Rongeurs

570 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral modifié est injecté directement sous la rétine des deux yeux sous anesthésie, suivi d'imageries et d'électrorétinogrammes répétés, puis les yeux, le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. L'objectif est de tester si une modification chimique de l'enveloppe du vecteur le dirige mieux vers la rétine. Le porteur affirme que la rétine ne peut être reconstituée "parfaitement in vitro" et retient le rat pour la taille de son œil, plus commode à injecter.

Objectifs

Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les outils les plus performants pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. L’AAV de serotype 2 (AAV2) est capable d’infecter une large gamme de cellules in vivo chez le mammifère comme les cellules musculaires, les hépatocytes ou les neurones ce qui explique en partie sa popularité. Ce sérotype a d’ailleurs été utilisé en clinique pour le transfert de gène dans le foie notamment dans le premier essai clinique sur hémophilie B. Ces propos optimistes sont néanmoins pondérés par des limites : •Le tropisme très large des AAV qui peut être à l’origine d’une expression du transgène dans d’autres tissus que celui ou ceux où l’expression du transgène est souhaitée. •Il reste nécessaire d’injecter des doses importantes qui peuvent entrainer une immuno-toxicité au détriment de l’effet thérapeutique Ces principaux inconvénients sont à l’origine de ce projet de recherche car nous pensons qu’une modification chimique ciblée, pourrait changer l’adressage des vecteurs vers l’organe d’intérêt, ici la rétine. Ce projet consiste à modifier chimiquement la capside (l’enveloppe) des vecteurs dérivés du Virus Adéno-Associé de type 2 et 8 (AAV2 et AAV8). Il repose sur le couplage à la surface des vecteurs de molécules chimiques ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine ce qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées. Des premiers tests seront effectués sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo. Il est également impossible de vérifier la bio-distribution et l’index thérapeutique de ces particules modifiées sur des cellules en culture. L'utilisation du rat est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres in vivo.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de déterminer l’infectiosité des AAV (virus adéno-associé) modifiés en les injectant chez des rats sains par voie sous-rétinienne. Il repose sur le couplage de molécules chimiques à la surface de la capside d’AAV ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrée et donc le risque de réaction immunitaire.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne, des vecteurs chimiquement modifiés dans les 2 yeux ou en intra-veineuse : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et de quelques minutes pour l’intra-veineuse. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, le jour de l’injection et le jour de l’euthanasie. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats. Durée du geste, 5min environ.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne ou intra-veineuse. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront sous anesthésie.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie…) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. L’œil du rat étant 5 fois plus gros que l’œil de souris, l’injection sous-rétinienne est plus facile à réaliser chez le rat, avec une distribution du produit plus homogène entre les individus. La taille de l’œil de rat permet également d’avoir suffisamment de matériel pour réaliser les analyses post-mortem.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses post-mortem et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec une solution saline, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes : marquages immunohistochimiques), des analyses de biologie moléculaire et biochimiques. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression de la GFP, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre le vecteur et une analyse statistique sur les amplitudes en ERG (électrorétinogramme).

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés et une régulation de leur température, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats. L’enrichissement sera renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le rat est un bon modèle pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large permettant une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats non albinos, ayant une acuité visuelle moins impactée par l’âge ce qui nous semble cohérent pour l’analyse de l’impact de vecteur sur l’intégrité et la structure de la rétine. Les rats seront utilisés à l’âge d’un mois pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, une injection intraveineuse d'un immunostimulant dérivé d'une molécule bactérienne, puis des prélèvements sanguins, sur des lignées immunocompétentes et immunodéficientes. L'étude, exploratoire, vise à décrire la réponse immunitaire innée dite mémoire face à la tumeur. Le porteur affirme que tester ce composé exige un "organisme entier" que les cultures ne reproduisent pas, et renvoie les retombées contre les cancers et les maladies infectieuses au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans le développement des cancers. Récemment, de nouvelles immunothérapies permettant la modulation du système immunitaire ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule contenue dans les bactéries a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire, mais sa toxicité ne permet pas son utilisation en clinique. La détoxification de ce composé et son encapsulation a permis d’améliorer sa pharmacocinétique et réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. La réponse mémoire innée n’a été décrite que récemment, mais pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la progression et de la rechute tumorale. Mais les mécanismes impliqués ainsi que les acteurs de ce contrôle sont en revanche encore peu connus à ce jour. Ce projet aura pour objectif : 1) de décrire le type de réponse immunitaire innée et adaptative induite par cette molécule détoxifiée sur des souris immunocompétentes, préalablement implantées avec des cellules tumorales. Cette évaluation nous permettra d’appréhender les variations des populations immunitaires totales au cours du temps. 2) nous évaluerons ces mêmes critères sur des souris immunodéficientes ne présentant pas tous les aspects de la réponse immunitaire, afin d’estimer l’implication de la seule réponse innée. Cela permettra par la suite d’évaluer si la réponse innée seule permet la mise en place d’une réponse efficace contre la prolifération des cellules cancéreuses, mais également de conclure sur l’efficacité de ce composé détoxifié en tant qu’immunothérapie anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les populations immunitaires impliquées dans la mémoire innée, et promues par ce composé détoxifié prometteur pour la santé humaine. Cette caractérisation aura plusieurs retombées : 1) Suivre la cinétique du système immunitaire complet chez des souris immunocompétentes, 2) Renforcer l’affirmation que le système immunitaire adaptatif n’est pas le seul menant à une réponse mémoire, 3) Mettre en évidence les populations cellulaires responsables de cette mémoire innée, permettant par la suite de comprendre comment favoriser leur induction. A plus long terme, cette réponse mémoire innée pourrait être mise à profit non seulement pour soigner différents types de cancers, mais également dans le cas de maladies infectieuses.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) - durée < 1 minute. - 1 contention + 1 injection intraveineuse (animal vigile) du composé testé - durée < 5 minutes. - 1 prélèvement sanguin sous vapeurs d’isoflurane (3,5%) - durée < 5 minutes.

Impact sur les animaux

- douleur lors d’injection de cellules tumorales en sous-cutané (durée de quelques minutes, une fois), - gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec les modèles tumoraux utilisés. - stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes) - douleur lors d’injection dans la veine caudale (durée de quelques minutes, une fois)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à la nécessité de prélever les échantillons biologiques

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire et d’une réponse mémoire, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Cette expérience est exploratoire, et a pour but de décrire les populations immunitaires recrutées après traitement ainsi que leur activation dans les différents compartiments testés. Nous avons choisi d’utiliser 12 animaux par groupes afin d’obtenir un nombre suffisant de cellules dans les organes prélevés pour mener à bien toutes les analyses et obtenir des résultats suffisamment représentatifs. Dans ce cas, nous ne pouvons pas déterminer de tests statistiques appropriés, mais nous nous sommes basés sur le nombre de cellules vivantes à enregistrer, en comparaison avec le nombre de cellules obtenu par prélèvement sanguin, retranché des biais de manipulation connus (mortalité cellulaire, perte des cellules lors des différentes étapes de lavages et de traitement de l’échantillon). Ce nombre permet également de palier au fait que l’implantation de tumeur ne prenne que dans 80% des cas. Nous avons donc dû prévoir une augmentation de l’effectif de souris prévu initialement de 20%. A des fins de réduction, nous avons choisi d’utiliser le groupe de souris contrôle comme point de référence T0.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement (activité, isolement…) critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels seront annotés sur une fiche de suivi, et comparées à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Si score 1, observation quotidienne des animaux par l’expérimentateur, pas d’action particulière. Si score 1 deux jours de suite : action similaire à score 2. Si score 2, animaux suivi matin et soir. Si score 3 ou 4, traitement palliatif mis en place le jour même sur une durée de 24h. Si score 5, animaux mis à morts = Point Limite. Des points limites adaptés seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs et permettent de constituer des groupes d’effectifs compatibles avec des résultats statistiquement significatif. Des souris femelles âgées entre 12-20 semaines seront choisies car elles sont moins agressives entre elles que le sont les mâles, et ont un système immunitaire compétent et mature. Le modèle immunocompétent est particulièrement utilisé pour l’étude de l’immunité cellulaire. Pour évaluer la réponse immunitaire innée, un modèle animal fortement immunodéprimé ne comportant pas de système immunitaire adaptatif est nécessaire, celui-ci pouvant fausser nos résultats dû aux interactions entre ces deux versants de l’immunité. La souris immunodéficiente est connue pour présenter ces caractéristiques en ne développant pas certaines cellules immunitaires. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins.

1432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen, dont un agent pro-inflammatoire qui peut faire perdre 10 à 15 % du poids, subissent un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par incisions répétées de la queue, avant un prélèvement de sang terminal. L'objectif est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes limitent l'inflammation cérébrale via la microglie et freinent l'obésité. Le porteur renvoie le bénéfice, une "nouvelle possibilité de lutte contre l'obésité", au conditionnel et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris pour ces échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. L’inflammation est un facteur qui favorise l’apparition de l’obésité. L’hypothalamus est la région du cerveau impliquée dans les régulations métaboliques. Les cellules immunitaires responsables de l’inflammation dans le cerveau s’appellent cellules microgliales. In vitro les hormones thyroïdiennes ont un effet anti-inflammatoire dans ces cellules. L’objectif de ce projet est d’abord de verifier qu’in vivo aussi les hormones thyroïdiennes sont capables de limiter l’inflammation provoquée par un agent bactérien ou un régime trop gras, via leur action dans la microglie. Puis nous évaluerons l’importance de ces hormones dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime obésogène.

Bénéfices attendus

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. Cette étude permettra de déterminer si cibler le pouvoir anti-inflammatoire des hormones thyroïdiennes dans l’hypothalamus constitue une nouvelle possibilité de lutte contre l’obésité

Procédures

L’ensemble des animaux évoqués sont vigiles sauf indication contraire Dans la première expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Toutes les souris sont ensuite injectées dans l’abdomen (1 fois, 15s) et analysée après 0, 1 ou 5 jours. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans la deuxième expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Puis L’alimentation normale sera remplacé par un régime obésogène pour 3 ou 7 jours) pour certains des animaux. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans une troisième expérience, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1 fois/jr, 15s, 5 jr). Pour certains, le régime alimentaire normal sera remplacé par un régime obésogène (2 mois). Toutes les souris seront soumises à un test pour mesurer leur capacité à utiliser du glucose administré en gavage (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère incision à la queue (1 incision, 5s par prélèvement). Après une semaine toutes les souris seront soumises à un autre test sanguin pour mesurer leur capacité à utiliser le glucose en réponse à une injection d’insuline dans la cavité abdominale (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée comme après gavage au glucose. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s)

Impact sur les animaux

Ne travaillant que sur les mâles et les animaux mutants et contrôles issus d’une même portée devant être répartis dans les différents groupes expérimentaux (nourriture), certains peuvent être isolés pendant l’ensemble de la procédure. Une douleur temporaire peut apparaitre suite aux injections quotidiennes d’hormones ou de tamoxifène 5 jours d’affilées. Il y a aussi un risque d’inflammation de la cavité péritonéale suite à ces injections répétées. Les prélèvements à la queue dans les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer une douleur plus légère. Après l’injection de LPS (procédure 1), la perte de poids peut être importante (entre 10 et 15% du poids pré-injection) le premier jour pour remonter en suite. Pour la procédure 3, sous le régime obésogène les animaux peuvent prendre beaucoup de poids. Cette forte prise de poids peut s’accompagner de difficulter à se déplacer. Lors des tests de tolérance à l’insuline, les souris peuvent se retrouver en hypoglycémie

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser par histologie ou biologie moléculaire ou pour récupérer des cellules

Remplacement

Nous avons déjà étudié et pu établir l’effet anti-inflammatoire de l’hormone thyroïdienne in vitro. Le but ici est de comprendre l’impact de cet effet anti-inflammatoire dans un contexte physiologique d’inflammation et son impact sur les conséquences métaboliques de cette inflammation L’hypothalamus est une région du cerveau qui présente une grande diversité cellulaire. Les différents types cellulaires interagissent entre eux pour élaborer les réponses physiologiques adaptées. Les outils génétiques nous permettent aujourd’hui d’inhiber sélectivement la signalisation thyroïdienne dans un type cellulaire donné chez la souris, ici la microglie. Aucun modèle in vitro ne peut se substituer au modèle animal, pour ce type d'études physiologiques qui impliquent la communication entre différents organes, en réponse à différentes conditions physiologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour permettre l’obtention de résultats significatifs. 6 animaux (mâles) par condition expérimentale en fin d’expériences sont nécessaires et suffisants. En effet les effets de l’hypothyroïdie sont variables d’un animal à l’autre. Pour certaines expériences, on augmente le nombre d’animaux à 8 par groupe car dans ces expériences des animaux devront peut-être être retirés avant la fin suite à l’atteinte de points limites. Cette étude est aussi séquentielle : l’ensemble des expériences proposées ne seront pas forcément menées à bien. En particulier, nous n’étudierons l’importance des hormones thyroïdiennes dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime riche en gras que si les premières études montrent que les hormones thyroïdiennes régulent l’inflammation dans l’hypothalamus.

Raffinement

Autant que possible, les animaux sont maintenus en groupes sociaux à deux ou trois animaux par cage pour limiter le stress. Si les animaux viennent à être séparés suite à des blessures, ou pour permettre la ventilation des animaux dans les différents groupes, on leur procurera un enrichissement dans leur cage. Nous veillerons au bien être et la bonne santé des animaux tout au long des expériences, en leur effectuant des visites trois fois par semaine, en vérifiant leur poids, et observant que leur comportement soit normal. Des lotions antiseptiques seront appliquées en cas de blessure Lorsque des injections quotidiennes doivent être faites dans l’abdomen nous changeons chaque jour le site d’injection pour minimiser les risques d’inflammation. Lorsqu’une perturbation importante des animaux est attendue, comme la perte de poids après injection de l’agent pro-inflammatoire, la fréquence de la surveillance des animaux est augmentée à deux fois par jours jour. La nourriture obésogène a tendance à rancir, elle est donc renouvelée deux fois par semaine. L’insuline peut faire chuter le taux de glucose sanguin. Lors des tests de tolérance à l’insuline, on veille à ce que ce taux ne descende pas en dessous d’un seuil critique. Si ce seuil est atteint l’animal est immédiatement injecté avec du glucose Des analgésiques et anesthésiques sont utilisés pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins et des derniers traitements avant la mise à mort des souris.

Choix des espèces

Les rôles des hormones thyroïdiennes chez la souris sont très similaires à ceux chez l’homme. Chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique et contrôlent la température. La souris est un modèle de choix pour les manipulations génétiques et les expériences de physiologie. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes de recherche et d’autre part de disposer du matériel nécessaire pour réaliser les expériences. Nous utilisons des souris adultes car nous ne voulons pas d’interférence entre les processus de croissance et métaboliques.

Ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour implanter des cellules ou un fragment de tumeur sur le côlon ou le pancréas, ablation de la rate après injection de cellules tumorales pour les métastases du foie, ou injection de cellules dans le péritoine : 400 souris immunodéficientes Swiss Nude reçoivent d'abord ces tumeurs dans un premier établissement. Transférées dans un second, elles reçoivent sous anesthésie une injection dans le péritoine tous les sept jours d'un composé d'imagerie, passent des séances d'imagerie sous isoflurane, puis une ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de leurs tumeurs sous caméra à fluorescence, 30 minutes par souris. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et le porteur cite comme effets possibles des chirurgies la souffrance, la perte de poids et l'infection, ainsi que les effets de grosses tumeurs et de métastases. Toutes sont tuées à la fin des procédures, pour vérifier à l'autopsie l'absence de reprise tumorale.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. L’objet même de ce projet consiste à développer ces modèles tumoraux pus à utiliser ces Ac bimodaux pour pouvoir réaliser l’imagerie des tumeurs puis ensuite leur élimination par la chirurgie sous caméra. A terme nous nous attendons à démontrer que l’utilisation de ces Ac bimodaux permet une visualisation fine des tumeurs avant la chirurgie (imagerie SPECT) et une détection plus précise par fluorescence permettant de minimiser l'étendue de la résection. L'absence de récidive pourra être détectée en ré-injectant cet Ac bimodal quelques mois après la chirurgie pour visualiser l’absence de récidive (SPECT). Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules ou fragment de tumeur), la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées à l’isoflurane pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou d’enlever la rate ou encore de ligaturer un morceau de tumeur sur le colon. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée.

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les souris ayant un déficit en système immunitaire, leur hébergement sera réalisé dans des cages sous couvercle filtrant et les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunodéficientes Swiss Nude, nous permettant d’implanter des cellules tumorales humaines. Ces souris ont déjà été utilisée lors des premiers travaux avec des tumeurs humaines implantées en sous-cutané. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Les 20 souris de cette étude pilote sont des triples mutantes, issues de croisements de lignées génétiquement modifiées pour qu'on puisse activer, inhiber ou éliminer, de façon sélective et inductible, une classe de neurones de la peau poilue qui détectent les stimulations mécaniques faibles. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, le porteur écrivant que "leur mise en liberté est inconcevable". Chacune reçoit du tamoxifène par une injection dans le péritoine puis trois gavages espacés de trois jours, un cathéter dans la veine de la queue sous anesthésie, et passe sous anesthésie une séance d'IRM de moins d'une heure trente, avant et après l'injection de sérum physiologique ou de clozapine-N-oxyde, un composé qui active ces neurones. L'étude doit vérifier qu'une IRM détecte la réponse du cerveau à cette activation, et ses résultats "conditionneront la mise en œuvre" d'un projet plus large d'IRM fonctionnelle sur les réseaux cérébraux de la douleur.

Objectifs

Il s'agit ici d'une étude pilote dont les objectifs sont d'étudier la biologie d'une classe particulière de neurones somato-sensoriels non myélinisés capables de transduire des stimulations mécaniques à bas seuil, détectées au niveau de la peau poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et la transduction du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes, y compris certaines réalisées au sein de notre équipe, suggèrent que ces neurones sont aussi capables de moduler la douleur post-lésionnelle ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Cependant, ces conclusions ont toutes été formulées de manière indirecte et à l'heure actuelle, aucune étude n'apporte la démonstration directe de leur fonction in vivo, à l'état basal et dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. C'est précisément le but de notre projet. Il repose sur l'utilisation d'une série de lignées de souris génétiquement modifiées de manière à générer des souris triple mutantes permettant d'activer, inhiber ou bien éliminer séléctivement ces neurones in vivo, et ce, de manière inductible. Le but de cette étude pilote est de vérifier qu’il est possible de suivre par IRM la réponse cérébrale induite par l'activation de ces neurones. Les résultats de cette étude préliminaire conditionneront la mise en œuvre d’un projet s’appuyant sur des méthodes d’IRM fonctionnelle pour l’étude des réseaux cérébraux de la nociception impliquant ces neurones.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette étude pilote sont la prise en charge de la douleur qui est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somatosensoriels, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains. A noter que les neurones étudiés ont été également décrits chez l'homme.

Procédures

L'ensemble des animaux recevra une série d'administrations de tamoxifène : une injection intra-péritonéale (I.P.) à P42 suivie de 3 gavages espacés de 3 jours, 3 jours après l’injection I.P. Un cathéter sera implanté sous anesthésie dans la veine caudale, pour l'injection d'un agent de contraste spécifique de la technique d'IRM. Une session d'imagerie (d'une durée inférieure à 1h30) sera ensuite réalisée de façon non invasive sur chaque souris (sous anesthésie) à l’état basal (avant injection) et après injection d'un composé appelé Clozapine-N-Oxyde (CNO), activant ces neurones somatosensoriels.

Impact sur les animaux

Les animaux seront examinés une seule fois par IRM avant et après administration de NaCl ou d’une solution de CNO. Nos données préliminaires nous permettent d’affirmer que les doses de tamoxifène, d'agent de contraste et de CNO utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris triples mutantes. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque l’isoflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie, ce qui permet le réveil rapide des animaux.

Devenir

Les animaux seront tous euthansiés à l'issue de la procédure pour prélever post-mortem différents tissus. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.

Remplacement

Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. Le recours à l’animal est incontournable car la détection de variations hémodynamiques cérébrales résultant d’une stimulation pharmacologique ne peut être réalisée que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico car elles ne sont pas adaptées au suivi de cette étude. En effet, les organs-on-chips ou les organoïdes ne permettent pas de reconstituer les connexions neuronales complexes impliquant différents structures du système nerveux et ne reflètent donc pas la physiologie et le fonctionnement du cerveau dans son entièreté. Quant aux modèles informatiques pour la transduction d'un stimulus sensitif de la peau vers le cerveau, leur design nécessiterait des données in vivo, que nous n'avons pas mais espérons que cette étude nous en fournira.

Réduction

L’utilisation d’une technique d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. En l’absence de données préliminaires permettant de connaître la taille d’effet attendu (l’objectif de ce projet exploratoire étant justement d’apporter des informations sur la réponse cérébrale au CNO), nous avons estimé la taille des groupes nécessaires à l'obtention de données fiables sur la base de notre expérience en IRM préclinique. Les animaux seront leur propre contrôle. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique non paramétrique pour mesures répétées adaptée aux petits échantillons.

Raffinement

Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress et l’angoisse. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels. Suite à l'injection de tamoxifène et de CNO, les animaux seront suivis régulièrement et l'évaluation de la douleur sera monitorée par une grille de score fournie en annexe : recours à l'utilisation d'analgésiques pour réduire la douleur et euthanasie de l'animal en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

Chez la souris, la population des neurones somato-sensoriels ciblée dans ce projet est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.

150 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang à la queue, quatre injections sous-cutanées et un test de mémoire en piscine répété huit jours, avec un hébergement individuel de seize jours, pour étudier les différences de déclin cognitif au cours du vieillissement. Le porteur reconnaît que la contention destinée à étudier la réponse au stress est "forcément" génératrice de stress et signale un risque d'infection aux sites d'injection. Il conclut qu'une telle approche intégrée ne peut être menée in vitro ni in silico.

Objectifs

Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus de mémoire. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables alors que d’autres individus sont dits résilients car ils conservent une bonne mémoire au cours du vieillissement. La compréhension de ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles de mémoire liés à l'âge. Toutes les études menées ou en cours dans notre laboratoire se sont limitées au rat mâle du fait de l’impact du cycle hormonal sur cette formation de nouveaux neurones au cours de la vie. L’objectif de ce projet est d’étudier l’apparition chez la femelle de déficits de mémoire au cours du vieillissement avec deux populations dites vulnérable (mauvaise mémoire) et résiliente (bonne mémoire) et de voir si cela apparaît au même âge que le rat mâle.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santéle plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs quiaccompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre étude permettra d’étudier l’apparition de différences inter-individuelles chez la femelle au cours du vieillissement, de comparer les résultats à ceux obtenus chez le mâle et voir si ces différencesapparaissent dans une même fenêtre de temps.

Procédures

3 gestes techniques seront réalisés : *Prélèvement de sang à la queue : Le sang est prélevé à l’extrémité de la queue sur animal vigile (2 min). L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard (4x2 = 8min). *Injections sous-cutanées : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 4 injections (durée préhension de l’animal + injection = 3 min, durée totale par animal 4x3 = 12 min). *Test de comportement : il s’agit d’un test de mémoire. Les rats font chaque jour 4 essais, pendant 8 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans le test (temps maximum passé dans le test au cours d’une session = 4 x 90s = 360s = 6 min, temps total maximum passé dans le test = 8j x 6min= 48min). Généralement la durée totale moyenne passée dans la piscine est de 21min 20s (8j x160s en moyenne = 1280s = 21min20s).

Impact sur les animaux

Comme tout projet incluant des contentions et des injections (prélèvement de sang, injections sous-cutanées), il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention afin d’étudier la réactivité de l’axe corticotrope en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection (sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales (incision de la queue) s’infectent ou deviennent douloureux. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant 16 jours mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses réalisées sur leur cerveau.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’apparition de différences inter-individuelles mnésiques chez les femelles au cours du vieillissement. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des problèmes de santé inhérents au vieillissement : les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus. Une analyse préalable des données sera réalisée afin de vérifier la possibilité de poursuivre l’analyse. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les différences inter-individuelles apparaissent dès les premiers âges étudiés.

Raffinement

Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives enrichies (sizzle pad : lanières de papier kraft vierge) afin de réduire l’ennui et le stress. Une semaine avant le début du test comportemental, les animaux passeront en hébergement individuel enrichi (lanières de papier kraft vierge). Le contact visuel, olfactif et sonore entre les animaux sera maintenu. Les femelles seront observées quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect général et aspect du pelage) et manipulés mensuellement jusqu’à leur sacrifice. Elles seront stabulées dans une animalerie avec une température maintenue constante, une hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera illimité et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : en cas d’apparition d’une zone de dépilation et d’irritation au niveau du site d’injection sous-cutanée, nous appliquerons une pommade désinfectante et cicatrisante et ce jusqu’à disparition des symptômes et évaluerons la douleur de l’animal le cas échéant, avec des grilles. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’au sacrifice des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la néo-neurogenèse hippocampique est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections sous-cutanées. Les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après ces injections. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement :1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent d’étudier les différences inter-individuelles et le recrutement des néo-neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de déficits mnésiques.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mises à jeun hydrique et isolées, elles passent dix-sept tests de double choix entre deux boissons pour mesurer leur préférence pour des "faux lipides", avant un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'isolement pendant les tests peut être source de stress et prévoit un enrichissement supplémentaire. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut remplacer la souris pour l'évaluation orosensorielle liée à l'obésité.

Objectifs

Des études récentes chez l’Homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) que les saveurs sont détectées. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Ainsi ces deux lipido-récepteurs pourraient représenter la cible pour développer de nouvelles molécules (agoniste / antagoniste) permettant de moduler le comportement alimentaire lipidique chez les obèses. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras, nous avons synthétisé de faux lipides (agonistes de lipido-récepteurs), à partir de d’acides gras naturels, capables d’interagir avec les lipido-récepteurs mimant le goût du gras sans apporter de calories car ils ne sont pas métabolisables. Nous avons démontré l’absence d’effets génotoxiques et tératogènes de ces faux lipides. Cette demande représente l’extension de la précédente autorisation accordée concernant les faux lipides A et faux lipides B et qui sont brevetés L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de nouvelles molécules biosourcées « faux lipides » sur la préférence des aliments gras, et portera essentiellement sur l’évaluation orosensorielle vis-à-vis de ces faux lipides chez souris C57/BL6. Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules réduisent l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules modifient la préférence pour les molécules lipidiques et réduisent à long terme l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Les animaux, seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel (test de double choix entre deux boissons) afin de déterminer si les souris présentent une certaine préférence pour les molécules d'intérêt. Pour ce faire, Les animaux seront soumis à une mise à jeun hydrique de 4h avant les tests et pendant le test orosensoriel (durée 4h) les souris seront individualisées, les croquettes seront retirées et auront à leur disposition une bouteille d’eau et une bouteille de solution « test » pendant le test. Chaque lot de 15 souris subira 17 tests de double choix, avec une pause de deux ou trois jours entre les tests. A la fin de l’étude Les animaux seront mis à jeun pendant 4h et soumis à un prélèvement de sang terminal en intra-cardiaque sous anesthésie à l’Isoflurane (3%). Enfin, après mise à mort de l’animal, des prélèvements d’organes auront lieu. Aucun autre prélèvement sur animal vigile n’est envisagé.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact chez les souris puisqu’on est amené à les mettre en cages individuelles (pendant 12 h) lors des tests de double choix. Les animaux peuvent subir un stress suite à l’individualisation pendant la durée des tests. Pour minimiser l'effet de ce stress, un enrichissement supplémentaire (igloo en cellulose en plus des sizzle pad) sera apporté.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal (souris) s’impose dans ce projet d’une part du fait que nos molécules « faux lipides » sont nouvelles et par conséquent il n’existe aucun outil pharmacologique qui aurait pu permettre la mise en place d’une étude clinique et d’autre part par le besoin d’analyser les mécanismes multifactoriels impliqués dans la perception gustative. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En effet, malgré les résultats obtenus, in vitro, utilisant des cellules gustatives, Il n’est pas possible de se limiter à des approches in vitro pour des évaluations orosensorielles de faux lipides

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux

Raffinement

Les animaux seront parfois isolés pendant la durée du teste double choix (4 h), cependant en dehors des périodes de tests Les animaux seront hébergés en groupes (3-4 souris par cage) dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose en plus des sizzle pad). L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière et dès l’apparition de signes précoces de souffrance (des points limites adaptés et des critères d’arrêt sont prévus), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix lors de l’étude des évaluations orosensorielles et les investigations de la modulation du comportement alimentaire par les faux lipides et son incidence à long terme sur l’obésité. A la suite de ce projet nous envisageons dans une seconde étape de tester les molécules les plus préférées par les souris sur l’incidence de l’obésité dans le même modèle de souris. La souris est le modèle de l’obésité qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel.

600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie induisant un modèle de maladie de Parkinson, jusqu'à 168 administrations d'un composé selon les voies et jusqu'à 49 tests comportementaux neuropsychologiques. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, inflammation, infection et perte de poids, et que les troubles induits altèrent la locomotion et la démarche. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est disponible et que les animaux ne peuvent être réutilisés du fait de substances aux effets inconnus à long terme.

Objectifs

La maladie de Parkinson touche 1% de la population âgée de plus de 60 ans et 4% de la population des personnes de plus de 80 ans. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative du système nerveux central qui progressivement entraine des troubles moteurs (tremblements, rigidité musculaire, impossibilité ou ralentissement des mouvements). Comme d’autres maladies neurodégénératives, il n’y a pas de traitement capable de stopper ou de guérir la maladie. Les traitements qui existent sont purement symptomatiques. Toutefois, les traitements existants entrainent des effets secondaires sérieux tels que dyskinésie (mouvements anormaux involontaires), désorientation et confusion. Plusieurs voies de recherche sont en cours pour le traitement de la maladie de Parkinson et incluent par exemple la thérapie génique, la greffe de neurones et le traitement par des molécules neuroprotectrices. Un des modèles animaux le plus utilisé dans la recherche sur la maladie de Parkinson est basé sur une lésion unilatérale et sélective par injection d’une neurotoxine dans le cerveau. Cette injection affecte chez le rat la même zone cérébrale que celle endommagée chez les patients atteints de la maladie de Parkinson et permet ainsi de mimer certains de leurs symptômes. Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de diverses molécules sur le modèle de rat hémi-parkinsonien afin de sélectionner de nouveaux composés pour les essais cliniques.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de mettre en évidence des molécules qui n’ont pas d’effets secondaires sur les animaux et qui permettraient de palier en partie ou totalement aux troubles moteurs et cognitifs de la maladie de Parkinson. Nous testerons aussi sur ce modèle des molécules en phase clinique pour la maladie de Parkinson, afin de mieux appréhender sa prédictivité.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale (20-30 min) sous anesthésie, l’administration, du composé à tester sur animal vigile (sauf pour l’administration intraveineuse qui est faite sous anesthésie) pour une durée maximale de 12 semaines selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 49 tests de comportement neuropsychologiques (moins de 10 min chacun) sur animaux vigiles. En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 168 fois par voie per os, sous-cutanés ou intrapéritonéale ou 84 fois par administrations intra-nasales ou intramusculaires ou encore 10 fois par intraveineuse. A savoir une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Pour le reste des administrations, la durée est de moins de 30 second en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 12 semaines en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang dure 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, l’intervention chirurgicale peut induire une douleur transitoire, des signes d’inflammation, d’infection et une perte de poids. De plus les troubles induits peuvent gêner les animaux dans leur vie quotidienne : locomotion réduite et démarche altérée. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des nuisances au niveau des sites d’administration et de prélèvement : comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration et/ou un phénomène de mâchonnement ou une fausse route (pour le gavage). Un stress lié aux différentes manipulations et tests comportementaux peut également apparaitre.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Le développement de la maladie de Parkinson et ses symptômes sont des phénomènes complexes qui mettent en jeu plusieurs acteurs (différentes zones cérébrales, muscle, …) et différents processus, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses biochimiques ou histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 12 à 20 animaux. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, en présence de traitements antalgiques avec une aide au maintien de la température corporelle de l’animal (tapis chauffant) et en garantissant la stérilité de l’intervention. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé, les animaux recevront un antalgique pour prendre en charge leur douleur. De plus les animaux reçoivent de la nourriture en gel pour faciliter leur récupération post-chirurgicale et de la nourriture en granulé est déposée sur la litière. Le poids corporel des animaux sera suivi. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. A côté de cela, il faut noter que nous avons une longue expertise de l’utilisation des rats dans ce modèle de la maladie de Parkinson. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 200-250g au moment de la chirurgie). Ce choix est basé sur le fait que la pathologie est induite par chirurgie et ne dépend donc pas de l’âge des animaux. De plus les jeunes adultes supportent mieux les interventions chirurgicales, ce qui nous permet de réduire les risques liés à la chirurgie, de leur assurer une récupération plus rapide et de meilleure qualité.