Rongeurs

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis cinq mois à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un état prédiabétique, ils passent des IRM cardiaques sous anesthésie, un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tués par injection létale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme vouloir tester la vitamine D comme protection du cœur, avec pour objectif déclaré de proposer un jour cette approche chez l'humain. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut aujourd'hui remplacer le rat, qu'il juge proche de la physiologie cardiaque humaine.

Objectifs

Le but de ce projet de recherche est de proposer une approche thérapeutique simple et innovante afin de protéger le coeur prédiabétique mâle et femelle dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique à l'Homme. Plus précisément,, nous chercherons à mettre en évidence l’effet d’une supplémentation en vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre. Le prédiabète est un véritable enjeu de santé publique car au regard de sa durée longue et réversible, il offre une fenêtre thérapeutique très pertinente. Par ailleurs, la vitamine D a des effets importants sur le système cardiovasculaire en régulant le métabolisme du calcium, l’immunité et l’inflammation et pourrait exercer un effet protecteur sur les altérations cardiovasculaires précoces associées au prédiabète. Au laboratoire, nous avons acquis une solide expérience dans la caractérisation des atteintes cardiovasculaires induites lors du prédiabète et du diabète de type deux selon le sexe sur l’animal in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’étudier l’effet de la supplémentation en Vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique chez l’Homme.

Procédures

Nous utiliserons une approche multiparamétrique in vivo combinant les techniques d’imagerie (IRM) de résonance magnétique à une étude de l'homéostasie glucidique et à des analyses biochimiques sur différents tissus. Le modèle animal utilisé sera le rat soumis à un régime riche en graisse et en sucre (HFS) pendant 5 mois, qui mime une alimentation déséquilibrée retrouvée fréquemment dans les pays développés. Nous définirons 3 groupes mâles et femelles de 12 animaux : un groupe contrôle avec une alimentation normale, un groupe sous régime HFS et un groupe sous régime HFS supplémenté par la vitamine D pendant les deux derniers mois de régime. Pour l’ensemble du projet, le nombre maximum d’animaux sera de 36 mâles et 36 femelles, soit un total de 72 rats. Une pesée hebdomadaire et une mesure de la prise alimentaire seront faites toutes les semaines pendant les 5 mois de régime. Les altérations cardiovasculaires seront suivies de manière non invasive in vivo par IRM après 3, 4 et 5 mois de régime. Après 5 mois de régime, un test de tolérance au glucose et une mesure de l’insuline seront faits afin de vérifier l’état prédiabétique et le métabolisme glucidique des animaux. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection léthale d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.

Impact sur les animaux

Lors de l'IRM, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (2%) et d’oxygène (1 L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sert assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée,une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la bétadine jaune. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.Tout le long du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet de la supplémentation en vitamine D sur les complications cardiovasculaires précoces associées au prédiabète selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, les mêmes animaux seront utilisés pour les analyses décrites (examen par IRM, test de tolérance au glucose et mesure de l'insuline). A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimun nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes et a été déterminé à l'aide d'une analyse statistique utilisant le logiciel Statistica.

Raffinement

L'étude par IRM se fera sous anesthésie inhalée afin de réduire l'angoisse et la douleur. La température corporelle sera maintenue à 37°C pendant l'examen à l'aide d'une couverture chauffante et vérifiée avec une sonde rectale. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés. L'impact environnemental sera pris en compte par une phase d'acclimatation des animaux de quelques jours. Le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Les animaux seront pesés une fois par semaine par les expérimentateurs pendant les 5 mois de régime. Les animaux seront aussi régulièrement manipulés par les expérimentateurs pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Les points limites seront déterminés en fonction des observations définies par Morton et Griffiths (1985). Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.

Choix des espèces

Le modèle de rat nourri avec un régime HFS permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le cœur. Le modèle HFS a été décrit pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale. Les animaux seront âges de 6 semaines à l’achat et de 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement des animaux.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, un gavage, des prélèvements de sang et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, avec induction d'un diabète et d'une inflammation intestinale. Le porteur reconnaît une polydipsie, un poil hérissé, une léthargie, un dos courbé, une ataxie et des tremblements possibles. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale et assure donc un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinal et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales. Notre projet permettra l'identification dans l'épithélium intestinal des cibles cellulaires et des voies de signalisation dérégulées au cours de la résistance à l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

-1 lot d’animaux vigiles fera l’objet d’une mise à jeun (14h), de 6 à 7 contentions (45 secondes chacune), d’une administration orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -1 autre lot d’animaux vigiles fera l’objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 7 à 8 contentions (45 secondes chacune), de 2 administrations orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 480 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post-opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Par ailleurs, le choix de cette espèce est motivé par la volonté de comparer les résultats de ce projet obtenus sur des modèles de perte d'action globale globale de l'insuline à ceux d'un autre projet obtenus sur des souris génétiquement modifiées, déficientes pour l’action de l’insuline spécifiquement au niveau intestinal. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

1314 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une insuffisance rénale leur est induite par injection d'acide folique à forte dose, suivie d'administrations de molécules à tester, de séjours en cage à métabolisme et de prélèvements sanguins. Le porteur indique ignorer "ni la nature ni les effets secondaires" des molécules de clients qu'il évalue, et reconnaît une perte de poids et une baisse du volume urinaire. Il présente le recours aux rongeurs comme "incontournable", aucun modèle ne mimant selon lui la fibrose rénale.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur la transition de l’insuffisance rénale aiguë vers l’insuffisance rénale chronique et sur le développement de la fibrose rénale.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients présentant une insuffisance rénale.

Procédures

Les animaux subiront une injection intrapéritonéale d’acide folique et une administration de molécules à tester en total respect de la législation (voies, fréquence et durée dépendantes de chaque protocole expérimentale). Ils pourront également être mis dans des cages à métabolisme pour récolter de l’urine pendant 24 heures maximum. De plus, les animaux pourront être anesthésiés à l’isoflurane, afin d’attacher un capteur permettant la mesure du débit de filtration glomérulaire. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang. Enfin, différents prélèvements pourront être réalisés sur l’animal post-mortem.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. De plus, toute manipulation de l’animal pour les traitements ou expérimentations peut provoquer un certain stress, désagrément, douleur qui seront minimiser par le fait que les expérimentateurs auront les formations et les compétences nécessaires pour réaliser tous les gestes expérimentaux. De plus, le modèle pathologique induisant une insuffisance rénale, les animaux pourront ressentir tous les effets indésirables de cette pathologie (perte de poids possible, volume urinaire diminué…).

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation car des prélèvements d’organes et des examens post-mortem pourront être réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la fibrose rénale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité (développement d’une fibrose rénale). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

L’évaluation de l’effet de candidats médicaments sur l’insuffisance rénale se fera au cours du temps par des techniques non-invasives : mesure du poids, récolte urinaire par cage à métabolisme avec phase d’habituation à la cage pour limiter le stress, mesure du débit de filtration glomérulaire. De plus, une évaluation en basal (avant traitement) ainsi que des évaluations à différents temps pendant le traitement permettent pour chaque animal d'être son propre contrôle et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutefois, il est nécessaire de garder un groupe contrôle (sans la pathologie) afin de pouvoir le comparer avec un groupe pathologique afin de valider le modèle de l’étude. Une étude pilote préalable sur quelques animaux sera réalisée afin de mettre au point ce modèle. Aucun test statistique pour calculer le nombre d’animaux par groupe n’a été réalisé mais de par notre expérience et en tenant compte des études déjà publiées sur ce modèle, un nombre d’animaux par groupe de 15 pour la souris et 12 pour le rat est le minimum nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité inter-individuelle des réponses étudiées. Tout geste expérimental sera réalisé par du personnel compétent et expérimenté, limitant ainsi le stress et la douleur possible lors de chaque manipulation des animaux.

Raffinement

L’état général des animaux sera observé tous les jours par du personnel qualifié permettant d’appliquer les points limites décrits dans les procédures (prostration, perte de poids importante, difficulté à se nourrir, se mouvoir…) et des critères d’arrêt des souffrances de l’animal. Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, différents types d’enrichissement pourront être ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois) ou igloo/tunnel en polycarbonate). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Certaines expérimentations (récolte urinaire ou mesure de la filtration glomérulaire) nécessitent un isolement temporaire des animaux dans des cages individuelles. Toutefois, les animaux pourront voir leurs congénères du fait que toutes les cages sont transparentes. Si un animal présentait des symptômes de mal-être tels que perte de poids, poils hérissés, plaies, déshydratation, il serait soigné, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière et isolé si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h et que un des points limites était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle de pathologie rénale induite par une injection d’acide folique à forte dose est largement décrit dans la littérature chez le rongeur (souris et rat) Classiquement nous utiliserons des animaux matures sexuellement d’au moins 8 semaines car la fibrose rénale apparaît principalement chez l’adulte. Néanmoins cet âge pourra être amené à être modifié à la demande du client.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une lésion du cortex moteur puis une greffe de neurones sous chirurgie crânienne, des tests moteurs de préhension, d'équilibre et de marche, et une restriction alimentaire de seize heures avant certains tests. Le projet couple cette greffe à de l'activité physique et à un antioxydant, les retombées pour l'humain étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire un cerveau de mammifère et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Du fait de la très faible capacité du cerveau à s’autoréparer, les traumatismes craniens sont dévastateurs. La lésion du cortex moteur est une caractéristique commune de nombreuses conditions neuropathologiques telles que les tumeurs, les lésions (traumatisme, accident vasculaire cérébral) ou les maladies neurodégénératives (sclérose latérale amyotrophique, ataxies scérébeleuses, maladies de Huntington, d'Alzheimer...). Afin de pallier les capacités de régénération limitées du cerveau adulte, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques. La transplantation neuronale a été explorée comme une approche potentielle permettant de rétablir les fonctions cérébrales en remplaçant les neurones perdus par de nouveaux neurones. Il est déjà démontré que des neurones issus de cellules souches, transplantés dans des cerveaux de souris, peuvent efficacement rétablir des connexions spécifiques après une lésion corticale. Une réparation des réseaux neuronaux est donc possible chez la souris, mais l'éfficacité de cette approche doit encore être améliorée avant de pouvoir être envisagée chez l'Homme. Par ailleurs, la pratique de l'activité physique et l'administration d'un antioxydant sont connus pour améliorer la réparation spontanée du cerveau. Dans cette étude, nous souhaitons coupler la greffe de neurones à une activité physique régulière des animaux et/ou à un traitement avec un antioxydant. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet de l'activité physique et de l'antioxydant.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l'effet de la combinaison de l'activité physique et d'un antioxydant sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie chez l'Homme autour de l’activité physique ou d'un antioxydant couplé à la transplantation cellulaire afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer le traitement par greffe de cellules souches par la mise en place de thérapies adaptées.

Procédures

Sur animaux vigiles : une cinquantaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois par semaine, sur toute la durée du projet); 7 sessions de différents tests de comportement moteur (test de préhension de nourriture, test d'équilibre, test de marche) : 1 semaine tous les deux mois (maximum 15 minutes par souris par jour durant 5 jours de test ). Sur animaux anesthésiés : intervention 1 : Lésion corticale traumatique légère : 1 fois (10 minutes par animal) - intervention 2 : Greffe de neurones corticaux moteurs : 1 fois (10 minutes par animal).

Impact sur les animaux

L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, l’effet indésirable attendu est un inconfort transitoire au réveil. La lésion du cortex moteur entraine un très léger trouble de la préhension avec la patte avant gauche de l'animal. Une restriction alimentaire sera réalisée pendant environ 16 heures, le jour précedent le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier la transplantation de cellules souches neuronales et l'effet de l'activité physique.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation de calcul de puissance.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle. De plus, elles seront réalisées par un binôme compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire si l'état de l'animal le nécessite. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, AVC...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler sur des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, une biopsie, des administrations orales et injections répétées et jusqu'à quatorze prélèvements de sang à la queue, un test de tolérance à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie prononcée. Le projet vise à décrire le rôle de l'insuline intestinale dans la prise de poids sous régime gras, le porteur affirmant que ce régime "n'entraîne pas de souffrances". Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote et assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. L’hyper- perméabilité intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique de bas grade qui accompagne l'obésité, état inflammatoire qui favoriserait la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique). Nos premiers résultats montrent que la perte d'action intestinale de l’insuline conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin chez la souris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline et l'hyperperméabilité intestinale associée favorise ou accélère la prise de poids et l'altération de l'équilibre glycémique au cours d'un régime obésogène. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) - 1er lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 4 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) - 2ième lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 8 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) -3ieme lot d'animaux: 2 mises à jeun (14h et 6h), 16 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun). Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucun des modèles murins ne présente de phénotype dommageable à l’état basal et le regime gras n'entraine pas de souffrances. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention et des injections. L'animal peut avoir une sensation de douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille). Le test de tolérance à l'insuline peut entraîner une hypoglycémie prononcée chez la souris.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 360 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. L'euthanasie de l'animal se fait sous analgésie et anesthésie profonde. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 9 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

4320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle d'hépatite leur est induit, avec des injections répétées plusieurs fois par semaine et des prélèvements sanguins, entraînant une perte de poids et un score clinique que le porteur relie à un changement de comportement. Le projet teste une thérapie ciblant des cellules immunitaires, les bénéfices annoncés pour les patients étant renvoyés à un éventuel essai clinique. Le porteur présente la souris comme un moyen d'éviter le recours au primate et affirme que le modèle animal est "nécessaire" avant tout essai humain.

Objectifs

Les maladies Auto-immune (hépatite auto immune) et les maladies inflammatoires (hépatite aiguë) n’ayants pas de traitements satisfaisants aujourd’hui, la recherche de nouvelles thérapies est nécessaire. Ce projet s’inscrit dans ce but afin de tester une nouvelle cible thérapeutique et d’en comprendre les mécanismes. La plupart des maladies Auto-immune sont traitées avec des traitements qui bloquent de façon non spécifique le développement de la maladie et induisent des effets secondaires. Parfois, certains patients sont traités avec des molécules qui induisent la mort cellulaire d’un type cellulaire à l’origine de la pathologie mais cela entraine le plus souvent des effets indésirables. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie qui pourrait inhiber les cellules impliquées dans la chronicité de l’inflammation mais cela de manière spécifique en gardant un système immunitaire compétent pour se défendre contre de nouveaux pathogènes.

Bénéfices attendus

L’objectif est de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait une population cellulaire à l’origine de la pathologie afin de la bloquer ou de l’éliminer dans les maladies inflammatoires ou les maladies Auto-immune. Il est important de noter qu’actuellement la plupart des traitements utilisés ne sont pas spécifiques et ils réduisent la capacité des patients à se défendre contre de nouveaux pathogènes. La technologie que nous développant a pour objectif d’être plus spécifique et plus efficace. En étant plus spécifique, on réduit la probabilité d’avoir des effets indésirables et en étant plus efficace on donne la capacité aux patients de se défendre contre de nouvelles infections. Chez l’animal nous espérons pouvoir observer un blocage, une élimination ou une réduction des cellules pathogéniques à l’origine de la maladie. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant des maladies auto-immunes ou inflammatoires et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique spécifique et plus sûre. Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique.

Procédures

Les traitements administrés aux animaux durent quelques secondes et seront réalisés plusieurs fois par semaine durant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés durant plusieurs semaines et durent quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux (X semaine) ainsi que les prélèvements sanguins (X semaine) seront variables en nombre de semaines (Procédure 1 : 3 semaines, Procédure 2: 1 semaine ; Procédure 3 ; 1 à 12 semaines) mais pas en durée (toujours quelques secondes) et dépendra de chaque groupe de souris et du succès du traitement.

Impact sur les animaux

Il va s’en suivre une perte de poids associée à un score clinique important qui peuvent induire chez la souris une modification du comportement et de l'apparence physique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés une fois les points limites atteints. L'injection peut entrainer une perte de poids, un changement dans le comportemant chez la souris. Cela va se produire dans les groupes contrôles et dans les groupes dont les molécules n'ont pas d'effets bénéfiques. Dans les groupes ou un effet bénéfique pourrait être observé, les souris seront quand même euthanasiées car cela n'est pas possible d'utiliser les mêmes souris pour un second protocole car l'âge de la souris ne sera plus adéquat.

Remplacement

Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique. Vu la complexité du système immunitaire et des différences entre espèces, il est nécessaire d’étudier l’impact d’une molécule ainsi que ses effets thérapeutiques sur un modèle proche de l’Homme. Pour cette première nécessité le primate est souvent utilisé, ici, nous avons la possibilité d’éviter l’utilisation de primate, donc nous étudierons ces paramètres chez la souris. Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour les récepteurs mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. En effet, les molécules sont testées in vitro afin de déterminer si elles ont la capacité d'induire l'effet attendue c'est à dire, la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires, le blocage de molécules activatrices sur différents types cellulaires, ou l'activation de molécules inhibitrices afin de réguler l'inhibition des cellules cibles. Les modèles d'hépatites qui reproduisent au mieux ce qui se produit chez l'homme ont été décrit chez la souris et notamment la souris.

Réduction

Les tests statistiques qui seront réalisés seront des tests non paramétriques pour comparer chaque groupe en fonction du groupe contrôle. Il pourra également être réalisé des tests pour comparer tous les groupes les uns avec les autres ou tous les groupes en fonction du groupe contrôle. Nous avons réduit chaque groupe au minimum de 5 souris nécessaire à l’obtention d’une différence statistique. Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible.

Raffinement

Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Si un animal se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec un dôme. Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et seront manipulés afin de les habituer aux expérimentateurs. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront un analgésique dans l’eau de biberon pour la nuit. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire.

Choix des espèces

Des formats d’anticorps ont été validés in vitro. Les animaux sont indispensables car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité de (des) format(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est (sont) efficace (s). En outre, avant de passer aux travaux généralement réalisés chez le primate, il est impératif de valider au préalable l’efficacité de cette thérapie chez la souris afin de réduire au maximum le nombre de format d’anticorps, la dose ainsi que la voie d’injection qui pourrait être testés chez le primate. Les souris seront utilisées autour de 8 semaines.

Des rats et des souris reçoivent, pour le compte de clients, des candidats médicaments dont le laboratoire dit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles". 2 076 rongeurs, 1 038 souris et 1 038 rats, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements de tissus. Le létrozole sert à induire un syndrome des ovaires polykystiques, et le protocole peut comporter jusqu'à dix semaines d'administrations, jusqu'à deux fois par jour, un régime gras, une ovariectomie ou l'implantation de pellets, des frottis vaginaux et des prises de sang. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a fixé la taille des groupes, huit rongeurs chacun, et estime trois études par an raisonnables au regard de ses autres protocoles et des demandes de ses clients.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et de létrozole par différentes voies d’administration pendant maximum 10 semaines de façon biquotidienne pour les voies per os, sous-cutanée et intrapéritonéale et de façon quotidienne pour les voies intraveineuse et intramusculaire. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. Les animaux seront pesés régulièrement et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir une ovariectomie selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien pendant une semaine ou un frottis par semaine pendant dix semaines. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 goutte pour le glucomètre pour les analyses de tolérance au glucose ou à l’insuline prélevée à la queue de l’animal) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique (queue ou rétro-orbital ou submandibulaire…). Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies d’implantation de pellets ou d’ovariectomie). Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. Nous avons établi des points d’intervention afin de limiter la douleur à son minimum : • Addition d’Aspen brick, de carré de coton, de tunnels et d’igloos en cas de bagarres entre animaux et séparation du dominant pendant quelques jours si nécessaire, • Mesure du poids des animaux régulièrement, • Arrêt des traitements en cas de perte de poids ≥ 20% du poids initial. Nous avons établi des critères qui mettront fin à l'expérimentation si nécessaire : • Altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de se nourrir, de s’alimenter, se mouvoir…), • Présence d’une souffrance/douleur (vocalisation, perte d’appétit, piloérection, prostration…), • Perte de poids ≥ 20% du poids initial sur 72h, Si l’état général de l’animal ne s’améliore pas et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier serait euthanasié.

Choix des espèces

Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Le choix sera ainsi dépendant des demandes clients car le modèle SOPK induit par le létrozole est bien décrit dans la littérature chez les deux espèces. Le SOPK débutant à l’adolescence lors de la puberté, ce modèle pourra être induit sur des rats et des souris adultes ou prépubères (3 semaines). De ce fait, nous utiliserons des animaux âgés d’au moins 3 semaines (animaux livrés avec leur mère car le sevrage ne sera pas terminé).