles et d'une durée de 2-3 minutes par prélèvement.
Impact sur les animaux
Les études de pharmacocinétique nécessitent des prélèvements fréquents de sang, ce qui générera du stress et de l’inconfort, surtout le premier jour d’injection où 7 prélèvements seront nécessaires.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet après inspection vétérinaire ou de toute autre personne habilitée, exception faite des 50 animaux qui seront mis à mort lors de l’étude de biodistribution après injection et distribution de la molécule pour récupérer des organes d’intérêt pour compléter les analyses. En effet, les animaux du groupe 4 (biodistribution) reçoivent la drogue, sont sortis d'anesthésie puis euthanasiés 24h après injection de la drogue. De fait, ces animaux se trouvent dans la procédure légère puisque réveil après injection puis dasn une procédure sans réveil 24h après. Soit 210 animaux inlcus en procédure légère dont 50 seront sans réveil à l'issue de l'étude de biodistribultion.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique de ce genre nouveau de médicaments et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.
Réduction
Les études de pharmacocinétique chez le rongeur sont souvent reproductibles d’un animal à l’autre. Si lors de l’étape 1, nous pouvons apprécier cette homogénéité interindividuelle, nous pourrons réduire le nombre d’animaux au minimum sans affecter la pertinence statistique et scientifique. Nous avons donc défini le nombre d'animaux par groupe de 5 au minimum à 10 animaux selon la reproductibilité pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d'animaux nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit. En outre, les animaux de l’étape 1 pourront être ré-utilisés pour l’étape 4. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés pourraient se limiter à 105 animaux au total sur les 4 étapes (N=50 pour l’étape 1 & 4 ; si N=5, il y aurait 35 animaux à l’étape 2 et 20 à l’étape 3).
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur la pharmacocinétique des traitements entre les groupes de rats, puis une analyse de méthode d’administration, et enfin une étude pharmacologique après injections multiples. La douleur sera évitée dans la mesure du possible sachant qu’ils recevront les injections de produits à l’aide de seringue dans une fréquence limitée et des prélèvements réduits à leur minimum pour étudier les paramètres cités dans cette demande. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 2 à 3 selon leur poids pour limiter le stress du manque d’espace. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux rats de s’enfouir et se cacher. Enfin, nous utiliserons sans préférence des mâles ou des femelles. En effet, le sexe des animaux n’influent pas sur une étude de pharmacologie et de distribution d’une molécule de ce type. Cette étude visant à mesurer la pharmacocinétique d’une molécule, la souffrance qui pourrait être engendrée par l’étude exclue l’interprétation et la continuité de l’étude.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec le rat qui est un modèle de référence pour la recherche préclinique et notamment les études de pharmacocinétique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car c’est à cet âge que l’on évalue communément une pharmacocinétique chez l’animal.
Caractérisation de modèles murins d’autisme et développement de nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'autisme, elles reçoivent des injections répétées, certaines une chirurgie stéréotaxique pour implanter une fibre optique ou une canule, puis passent des tests de comportement social, moteur et d'anxiété, le porteur reconnaissant des douleurs post-opératoires et des risques d'hémorragie ou d'infection. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" et présente les bénéfices thérapeutiques comme une perspective.
Objectifs
La prise en charge des patients souffrant de troubles autistiques nécessite le développement de nouveaux traitements pharmacologiques visant à soulager leurs déficits comportementaux. Le projet proposé a pour objectif (1) une meilleure compréhension des substrats biologiques de ces pathologies, (2) la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles animaux des troubles autistiques présentant une bonne homologie avec les conditions cliniques, et (3) l'évaluation in vivo, dans ces modèles, de nouvelles stratégies thérapeutiques, le tout à des fins strictement scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des gènes impliqués dans le développement de l'autisme et proposera de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager la pathologie.
Procédures
Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudier des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subira une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés, soit via la canule d’injection, soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implantées avec une fibre optique. Nous allons évaluer les compétences sociales des animaux ainsi que leurs compétences motrices et leur niveau d'anxiété. Chaque test sera réalisé une fois, avec une durée maximale de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Pour le groupe d’animaux soumis à des administrations répétées d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale, on ne peut pas exclure une inflammation au niveau du site d’injection. Pour les animaux subissant une administration per-nasale, à l’exception d’un inconfort, ce type d’injection n’est pas connu pour générer d’effets indésirables. L’administration de composés par voie intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésie gazeuse. On peut donc s’attendre à une douleur modérée au niveau du site d’injection ainsi qu’à un inconfort au réveil de l’anesthésie. Les animaux subissant une chirurgie stéréotaxique présenteront une douleur post-opératoire, les conséquences d’une anesthésie, et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection).
Devenir
À la fin de chaque expérience, les animaux seront euthanasiés et les tissus seront prélevés en vue d'expériences ex-vivo ultérieures.
Remplacement
La compréhension des mécanismes causaux de l'autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du comportement des animaux modèles permet de valider l'existence de la pathologie autistique et, le cas échéant, l'efficacité d'une approche thérapeutique. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental : en effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Nous avons ajusté nos effectifs de manière à les réduire au maximum sur la durée totale du projet, tout en assurant la significativité des résultats.
Raffinement
Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes subies par les animaux au cours des expériences. En ce qui concerne l’hébergement, les souris seront regroupées en sociaux de 2 à 4 individus, avec mise à leur disposition du matériel nécessaire pour construire un nid (ouate et cabane en carton), et manipulation quotidienne par le même expérimentateur. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des individus des deux sexes, les testerons dans différentes tâches, et appliquerons les tests statistiques appropriés. Tout au long des expériences, nous surveillerons quotidiennement le bien-être des animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d'injection. Pour les chirurgies, nous mettrons en place une procédure d’anesthésie adéquate (anesthésique associé à un analgésique), ainsi qu'un suivi post-opératoire renforcé. En effet, nous administrerons un traitement anti-inflammatoire aux animaux pour réduire la douleur et effectuerons un suivi quotidien de la cicatrisation de la plaie, du poids et de la posture des animaux. Des points limites appropriés seront définis pour éviter de causer des souffrances inutiles aux animaux. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal, car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.