Rongeurs
Evaluation in vivo de polymères à visée thérapeutique dans la prévention et le traitement de névrome chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
746 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit la section puis la réparation d'un nerf sous anesthésie et des mesures de conduction nerveuse par stimulation électrique, pour tester des colles et implants censés prévenir les névromes après amputation. Le porteur indique que la section nerveuse affecte la mobilité de la patte opérée et provoque léthargie, douleur et perte de poids. Il affirme qu'un modèle mammifère est "essentiel" et que ces études ne peuvent se faire ni ex vivo ni in vitro, faute de reproduire un "organe entier".
Objectifs
La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation des tissus et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. Notre objectif est de développer des systèmes de réparation atraumatiques sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales ont été développés pour différentes applications dont la réparation des nerfs périphériques et ont démontré une nette efficacité lors de précédentes études. Le but de ce présent projet est d’élargir l’indication de ces systèmes de réparation à des scénarios cliniques très spécifiques comme le traitement et la prévention de névrome notamment dans le cadre d’amputations. L’amputation concerne plus d’un million de patient par an à l’échelle mondiale, qu’elle soit liée à des traumatismes ou à des maladies chroniques comme le diabète ou le cancer. Après une amputation, il est fréquent que les nerfs sectionnés soient à l’origine : 1) du phénomène de douleur du membre fantôme qui correspond à des douleurs ressenties dans la partie du corps amputée. Ce phénomène affecte 95 pour cent des patients en postopératoire immédiat avec une persistance au long cours chez la moitié d’entre eux. 2) de la formation d’un névrome (48,7 pour cent des patients). Il s’agit d’une tumeur bégnine formée par des fibres nerveuses qui se sont développées de façon anarchique. Un névrome s’accompagne de douleurs fulgurantes et peut nécessiter une nouvelle intervention chirurgicale pour le retirer. En clinique, les chirurgiens utilisent la réinnervation musculaire ciblée pour traiter les nerfs lors d’une amputation pour prévenir l’apparition de névromes. Le but de ce projet est de valider in vivo l’efficacité de nos systèmes de réparation sur les nerfs dans un modèle de réinnervation musculaire ciblée chez le rat.
Bénéfices attendus
Si la régénération nerveuse est confirmée avec nos systèmes de réparation, une solution atraumatique pourra être proposée aux chirurgiens pour éviter l’apparition de névromes post-amputation sans créer de traumatismes supplémentaires aux tissus.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie unique d’une durée de 30 minutes environ de transection puis réparation du nerf, effectuée sous anesthésie générale gazeuse et locale associée à une prise en charge de la douleur pré et postopératoire. Nous évaluerons à trois reprises (avant, pendant et après la chirurgie) la conduction nerveuse par électrophysiologie (stimulation électrique des nerfs) sous anesthésie générale pour une durée de 20 à 40 minutes. A la fin de la période de maintien prévu, ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire. Au cours de la chirurgie, des nerfs vont être sectionnés ce qui va impacter la mobilité de l’animal au niveau de la patte opérée. Le muscle n’étant que partiellement dénervé au cours de la chirurgie, l’impact sur la mobilité sera limité.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer l’efficacité de nos systèmes de réparation sur la régénération nerveuse.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères et les designs les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet doit nous permettre d’évaluer une régénération nerveuse ce qui ne peut être fait que dans un individu intégré et autonome.
Réduction
Au maximum, 746 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres designs ou des temps de suivi tardifs. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=10 animaux par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats/cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée avant la chirurgie puis 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour évaluer la récupération de l’animal puis 1 fois/semaine. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifiées seront déposés directement dans le fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront également ajoutées à l’alimentation usuelle pour diversifier l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance par la mise en place de points limites. Le scoring sera effectué 1 fois par semaine et servira de support au suivi quotidien des animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin, d’autant plus que nous travaillerons sur des nerfs. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est très important pour les temps de suivi tardifs de notre étude.
Impact du vieillissement des cellules oligodendrogliales dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
949 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles sont génotypées par prélèvement d'oreille ou de queue, opérées par injection dans le cortex moteur et soumises à des tests d'apprentissage sur roue avec isolement partiel, pour étudier le rôle du vieillissement de cellules gliales dans le déclin cognitif. Le porteur indique que l'isolement peut induire des "troubles dépressifs" et que la chirurgie provoque une douleur atténuée par des antidouleurs. Les souris des procédures sont euthanasiées pour prélèvement des tissus, tandis qu'une cohorte de lignées est conservée pour des études ultérieures.
Objectifs
La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge, en particulier dans la maldie d'Alzheimer. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules oligodendrogliales dans la plasticité cérébrale et la cognition. Dans ce projet, nous allons tenter de comprendre si le phénotype vieillissant des cellules oligodendrogliales peut directement participer à l'apparition de symptômes dans le modèle murin d'Alzheimer, notamment en accélérant la neurodégénérescence axonale. Ce projet est divisé en plusieurs étapes, à partir d'un modèle murin d'Alzheimer 5xFAD : 1/ Caractériser l'effet du vieillissement oligodendroglial sur les capacités cognitives ; 2/Identifier les gènes dérégulés dans les cellules oligodendrogliales ; 3/ Caractériser le rôle de gène cibles oligodendrogliaux dans l'apparition de déficits cognitifs. En caractérisant l'effet du vieillissement des cellules oligodendrogliales sur la cognition, notamment dans un modèle murin de maladie d'Alzheimer, notre projet pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact, pour une maladie encore sans traitements efficaces.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des cellules oligodendrogliales et des voies dérégulées dans l'apparition des déficits cognitifs dans un modèle murin de maladie d'Alzheimer. À long terme : développer des stratégies translationnelles basées sur une réactivation et rajeunissement des cellules oligodendrogliales pour ralentir la neurodégénérescence dans la maladie d'Alzheimer, et donc retarder l'apparition de symptômes chez les patients. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage après sevrage. D'autres devront être génotypés avant sevrage, en prélevant un échantillon de queue (sous anesthésie, 5 secondes, une fois). Des animaux subiront une anesthésie à l'isoflurane. Certaines souris seront injectées chirurgicalement dans la zone corticale motrice (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Des souris seront soumises à des tests comportementaux afin d'évaluer leur capacité d'apprentissage moteur (2 semaines, isolement partiel, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être euthanasiées (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Lors du génotype avant sevrage ou pendant la chirurgie, on pourrait noter quelques saignements. Lors des tests comportementaux, les souris seront partiellement isolées et peuvent donc présenter des troubles dépressifs. Après la chirurgie, les animaux pourraient ressentir de la douleur, qui devrait etre limitée par les traitement anti-douleur prévus.
Devenir
Tous les ensembles expérimentaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Une cohorte des lignées de souris générées Tet1cKOxAD sera conservée dans notre animalerie, pour des études ultérieures.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions cognitives au niveau de l'organisme et comment pouvoir les maintenir malgrès le déclin observé avec l'âge. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques et de voies moléculaires dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et de cellules souches pluripotentes induites humaines. En effet, pour optimiser notre approche lentivirale, nous allons d'abord tester notre protocole sur des lignées cellulaires Olineu, afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 5 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes. Pour les animaux sacrifiés pour les cultures de tissus, nous devons mettre en commun 3 tissus de souris par expérience. Notre expérience avec ce modèle de co-culture suggère de prévoir 4 répétitions par test in vitro, pour chaque lecture (immunohistochimie, électrophysiologie,...).
Raffinement
Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers formés et chargés de veiller à leur bien-être. Pour la procédure d'apprentissage de la roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. Il est à noter que les cages de comportements sont transparentes, donc l'isolement est partiel : les souris sont isolées mais maintiennent un contact visuel et auditif auprès de leur cohorte (10-20 souris). Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans sa cohorte de groupe. Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris recevront une injection d'anti-douleurs et seront sous anesthesie profonde. Pendant la chirurgie, nous placerons l'animal sur un tapis chaufant et appliquerons une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et couvrirons les yeux pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, l'animal sera placé sous une lampe chauffante jusqu'au réveil anesthésique. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage pour les animaux, afin de fournir un soutien trophique général et de garantir que la perte de poids est limitee. Si l'état général du corps atteint des points limites, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. L'existence de lignée knock-out ou modèles de la maladie d'Alzheimer nous permet de recréer des modèles pertinents dans notre établissement. Pour les procédures comportementales, les souris adultes seront utilisées à l'âge de 4 mois. Pour les procédures utilisées en culture, les souriceaux de 7 jours seront utilisés pour collecter les tissus cérébraux.
Etude des polyphénols alimentaires sur l’hémostase et le risque hémorragique sous anti-coagulants chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tués sous anesthésie, sans réveil, après des prélèvements et des mesures d'hémostase, 80 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Pendant cinq semaines, ils reçoivent chaque jour sous contention un anticoagulant par la bouche et subissent une prise de sang, pour mesurer l'effet d'une supplémentation alimentaire en polyphénols sur leur coagulation et leur risque de saignement. Le porteur les héberge seuls, pour éviter que des comportements agressifs ne provoquent blessures et saignements sous anticoagulant et pour recueillir leurs urines de 24 heures, avec pour enrichissement un tunnel et des balles en acier. Il annonce aussi que le projet contribuera à la "mise en place d'un modèle animal" destiné à tester d'autres facteurs nutritionnels ou agents pharmacologiques présentant "un bénéfice ou un risque hémorragique".
Objectifs
Le saignement sous anti-coagulants représente une des premières causes iatrogènes d’hospitalisation d’urgence en France. Une marge thérapeutique étroite et des effets indésirables potentiellement graves des anti-coagulants conduisent les praticiens à prendre en considération les interactions possibles entre anti-coagulants et alimentation du patient. L’objectif du projet est l’évaluation des effets d’une supplémentation nutritionnelle en polyphénols sur les paramètres de l’hémostase et le risque d’hémorragie chez le rat sous anti-coagulant. En effet, de nombreuses études montrent que les polyphénols agiraient favorablement sur certains facteurs de risque cardiovasculaires dont l’amélioration de la fonction endothéliale . Bien qu’encore peu documenté au niveau clinique, les flavonoïdes, une famille de polyphénols, auraient également un impact direct sur l’hémostase (ensemble des phénomènes qui permettent l’arrêt d’une hémorragie). Elle est divisée en deux temps successifs : l’hémostase primaire correspondant à la formation du « clou plaquettaire » et l’hémostase secondaire, dite « cascade de coagulation ». Murphy et al. ont mis en évidence un impact des flavonoïdes sur l’hémostase primaire en exerçant une action antiplaquettaire. Plus récemment, des études ont mis en évidence une réduction de la coagulation plasmatique par les flavonoïdes qui exercent des activités anti-facteur IIa ou anti- facteur Xa. De plus, notre équipe a montré un impact des flavonoïdes sur la structure du caillot de fibrine formé lors de l’hémostase secondaire, résultant en un caillot moins dense et plus perméable. L’ensemble de ces résultats sont en faveur d’une diminution des évènements thrombotiques et d’un allongement de l’hémostase primaire , qui pourrait constituer un facteur de risque de saignement, notamment chez les sujets sous anti-coagulants. Ainsi, il apparaît pertinent de porter une attention particulière au risque hémorragique en cas de supplémentation nutritionnelle riche en polyphénols.
Bénéfices attendus
Les bénéfices qui découleront de ce projet sont la contribution à la compréhension de l’impact des polyphénols de notre alimentation sur l’hémostase, le risque hémorragique, et la réactivité vasculaire. Le projet contribuera également à la mise en place d’un modèle animal permettant de tester d’autres facteurs nutritionnels ou agents pharmacologiques présentant un bénéfice ou un risque hémorragique (anticoagulants ou anti-agrégants plaquettaires…).
Procédures
Les animaux, sous contention (d'une durée d'environ 30s) recevront une administration quotidienne d'anticoagulant par voie orale pendant 5 semaines. Une prise de sang unique sera réalisée pour s'assurer du taux plasmatique d'anticoagulant au cours du traitement (durée du geste = moins de 2 minutes). En fin d'études, les animaux seront anesthésiés (5 minutes) pour la réalisation de prélèvements et des mesures d'hémostase avant sacrifice sans réveil préalable pour la collecte des tissus.
Impact sur les animaux
La mise sous anti-coagulants ainsi que la supplémentation nutritionnelle en polyphénols (à des doses équivalentes à celles des aliments sources) ne sont pas suspectées d’induire d’effets indésirables. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés lors de l’administration par voie oral des traitements anti-coagulants afin de s’assurer de l’absence d’effet secondaire (hémorragie spontanée, …). Par ailleurs, l''hébergement en cage individuelle transparente n'est connu pour induire de baisse de l'ingéré. Par précaution, la masse corporelle ainsi que leur consommation alimentaire seront contrôlées de façon bi-hebdomadaire dans le cadre de se projet.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de collecter le plasma et les tissus vasculaires nécessaires à l'exploration des fonctions tissulaires impliquées dans l'hémostase et la réactivité vasculaire.
Remplacement
Les méthodes d’étude de l’hémostase in vitro, sur des restes de tubes de plasma humain par exemple, ne permettent pas la prise en compte du métabolisme des flavonoïdes. En effet, les flavonoïdes de notre alimentation sont soumis à différentes modifications de structure par les enzymes digestives et métaboliques, résultant en la génération de formes nommées métabolites dans la circulation sanguine. De plus, les approches in vitro ne prennent pas en compte les effets des métabolites des flavonoïdes sur les paramètres cellulaires régulant l’hémostase (ex : facteurs endothéliaux …). De plus ces méthodes permettent d’estimer de façon indirecte le risque d’hémorragie. Par conséquent, à ce jour, aucune méthode de remplacement n’est envisageable pour répondre aux objectifs scientifiques de notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux dans l’étude proposée a été déterminé sur la base des données de la littérature ayant mis en évidence une modification significative du temps de saignement chez le rat anti-coagulé à l’aide d’une procédure similaire. Par ailleurs, des critères secondaires d’analyses tels que l’évaluation de l’hémostase primaire et secondaire ainsi que l’évaluation de la réactivité vasculaire ont été inclus dans l’étude afin de ne pas répéter cette expérimentation à ces fins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés individuellement afin d’éviter tout comportement agressif pouvant engendrer des blessures et saignement notamment lors des traitements sous anti-coagulants. De plus, l’individualisation des animaux est nécessaire pour le suivi de la prise alimentaire et le recueil des urines 24h. Cet hébergement se fera dans les conditions standards et réglementaires. Toutefois, ces animaux bénéficieront d’attention particulière notamment en termes d’offre d’objets d’enrichissement (tunnel et balles en acier) avec des alternances hebdomadaires. Un suivi quotidien des animaux, imposé par ailleurs par le déroulé du protocole, permettra de compléter la surveillance de leur bien-être.
Choix des espèces
Les rats « Sprague-Dawley » ont été largement étudiés avec des similitudes physiologiques avec l’homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Ces animaux sont également utilisés dans les études publiées sur le temps de saignement ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux agés de 8 semaines (poids < 200gr) de façon similaire aux études précédentes publiées.
Enseignements pratiques de physiologie animale et de pharmacologie : apprentissage des savoir-faire en expérimentation animale
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 70
282 souris et rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Les rats reçoivent la pose de cathéters et un prélèvement à la carotide, les souris des injections et une ischémie du rein gauche par clamp, gestes réalisés par des étudiants de licence pour apprendre les techniques de base de l'expérimentation animale. Le porteur reconnaît qu'un réveil prématuré ou une surdose d'anesthésique peut survenir et qu'il arrive qu'un animal meure pendant la séance. Il indique que les étudiants s'exercent d'abord sur des rats en plastique, la plupart se destinant à la recherche sur le vivant.
Objectifs
L’objectif est principalement d’inculquer aux étudiants des notions d’expérimentation animale requises dès la troisième année de licence de biologie et d’autre part d’illustrer les cours théoriques de physiologie animale et de pharmacologie par des applications techniques concrètes réalisées sur le rat et la souris.
Bénéfices attendus
Acquisition des techniques de base d’expérimentation animale sur animal vigil (préhension, contention et techniques d’injections les plus courantes) et sur animal anesthésié (pose de cathéters, prélèvement carotidien).
Procédures
Les séances avec contention et injections sur animal vigil impliquent un stress chez l’animal qui est minimisé par l’acclimatation des animaux à leur environnement une semaine avant les séances de travaux pratiques et par un apprentissage des étudiants sur un modèle inerte de rat plastique. Après une analgésie préopératoire de buprénorphine, les rats seront anesthésiés à l’isoflurane dès leur entrée dans la salle de TP, puis pose de cathéters, injection et prélèvement unique de sang (1-2 mL) par le cathéter carotidien. Chez les souris après analgésie/anesthesie, initiation aux techniques d’injections intrapéritonéale et sous-cutanée et induction d’une ischémie du rein gauche en appliquant un clamp sur l'artère rénale et la veine pendant 20 minutes. La nuisance principale est un réveil prématuré de l’animal lors de la séance d’expérimentation ou au contraire une surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire de l’animal. Selon les cas, l’enseignant réajuste la dose d’anesthésique et le cas échéant, opère une réanimation.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n’est attendue sur les animaux. Le stress à la contention est minimisé par l'apprentissage de la réglementation et de l'éthique lors d'une séance de présentation en cours magistral et d'une démonstration préalable par l'enseignant. Un apprentissage sur un modèle d'imitation (animal inerte conçu avec un matériau qui confère la sensibilité spécifique d'un animal vivant) permet d'acquérir les compétences nécessaires pour manipuler et réaliser les gestes de routine d'expérimentation (injection et pose de catheter), sans la nécessité d'utiliser un animal vivant. Cet entrainement dans une séance qui précède la séance d'expérimentation sur l'animale vivant permet de réduire à la fois le stress de l'étudiant et chez l'animal. L'effet indésirable, bien que rare, est l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Une réanimation est donc réalisée par l'enseignant avec un contrôle du débit d'anesthésiant, mais il arrive qu'un animal meurt pendant une séance d'expérimentation.
Devenir
Procédures sans réveil, compte tenu des manipulations expérimentales et des injections réalisées par les étudiants, les animaux ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure par l’enseignant.
Remplacement
Afin d’acquérir les compétences techniques d’expérimentation animale, les étudiants s’entraineront tout d’abord sur des modèles de rats en plastique. Cette initiation leur permettra de se familiariser avec les structures anatomiques et les gestes techniques (contention et techniques chirurgicales) avant de pratiquer sur les rats véritables dans une expérimentation réalisée dans la demi-journée qui suit.
Réduction
Le nombre d'animaux choisi est le nombre minimal permettant d'acquérir les techniques de bases en expérimentation animale afin de sensibiliser et former nos étudiants, qui pour la majorité d’entre eux sont destinés à poursuivre leur carrière dans le domaine de la recherche en laboratoire sur le vivant.
Raffinement
Aucune souffrance n’est causée aux animaux. Pour l’ensemble des procédures, les animaux sont anesthésiés afin d’empêcher toute douleur ou souffrance de l’animal en fonction des gestes réalisés et jusqu’à leur mise à mort à la fin de l’expérimentation. Un enseignement spécifique de la réglementation et des principes éthiques relatifs à l’expérimentation animale est réalisé avant les séances de travaux pratiques. Au début de chaque séance d'expérimentation, les étudiants sont sensibilisés au respect des animaux et à la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles avec une démonstration réalisée par l’enseignant. Pour la première séance d’expérimentation sur le rat, l’initiation au préalable sur des modèles plastiques permet de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux anesthésiés/analgésiés.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les modèles animaux les plus utilisés en recherche et le choix d’animaux jeunes adultes permet une manipulation plus aisée et un meilleur contrôle de l’anesthésie.
Etudes de protéines membranaires dans la douleur inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent dans le coussinet une injection d'agent inflammatoire, puis subissent l'application de chaleur infrarouge et d'une force mécanique sur les pattes, la douleur spontanée provoquée étant l'objet même de l'étude. Le porteur indique que l'inflammation persiste pendant les tests et que les mêmes individus servent à plusieurs procédures. Il affirme qu'"il n'existe pas d'alternative à l'expérimentation animale pour observer la sensibilité douloureuse".
Objectifs
Les protéines que nous étudions sont connues pour leur implication dans la régulation des messages nerveux, notamment des neurones. Nos recherches nous mènent à penser que ces protéines sont impliquées dans la transmission de messages douloureux. Elles pourraient donc représenter des cibles pharmacologiques importantes pour l'Homme dans le domaine de la douleur, nous étudierons les effets de l'absence de ces protéines sur la sensibilité de ces souris.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait mettre en évidence le rôle de ces protéines dans la régulation de la douleur. Ainsi, ce projet pourra apporter des informations nouvelles sur le fonctionnement de la douleur et ouvrirait la voie à la recherche de nouveaux anti-douleurs chez l'Homme.
Procédures
Pour une partie des animaux : isolement pour habituation dans la cage d'observation (45 min, aucun geste), puis injection intra plantaire unique puis remise en cage isolée pour observation (dure totale de la procédure : 1h45). Pour une autre partie des animaux : 2 testes réalisées en alternance séparés de 24h (durée totale de la procédure 22 jours) 1e test: injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de chaleur infra rouge avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. 2e test : injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de force mécanique avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. Les injections unique intra-plantaires seront réalisées en quelques secondes dans le coussinet de la patte de chaque animal. Chaque jour les animaux seront placés dans cages en plaxiglass et seront donc isolés 1h par jour, tous les jours, durant les tests mécaniques et thermiques.
Impact sur les animaux
Les animaux seront isolées de leur congénaires pendant les tests, et pourront présenter des signes de douleur spontanées, ceci étant le but recherché de l’expérience. Lors de l'analyse de l'activité, les animaux pourront présenter des signes de stress, de mobilité réduite ou de stéréotypies (comportements qui seront justement mesurés), mais ne présenteront plus de comportements douloureux spontanées. Pendant toute la durée des tests, les animaux présenteront une inflammation de la patte injectée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer leurs organes pour analyses biochimiques et moléculaires. Au total, 232 animaux seront mis à mort pour prélever leurs organes.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer le fonctionnement d'une protéine dans les voies de la douleur. Il n’existe pas d’alternative à l’expérimentation animale pour observer la sensibilité douloureuse, il nous est donc impossible de remplacer les animaux pour étudier les voies de la douleur.
Réduction
Nous avons pris plusieurs mesures de réduction du nombre d'animaux. Tout d'abord,le nombre d'animaux maximum a été défini par une analyse données statistiques. Puis, tous les animaux mis à mort à la fin de chaque procédure serviront également au prélèvements de leurs organes pour analyse, nous nous limitons à analyser les organes des animaux testés et nous n'utiliserons donc pas d'autres animaux pour ces analyses. Nous avons également conçu nos procédures de manière à utiliser le moins d'animaux possibles, nous utiliserons notamment les mêmes animaux pour différentes procédures divisant ainsi par 2 le nombre d'animaux.
Raffinement
Nous avons défini et mettrons en place de points limites précis précoces et adaptés pour chaque procédure afin de garantir une prise en charge adéquate des animaux en cas de souffrance/douleur ou inconfort. Plusieurs facteurs sont susceptibles de moduler la sensibilité, c’est pourquoi une attention particulière sera apportée à l’hébergement et aux bien-être des animaux tout au long de leur vie. Les animaux sont hébergés à cinq par cage, dans des cages mis sur portoirs ventilés avec enrichissement adéquat, nourriture et boisson ad libitum et seront suivi tous les jours. Un des principaux enjeux sera de diminuer le niveau de stress des animaux, afin d’améliorer les conditions de vie des animaux et de maitriser les facteurs pouvant influencer la sensibilité. En cela, les animaux seront habitués plusieurs fois aux environnement des tests pour diminuer le stress des animaux aux nouveaux environnements. Nous avons également concu des procédures les plus courtes possibles pour étudier la douleur inflammatoire.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce constitue le meilleur modèle pour notre étude car les caractéristiques des souris de la souche utilisée sont largement documentées. La souris possède également une reproductibilité rapide et fiable, constituant un atout pour développer efficacement notre projet. Les tests de sensibilité sont bien adaptés pour les souris et suffisamment documentés. Nous possédons déjà les souris génétiquement modifiées indispensables à notre étude. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 12 semaines. Ce choix est motivé par la volonté de nous soustraire des variations dues aux processus développementaux ou liés au vieillissement.
Etude de l’efficacité antitumorale d’un ADC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées et porteuses d'une tumeur greffée, elles reçoivent des injections sous anesthésie, des prélèvements de sang et des séances d'imagerie, pour tester un composé associant anticorps et anticancéreux dit "théranostique". Le porteur indique qu'une gêne liée à la tumeur, jusqu'à un début de nécrose, est possible. Il affirme qu'aucune méthode alternative, "même les plus complexes", ne remplace ce modèle animal, l'efficacité étant déjà validée in vitro.
Objectifs
Certains composés anticancéreux sont très toxiques et peu solubles : ils sont couplés à des anticorps, spécifiques des tumeurs, afin de faciliter leur accumulation principalement dans la tumeur. Ces composés appelés ADCs (antibody- drug conjugates) peuvent être marqués par un fluorophore afin de suivre en temps réel la substance active : ils deviennent alors des composés dits "théranostiques" (Possédant une activité thérapeutique et un marqueur de monitoring). Dans ce projet, nous souhaitons apporter la preuve de concept d'une nouvelle association anticorps-composé anticancéreux (ou ADC). Nous souhaitons tout d'abord étudier la pharmacocinétique et la distribution de nouveaux ADCs, puis en étudier l'efficacité anti-tumorale et la toxicité globale. Nous projetons de travailler avec un maximum de 4 ADCs différents.
Bénéfices attendus
Selon l'anticorps utilisé, plusieurs types de cancers peuvent être ciblés. Aujourd'hui nous démarrons le projet avec un anticorps ciblant les tumeurs du sein et de l'ovaire. Notre principal objectif est de valider la nouvelle construction chez l'animal car les essais sur cellules sont très favorables. Nous souhaitons obtenir un composé théranostique (thérapeutique et diagnostique), avec une forte activité anti-tumorale et une bonne tolérance générale. Il est crucial d'améliorer la thérapie antitumorale en général, et en particulier dans le cadre des cancers qui métastasent rapidement dans le cerveau comme les tumeurs du sein. Un agent théranostique permet en plus de son activité de valider le ciblage de l'ensemble des lésions.
Procédures
Les animaux seront soumis à des préhensions, des anesthésies et des injections (sous cutanée (x1) et intraveineuse (maximum 3)) sous anesthésie gazeuse. 24 animaux seront soumis à 4 prélèvements de 50 uL de sang sous anesthésie gazeuse. Les imageries seront réalisées sous anesthésie gazeuse : elles durent quelques secondes. L'ensemble de ces gestes a une durée individuelle inférieure à 5 minutes.
Impact sur les animaux
L'immunodéficience des souris pourrait être source de nuisance. Lors des anesthésies, préhensions, injections IV, du stress et/ou des douleurs légères pourraient survenir. Le composé en lui meme pourrait entrainer des nuisances : toutefois la dose choisie sera testée sur un nombre restreint d'animaux (1ere étude d'imagerie), ce qui devrait nous assurer de sa tolérance. Cette dose est, de plus, choisie par rapport à l'état de l'art qui utilise principalement ce dosage (voire des doses supérieures). Une gêne liée à la tumeur en sous cutané pourrait subvenir telle qu'un défaut de marche, ou un début de nécrose, ce qui sera pris en compte dans les points limites.
Devenir
Tous sont anethésiés puis mis à mort en vue du prélèvement et de l'analyse des organes ex vivo.
Remplacement
L'efficacité des composés est déjà validée in vitro sur des cellules qui expriment l'antigène reconnu par l'anticoprs et son inefficacité est démontrée lorsque les cellules n'expriment pas la cible. Pour aller plus proche de la clinique humaine, notre projet étant une investigation thérapeutique et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, et microenvironnement tissulaire, système d'élimination de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les expériences de cinétique sanguine et de biodistribution avec 3 animaux par groupe pour obtenir des résultats fiables et permettre une analyse statistique, tout en limitant le nombre d'animaux utilisé. Chaque composé sera testé individuellement afin de maitriser le nombre d'animaux à gérer; lorsqu'un composé sera validé comme "ADC théranostique pertinent", l'étude sera arrêtée ce qui pourrait réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes.
Raffinement
Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse notamment en mettant en place des points limites (mesures de la taille tumorale, état général de l'animal, suivi du poids de l'animal). De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés par groupe, dans des cages qui comportent des objets permettant de se cacher et de faire des abris (tunels, coton etc). L'ensemble des personnels qui manipulent les animaux ont été formés au respect et au bien être des animaux, ou sont sous surveillance de personnes qui ont été formées. Les souris immunodéprimées étant fragiles, elles sont maintenues dans un environnement protégé (portoir ventilé).
Choix des espèces
Les souris permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Souris de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines.
Etude du potentiel régénératif de sous populations de cellules souches cutanées
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
2062 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles subissent des blessures cutanées créées par biopsies au dos, des greffes posées à l'aide d'un punch, des injections et le port d'une attelle, pour étudier le potentiel régénératif d'une sous-population de cellules souches de la peau. Le porteur indique que ces atteintes provoquent une douleur limitée par des antidouleurs et une gêne au déplacement. Il affirme que le processus de cicatrisation "ne peut donc pas être réalisé in vitro", la peau restant impossible à reconstituer dans sa complexité.
Objectifs
Les mécanismes de régénération chez les mammifères adultes représentent un enjeu de santé publique majeur. En effet, lors d’une blessure cutanée la réponse par défaut est une réparation rapide de la barrière avec défaut de formation des annexes. La cicatrice est donc un marqueur de la réparation restaurant la seule fonction de barrière. La régénération qui se produit au cours de la vie restaure elle toutes les fonctions cutanées (sensorielles, thermorégulatrices etc…). La compréhension des mécanismes fondamentaux qui régissent la régénération par opposition aux mécanismes de réparation représente de nouvelles perspectives de thérapies régénératives dans le cadre du traitement des grands brulés et des blessures chroniques. L’épiderme constitue un modèle de choix afin d’étudier ces processus. En effet, l’épiderme se régénère tout au long de la vie grâce à la présence de cellules souches (bien caractérisées et très hétérogènes) en son sein et se répare après blessure avec formation d’un épiderme dépourvu d’annexes (c’est à dire sans follicule pileux ni glande sébacée) grâce à la participation de ces mêmes cellules souches. Ce projet concerne l’étude du potentiel régénératif d’une sous population de ces cellules souches de l’épiderme. Nous avons identifié au laboratoire une sous population cachée qui pourrait constituer un réservoir régénérateur. Pour l’étudier, nous combinerons des modèles de traçage génétique à des tests de cicatrisation et de greffes permettant d’évaluer le potentiel régénératif des cellules souches d’intérêt.
Bénéfices attendus
L’identification d’une sous population au potentiel régénératif puissant ouvrant des nouvelles perspectives thérapeutiques en médecine régénérative pour les grands brulés et les patients souffrant de blessures chroniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie afin de créer des blessures dorsales par biopsies, la durée de la chirurgie sera de 7 à 10 minutes par souris. Les souris recevront aussi des injections sous cutanées d’analgésiques ou de composants pharmacologiques au cours de l’anesthésie d'une durée de quelques secondes (2 ou 3 secondes). Les injections d’analgésiques sous cutanées seront poursuivies les 3 jours suivant la chirurgie.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures sont de classe sévère mais réalisées sur des animaux à phénotype non dommageable. Les biopsies cutanées représentent une atteinte à l’intégrité de l’animal toutefois la cicatrisation est un mécanisme rapide donc la douleur est limitée. Les animaux recevront des antidouleurs afin de limiter la souffrance pour les 3 jours qui suivent la blessure. L’attelle ralentit le processus de cicatrisation en limitant la contraction dermique mais ne produit pas d’autres effets. Pour ce qui concerne les grandes blessures, des pansements seront positionnés et changés tous les jours pendant 5 jours. Cette période peut entrainer la gêne du déplacement et éventuellement des démangeaisons. En ce qui concerne les expériences de greffes, la nuisance attendue est comparable aux autres procédures de cicatrisation car la nuisance repose sur le punch réalisé pour implanter la chambre de greffe et qui fait lui aussi l’objet d’une injection d’analgésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les échantillons et réaliser les analyses histologiques nécéssaires à l'analyse des résultats.
Remplacement
Le processus de cicatrisation nécessite tous les compartiments cutanés et ne peut donc pas être réalisé in vitro car il est aujourd’hui impossible de reconstituer la peau dans sa complexité hypoderme/derme/épiderme.
Réduction
Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles, ce qui permet d’utiliser la totalité́ des animaux générés. Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs d'après des calculs de statistiques prédictives. Certaines parties de cette procédure pourront être annulées en fonction des résultats obtenus. Il est donc fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inferieur à la fin du projet.
Raffinement
Les animaux seront traités avec un inducteur pharmacologique tous les deux jours afin d’éviter le dessèchement cutané car le traitement appliqué est resuspendu en éthanol absolu. De plus, après chirurgie, les animaux seront rassemblés en accordance avec leur genre. Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en œuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé́ ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnement enrichi (maisonnettes et buchettes). Lorsque les souris sont isolées nous veillerons à ce que l'enrichissement (buchettes, maisonettes, patchs de coton) soit bien présent dans la cage d'hebergement.
Choix des espèces
Nous utiliserons des modèles murins car ils sont plus simples à manipuler que d’autres modèles cutanés tels que les mini-cochons. De plus, les modèles murins génétiquement modifiées permettent de réaliser des expériences de traçage génétique qui donnent un accès unique au devenir des cellules au cours de processus intégrés et complexes dans un contexte in vivo. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines. Ainsi nous utiliserons des souris adultes mais en phase de repos pour l’activation des cellules souches du follicule pileux. De plus, dans la procédure 7 nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines mais aussi des souris à P2 (soit des souriceaux agés de 2 jours Post natal jour2=P2) afin d’utiliser leur potentiel morphogénique puissant. Nous utiliserons des mâles et des femelles au cours de ces procédures. Notre expérience dans le domaine cutané nous a permis de déterminer que le genre à cet âge-là n’influence pas la réponse et le potentiel des cellules souches épidermiques.
Etude des effets neuraux de l’exposition aux mélanges de contaminants environnementaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées pendant la gestation et la lactation à des mélanges de polluants, elles subissent une série de tests comportementaux, activité locomotrice, anxiété, apprentissage et mémoire spatiale, avant d'être euthanasiées pour prélèvement des tissus cérébraux. Le porteur indique que l'exposition pourrait altérer l'apprentissage et la mémoire, effets que le projet vise justement à déterminer. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer l'animal entier pour l'étude des effets comportementaux, une partie des analyses étant faite in vitro.
Objectifs
L’évaluation des effets de contaminants chimiques se fait encore actuellement substance par substance, ce qui ne reflète pas de manière réaliste l'exposition environnementale. Ce projet vise à étudier chez la souris les effets neuraux de mélanges réalistes de polluants chimiques, identifiés dans des matrices et cohortes humaines, et à des doses faibles estimées pour cette exposition environnementale. Ce travail combinera des approches complémentaires d’analyses comportementales, neuroendocrines, cellulaires et moléculaires afin de caractériser les effets et les modes d'action de ces mélanges et ainsi participer à travers les données produites à l'amélioration de l'évaluation des effets de mélanges de substances chimiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude sont i) l'obtention de données sur les effets potentiels sur la santé humaine de l'exposition à deux cocktails de contaminants environnementaux, ii) l’identification de biomarqueurs pertinents de l’exposition qui peuvent servir à l’évaluation du risque pour la santé humaine, et iii) l’établissement et l’amélioration d'approche d'évaluation des effets de mélanges de contaminants chimiques à des doses de l'ordre de l'exposition environnementale.
Procédures
Les animaux analysés seront exposés pendant les périodes gestationnelle et lactationnelle à de très faibles doses de substances chimiques, incorporées dans un morceau de pâte à cookie proposé aux mères gestantes sans contrainte. Les animaux issus de ces mères exposées, seront séparés en deux lots. Un premier lot subira une euthanasie réglementaire sous analgésié/anesthésie après sevrage. La mort de l’animal est immédiate dès le début l’euthanasie et la procédure dure environ 15 minutes. Le deuxième lot sera analysé dans 5 tests comportementaux. Après sevrage, les animaux seront évalués pour leur activité locomotrice (1 fois 2h) puis état d’anxiété basale (1 fois 10 min), et à l’âge adulte, pour l’apprentissage et la mémoire spatiale (4 essais de 90 secondes chacun par jour pendant 8 jours, puis deux tests finaux de 60 secondes chacun, 20 minutes et 24h-72 h après le dernier test), puis pour leur activité locomotrice (1 fois 2h) et état d’anxiété basale (1 fois 10 min). A l’issue de ces tests, les animaux subiront une euthanasie réglementaire sous analgésié/anesthésie. La mort est immédiate dès le début de l’euthanasie et la procédure dure environ 15 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqûre. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs utilisés dans les tests comportementaux. Les effets comportementaux potentiels de l’exposition développementale aux mélanges de contaminants, qui sont à déterminer dans ce projet : effets locomoteurs, troubles anxieux, altération de l’apprentissage et de la mémoire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour prélever les tissus nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’évaluation pour la santé humaine des effets de l’exposition aux polluants chimiques repose sur l’utilisation des modèles rongeurs et la caractérisation dans ces modèles in vivo des effets et des mécanismes de ces substances. Jusqu’à présent, ces critères ne peuvent être étudiés que dans ces modèles in vivo. Une méthode alternative ne peut remplacer l’animal entier notamment pour l’étude des effets comportementaux. Néanmoins, certains aspects de cette étude seront remplacés par de la modélisation mathématique et une approche in vitro de cultures de cellules.
Réduction
Les effectifs utilisés (450 au total) ont été calculés au plus juste afin d'obtenir une puissance statistique significative. L’utilisation des animaux servira seulement pour l’exposition aux mélanges complets, afin de caractériser les effets et les mécanismes d’action des mélanges. La comparaison des effets de certaines substances seules à ceux des mélanges, ou la dissection des mécanismes moléculaires des polluants du mélange seront effectuées in vitro sur des cultures de cellules. Par ailleurs, plusieurs régions cérébrales ainsi que plusieurs organes seront collectés et stockés pour des études ultérieures.
Raffinement
Les animaux seront produits et hébergés localement, conformément à la législation en vigueur, afin d'éviter tout stress lié au transport, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifiés. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12 h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement. De plus, une habituation à l'expérimentateur est pratiquée pendant au moins une semaine avant le début des tests comportementaux, afin d'éviter tout stress lié à la manipulation. La mise en place de points limites précoces permet une surveillance adaptée des animaux et une prise en charge antalgique ou anesthésique dès que nécessaire.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études comportementales et neuroendocrines grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Les tests réalisés depuis le sevrage jusqu'à l'âge adulte sur les souris mâles et femelles permettent d'avoir une analyse longitudinale des effets à court et à long terme.
Etude chez la souris de l’activité anti-inflammatoire des cellules Immunomodulatrices dans un modèle d’infection pulmonaire avec la bactérie Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
1728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, des instillations de cellules immunitaires et de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires, certaines à dose létale, pour étudier des globules blancs suppresseurs comme modulateurs de l'inflammation pulmonaire. Le porteur indique que l'infection peut entraîner perte de poids et souffrance, l'euthanasie étant alors pratiquée. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que ces connaissances ne peuvent être obtenues qu'à l'échelle de l'organisme.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (P.a) est une cause majeure d'infections respiratoires chez l'homme, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, ou celles atteintes d'emphysème et de bronchite chronique. Cette bactérie provoque des infections aiguës dramatiques chez les personnes immunodéprimées (personne dont les défenses immunitaires sont affaiblies) et elle devient progressivement multirésistante aux antibiotiques et représente une menace considérable pour la santé publique. Il est bien établi dans d’autres pathologies telles que le cancer et les maladies infectieuses qu'une catégorie de globules blancs immuno-suppresseurs particuliers, les cellules myeloides suppressives ( MDSCs) sont induites par l'infection et/ou les infections. Il est également connu que dans les infections où P.a est présente, par exemple chez les patients placés sous ventilation respiratoire, ou chez les patients souffrant de mucoviscidose, c’est l’inflammation exacerbée qui est la cause de la morbidité. Les cellules MDSCs générées post-infection/inflammation représentent probablement un mécanisme protecteur pour contrecarrer cette réponse excessive inadaptée. En effet, il a été montré que des MDSCs fabriquées à partir de moelle osseuse de souris C57/Bl6 sont anti-inflammatoires, lorsqu ’infectées in vitro avec la bactérie P.a. En effet, la littérature indique que les MDSCs (avant ou après infection par P.a) peuvent inhiber la réponse immune. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle des MDSCs comme modulateurs de l’inflammation pulmonaire exacerbée observée chez les patients infectés, et dans les modèles de souris d’infections à P.a et d'étudier les mécanismes en jeu.
Bénéfices attendus
Il est bien connu que la bactérie P.a entraîne une forte morbidité et/ou mortalité chez les patients immuno-déprimés (patients sous-ventilation mécanique, patients souffrant de mucoviscidose, sujets grands brûlés), dûes à une inflammation exacerbée non contrôlée. A ce titre, nous pensons que ce projet pré-clinique visant à utiliser les cellules myeloides suppressives (MDSCs), cellules spécifiquement 'anti-inflammatoires’ est innovant et pourrait grandement bénéficier à la communauté scientifique, et à moyen terme aux patients souffrant de ces pathologies.
Procédures
Pour l’ensemble des souris étudiées, les injections intrapéritonéales (dans la cavité abdominale) d’anesthésiques réalisées sur les animaux vigiles durent quelques secondes. Lorsque l’animal est endormi (au bout de quelques minutes), les instillations des cellules et des bactéries s’effectuent par la voie oro-pharyngée et intra-nasale, respectivement, en déposant quelques gouttes de liquide sur les narines ou au niveau du pharynx . Ces instillations durent au maximum une minute. Pour certains animaux, juste avant la première instillation oro-pharyngée (J0) nous réaliserons un prélèvement sanguin de quelques microlitres à la veine sous-maxillaire sur les animaux vigiles. Ce prélèvement dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Sur la base de la litterature utilisant des macrophages transferrés de façon adoptive par la même voie, l’instillation par voie oro-pharyngée des cellules myéloides suppressives (MDSCs) pourrait entrainer une perte de poids très modérée durant 24-48h. Dans toutes les procédures, l’instillation de MDSCs et les infections par P.a par voie oro-pharyngée sera effectuée sous anesthésie. D’après l’état de l’art, l’instillation des MDSCs et l’infection sous-létale avec P.a n’entraînera pas d’effets indésirables (pas de perte excessive de poids progressive, pas de réduction de la mobilité, pas de négligence du toilettage. Pour les animaux instillés avec une dose létale, la cinétique de développement des signes cliniques nous permettra d’anticiper la souffrance et la douleur pouvant être associées. En cas de souffrance et de douleur, l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Les pathologies développées par les souris souffrant de mucoviscidose peuvent entraîner à partir de la naissance une dégradation de l’état général des souriceaux nécessitant une surveillance journalière.
Devenir
Dans le cadre de l’étude de la réponse immune post traitement, il est important d’euthanasier les animaux à la fin de l’expérience pour pouvoir étudier leurs réponses immunitaires.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues autrement qu’à l’échelle de l’organisme, compte-tenu de la complexité des mécanismes à étudier.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utilisons 6 souris par groupe expérimental. Trois procédures expérimentales seront effectuées. La 1ère nous permettra d’étudier la présence des cellules myéloides immunosuppressives (MDSCs) dans les poumons et les ganglions de souris après infection par Pseudomonas aeruginosa (P.a). Si des différences ne sont pas observées dans cette procédure, un certain nombre d’expériences ultérieures ne seront pas effectuées, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques adéquats permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie, en complément à celle des expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages avec 6 souris maximum par groupe expérimental dans une animalerie dédiée aux expérimentations à caractère infectieux. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Une grille d’évaluation des signes cliniques (prenant en compte l’apparence physique, le poids, le comportement ou la progression de la maladie) sera renseignée une fois ou deux fois par jour, suivant les procédures. Les souris présentant une souffrance et/ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale et/ou physique seront euthanasiées. En cas d’affaiblissement des animaux, des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent accéder plus facilement à la nourriture. Lorsque nécessaire, l'utilisation d'analgésiques locaux sera effectuée, afin de minimiser l'inconfort potentiel des animaux lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines, c’est à dire à l’âge de maturité du système immunitaire de souris à l’état normal. L’utilisation de souris dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. En effet, la souris est un animal sensible à l’infection respiratoire à la bactérie que nous utilisons dans ce projet, et cette espèce est utilisée classiquement depuis de nombreuses années par la communauté scientifique.
Evaluation de la pathogénicité de souches de virus de la fièvre de la vallée du Rift
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
2304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec des souches du virus de la fièvre de la vallée du Rift, par injection ou par voie nasale sous anesthésie, puis subissent jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour comparer la pathogénicité de souches isolées sur le terrain. Le porteur indique que l'infection est "le plus souvent mortelle" et provoque perte de poids, prostration, signes d'encéphalite et convulsions, les souris étant mises à mort dès les premiers signes cliniques. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" du fait de sa sensibilité au virus.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer la pathogénicité de nouvelles souches de virus de la fièvre de la Vallée du Rift isolées sur le terrain (pays africains) lors de foyers infectieux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir des indications pertinentes et importantes (différences de sévérité clinique et de virémie - niveau et cinétique) sur le niveau de pathogénicité des nouvelles souches virales isolées, dans un contexte expérimental parfaitement contrôlé, par comparaison avec une ou deux souches de référence. Ces données pourront être confrontées avec des observations de terrain lorsqu'elles seront disponibles.
Procédures
Les souris seront soumises : - à l'inoculation d'une suspension virale soit par injection (une fois, 2 secondes), soit par voie intranasale après anesthésie par injection (une fois, 2 secondes, durée d'anesthésie 20 minutes); - au maximum à 4 prélèvements de sang de faible volume (durée 15 secondes) espacées de 3 jours.
Impact sur les animaux
L'infection par inoculation intrapéritonéale n'engendre qu'une sensation légèrement douloureuse très brève. L'inoculation par voie intranasale est réalisée sous anesthésie générale et n'a aucun impact au réveil de la souris. Les prélèvements de sang entraînent une douleur de piqûre au point de prélèvement qui dure moins de 10 secondes. Les volumes prélevés ont été réduits pour n'entraîner aucun risque d'anémie. La réalisation de ces gestes par un opérateur expérimenté contribue à réduire l'effet indésirable ressenti par les souris. L'inoculation du virus de la fièvre de la Vallée du Rift à des souris de laboratoire induit une infection le plus souvent mortelle. Cliniquement, une perte de poids apparaît au bout de 3-4 jours avant que les souris développent des symptômes sévères (prostration, signes d'encéphalite, convulsions) qui précèdent la mort de quelques heures. Néanmoins, les animaux n'attendront jamais ce stade et seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes cliniques.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort car elles seront infectées par un agent infectieux dangereux pour la santé humaine.
Remplacement
La caractérisation des nouvelles souches virales impose d'établir leur niveau de pathogénicité par comparaison avec des souches de référence. Ce sera fait in vitro sur des cultures de cellules, qui ne permettent toutefois pas de prédire la pathogénicité in vivo (en particulier la répartition du virus entre les organes, qui peut varier d'une souche à l'autre). Le recours à un modèle animal est indispensable et la souris est le plus adapté en raison de sa sensibilité au virus et de la somme de connaissances accumulées sur ce modèle d'infection.
Réduction
Les nombreuses données que nous avons déjà produites au laboratoire nous permettent d'estimer que des groupes de 7 à 10 souris seront nécessaires et suffisants pour obtenir des informations fiables dans des expériences de suivi clinique. L'effectif sera ajusté en fonction des résultats (sévérité clinique et charge virale). Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, les expériences seront d'abord réalisées sur des femelles, chez qui l'infection est moins rapide. Seules les doses et souches intéressantes seront ensuite répliquées chez les mâles. De même, une première voie et première dose sera testée en priorité, d'autres doses et voie d'administration ne seront pas systématiquement réalisées
Raffinement
Les souris seront entretenues dans des conditions d'hébergement normales (isolateurs, cages de 5 souris pour les femelles et autant que possible en petits groupes de 2-3 pour les mâles). Les gestes techniques seront réalisés par un opérateur très expérimenté les maîtrisant parfaitement. Les sourisseront suivies chaque jour, puis deux fois par jour après l'apparition des premiers symptômes pour mettre en œuvre des points limites précoces mais qui ne perturbent pas les conclusions des expériences. De l'aliment gélifié sera mis à disposition des souris sur la litière pour les aider à s'alimenter dès observation de difficultés locomotrices.
Choix des espèces
La souris est une espèce adaptée à l'étude du virus de la fièvre de la vallée du Rift en raison de sa sensibilité spontanée et des nombreuses connaissances produites sur ce modèle d'infection. Elle est compatible avec un hébergement en isolateur indispensable compte tenu du niveau de risque associé à ce virus. Nous utiliserons des jeunes adultes (9-12 semaines), âge auquel le modèle d'infection a été validé dans les études antérieures.
Evaluation d’une immunothérapie pour traiter la fibrose dans la Dystrophie Musculaire de Duchenne dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes d'une forme de myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections d'un traitement, des prélèvements de sang, une échographie cardiaque sous anesthésie et des tests de force, pour évaluer une immunothérapie censée réduire la fibrose musculaire et cardiaque. Le porteur indique que la maladie induit un affaiblissement musculaire et un décès prématuré des souris. Il affirme que les modèles murins restent une "source unique et indispensable" pour évaluer le traitement, les modèles cellulaires servant au préalable.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations d’un gène qui assure la stabilité structurelle des muscles. Chez les patients, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. Si la recherche d’un traitement curatif pour cette maladie est plus forte que jamais, le besoin médical reste à ce jour non satisfait. En effet, l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement est la difficulté d’accès à leurs cibles en raison d’une fibrose excessive. C’est pour cette raison qu’il est cliniquement pertinent d'explorer une réduction de la fibrose comme une nouvelle piste. L’une de ces pistes consiste à cibler une protéine exprimée spécifiquement à la surface des fibroblastes activés, à l’aide de cellules immunitaires ou particules génétiquement modifiés qui ciblent spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept a préalablement montré que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin d’hypertension. Cette pathologie diffère toutefois de la myopathie, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de traitements innovants dans un modèle murin de myopathie. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la myopathie.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes T spécifiques dans des modèles murins de la myopathie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. Le terme ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la maladie à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permettra également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront 1- l’Injection du traitement (5 min) 2- les Prélèvements sanguins espacés d'une semaine pour les deux premiers et 1 mois plus tard pour le dernier (1 min chacun) 3- Echographie cardiaque réalisé sous anesthésie (5 min) 4- Test de force (10 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues causées par la maladie consistent en un affaiblissement musculaire (respiration haletante, démarche incertaine, fatigue) et une réduction modérée de la fonction cardiaque. Il est à noter que cette maladie induit un décès prématuré (11 mois par rapport à une espérance de vie d’environ 2 ans chez les souris saines). Le pré-traitement peut induire un état transitoire de fragilité (4-7 jours) chez la souris avec notamment une perte de poids. Les prélèvements sanguins et injections peuvent générer du stress chez l'animal et une douleur minime. Les prélèvements et injections n’induisent qu’une très faible douleur. L’échocardiographie nécessite une anesthésie pour garantir l’immobilité de l’animal pendant la mesure (5 min) et occasionne un stress chez l’animal.
Devenir
A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera mise à mort par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (cœur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les données indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.
Remplacement
En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité est mise en place sur des modèles cellulaires. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur la sécurité de ce traitement.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est calculé grâce à des tests statistiques qui seront réalisés pour analyser les résultats et l’utilisation de calcul de puissance statistique pour évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Ces calculs se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe, en prenant en compte des sorties des animaux de protocoles (atteinte de points limites ou décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception de l’injection intra-veineuse et du prélèvement de sang, sont des tests indolores, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse étant donné qu’elle est non invasive. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et de manière hebdomadaire par les expérimentateurs. Une grille d’évaluation des points limites est établie afin de prévenir et limiter la survenue de la souffrance animale. L’animal sera mis sous surveillance accrue et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité.
Choix des espèces
La souris est l’espèce permettant de reproduire la complexité de la myopathie puisqu’aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la myopathie. En outre, les modèles pré-cliniques de la myopathie ont été développés chez la souris et récapitulent la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. L’âge choisi de la souris constituant le modèle sera au stade adulte, plus précisément entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant atteint la fin de leur croissance musculaire et cardiaque. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ce modèle à partir de 4 mois.
Identification de molécules thérapeutiques pour stopper la perte de vision et d’audition chez un modèle murin atteint du syndrôme de Wolfram
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Une lignée de souris du syndrome de Wolfram, qui perd la vue et l'audition vers un mois et développe un trouble vestibulaire source d'hyperactivité, est exploitée pour tester cinq composés chimiques fournis par des chimistes. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs organes. Après un marquage à l'oreille, elles reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine pendant quinze jours, un test de vision éveillées à un mois et deux anesthésies à trois jours d'intervalle pour un test d'audition d'une heure et un test de vision de 30 minutes, des tests que le porteur dit tous "indolores". Le texte justifie des lots de 10 souris par groupe par plus de vingt ans de mesures, sans détailler comment ces groupes aboutissent à 800 souris pour cinq composés.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.
Procédures
Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).
Impact sur les animaux
Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.
Remplacement
L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.
Choix des espèces
La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.