Rongeurs
Évaluation, dans un modèle de rat et chez le macaque, de l’efficacité et de la toxicité d’une stratégie de thérapie génique pour traiter la maladie de Stargardt.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Macaques à longue queue : 6
170 rats et 6 macaques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les uns et les autres reçoivent une injection de vecteurs de thérapie génique sous la rétine des deux yeux, puis subissent des séries d'imageries et de tests rétiniens sous anesthésie, répétés jusqu'à quinze fois chez les macaques, ainsi que des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de tester l'efficacité d'un traitement de la maladie de Stargardt chez les rats et sa toxicité chez les macaques, que le porteur juge indétectable chez les rongeurs. Il présente la rétine comme non reconstituable in vitro et retient le macaque pour son œil proche de celui de l'humain.
Objectifs
La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.
Procédures
(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Injection intramusculaire d'un traitement immunosuppresseur: Geste réalisé sur animaux vigiles (sous contention dans leur cage), pour les macaques une fois avant l'injection du vecteur, puis une fois par semaine pendant les 5 semaines suivant l'injection du vecteur. (v) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 10 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide après les chirurgies car les animaux seront sous anesthésie gazeuse.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Ce nombre basé sur celui de nos précédentes études, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 2 animaux par groupe, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voire de décider d'une mise à mort prématurés.
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.
Traitements des lésions coliques radio-induites par médecine régénérative combinée à la thérapie cellulaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 036 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen sous anesthésie, des coloscopies pour l'administration d'un patch ou d'un gel, puis un prélèvement sanguin terminal, l'irradiation pouvant toucher l'intestin grêle et provoquer un amaigrissement et un gonflement abdominal irréversibles. L'objectif déclaré est de tester des traitements régénératifs contre les lésions du côlon provoquées par la radiothérapie chez des patients atteints de cancer pelvien. Le porteur affirme qu'évaluer un tel traitement exige un modèle animal intégré et que les organoïdes ne sont pas techniquement possibles ici.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer les bénéfices thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ainsi que des molécules anti-inflammatoires et antifibrotiques lorsqu'elles sont intégrées dans un dispositif médical innovant auto-enroulé ou dans une solution liquide gélifiante à 37°C. L'objectif principal est de traiter de manière ciblée et locale les lésions colorectales radio-induites, en favorisant la régénération tissulaire et en réduisant l'inflammation et la fibrose associées à ces lésions. Par conséquent, ce projet vise à améliorer la qualité de vie des hommes et des femmes atteints de radioproctopathie.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche scientifique vise à apporter plusieurs bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites dans le côlon, notamment : - Meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites : Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites dans le côlon. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, ainsi que l'évolution de ces lésions au fil du temps. Cela permettra une détection précoce plus précise et une intervention thérapeutique plus efficace. - Développement d'un traitement préventif : Le projet vise à développer des approches thérapeutiques préventives pour réduire le risque de lésions radio-induites dans le côlon. Cela pourrait inclure l'utilisation de molécules spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres stratégies novatrices visant à protéger les tissus normaux contre les effets néfastes de la radiothérapie. Un tel traitement préventif pourrait contribuer à améliorer la qualité de vie des patients en limitant les lésions radio-induites. - Développement d'un traitement curatif de la radioproctopathie : la radioproctopathie désigne les lésions radio-induites spécifiquement localisées dans le colon descendant-rectum. Le projet vise à développer des traitements curatifs ciblant cette condition. Cela pourrait impliquer l'utilisation de molécules thérapeutiques spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres approches novatrices pour promouvoir la guérison des lésions, réduire l'inflammation, restaurer la fonction normale du colon et éviter la fibrose. Cette approche curative pourrait améliorer la qualité de vie des patients et réduire les complications à long terme. En somme, les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Il comprend une meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites dans le colon, ainsi que le développement de traitements préventifs et curatifs pour la radioproctopathie. Ces avancées contribueront à améliorer les résultats cliniques, à réduire les effets indésirables de la radiothérapie et à améliorer la qualité de vie des hommes et femmes atteints de cancer pelvien.
Procédures
- Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Coloscopie sous anesthésie gazeuse, d'environ 10 minutes, une ou deux fois selon le groupe pour l’administration du traitement (patch ou gel). - Prélèvement de 10 ml de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Les deux modèles d’irradiation localisée du colon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. La mise en place du système enroulé se fait sous coloscopie avec anesthésie, de même pour le liquide gélifiant qui sera administré par voie rectale sous anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de valider in vivo sur un modèle de pathologie radio-induite cliniquement relevant l’efficacité de traitements locaux combinés. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique d’un traitement, il est nécessaire d’utiliser un modèle intégré in vivo. De plus l’effet de ces traitements, pour qu’ils soient pertinents, nécessitent leur interaction avec les différents compartiments du côlon, condition retrouvée chez le modèle animal intégré. D'autre part, l'utilisation des organoïdes pour la réalisation de ce projet n'est actuellement pas techniquement possible, car il est nécessaire d'obtenir une monocouche orientée de cellules.
Réduction
Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 10 à 20 individus selon le paramètre utilisé. Une analyse sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). De plus, des dispositifs d'enrichissement seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.
Choix des espèces
Le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique, en raison de sa similitude avec l'être humain dans l'élimination des toxicités. Le protocole d’irradiation proposé a été mis au point au laboratoire chez le rat. La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. En outre, nous utiliserons des animaux de 275 g à 300 g pour les différentes études citées ci-dessus (rats à l’âge adulte). Pour la mise en culture des CSM (hors du champ d’application), nous utiliserons des rats GFP mâles ou femelles d6 semaines provenant de notre élevage interne. La multi-potentialité des CSM et leur capacité réparatrice est réduite avec l’âge, nous isolerons donc les CSM à partir de rats juvéniles.
Interaction neuro-immune dans les ilots pancréatiques chez la souris 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que 3 630 d'entre elles seront mises à mort dès le départ parce que leur génotype ne convient pas, les autres subissant un régime gras de douze semaines, des jeûnes, de nombreuses injections et prélèvements sanguins, une chirurgie abdominale et une perfusion intracardiaque. L'objectif déclaré est d'étudier le dialogue entre les macrophages et les nerfs des îlots du pancréas, en conditions normales et de diabète. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur des modèles animaux.
Objectifs
Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.
Procédures
Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).
Impact sur les animaux
-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.
Devenir
Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.
Remplacement
Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.
Neuroprotection dans le cadre de l’hypoxieischémie néonatale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
650 rats, des nouveau-nés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une ligature de la carotide suivie d'une hypoxie leur provoque des lésions cérébrales que le porteur reconnaît irréversibles, avant l'administration de lactate, des examens d'IRM sous anesthésie et des tests de réflexes, de mémoire et de dépression avec restriction alimentaire. L'objectif déclaré est d'évaluer des stratégies de neuroprotection contre l'hypoxie-ischémie du nouveau-né humain, dont un complément alimentaire pour la femme enceinte. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne remplace le cerveau "dans son intégrité" et renvoie au long terme l'application clinique.
Objectifs
L’hypoxie-ischémie néonatale est un problème de santé publique majeur tant par son occurrence (1-6 cas pour 1000 naissances) que par sa létalité et par les troubles cognitifs et/ou infirmités motrices qu’elle engendre. Elle est caractérisée par une diminution du flux sanguin cérébral au niveau du cerveau du nouveau-né. La seule thérapie actuellement appliquée est l'hypothermie thérapeutique modérée (diminution de la température corporelle de quelques degrés pendant 3 jours maximum), mais environ la moitié des nouveau-nés n’y répondent pas favorablement. Les objectifs de ce projet sont de développer des stratégies de neuroprotection dans le contexte de l'hypoxie-ischémie néonatale, sur un modèle de ratons. Pour répondre aux objectifs, les effets neuroprotecteurs du lactate (substrat énergétique neuronal, administré par voie intrapéritonéale) et de polyphénols (administrés dans l'eau de boisson de la mère) seront évalués.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont : - le développement d’un complément alimentaire, riche en polyphénols, destiné à la femme enceinte pour prévenir les dommages induits par une hypoxie-ischéime néonatale - les résultats préliminaires de l'injection de lactate chez le rongeur permettront la mise en place d’une étude préclinique chez le porc, dont la physiologie est plus proche de l'humain. A long terme, cette neuroprotection de l’administration de lactate pourra être testée en clinique.
Procédures
Pour l'induction de l'hypoxie-ischémie, les animaux subiront une chirurgie puis une hypoxie. L'hypoxie-ischémie ser suivie par une hypothermie. Les animaux subiront une procédure chirurgicale (ligature de l'artère carotide commune ; réalisée une fois d'une durée inférieure à 10 minutes). Une hypothermie modérée sera mise en place à la sortie du caisson d'hypoxie-ischémie (1 fois, durée : 2 h). Une injection intra-péritonéale sera rélisée afin d'administrer le lactate (réalisée juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivant, durée : 2 s). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire de diffusion sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (durée : 30 - 45 min). Ils effectueront aussi des examens par résonance magnétique nucléiare fonctionnelle sous anesthésie administrée en intra-veineux (1 fois, à 45 jours d'âge, durée : 2 h). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces (durée : 5 min) et de mémoire (durée 10 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (durée : test échelonné sur 3 jours ; durée du test : 10 min).
Impact sur les animaux
Lors de précédents projets, il a été noté une perte de poids chez un faible nombre de ratons, dans les 48-72 h suivant l’hypoxie-ischémie. Dans le caisson d'hypoxie-ischémie, tout comme lors de l'hypothermie, des difficultés respiratoires pourraient subvenir. L'administraton de lactate par injection intrapéritonéale pourrait engendrer une légère douleur due à l'insertion de l'aiguille. La réponse à l'hypoxie-ischémie est variable d'un individu à l'autre : dans de rares cas, des lésions cérébrales importantes pourraient subvenir. Elles représenteront un point limite. Un stress lié à l'anesthésie durant l'IRM, une perturbation du rythme cardio respiratoire entraîneront un arrêt de la séance d'imagerie. Les tests comportementaux pourraient être vecteurs de stress pour les ratons. La restriction alimentaire associée à la mesure d'un état dépressif pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 130). L'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.
Remplacement
Des modèles d’hypoxie cellulaires existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de l’hypothermie et de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par (i) le fait que la compétence dans le modèle d’hypoxie-ischémie chez le rat est maîtrisée au laboratoire (pas de mise au point nécessaire), (ii) nous disposons de nombreux contrôles antérieurs (moins de contrôles à refaire), (iii) l'imagerie par résonance magnétique de diffusion ou fonctionnelle est une technique d’investigation non invasive et permet donc une suivi dans le temps des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux, (iv) l'utilisation d'outils statistiques.
Raffinement
La chirurgie sera réalisée sous anesthésie ; une injection d'analgésique locale sera réalisée avant l’incision et avant la suture. Les pertes de poids seront surveillées et à partir d'un certain point seront considérées comme atteignant un point limite. Des difficultés respiratoires post-opératoires entraîneront l'arrêt de la procédure. Les examens d'IRM seront réalisés sous anesthésie générale. Une modification du rythme cardiaque ou du rythme respiratoire entraînera l'arrêt de l'expérimentation. L'utilisation de gel ophtalmique durant les examens d'IRM préviendra le risque de sécheresse oculaire. L'IRM permet la quantification des volumes lésionnels.Le volume des lésions sera calculé, et au delà d'un certain pourcentage l'animal sera considéré comme atteignant un point limite. Une surveillance particulièrement accrue sera mise en place pour les 5 jours post-opératoires (couleur de la peau, estomac plein, mouvements, interactions avec la mère et les autres membres de la portée). Tous les tests de comportement seront réalisés par un unique expérimentateur, et dans une salle unique dédiée, permettant une habituation des animaux aux manipulations et à l’individu lui-même. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l’animal représentera un point limite. Au niveau de l’hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. Lors de ces observations quotidiennes, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés.
Choix des espèces
Le rat Wistar est utilisé depuis plusieurs années dans ce modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. Nous souhaitons suivre les animaux par IRM à 4 stades de développement: - sur des ratosns âgés de 7, 9 et 30 jours, par IRM de diffusion afin d'évaluer l'effet neuroprotecteur précoce des traitements administrés en phase aigüe de la pathologie (3 h et 48 h) et à 30 jours afin d’évaluer les effets neuroprotecteurs à long terme ; l’IRM fonctionnelle permettra, chez les ratons âgés de 50 jours d’évaluer les effets de la neuroprotection sur le remodelage des circuits neuronaux et la récupération fonctionnelle.
Développement de vaccins mRNA de nouvelles générations contre la tuberculose
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
1 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après deux à trois injections de candidats vaccins ARN, la moitié est infectée par aérosol avec le bacille de la tuberculose puis mise à mort quatre semaines plus tard, les souris qui perdent du poids pouvant l'être plus tôt. Le porteur indique tester une vingtaine de candidats au service de l'objectif de l'OMS "En finir avec la tuberculose d'ici à 2030". Il affirme qu'une réponse immunitaire protectrice ne peut être validée que sur un "organisme entier" et retient la souris comme "meilleur compromis éthique".
Objectifs
La tuberculose reste un problème majeur en santé publique touchant des millions d’individus. L’infection par Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose, est généralement traitée par antibiotiques. Cependant, ces bactéries présentent actuellement des niveaux alarmants de résistances à ces antibiotiques, constituant une menace majeure pour la santé et la sécurité sanitaire. Il y a donc urgence à développer des traitements alternatifs. Si les vaccins sont reconnus comme des outils très efficaces pour atténuer la résistance aux antibiotiques, la mise au point d'un vaccin efficace contre les bactéries intracellulaires telles que Mycobacterium tuberculosis, reste à développer. En effet, le seul vaccin actuellement approuvé contre la tuberculose est une souche de Mycobacterium bovis atténuée (BCG). S'il est efficace chez les jeunes enfants, son efficacité chez les adultes, reste insuffisante pour induire une protection efficace. Le développement d’un vaccin antituberculeux efficace produisant une immunité protectrice à tous les âges est donc une priorité absolue pour endiguer la propagation de la tuberculose résistante aux antibiotiques afin d’atteindre l'objectif défini par l'Organisation Mondiale de la Santé "En finir avec la tuberculose d'ici à 2030". L’objectif de ce projet est de développer de nouveau vaccins antituberculeux efficaces en utilisant des approches innovantes. Le but du projet est de produire des vaccins mRNA permettant l’expression des antigènes de Mycobacterium tuberculosis définis et de tester l’efficacité de ces vaccins dans des modèles animaux. Les bénéfices du projet seront la production de vaccins antituberculeux protecteurs efficaces contre des souches de Mycobacterium tuberculosis résistantes aux antibiotiques. Une fois défini, ces vaccins seront testés dans des essais cliniques chez l’homme pour être développés pour la population humaine. Il est prévu dans le projet de tester une vingtaine de candidats vaccins dans des expériences de protection chez la souris.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à la production de vaccins antituberculeux protecteurs efficaces contre l’infection par Mycobacterium tuberculosis, et pourrait ainsi palier le problème du développement de souche bactériennes résistantes aux antibiotiques, qui est un des problèmes majeurs de santé publique défini par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet devrait permettre de définir un protocole vaccinal chez la souris qui nous aidera à déterminer une stratégie vaccinale efficace contre la tuberculose chez l’homme. En effet, dans le cadre d’un projet européen plus large, les formulations vaccinales et le protocole de vaccination, une fois établis chez la souris, seront alors évalués chez le primate non humain et lors d’essais cliniques chez l’homme avec l’objectif de développer un vaccin antituberculeux pour la population humaine. Par ailleurs, en cas de succès, la stratégie de caractérisation et d’élaboration de nouveaux vaccins basé sur l’identification d’antigène et d’expression par ARNm pourra alors être utilisée pour la mise en place de nouveaux vaccins contre d’autres infections intracellulaires pathogènes.
Procédures
Pour tous les animaux, 2 à 3 injections de vaccins à l’aide de seringues sur animaux vigiles prenant une dizaine de secondes par animal. Les injections sont espacées de 21 jours. 1 prélèvement sanguin un jour après la dernière injection prenant quelques secondes par animal. Pour la moitié des animaux, une infection par des bacilles tuberculeux par voie aérosol est réalisée ; la durée de l’exposition est d’une vingtaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront 2 à 3 doses de vaccin par voie intramusculaire. Il est maintenant reconnu que les vaccins à base d’ARNm n’entrainent que des effets indésirables légers et plus particulièrement une douleur de courte durée sur le site d’injection lors de la vaccination. D’autre part il est important de noter que les formulations vaccinales seront préalablement testées pour leur biodélivrance et leur toxicité par le laboratoire les produisant. Ainsi, concernant les animaux impliqués dans cette demande, ils ne recevront que des formulations n’induisant que des effets secondaires légers généralement observés lors d’une vaccination. La vaccination des souris n’induit que des douleurs légères. Cependant 4 semaines après la dernière injection, les souris seront infectées par des bacilles tuberculeux. Les souris sont mises à mort 4 semaine après l’infection. Cette période est choisie car cela permet aux bactéries de se multiplier dans les organes sans développer de signe pathologique de la tuberculose. Les dommages et effets indésirables pour les animaux sont donc considérés comme modérés dû à la présence de foyer de multiplication des bactéries dans la rate et les poumons mais sans symptôme pathologique.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux. Ces organes ne pourront être prélevés qu’après mise à mort de l’animal.
Remplacement
Il s’agit ici de tester différentes formulations de vaccins de type ARNm. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules isolées à partir de sang telle que l’expression des ARNm ou l’activation des cellules du système immunitaire seront réalisées in vitro. Cependant, l’induction d’une réponse immunitaire est un phénomène complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires dans différents organes et ne peut être étudiée que dans sa globalité. En effet, il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. L’évaluation de l’efficacité des vaccins sur l’induction d’une réponse immunitaire protectrice devra donc être analysée et validée sur un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos collaborateurs sur la conception d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (5) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiples facteurs caractérisant la réponse immunitaire pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un environnement protégé et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La durée et les doses sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Néanmoins, des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences. Pour les souris qui seront infectées par Mycobacterium tuberculosis, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base d’expériences passées, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids sera effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal sera mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). La perte de poids ou l’apparition de symptômes importants suggérant une souffrance de l’animal caractérisée par un score défini par une table de score clinique seront considérés comme point limite; les animaux concernés seront mis à mort. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel.
Choix des espèces
La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel comme modèle pour l’infection par Mycobacerium tuberculosis permettant d’analyser les réponses immunitaires dirigées contre le bacille, mais aussi qui permet d’analyser et d’évaluer le contrôle de la prolifération bactérienne dans les organes cibles, et donc l’effet protecteur. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, de nombreux outils très performants sont disponibles pour l’analyse de réponses immunitaires chez la souris nous permettant d’avoir des réponses claires et précises en utilisant de faibles quantités d’échantillons et permettant ainsi d’analyser différents facteurs. De plus de nombreuses données sont déjà disponibles (par notre expérience et dans la littérature) nous permettant de valider les résultats par comparaison. Le système immunitaire étant parfaitement développé chez les individus matures, nos travaux sont effectués sur des animaux adultes. Les souris de 6 semaines seront livrées. Les manipulations sont toujours planifiées après avoir laissé une semaine d’adaptation aux animaux.
Interactions entre le microbiote intestinal et la microglie, les astrocytes et les neurones dopaminergiques de l’aire tegmentale ventrale et modulation des effets de récompense de la nicotine
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Privation de nourriture pendant une nuit, jusqu'à huit administrations par sonde gastrique en une journée, antibiotiques ou régime riche en graisse pendant dix jours à quelques semaines, chirurgie intracérébrale : selon les groupes, 2 402 souris subissent ces procédures, en plus de tests comportementaux de mémoire, de sociabilité, d'anxiété, de dépression et de sensibilité aux effets des drogues, sans que le texte nomme ces tests. La déclaration compte 749 souris en souffrance légère et 1 653 en souffrance modérée, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau, dans un projet sur l'influence des bactéries intestinales sur les effets de récompense de la nicotine. Le porteur qualifie de "minimes" les "dommages escomptés pour les animaux", et retient parmi les points limites une perte de poids de plus de 20 %, une diarrhée de plus de deux jours sous antibiotiques, un poids dépassant 45 g ou une locomotion "fortement compromise" par le régime gras. Les effets possibles cités comprennent aussi ceux d'une vagotomie, section du nerf vague, que la description des procédures ne mentionne pas.
Objectifs
L’objectif général du projet est de comprendre dans quelle mesure et comment les bactéries intestinales influencent les processus associés à l’addiction aux drogues et plus particulièrement à la nicotine, composé actif principal du tabac. En effet l’addiction reste un enjeu de santé publique majeur, le tabac étant la principale cause de mortalité précoce, et il reste beaucoup à découvrir sur les mécanismes qui sous-tendent cette pathologie. Tous les individus n’ont pas le même risque de développer une addiction après avoir expérimenter une drogue telle que la nicotine. Plusieurs facteurs génétiques et environnementaux contribuent à augmenter ce risque chez certains individus. De plus en plus d’études montrent un rôle très important de la flore intestinale dans le fonctionnement du cerveau et dans le développement de maladies psychiatriques y compris dans l’addiction. Cependant les mécanismes d’action mis en jeu sont encore très peu connus. On sait que les drogues activent le circuit dit de récompense au sein du cerveau. En plus des neurones, le cerveau comprend également un ensemble de cellules dites gliales qui servent de support à l’activité neuronale et mettent en jeu des mécanismes de défense. Il est connu que ces cellules influencent la réponse des neurones du circuit de la récompense aux drogues. De plus en plus d’études suggèrent que les bactéries intestinales influencent fortement leur activité. Ainsi, les objectifs précis du projet sont de caractériser l’impact de la flore intestinale d’une part sur l’activité des neurones et des cellules gliales du circuit de la récompense, et d’autre part de comprendre le lien mécanistique qui existe entre flore intestinale, cellules gliales et neurones en réponse à la nicotine.
Bénéfices attendus
L’addiction aux drogues représente l’un des enjeux majeurs des systèmes de santé, et leur prévalence s’accroit, sans aucun traitement suffisamment efficace à ce jour. Le projet permettra d’identifier de nouveaux facteurs de prédisposition à l’addiction et en particulier à l’addiction à la nicotine, principal composé actif du tabac. A court terme, il permettra d’identifier dans quelle mesure et comment les bactéries intestinales modifient la réponse du cerveau à la nicotine. Identifier les souches de bactéries, leurs métabolites et mécanismes d’action impliqués dans les effets des drogues, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique, pourra ouvrir à plus long terme sur de nouvelles stratégies d’intervention pour aider à la prévention et /ou à la cessation du tabagisme basées notamment sur l’utilisation de prébiotiques et /ou de probiotiques précis et sur des modifications des habitudes de vie ayant une action directe sur la composition de la flore intestinale. .
Procédures
Les animaux seront soumis à différents tests comportementaux, à raison d’un test maximum par jour, dans le but de tester leurs fonctions locomotrices, mnésiques et sociales, leurs états émotionnels de type anxieux ou dépressif, ainsi que leur sensibilité aux effets hédoniques des drogues. Ils seront soumis à une administration intragastrique; dans la majorité des cas elle sera réalisée une fois par jour pendant 10 jours et une minorité d’animaux recevront jusqu’à 8 administrations en une journée mais seulement une journée. Une minorité d’animaux devront être privés de nourriture mais uniquement pendant une nuit et l’eau sera laissée à volonté. L’exposition à des antibiotiques ou à une nourriture riche en graisse sera réalisée pendant 10jours à quelques semaines chez certains animaux. En outre, certains animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale au cours une infusion ou implantation intracérébrales sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer.
Impact sur les animaux
Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests. Les différents modèles et protocoles qui seront employés pour perturber la flore intestinale ont déjà été testés et validés, et n’ont pas été associés à des altérations majeures de la santé physique ou émotionnelle des animaux. Ils ont été choisi sur cette base. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort de type anxieux passagers chez certains animaux soumis à une nourriture riche en gras, exposés à l’administration intra-gastrique, ou à certains tests comportementaux de dépression, ou à une privation alimentaire pendant une nuit, ou à une chirurgie intracérébrale ou de vagotomie. Ces nuisances seront gérées par des points limites spécifiques et précoces et par un protocole d’anesthésie et d’analgésie en cas de chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les cerveaux devront être prélevés pour des expériences ex vivo.
Remplacement
Pour évaluer le rôle des bactéries intestinales, et identifier les mécanismes mis en jeu, sur les processus associés à la dépendance à la nicotine, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un circuit intestin-cerveau fonctionnel, et d’étudier les comportements de prise volontaire et les états psychologiques associés aux effets hédoniques des drogues au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique entre intestin et cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisants pour en faire des modèles d’étude pertinents.
Réduction
La méthodologie statistique a été discutée en amont de la soumission de ce projet avec des biostatisticiens. Dans les études prévues, notamment l’étude des comportements, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 10 et 12 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions (parfois en deux réplicas) pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Pour l’étude de l’expression des gènes, les experts en bioinformatique préconisent un minimum de 4 animaux par condition. Un groupe contrôle sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de souris sont couramment utilisées. Notre expérience dans les différents aspects du projet nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions avec des statistiques appropriés, pour mesurer l’effet des différents facteurs et de leur interaction possible sur les différents paramètres d’intérêt. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y a aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Nous enrichirons le milieu avec du coton, et/ou des igloos en carton, et nous nous rapprocherons du comité responsable du bien-être animal pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués. Si apparition des signes d’infection et en accord avec le vétérinaire des antibiotique seront donnés. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement. Au moins une fois par jour les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression facial très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, ou diarrhée systématique pendant plus de deux jours suite aux antibiotiques, ou prise de poids supérieure à 150% ou poids dépassant 45g ou locomotion fortement compromise suite au régime riche en graisse ). Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les mécanismes et comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions physique et émotionnelle reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler l’activité du cerveau, la flore intestinale et le génome sans dommages durables pour les individus. La souris est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier la flore intestinale et son lien avec le cerveau. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), afin que le cerveau soit suffisamment développé notamment pour l’étude de leur comportement Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement
TRAITEMENT DE LA DOULEUR REFRACTAIRE PAR STIMULATION ELECTRIQUE DU CINGULUM ANTERIEUR : étude des effets cliniques et des mécanismes d’action dans un modèle murin de douleur chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes intracérébrales et, pour la moitié, une ligature du nerf sciatique induisant une douleur neuropathique que le porteur indique ne pas soulager parce qu'elle est "l'objet de l'étude". Elles passent ensuite le test de la douleur Von Frey à six reprises et un test d'anxiété avec privation de nourriture pendant vingt-quatre heures. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de la stimulation cérébrale profonde utilisée chez des patients souffrant de douleurs chroniques rebelles.
Objectifs
Objectifs : Explorer chez la souris, dans un modèle de douleur chronique, l’action de la stimulation cérébrale profonde sur le plan électrophysiologique (activité́ électrique cérébrale), immunohistochimique (expression et localisation de molécules d'intérêts) et comportemental (tests de perception de la douleur et d'anxiété). Rationnel de l’étude : La douleur neuropathique chronique concerne 7% de la population française et la moitié de ces patients ne sont ni soulagés par les médicaments ni par les thérapies non médicamenteuses. Récemment, des patients souffrant de douleurs chroniques réfractaires ont été implantés par électrodes intracérébrales (technique chirurgicale qui existe de plus de 30 ans qui vise à implanter des électrodes dans des régions profondes du cerveau pour moduler électriquement l’activité́ de circuits neuronaux) dans le cortex cingulaire antérieur (structure cérébrale impliquée dans la notion de perception de douleur notamment son caractère émotionnel ) permettant une bonne amélioration des douleurs mais également aussi de la qualité́ de vie. Cette technique semble donc une thérapie prometteuse pour traiter ces douleurs rebelles invalidantes. Les mécanismes d’action de la stimulation du cortex cingulaire antérieur sont encore non étudiés et mal compris. Le but de cette étude est donc de comprendre ces mécanismes et pour cela nous aurons recours à un modèle murin de douleur chronique afin d’évaluer les effets par analyses histologiques, comportementales et électrophysiologiques. La compréhension de ces mécanismes permettrait également d’optimiser cette thérapie.
Bénéfices attendus
L’intérêt de cette étude est double : La première étant de comprendre les mécanismes de la stimulation cérébrale profonde (analyse des modifications biochimiques et électrophysiologiques). La deuxième étant qu’à partir des résultats obtenus par ces analyses, les structures cérébrales impliquées et modulées seront mieux identifiées. Ces modifications seront mises en corrélations avec les données obtenues en imagerie fonctionnelle chez l’humain, permettant de déterminer plus précisément une cible, des paramètres de stimulation, et la sélection des patients.
Procédures
Tous les animaux auront une chirurgie sous anesthésie générale, avec implantation d’électrodes de stimulation cérébrale profonde et d’électrodes d’enregistrement, puis une chirurgie au niveau de la patte droite, dont la moitié auront une ligature au niveau du nerf sciatique. La durée globale estimée est de 1h30. L’ensemble des souris subiront 6 fois le test de douleur (Von Frey) la durée sera d'une vingtaine de minutes environ avec acclimatation de 90 minutes. L’ensemble des souris suivront le test d’alimentation supprimée par la nouveauté́, il s’agit d’un test de comportement (c'est le seul test qui permet de vérifier l'état d'anxiété́ avec un rôle minimal de la locomotion, et donc d'éviter un biais dû à la douleur neuropathique induite dans la patte ligaturée). Les souris seront privées de nourriture 24 heures avant le test pour obtenir une motivation suffisante pendant le test, elles auront un accès libre à l'eau. Ce test sera réalisé́ 3 fois à 10, 12 et 14 semaines. Les enregistrements électrophysiologiques auront également lieux à 10, 12 et 14 semaines, avec une durée de 30 minutes à chaque session sur animal vigile et concerne toutes les souris.
Impact sur les animaux
Les effets possibles et directs de la chirurgie sont une difficulté dans les déplacements des animaux, une douleur, une perte de poids, stress et comportement anormal mais devrait rapidement disparaitre. Ensuite, dans les 10-15 jours suivant la ligature il y aura le développement de la douleur neuropathique, plus particulièrement une allodynie mécanique mais qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Les 2 tests comportementaux pourraient induire un stress et un comportement anormal pendant la période du test (notamment les 24h sans nourriture mais avec boisson) et devrait disparaitre après le test. La connexion pour faire les enregistrements électrophysiologiques pourrait induire un stress passager pendant la durée des enregistrements, mais notre expérience montre que les animaux s'habituent rapidement à l'appareillage
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En l’absence de système pouvant reproduire in vitro les interactions entre les les régions cérébrales et les effets biochimiques et électrophysiologiques propre à chacune de ces régions, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous pratiquons une gestion éthique de l’élevage qui nous permettra de ne pas générer d’animaux non utilisés. Nous utiliserons indifféremment les males et les femelles qui seront répartis dans les groupes expérimentaux. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire aux études statistiques. Les techniques chirurgicales et d’investigations sont bien maitrisées par les évaluateurs afin de ne pas avoir de pertes issues d’erreurs liées au manque d’expérience.
Raffinement
Afin de limiter les stress lors des tests comportementaux il sera effectué une habituation aux tests. Les surveillances régulières des animaux : tous les jours pendant 4 jours après la chirurgie puis 5 fois par semaine, nous permettront d’identifier les souris souffrantes, nous sacrifierons les souris qui atteindront le point limite. Les souris opérées auront une surveillance post opératoire avec soulagement antalgique post opératoire immédiat (buprenorphine 0,1 mg/kg ip), puis carprofen 40 mg/L pendant 3 jours dans l'eau de boisson. Une grille d’évaluation a été établie avec des points limites et des actions précises.
Choix des espèces
La souris est très utilisée dans les études fondamentales et comportementales. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et nous avons des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’homme. Nous utiliserons des souris adultes C57Bl/6J des 2 sexes qui sont des souris couramment utilisées pour évaluer des procédures chirurgicales et de douleurs. Le modèle de souris douloureux chronique par ligature du nerf sciatique de manière unilatérale est un modèle validé et très fréquementt utilisé pour évaluer l’efficacité d’un traitement antalgique. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes C57Bl/6J, d’âge minimum de 8 semaines (poids de la souris >20 grammes). Le choix de souris adultes est de pouvoir au maximum être en accord avec la réalité clinique (age adulte et maturation du système nerveux central) de manière que les souris puissent supporter les anesthésies et les chirurgies.
Innovation dans le traitement du cancer du poumon par le développement de vaccins innovant basés sur la technologie ARN
- Recherche appliquée
- Cancers
2 476 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée par injection, puis elles reçoivent jusqu'à quatre vaccins ARN administrés dans le poumon sous anesthésie et subissent des séances répétées de tomographie et des prélèvements sanguins. Le porteur affirme sortir les animaux de l'expérimentation avant que les tumeurs n'atteignent leur physiologie, si bien qu'aucune modification du comportement ne serait détectable. Il présente comme espoir de "soigner un nombre important de patients" et revendique l'impossibilité de tester cette preuve de concept ailleurs que sur un système vivant complet.
Objectifs
Les vaccins à ARN messager ont permis de juguler la mortalité liée au SARS-COV2 dans les pays développés. Ces technologies basées sur les ARN ont permis pour la première fois de produire un vaccin efficace en un temps extrêmement court. Cette adaptabilité des technologies ARN les rend très attractives pour la lutte contre le cancer. Ce projet a pour objectif à court terme de prouver qu’il est possible d’induire une réponse immunitaire anti-tumorale spécifique dans le cancer du poumon en utilisant une nouvelle approche vaccinale. Notre stratégie expérimentale doit donc permettre de : 1) Fournir la preuve de concept qu’il est possible de soigner le cancer du poumon en utilisant une stratégie de vaccin ARN. 2) Caractériser précisément les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cette nouvelle stratégie vaccinale pourrait fonctionner de façon optimale.
Bénéfices attendus
Par le développement de cette nouvelle technologie vaccinale, nous pensons être en mesure de soigner un nombre important de patients pour lesquels il n’existe pas de traitement efficaces sur le long terme à ce jour. Ces investigations réalisées chez la souris seront une pierre angulaire dans l’implémentation d’un vaste projet impliquant 7 équipes en Europe et visant à aboutir sur la validation d’une nouvelle stratégie vaccinale. En somme, si comme nous l’espérons, nous fournissons par ce projet la preuve que notre nouvelle formulation vaccinale peut permettre de lutter plus efficacement contre le cancer du poumon, nous serons en mesure de proposer cette technologie aux patients dans un temps très court.
Procédures
La transplantation des lignées tumorales sera effectuée par injection intraveineuses (une fois sur chaque animaux) ou sous-cutanée (une fois par animal). Cette injection nécessite une contention des souris de deux minutes maximum. Une petite proportion des animaux subira un prélèvement de sang par incision de la veine caudale. Ce geste ne sera répété qu’une fois avec un intervalle de deux semaines. Cela nécessite de placer les animaux sous une lampe chauffante durant 5 minute puis une contention de deux minute. La majorité des animaux subiront des tomographies (technique d’imagerie non invasive) permettant de suivre l’évolution de la croissance tumorale nécessitant une anesthésie gazeuse qui aura lieu à une fréquence d’une fois toutes les deux semaines et sera répétée 6 fois maximum. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement. L’administration dans le poumon de notre vaccin sera réalisée sans chirurgie mais demande une anesthésie des animaux. Pour réduire le nombre de d’anesthésies, nous combinerons la vaccination avec la tomographie. Il y aura un maximum de 4 vaccinations par animal espacées de deux semaines. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables pour les animaux sont : - L’initiation et le développement du cancer du poumon. Nous avons adapté nos protocoles et mis en place des techniques de suivi des animaux de sorte que nous considèrerons les animaux seront sortis de l’expérimentation avant que la croissance des tumeurs ne cause une atteinte significative à leur physiologie. Suivant nos procédures, aucune modification du comportement des animaux ni de leur performance physique n’est détectable en lien avec le développement de la maladie car nous arrêtons les protocoles à un stade suffisamment précoce du développement de la maladie. - Une infection au site d’injection ou de prélèvement de sang - Les anesthésies répétées
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour les besoins expérimentaux nécessitant l’accès aux sang, rates, ganglions et au poumons.
Remplacement
Nous développons une approche vaccinale qui a pour objectif de changer les interactions en le l’hôte et la tumeur par le développement d’une réponse immunitaire anti-tumorale. La preuve de concept de notre stratégie ne pourrait donc être réalisée en système in vitro ou par simulation informatique car elle doit être intégrée dans un système physiopathologique complet. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les différentes formulations de vaccins ont été ou sont en cours d’évaluation in vitro. A ce jour nous avons validé 13 formulations et continuons d’en identifier d’autres. Pour des raisons de éthiques et de faisabilité, nous ne dépasserons pas ce nombre de formulation différentes.
Réduction
Le nombre d’animaux sera au maximum de 2476 souris sur 5 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos vaccins. Le nombre d’animaux a été évalué de manière à effectuer des tests statistiques relevant pour définir la significativité de nos résultats. Pour réduire le nombre d’animaux, notre projet est conçu de sorte à ce que les premières étapes de validation permettent de réduire le nombre de conditions possibles par l’optimisation des modèles et la sélection d’une seule formulation de vaccin à partir de 13 candidats validés in vitro. Enfin ce projet a pour but de fournir une preuve de concept dans un modèle préclinique justifiant le transfert de notre technologie chez les patients. Hors comme l’utilisation de ce modèle nécessite un parcours expérimental de 6 mois avec les animaux génétiquement modifiés, nous avons défini une construction de notre projet qui repose sur des étapes de validation de nos candidats vaccin sur des temps cours en privilégiant des procédures ne nécessitant pas d’intervention lourde sur les animaux. Ainsi, même si réduit au maximum le nombre d’animaux reste élevé, nous travaillerons à l’optimisation de l’utilisation de chaque animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés (5 par cage) en milieux enrichis, la durée d’hébergement des animaux est réduite au minimum. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress et d’agressivité. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique, mise en place par la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être envisagée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation. Néanmoins, un arbre décisionnel basé sur le poids, la prostration, la détection de difficulté respiratoire, l’agressivité et l’isolement décidera de l’arrêt de toute expérimentation de l’utilisation d’analgésique voir de la mise à mort des animaux. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans notre étude est le plus relevant pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence des effets vaccinaux sur le long-terme. Ces souris immunocompétentes sont greffées avec des tumeurs murines de même fond génétique. Les souris que nous utilisons offrent à ce jour le meilleur modèle de cancer du poumon autochtone pour adresser les questions biologiques que nous développons ainsi que pour fournir la preuve de concept de l'efficacité de notre nouvelle thérapie. En effet, dans ce modèle, le développement tumoral à lieux dans des individus présentant un système immunitaire intacte mimant parfaitement la maladie humane, non seulement d’un point de vue immunitaire mais aussi au regard des mutations conduisant à l’apparition des tumeurs.
Évaluation d’une stratégie de vaccination par voie buccale contre le virus de l’hépatite B
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
406 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent plusieurs anesthésies générales pour des prélèvements sanguins et l'administration d'un vaccin par voie buccale ou stomacale, afin de tester l'hypothèse qu'une vaccination orale contre l'hépatite B protège mieux qu'une injection dans le muscle. Le porteur indique n'attendre qu'un stress de contention et une inflammation modérée après la vaccination. Il affirme qu'aucune méthode in vitro validée ne peut remplacer l'animal et qualifie le développement de nouvelles approches vaccinales d'"indispensable".
Objectifs
L'hépatite B (HBV) est une infection due à un virus qui attaque le foie. Cela peut causer des problèmes de santé sérieux comme des cicatrices au foie ou même un type de cancer du foie. En 2019, plus de 800 000 personnes sont décédées à cause de cela. Le virus se propage généralement de la mère à l'enfant lors de la naissance ou par contact avec le sang ou d'autres liquides du corps pendant les rapports sexuels non protégés, les piqûres d'aiguilles ou le partage d'objets pointus. Il existe un vaccin pour éviter l'hépatite B. Les enfants reçoivent généralement trois doses de ce vaccin par injection dans le muscle avant d'avoir un an. Parfois, même si on a eu plusieurs doses de vaccin, certaines personnes ne sont pas protégées contre l'infection par le virus. La mise au point d’un vaccin optimisé capable de protéger durablement et effacement contre HBV s'avère être un défi qui nécessite de faire appel aux modèles animaux. Notre hypothèse est qu'une vaccination anti-HBV reposant sur une vaccination par voie buccale est supérieure à une vaccination voie musculaire. Notre objectif sera dans un premier temps de trouver des substances qui aident le vaccin à fonctionner quand il est administré par la bouche. Ensuite, nous étudierons comment la muqueuse de la bouche contribue à l'effet protecteur du vaccin. Pour réaliser ces expérimentations nous allons utiliser un total de 401 souris. Notre objectif sera de diminuer la souffrance des animaux au maximum. Il n'est pas attendu de souffrance particulière des animaux si ce n'est le stress lié à la contention et à l'inflammation modérée associée à la vaccination.. Nous utiliserons des méthodes statistiques pour réduire au minimum le nombre de souris nécessaires. De plus, nous améliorerons leur environnement en enrichissant leurs cages et en surveillant leur santé après la vaccination. L’utilisation des souris pour cette étude est nécessaire car les animaux doivent avoir un système immunitaire intègre pour produire une réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Les vaccins actuels contre l’hépatite B conduisent parfois à une absence de réponse humorale, malgré un schéma vaccinal intensifié (au moins 6 doses de vaccin). Il peut même arriver qu'il n'y ait pas de protection contre l'infection par le virus, malgré une bonne réponse anticorps de l’individu. Par conséquent, le développement de nouvelles approches vaccinales est indispensable pour optimiser la vaccination contre ce virus.
Procédures
L'ensemble des animaux de cette demande d'autorisation subira deux cycles d'anesthésie générale à 14 jours d’intervalle pour la réalisation d'un prélèvement sanguin et l'administration du mélange vaccinal par voie buccale ou stomacale. Les animaux de la procédure 2 subiront tous des prélèvements sanguins sous anesthésie à J28 post-immunisation. Enfin, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Il n'est pas attendu de souffrance particulière des animaux si ce n'est le stress lié aux injections intrapéritonéales pour l'anesthésie (contention et douleur au point de piqure) et à l'inflammation modérée entre 24 et 48 heures suivant la vaccination.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n'existe aucune méthode in vitro scientifiquement validée ni test in vitro connu qui fournirait une alternative à l'expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène de la réponse vaccinale ne peut pas être étudié de manière adéquate in vitro, car il s'agit d'un processus complexe qui ne peut être examiné que chez l'animal, en tenant compte de l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. Par conséquent, l'utilisation d'un modèle expérimental in vivo est un prérequis pour la phase de développement clinique.
Réduction
Pour toutes les procédures, nous avons déterminé le nombre d'animaux en utilisant une approche statistique reconnue. En effet, notre stratégie expérimentale repose sur la comparaison des taux d'anticorps sériques entre les différents groupes d'animaux immunisés. Le test de puissance effectué avec un logiciel spécialisé nous a permis de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs en fonction des hypothèses formulées.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront logés dans des cages collectives avec un environnement enrichi, comprenant des tubes en carton pour se cacher et des briques de bois à grignoter. Une période d'acclimatation d'au moins 7 jours sera observée, durant laquelle aucune intervention technique liée à la procédure expérimentale ne sera entreprise. L'anesthésie et l'administration de la formulation vaccinale seront effectuées par le personnel qualifié, et les animaux seront sous anesthésie lors des actions susceptibles de provoquer du stress ou de la douleur. Une surveillance attentive sera assurée à 24 et 48 heures après l'immunisation des animaux pour détecter tout effet secondaire inflammatoire douloureux potentiel suite à l'injection d'adjuvant. Des points limites suffisamment prédictifs et précoces seront définis dans le but de minimiser la douleur autant que possible.
Choix des espèces
L’espèce souris sera utilisée en raison des données de la littérature déjà existantes sur la vaccination des souris conte le virus de l’hépatite B. Nous travaillerons avec des animaux adultes car l’objectif est le développement d’un vaccin utilisable chez l’adulte.
Validation in vivo d’un nouveau dispositif de mesure de l’élasticité des tissus mous : étude expérimentale sur modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 14
14 rats et 7 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent une plaie cutanée au bistouri sur le dos et une injection intradermique, les souris une injection de médicament anticancéreux destinée à provoquer une nécrose de la peau, pour tester un nouvel appareil de mesure de l'élasticité des tissus comparé à deux dispositifs du commerce. Le porteur annonce des douleurs localisées, une perte de poids modérée et un stress lors des manipulations. Il présente l'outil comme plus simple et moins coûteux et renvoie au conditionnel son application clinique chez l'humain.
Objectifs
La caractérisation des propriétés mécaniques des tissus mous, à l’instar de l’élasticité cutanée, présente un intérêt majeur pour de nombreuses spécialités médicales et chirurgicales. Sur une peau cicatricielle (séquelles de brûlures, cicatrices post-opératoires ou post-traumatiques, cicatrices chéloïdes, greffes de peau, etc.) sa mesure répétée au cours du suivi objective l’efficacité d’un traitement et conforte l’examen clinique. Les technologies actuelles sont cependant imprécises, coûteuses et complexes à manipuler et il n’y a pas de protocole fiable utilisé en pratique clinique pour effectuer cette mesure. L’objectif du projet est de valider un nouveau dispositif de mesure de l’élasticité des tissus mous, indolore et non invasif. Une étude mécanique préalable a été réalisée sur des échantillons inertes mimant des tissus biologiques (Agar Agar de différentes concentrations). Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur tous les échantillons, et de meilleures performances qu'avec les technologiques utilisées actuellement. L'objectif de ce nouveau protocole est de valider ce dispositif sur des tissus biologiques in vivo (modèles murins : la souris et le rat) en le comparant au Cutomètre® et au Myoton®, deux outils permettant la mesure de l’élasticité cutanée et des tissus mous. L’ensemble de ces expérimentations animales permettra d’assurer la cohérence en vue d’un futur essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus après analyses statistiques seront en premier lieu de confirmer l’applicabilité de notre dispositif à l’étude de l’élasticité des tissus mous in vivo sur un modèle murin, ainsi que la simplicité de cette mesure. Nous souhaitons démontrer la précision et la fiabilité de cet outil par comparaison au Cutomètre® et au Myoton®, pour un coût et une complexité de mise en oeuvre moindres. Ces résultats positifs permettront à court terme de développer une étude chez l’homme en pratique clinique usuelle. Notre outil pourrait permettre d’évaluer instantanément et in vivo l’élasticité d’un tissu mou biologique. Il pourra aisément s’intégrer au diagnostic et au suivi thérapeutique de l’ensemble des pathologies nécessitant une évaluation objective de ces propriétés mécaniques, et permettre un gain majeur en qualité de vie pour les patients cibles. Il s’agit d’un dispositif très simple puisqu’il se compose d’une masse équipée d’un ou plusieurs capteurs de force, et est ainsi peu coûteux en comparaison aux technologies déjà présentes sur le marché. A terme, son utilisation pourra s’étendre à d’autres domaines tels que la médecine régénérative, la cosmétologie ou la chirurgie carcinologique, par exemple via la délimitation en temps réel des marges tumorales lorsque celles-ci sont incertaines à l’inspection et à la palpation.
Procédures
Dans le premier protocole, il est effectué sur le dos des rats une perte de substance cutanée rectangulaire (plaie mécanique au bistouri). Elle est réalisée sous sédation chimique, après rasage à la crème dépilatoire et désinfection cutanée. Elle est ensuite recouverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation. Il est également réalisé une injection intradermique ventrale d'un produit volumateur. Dans le second protocole, il est effectué sur le dos des souris une injection intradermique d'un médicament anticancéreux afin d'induire une zone de nécrose cutanée.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus et prévisibles, et cibles des stratégies de raffinement sont : - Douleurs localisées au niveau des zones étudiées (perte de substance cervico-thoracique droite et point d'injection ventral droit chez le rat, zone de nécrose dorsale droite chez la souris) - Perte de poids modérée - Stress majoré lors des manipulations initiales et lors des mesures régulières en cours d'étude.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'étude : 14 rats et 7 souris, au terme des 2 mois de l'étude.
Remplacement
Les alternatives non animales pour notre étude ont été exploitées lors de la phase initiale du projet, lors de l'étude mécanique préliminaire in vitro réalisée sur des échantillons d'Agar Agar de différentes concentrations mimant des tissus biologiques. Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur toutes les concentrations en Agar et de meilleures performances qu'avec les méthodes élastométriques. L'objectif est désormais de valider notre outil sur le modèle animal, afin de le valider in vivo au cours d'un processus de cicatrisation complet. Ces résultats, s'ils sont positifs, permettront à terme de développer une étude chez l'homme en pratique clinique usuelle.
Réduction
Le nombre d'animaux requis pour notre étude a été calculé afin d'obtenir des analyses statistiques significatives en ce qui concerne la précision de nos mesures. Il est cohérent avec les protocoles suivis dans les études animales comparables. La durée totale d'étude de 2 mois a été retenue pour permettre un recul suffisant après cicatrisation, et ne pas prolonger inutilement le protocole. Elle est cohérente avec les délais des études comparables compris entre 1 mois 1/2 et 3 mois.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation des animaux avec des conditions de lumière et de température standardisées sera respectée en début d'étude, afin de limiter le stress animal. Une sédation sera réalisée avant chaque geste invasif, adaptée à la douleur. Concernant la perte de substance réalisée pour le protocole n°1, elle sera couverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation à la phase initiale. Passé le délai de 14 jours, et puisque les mesures seront alors plus espacées, un pansement hydrocolloïde transparent sera appliqué entre chaque mesure. En cas de douleur postopératoire, un antalgique sera administré à l'animal selon les bonnes pratiques usuelles. La réaction locale aux points d'injection sera étudiée à chaque temps et des photographies seront réalisées. Le choix d'une perte de substance dorsale a été fait pour éviter le risque de grattage de la lésion par le rongeur. Les cages comporteront des tiges de coton pour nidifier et des maisonnettes en carton.
Choix des espèces
Les modèles murins (souris et rats) sont très adaptés au suivi cicatriciel et permettent des manipulations aisées. Il s'agit des modèles principalement utilisés dans les études comparables de la littérature. Les rats et les souris seront à l'âge adulte. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des animaux plus jeunes, et leur surface corporelle ainsi que leurs capacités de cicatrisation seront optimales à ce stade de développement.
Effet de la délétion du récepteur intestinal de l’insuline sur l’obésité nutritionnelle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse pour reproduire une obésité, elles subissent des mises à jeun de quatorze heures, dix-sept contentions pour quatorze prélèvements sanguins en quatre jours, des administrations orales et des injections, avant un prélèvement de sang et d'organes terminal. Le porteur décrit comme seuls effets attendus le stress lié à l'identification, à l'anesthésie, à la contention et aux prélèvements. Il revendique l'identification des cellules intestinales de l'action de l'insuline comme "essentiel" pour concevoir des stratégies thérapeutiques, retombée formulée au futur.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité, grâce à l'utilisation de divers modèles de souris soumises à un régime riche en graisse afin de mimer l'obésité nutritionnelle chez l'Homme. L’intestin, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote, assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Cette altération de la barrière intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité, cet état inflammatoire favorisant la prise de poids et certains désordres métaboliques associés. L’insuline contrôlant la fonction barrière de l'intestin chez la souris, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, hyperglycémie) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité. Nous espérons montrer que le dévéloppement d'un diabète (perte d'action de l'insuline) entraine une détérioration de la fonction barrière de l'intestin qui favorise ou accélère la prise de poids et l'augmentation de la glycémie. Notre projet identifiera les cellules intestinales impliquées dans l'action de l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.
Procédures
Identification ( 1 contention de 30 secondes pour 1 prélèvement ), Sur animaux vigiles : 1 mise a jeun de 14h, 1 mise à jeun de 4h, 17 contentions de 30 secondes pour 14 prélèvements de sang (en 4 jours), 1 administration orale de 45 secondes de produit et 2 injections de 45 secondes de produit. Sur animaux anesthésiés : un prélèvement sanguin (30 secondes par souris).
Impact sur les animaux
Il y a un stress lors de l'identification, de l’anesthésie, de la contention, des prélèvements sanguins et des injections.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques et inflammatoires (obésité/diabète). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.
Réduction
L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.
Raffinement
La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.
étude des mécanismes de la fibrose tubulaire rénale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
1 037 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un baguage à l'oreille et l'ablation d'un bout de queue, des injections rétro-orbitaires quotidiennes sous anesthésie, jusqu'à huit prélèvements urinaires en cage métabolique avec six heures d'isolement à chaque fois, et un prélèvement sanguin terminal, le protocole induisant une insuffisance rénale. Le porteur indique viser une meilleure compréhension des mécanismes de la fibrose du rein, les retombées pour les patients humains restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que les approches in vitro ne reproduisent pas la complexité de l'organe et retient la souris pour ses outils génétiques, son temps de génération court et ses portées nombreuses.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques sont un enjeu majeur de santé publique. Les traitements actuels sont basés sur une immunosuppression agressive par les corticoïdes et des agents anti-cancéreux ciblant le système immunitaire, aux effets indésirables importants. Les reins ont une certaine capacité de régénération mais suite à un stress continu et grave, le rein cicatrise mal conduisant à ce qu'on appelle la fibrose tubulo-interstitielle. La fibrose et l’inflammation chronique entrainent une altération structurelle et fonctionnelle du rein jusqu’à induire une insuffisance rénale chronique. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques est donc impérative en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prémunir les reins de cette fibrose délétère. Nos données préliminaires dans des modèles cellulaires ont identifié des mécanismes potentiels de protection ou au contraire favorisant la fibrose rénale. L’objectif principal de ce projet est donc de valider nos résultats en étudiant ces mécanismes chez la souris dans un contexte plus représentatif de l'organe dans son entier.
Bénéfices attendus
A terme ces travaux permettront une meilleure compréhension des mécanismes conduisant au développement de la fibrose rénale afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’insuffisance rénale chez l'homme.
Procédures
Une identification (baguage à l'oreille + prélèvement d'un morceau de queue
Impact sur les animaux
Identification: baguage + prélèvement d'un morceau de queue (
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les reins.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches in vitro pour analyser les mécanismes de l'atteinte rénale. Les cibles identifiées sont d'abord testés sur des cellules en culture. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales comme les interactions avec le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous avons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés
Raffinement
les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal- être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les cages sont enrichies en coton et bâton de bois. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des lésions rénales au cours de l'hypertension artérielle car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les pathologies étudiées touchent essentiellement les adultes donc nous réaliserons les modèles expérimentaux chez des souris adultes.