Rongeurs
Rôle de la myéline dans la capacité à s’orienter dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Sur 2 160 souris, 66 passent les tests de comportement du projet et 2 094 sont utilisées pour maintenir les lignées, toutes étant tuées à la fin des tests, à la fin de leur période de reproduction ou lorsque leur génotype ne convient pas. La déclaration compte 2 094 souris en souffrance légère et 66 en souffrance modérée. Des souriceaux reçoivent à 7 et 10 jours deux injections intrapéritonéales d'une molécule non nommée, destinée à bloquer la formation de la myéline, puis passent vers cinq ou six semaines des tests d'orientation et de mémoire où ils doivent nager une minute, quatre essais pendant cinq jours consécutifs puis un dernier trois jours plus tard. Le porteur écrit qu'ils "peuvent perdre un peu de poids après la première injection", puis que certaines souris en perdent "pendant une période pouvant aller jusqu'à dix jours".
Objectifs
La myélinisation joue un rôle clé dans le fonctionnement des circuits neuronaux du cerveau. Nous souhaitons utiliser un modèle murin permettant d’inhiber la myélinisation pendant la période critique du développement. Notre intérêt est focalisé sur le circuit de navigation spatiale et a pour objectif de comprendre comment l'absence de la myéline affecte son fonctionnement.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à déterminer le rôle de la myéline au niveau comportemental, physiologique et cellulaire. Il permettra de clarifier le rôle de la myéline dans la navigation spatiale au cours du développement. De plus, chez les patients atteints de sclérose en plaques, maladie inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central, des troubles cognitifs sont associés à des lésions de régions cérébrales impliquées dans l'intégration multisensorielle. Parmi ces troubles cognitifs, on note l’apparition précoce de déficits d’orientation dans l’espace chez la moitié des patients. Cette pathologie qui touche 110000 personnes en France est la première cause de handicap non-traumatique chez l'adulte jeune. Nos travaux pourront apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques des déficits cognitifs dans la sclérose en plaques.
Procédures
Les animaux seront tatoués au niveau des pulpes digitales (maximum 2) et génotypés par prélèvement distal de la queue (durée inférieure à 2 minutes par animal, réalisé en une seule fois). Ils recevront deux injections d'une molécule permettant de mettre en place le modèle, l’une à 7 jours, l’autre à 10 jours post-nataux (durée inférieure à deux minutes par injection par animal). Nous effectuerons des tests de comportement qui sont des tests d'orientation et de mémoire à court terme. Il s’agit de 4 essais de 1 minute pendant 5 jours consécutifs et un dernier test 3 jours après le dernier essai. Une partie des animaux sera euthanasiée par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses. Une autre partie des animaux sera euthanasiée par une méthode réglementaire pour mauvais génotype.
Impact sur les animaux
Nous effectuerons une injection intrapéritonéale d'une molécule permettant de mettre en place le modèle. L’administration de cette molécule à cet age n’affecte pas la viabilité des souris. Les animaux peuvent perdre un peu de poids après la première injection. Elle peut entrainer une douleur mais aussi un hématome. Il faudra vérifier la zone de l'injection intrapéritonéale sur les jours suivants l’injection. Nous effectuerons des tests de comportement qui sont des tests d'orientation dans l'espace et de mémoire à court terme, générant un stress temporaire chez les animaux. L‘eau est maintenue à une température comprise entre 20-22 degrés mais les souris peuvent être en légère hypothermie en sortant. Les tests comportementaux sont imposés à la souris, elle doit nager une minute et peut se refroidir un peu. Une légère et brève douleur peut se produire au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage et au moment du tatouage au niveau de la pulpe distale. L’identification et le prélèvement pour génotypage ont lieu au même moment.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront euthanasiés à la fin des tests de comportement pour l'analyse de tissus post_mortem. Les animaux utilisés pour le maintien de la lignée sont maintenus en vie pour la reproduction, puis ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien en accouplement. Les animaux issus des croisements qui ne présentent pas le bon génotype seront euthanasiés.
Remplacement
Nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris) car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne permet aujourd'hui d'étudier les mécanismes de mise en place des circuits d'orientation dans l'espace au cours du développement. De plus, la souris présente une homologie importante avec l’Homme.
Réduction
Nous prévoyons une étude pilote en comportement sur un nombre limité d’animaux (22 animaux « sauvages/WT ») pour valider l’analyse des trajectoires grâce à un nouvel algorithme. L'étude de 2 groupes de 22 animaux permettra ensuite d'obtenir des résultats statistiquement significatifs en comportement. Le nombre d'animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques fiables et exploitables. Ce nombre d'animaux prend en compte une faible mortalité spontanée (10 pour cent) ayant cours du fait du phénotype. Ainsi dans ce projet nous prévoyons un total de 66 souris réalisant les tests de comportement et 2094 souris pour maintien des lignées. Une partie des souris euthanasiées dans le cadre du maintien des lignées sera utilisée pour des analyses complémentaires en immunohistologie et en électrophysiologie.
Raffinement
Les souris sont séchées avec une serviette de bain après chaque passage dans la piscine avant d’être replacées dans leur cage d’hébergement, sous lampe chauffante. Les animaux sont hébergés en groupe dans l’animalerie agréée (avec leur mère et leur portée avant sevrage, puis à 6 maximum par cage après sevrage), en milieu ventilé, avec une température de 22 plus ou moins 2 degrés, avec cycle diurne/nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Les animaux sont examinés quotidiennement par les zootechniciens, toute anomalie est signalée, l’équipe est rapidement informée pour une prise en charge optimale de l’animal. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Au moins un enrichissement par cage (pad de coton pour réaliser un nid) est fourni. Si une douleur devait persister malgré la prise en charge par la structure chargée du bien être animal/vétérinaire, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. Si au cours de l’expérimentation, l’animal présente de grosses difficultés à se déplacer ou se relever pour se nourrir, apparaît un amaigrissement de plus de 20 pour cent du poids mesuré avant l’expérimentation ou un comportement indiquant une souffrance, l’animal sera euthanasié. Dans les expériences avec injection de la molécule permettant de mettre en place le modèle, certaines souris perdent du poids pendant une période pouvant aller jusqu'à dix jours, mais retrouvent leur poids par la suite. Les souris seront surveillées par pesée avant injection de la molécule et quotidiennement ensuite.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix car son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues et sont relativement proches de celles de l’Homme. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées et correspondent donc à notre étude qui se base sur un support génétique impliqué dans le développement de la myéline. De plus il s’agit d’un modèle inductible, qui permet de contrôler l’arrêt de la myélinisation au cours du développement des souriceaux. Ensuite entre 5 et 6 semaines, les tests comportementaux seront réalisés car le développement du système nerveux sera suffisant pour réaliser ces tests. La myélinisation axonale n'est pas uniforme mais progresse après la naissance de la partie caudale à la partie rostrale du cerveau avec une progression comparable de l'efficacité de la communication neuronale. Cette myélinisation progressive n'a pas encore été clairement liée à l'ontogenèse de l’orientation spatiale. Nous pensons que le déficit de myéline dans les voies thalamo-cortico-presubiculaires devraient retarder l'émergence d'une orientation spatiale précise.
Rôle bénéfique de l’inhibition de l’expression du gène Usp28 sur l’exercice physique et la dystrophie musculaire.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une heure de course sur tapis roulant après trois jours d'habituation, avec des chocs électriques "légers et brefs" dès qu'elles s'arrêtent : des souris subissent cet exercice destiné à provoquer des lésions musculaires, que le porteur associe à un "inconfort musculaire important passager". 936 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des biopsies musculaires. Le projet cherche à savoir si l'inhibition du gène Usp28 améliore la réparation du muscle et pourrait traiter la dystrophie musculaire de Duchenne. Des souris mâles porteuses de la mutation de cette maladie, dont la faiblesse musculaire apparaît vers quatre mois, sont gardées trois mois après son apparition, dans une lignée que le porteur qualifie de "modèle bien établi et largement utilisé".
Objectifs
L'exercice physique peut provoquer des dommages musculaires, par exemple une déchirure ou une rupture de la structure contractile du muscle. Les cellules doivent alors réparer correctement ces dommages pour rétablir la fonction musculaire. Si elles ne le font pas, elles risquent de provoquer des lésions beaucoup plus importantes, voire des pathologies. D'autre part, une réparation efficace de ces lésions est la base de la construction du muscle par la pratique du sport. Nous avons précédemment découvert un gène particulièrement exprimé en cas de lésions musculaires. Notre étude préliminaire sur des cellules en culture suggère que l'inhibition de ce gène pourrait augmenter la réparation musculaire. Dans ce projet, nous examinerons donc le rôle de ce gène dans la réparation du muscle chez des souris vivantes. En outre, nous examinerons si la perte de ce gène (et donc l'augmentation de la réparation) peut être utilisée comme thérapie pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD).
Bénéfices attendus
Si notre hypothèse s'avère correcte, il deviendrait nécessaire de développer un inhibiteur de ce gène pour favoriser la régénération du muscle et pour soigner la dystrophie musculaire de Duchenne ou contribuer à son traitement.
Procédures
1. Le programme d’exercice réalisé par les animaux est un modèle d’activité physique intense. Il s’agit d’une procédure qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Cet exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant suivi d’un jour de course de 60 min comparable à un exercice physique intense. L’animal reçoit des chocs électriques légers et brefs pour le motiver à courir s’il s’arrête. Si l’animal ne court pas pendant plus de 5 secondes le test est arrêté. 2.Les souris mâles porteurs de la mutation de la dystrophie musculaire de Duchenne présentent un phénotype de faiblesse musculaire léger à partir de l’âge de 4 mois. Ces animaux seront gardés durant 3 mois après l’apparition de ce phénotype.
Impact sur les animaux
Le programme d’exercice est une procédure semblable à une activité physique intense qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Les souris porteuses de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne présentent un phénotype de faiblesse musculaire à partir de l’âge de 4 mois. Cependant, la délétion de notre gène d'intérêt dans les muscles devrait réduire ce phénotype.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Des données préliminaires concernant le gène d'intérêt étudié ont été obtenues en culture cellulaire avec une expérience simulant un exercice physique. Cependant, pour prouver sa fonction réelle dans une situation complexe in vivo, nous devons utiliser des modèles animaux. De plus, la DMD ne peut pas être facilement modélisée in vitro avec les technologies actuelles. Puisque nous voulons valider le potentiel de ce gène en tant que cible médicamenteuse, ces expériences sur les animaux sont nécessaires.
Réduction
Nous collecterons tous les tissus musculaires et les échantillons de sang pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes. Nous avons 3 types d’analyses qui seront composées de 5 animaux pour 6 temps différents. Ces temps d’analyses ont été choisis pour les 2 procédures du projet en fonction de résultats obtenus dans une étude in vitro dans notre équipe ainsi que des études publiées par la communauté scientifique. Si au cours du projet certains de ces temps ne présentent pas de modification significative d’expression des gènes analysés pour le groupe d’animaux du 1er type d’analyse (expression des gènes), alors nous ne ferons pas les groupes d’animaux destinés aux 2 autres types d’analyses ce qui diviserait le nombre d’animaux par 3 sur les temps d’observation concernés.
Raffinement
Pour générer nos souris d’expérience nous utiliserons des mâles porteurs de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne que nous euthanasierons avant l’apparition du phénotype dommageable. Nous garderons les mâles porteurs de la mutation et de la DMD que pour les expériences de ce projet. Si les animaux venaient à présenter des troubles musculaires comme des difficultés à se déplacer avant la fin de l’expérience, nous leur mettrions alors de la nourriture en gel dans la litière de la cage. Les prélèvements de sang nécessaire au dosage de la créatine kinase qui est un indicateur de lésions tissulaires seront effectués au niveau du sinus retro-orbital sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront mis à mort par élongation cervicale avant leur réveil pour éviter toute douleur dû à la technique de prélèvement.
Choix des espèces
Le programme d’exercice utilisé, modélisant une activité physique intense, est bien établi chez la souris. Nous utiliserons des souris jeunes adultes ou adultes (à partir de l’âge de 8 semaines) pour cet exercice car la maturation musculaire doit être achevée. De même, le modèle de souris pour l'étude de la DMD est un modèle bien établi et largement utilisé pour la recherche sur la dystrophie musculaire. Nous observons les souris de ce modèle et délétée pour notre gène d'intérêt longitudinalement à différents âges afin de suivre les modifications d’expression de nombreux gènes exprimés en son absence. Nous pourrons ainsi mettre en corrélation ces modifications avec la mesure de la créatine kinase qui est un indicateur de lésions tissulaires et surtout avec l’éventuelle disparition attendue des phénotypes de la DMD (de 1 mois à 12 mois maximum) à 6 âges différents : 3 avant l’apparition du phénotype et 3 après son apparition. Si le phénotype apparaît à 4 mois comme nous l’attendons, nous prélèverons les échantillons aux âges de 1, 2, 3, 4, 5 et 6 mois, sinon les 3 derniers âges de prélèvement seront décalés à l’apparition du phénotype au maximum à 10, 11 et 12 mois.
POTENTIEL THERAPEUTIQUE D’UN CIBLAGE DES MEMBRES DE LA FAMILLE DE LA TRISTETRAPROLINE, DE LA PROTEINE HUR, de RBM3, de la galectine-1, de la GAL3BP ET DES P-BODIES DANS LES MALADIES CHRONIQUES HEPATIQUES ALCOOLIQUE ET NON-ALCOOLIQUES ET LE CARCINOME HEPATOCELLULAIRE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2728 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une maladie chronique du foie et un cancer hépatique leur sont induits par des régimes gras ou alcooliques et des injections de carcinogènes comme le tétrachlorométhane et la diéthylnitrosamine, avec un suivi par IRM et un isolement d'hépatocytes par exsanguination terminale. Le porteur affirme que la plupart de ces protocoles n'occasionnent "aucune souffrance", les désordres métaboliques et tumeurs restant selon lui asymptomatiques tant que le foie fonctionne. Il conclut que le recours aux souris ne peut être remplacé par des modèles in vitro pour ces mécanismes inter-organes.
Objectifs
Le syndrome métabolique, l’obésité, l’infection par des virus de l’hépatite B et C ainsi qu’une consommation abusive et fréquente d’alcool, sont des causes majeures de pathologies hépatiques chroniques. Ces maladies sont associées à une accumulation de graisse dans le foie qui va progressivement induire une lipotoxicité et de nombreuses altérations cellulaires et métaboliques. Ces altérations conduisent au développement progressif d’une inflammation et d’une fibrose hépatique, qui peut ultimement dégénérer vers une cirrhose hépatique et un carcinome hépatocellulaire (CHC). Nos travaux au laboratoire ont permis de mettre en évidence le rôle critique de protéines appelées «AUBPs » (AU-rich elements binding proteins), qui régulent la dégradation et la traduction des ARNm. Nos travaux précédents ont permis de mettre en évidence l’importance de ces protéines dans le développement des hépatopathies stéatosiques non-alcooliques et le CHC. Nos travaux précédents et nos données préliminaires ont également mis en évidence l’altération d’oncogènes appellés “Galectines” à des étapes précoces comme la stéatose et qui pourrait donc jouer un rôle crucial dans la progression de la stéatose vers le CHC. Cependant, le rôle de ces protéines, dans les pathologies hépatiques reste à ce jour peu connu. Afin de mieux comprendre le rôle de ces protéines in vivo, notre projet suivra les objectifs suivants : 1. Etudier les conséquences des altérations de l’expression/de l’activité de nos candidats sur la physiologie, la survie et la prolifération des hépatocytes. 2. Etudier le rôle de nos candidats dans la stéatose et la fibrose hépatique. 3. Elucider le rôle physiopathologique de nos candidats in vivo dans le développement du carcinome hépatocellulaire.
Bénéfices attendus
De nombreuses études indiquent que le régime alimentaire, le diabète et l’obésité mais aussi la consommation chronique et excessive d’alcool représentent des facteurs de risque important pour le cancer du foie. En raison de l’augmentation rapide et mondiale de ces maladies, une augmentation des cas de cancer du foie est attendue dans un futur proche. Le rôle de nos protéines d’intérêt dans le développement des maladies chroniques du foie et du carcinome hépatocellulaire (CHC) reste encore peu connu. Les expériences prévues dans cette demande devraient apporter des informations importantes concernant la fonction de ces protéines mais aussi d’évaluer le potentiel thérapeutique de leur ciblage afin de prévenir les maladies métaboliques du foie et leur progression vers le CHC.
Procédures
Procédure 1 : Régime prolongé en graisse et sucre (4 semaines); Régime alcoolique (10 jours); Anesthésie kétamine/xylazine (isolement hépatocytes: 1 x 10 min. Procédure 2 (Durée totale du protocole: 16 semaines): Injection de virus adéno-associés (AAV8: 1 x 10 min); Régime prolongé en graisse et sucre (12 semaines); Tests tolérances glucose (GTT)/ pyruvate (PTT)/ insuline (ITT) (2 heures/test); Cages Métaboliques (habituation + expérience: 8 jours); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 3 (Protocole C1: durée totale du protocole : 28 semaines) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (2 x 10 min); Régime prolongé en graisse et sucre (24 semaines); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 3 (Protocole C2: durée totale du protocole : 8 semaines) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Régime déficient en méthionine et choline (4 semaines); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 4 (Protocole D1: durée totale du protocole: 38 jours) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Régime alcoolique (10 jours); Injection tétrachlorométhane (CCL4: 1 x 10 min); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 4 (Protocole D2: durée totale du protocole : 8 semaines) : Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Régime alcoolique (4 semaines); Injection CCL4 (12 x 10 min); Mise à mort (1 x 10 min). Procédure 5 (durée totale du protocole : 9 mois): Injection de diethylnitrosamine (DEN: 10 x 10 min); Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Imagerie (IRM: 1 x 30 min/mois pendant 7 mois); Mise à mort (1 x 10 min); Régime alcoolique (2.5 mois). Procédure 6 (durée totale du protocole : 9 semaines): Injection AAV8/traitement inhibiteurs HuR (1 x 10 min); Injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques (par injection i.v : veine caudale sans anesthésie: 1 x 10 min); Imagerie (IRM: 1 x 30 min/semaine); Mise à mort (1 x 10 min).
Impact sur les animaux
L’expression de nos protéines d’intérêts sera modulée à l’aide de vecteurs viraux permettant d’augmenter ou de diminuer l’expression de nos protéines spécifiquement dans les hépatocytes (Protocoles B, C, D et E). Nos travaux précédents ont démontré que cette méthode n’occasionne aucune souffrance chez les animaux et est très efficace pour moduler l’expression des gènes au niveau hépatique. L’injection de virus par voie rétro-orbitale est une procédure maitrisée qui n’occasionne aucune nuisance particulière. Une approche pharmacologique, avec des inhibiteurs d’une protéine appelée “HuR” est également proposée. D’après la littérature, aucune souffrance n’est attendue chez les animaux traités avec ces molécules. Dans nos procédures B, C et D, nous prévoyons d’utiliser des modèles de stéatose et fibrose hépatique induit par des régimes alimentaires (régime riche en graisse et en sucre ou avec une diète alcoolique). Nous n’attendons pas de souffrance particulière chez les animaux nourris avec ces diètes. Nos études précédentes ont montré que le développement de la stéatose et de la fibrose hépatique induite par ces régimes n’occasionne aucune souffrance chez les animaux. Pour la procédure d’isolement d’hépatocytes primaires (Protocole A), une anesthésie profonde de l’animal suivi d’une exsanguination par ouverture de la veine cave est réalisée. Cette procédure terminale est donc rapide et n’induit aucune souffrance particulière chez les animaux. Le développement de tumeurs (Protocole E) hépatiques peut induire une insuffisance hépatique qui se manifesterait par un ictère, une diminution de l’activité physique, une prostration ainsi qu’une diminution de la prise alimentaire et du poids du sujet. Cependant, le développement de petites et moyennes tumeurs dans le foie (
Devenir
Pour la procédure expérimentale 1, l’isolement des hépatocytes primaires de souris est une procédure terminale qui implique la digestion du foie par de la collagénase. L’isolement des hépatocytes est une étape clé dans ce projet qui nous permettra de confirmer les résultats obtenus sur des lignées cellulaires immortalisées sur les hépatocytes. Pour les autres procédures (2 à 6), les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de récupérer le foie mais aussi les autres organes métaboliques (tissus adipeux, pancréas, muscle) et le plasma dans le but d’étudier l’impact de la modulation de l’expression (AAV8) ou de l’activité de nos candidats (TTP, BRF1, BRF2, HuR, EDC4, RBM3, LGALS1, LGALS3BP) dans les processus associés aux pathologies chroniques hépatiques (alcooliques et non-alcooliques) et la carcinogenèse hépatique.
Remplacement
L’utilisation d’animaux ne peut actuellement pas être substituée par des modèles alternatifs in vitro ou in silico, pour étudier les altérations métaboliques ou hépatiques. D’une part, les pathologies hépatiques nécessitent le concours et la communication de différentes cellules composant le foie (i.e, cellules de Kupffer, cellules stellaires, cellules immunes, cellules endothéliales, etc). D’autre part, un contrôle par le système nerveux central et périphérique du métabolisme hépatique, ainsi que la communication entre les organes (par exemple foie-muscle, foie-tissu adipeux ou foie-pancréas) et le système immunitaire jouent un rôle clé dans le développement de ces pathologies. Concernant la carcinogénèse hépatique, il est également bien établi que le microenvironnement tumoral composé de vaisseaux sanguins mais aussi de fibroblastes et de cellules immunitaires, joue un rôle primordial et déterminant dans l’initiation et le développement de cancers au sein d’un organe. La plupart des modèles cellulaires disponibles (cultures ou co-cultures en 2D ou 3D) in vitro sont des cellules cancéreuses qui ont déjà été transformées (mutations) et dont le métabolisme est fortement altéré. L’absence d’un microenvironnement physiologique, de vascularisation et d’interactions avec le système immunitaire rendent ce type d’étude in vitro sur le métabolisme et le cancer peu pertinent et difficile à extrapoler aux situations in vivo chez la souris et encore plus chez l’humain. A l’heure actuelle, ces systèmes in vitro ne permettent donc ni d’étudier des processus métaboliques complexes, ni la progression tumorale dans un contexte physiopathologique pertinent au sein d’un organe particulier ou de tout l’organisme. En accord avec cette notion consensuelle dans ce domaine de recherche, nous avons montré dans le cadre d’une étude précédente, des divergences importantes entre les données in vitro et in vivo. En effet, l’une de nos études étudiant le rôle d'une protéine appelée "tristetraproline" (TTP) dans le développement de CHC, a démontré un rôle suppresseur de tumeur de cette protéine in vitro et oncogénique in vivo. Les analyses in vivo nous apportent donc des informations clés et actuellement impossibles à obtenir avec des méthodes alternatives permettant de mieux comprendre la physiopathologie de ces cancers et la pertinence des candidats potentiellement susceptibles de représenter des cibles thérapeutiques chez l’humain.
Réduction
Des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires pour chaque expérience ont été effectué sur la base de données publiées antérieurement et de notre propre expertise dans ce domaine. Ces analyses nous permettent de limiter le nombre d'animaux de façon importante tout en assurant l’obtention de résultats significatifs. Effectuer les expériences planifiées avec un nombre d’animaux plus restreint est selon notre opinion éthiquement discutable, car hautement susceptible de ne pas permettre l’obtention de résultats pertinents. Une telle situation invaliderait nos expériences rendant tous nos efforts de recherche inutiles ainsi que l’utilisation et la mise à mort d’animaux vaines. Il est à noter également que la constitution de bio-banques avec les organes et tumeurs résultant de ces études sont susceptibles d’être réutilisés dans des projets futurs (en particulier les groupes contrôles) réduisant ainsi le nombre d’animaux à utiliser ou le besoin de recourir à l’expérimentation animale dans de futures études. La mise en place de protocoles non-invasifs de bio-imagerie médicale (IRM et CT-scan) permet d’optimiser la qualité des résultats (nombres et tailles des tumeurs qui se développent au cours du temps). Mais surtout, ces protocoles donnent lieu à une forte diminution du nombre d’animaux car ils évitent la mise à mort de différents groupes d’animaux en fonction du temps pour étudier le développement et la progression des cancers hépatiques.
Raffinement
Pour affiner les conditions expérimentales, nous avons fixé des règles fermes quant aux limites de l'expérience. En effet, comme décrit, le poids, l'apport alimentaire, l'activité, le développement des tumeurs et l'état général des souris seront suivis de près et des analgésiques seront administrés en cas de besoin. Si les limites de l'expérience sont dépassées et que les analgésiques n'ont pas d'effet positif (après 24h), les animaux seront mis à mort. Nous aimerions cependant rappeler encore une fois que les désordres métaboliques et le développement de tumeurs hépatiques restent principalement asymptomatique chez la souris (comme chez l’humain) tant que la fonction du foie est préservée (entre 10 et 20% d’hépatocytes encore fonctionnels), ce qui est le cas dans la majorité des protocoles proposés. Le nombre d’animaux, et la mise à mort de différents groupes d’animaux en fonction du temps pour étudier le développement et la progression des cancers hépatiques ont été fortement diminués, en particulier grâce à la disponibilité et la mise au point de protocoles non-invasifs de bio-imagerie médicale (IRM et CT-scan). Ce choix nous permettra également d’optimiser la qualité de nos résultats (nombres et tailles des tumeurs qui se développement au cours du temps). Finalement, l'anesthésie sera utilisée pour toutes les injections afin d'éviter le stress de l'animal, mais aussi pour éviter les blessures accidentelles lors de l'intervention. Les mâles agressifs seront aussi séparés du reste de la cage pour éviter les combats.
Choix des espèces
Pour l’ensemble des protocoles de cette autorisation, des souris mâles seront utilisées. Tout comme chez l’humain, les œstrogènes ont un rôle protecteur sur le développement de CHC chez la souris. Il est donc plus difficile d’induire de manière efficace et reproductible des tumeurs hépatiques chez les femelles. Par ailleurs, les œstrogènes peuvent prévenir du développement de la stéatose. Il est donc préférable d’utiliser des souris mâles pour étudier les maladies chroniques hépatiques. Les souris C57BL/6J seront utilisées car cette lignée répond très bien aux diètes obésogènes ou aux diètes déficientes en choline/méthionine. Ces souris sont infectées par des virus avec un très bon rendement. En effet, plus de 80% de leurs hépatocytes expriment les gènes encodés par ces virus d’après nos expériences. La totalité des C57BL/6J développent des tumeurs dans les conditions expérimentales utilisées. Ce modèle de souris, tout comme le développement de CHC à la suite d’une induction par DEN ou après une transfection hydrodynamique de MYC et p53 muté, ont été validé par de multiples études, y compris les nôtres, auparavant.
Evaluation de l’effet de molécules à visée thérapeutique dans des modèles d’étude du transit intestinal chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 3600
7200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pathologie intestinale, constipation ou diarrhée, leur est induite pour tester des molécules dont le porteur indique ignorer "ni la nature ni les effets secondaires", avec des prélèvements sanguins et un maintien en cage sur grille de six à huit heures avant mise à mort. Le porteur reconnaît que les rongeurs ressentiront les mêmes symptômes que l'humain, douleur abdominale, diarrhée et déshydratation. Ce projet de prestation répond à des demandes de clients et présente le recours aux rongeurs comme "nécessaire", aucun modèle ne mimant selon lui la pathologie dans son ensemble.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur le transit intestinal chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de troubles intestinaux.
Procédures
Les animaux recevront des administrations de composés pour induire une pathologie intestinale type constipation ou diarrhées. Chaque geste d’administration dure environ 30 sec à 1 min selon l’expérimentateur et les produits à tester. Un stress peut être ressenti par l’animal lors de la contention. Comme nous induisons une pathologie à l’animal, celui-ci va ressentir les mêmes symptômes que chez l’Homme à savoir douleur abdominale, diarrhées, inconfort… Les animaux recevront des administrations de composés ou molécules inductrices des pathologies (environ 30 sec à 1 min par geste) et seront mis à mort peu de temps après. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés pouvant provoqués une douleur et une gêne à l’animal (environ 2-3 min par prélèvement). Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié pour limiter au maximum le stress des animaux. Pour une procédure, les animaux seront placés dans des cages individuelles sur grille pendant 6-8 heures maximum et seront euthanasiés juste après.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, toute manipulation, contention ou administration de produit peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille) à l’animal. Sachant que nous allons induire des modèles pathologiques intestinaux (diarrhées, constipation) nous pouvons nous attendre à ce que les animaux en ressentent les symptômes comme une légère déshydratation, des douleurs abdominales.
Devenir
A l’issue de 2 procédures, les animaux seront gardés en vie pour suivre une autre procédure. Dans la procédure finale, une des méthodes d’évaluation nécessite de récupérer l’estomac des animaux donc ces derniers seront forcément euthanasiés. Pour les autres méthodes d’évaluation, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude car ces derniers auront reçu des candidats médicaments à tester avec récupération d’organes possible et auront reçu d’autres inducteurs chimiques afin de leur induire une pathologie. Ils ne pourront donc pas être réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Le transit intestinal est un phénomène physiologique complexe qui ne peut pas être mimé dans des modèles cellulaires. Les fonctions motrices de l’intestin peuvent être étudiées à partir d’intestins isolés. Cependant, ce modèle ne prend pas en compte la difficulté du candidat médicament pour atteindre sa cible. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les pathologies intestinales dans leur ensemble et dans leur complexité. L’étude du transit intestinal nécessite donc le recours à des modèles expérimentaux in vivo afin de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine et d’évaluer au mieux les effets des candidats.
Réduction
Les expérimentations ainsi que le suivi des animaux au niveau de la zootechnie (change de la litière, suivi quotidien visuel, mise à disposition d’eau et de nourriture) seront réalisés par du personnel expérimenté, limitant au maximum le stress des animaux. Ce projet ayant déjà reçu une autorisation de projet de la part du Ministère il y a 5 ans, nous avons déjà réalisé ces études de nombreuses fois et du fait de notre expérience, nous pouvons constater que n= 10 animaux par groupe est le minimum pour obtenir des résultats statistiquement satisfaisants du fait de la variabilité interindividuelle des animaux et de leur réponse à l’administration de candidats médicaments dans un modèle pathologique.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Une procédure nécessite une mise des animaux dans des cages individuelles sur grille. Ces derniers seront placés dans ces cages au moins 1 heure avant le début de l’étude pour une habituation au nouvel environnement afin de limiter le stress lors de l’expérimentation. Si un animal présentait un point limite, il sera isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Ce modèle est applicable à toute espèce/souche de rongeur. Le choix sera ainsi dépendant des demandes clients car les différents modèles sont bien décrits dans la littérature pour les deux espèces. Nous utiliserons des rats et des souris âgés d’au moins 6-8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures.
Détermination de l’effet anti-tumoral du GNR-αDR4-AzaB, un nano-théranostique, dans des modèles de tumeur du sein chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du sein leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des injections intraveineuses de nanoparticules d'or et des séances de laser portant la tumeur à 41-43 °C, avec un prélèvement de sang intracardiaque terminal, les nécroses tumorales douloureuses déclenchant la mise à mort. Le porteur annonce espérer une "régression totale" des tumeurs et la "guérison des souris", bénéfices renvoyés à un éventuel passage en clinique. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" n'est disponible pour cette étude de biodistribution et de toxicité.
Objectifs
Dans la lutte contre le cancer, une des stratégies thérapeutiques utilisées consiste à induire la mort des cellules cancéreuses, en ciblant notamment des récepteurs de la famille du TNF. Ce « suicide » cellulaire peut être activé à l’aide d’anticorps monoclonaux (Acm), ciblant des récepteurs membranaires. C’est ce qui est proposé dans ce projet où le greffage de ces Acm sur des nanoparticules d’or va permettre, suite à l’induction d’une hyperthermie induite par action d’un laser, d’augmenter leur activité cytotoxique. L’approche thérapeutique développée dans ce projet est basée sur des données expérimentales obtenues dans notre équipe qui démontrent notamment qu’une hyperthermie modérée sensibilise les cellules cancéreuses à la mort et que cette hyperthermie peut-être obtenue par excitation de nanoparticules d’or par un laser. : L'objectif de ce projet consiste donc à démontrer l’effet anti-tumoral de notre médicament dans des modèles de tumeurs mammaires chez la souris. Notre médicament est composé de nanoparticules d’or cylindriques sur lesquelles sont greffées des anticorps ciblant un récepteur membranaire, couplées à une molécule fluorescente. Une fois injecté aux souris, ce médicament présentera donc l’avantage de cibler les tumeurs exprimant le récepteur et de pouvoir être suivi par imagerie. De plus, la présence des nanoparticules d’or va permettre d’induire une hyperthermie modérée (41 à 43°C) grâce à un laser émettant dans le proche infrarouge, ce qui devrait en principe favoriser la mort des cellules tumorales. Afin de pouvoir proposer cette nouvelle thérapie en clinique, il nous faut maintenant déterminer l’effet anti-tumoral de cette thérapie dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous analyserons la toxicité de l’agent, sa bio-distribution et son efficacité thérapeutique dans des souris porteuses de tumeurs exprimant ou non le récepteur d’intérêt.
Bénéfices attendus
De nombreux travaux mettent en évidence l’intérêt de cibler les récepteurs de mort, cette thérapie étant en essai clinique dans certains cancers de l’Homme. D’autres travaux obtenus in vitro montrent que l’induction d’une hyperthermie peut augmenter l’activation du signal de mort, l’activation de nanoparticules d’or par un laser étant un des moyens d’induire cette hyperthermie ciblée. Ce nouvel agent combine toutes ces propriétés puisqu’il est composé de nanoparticules d’or sur lesquelles sont greffées des anticorps (Acm) ciblant un récepteur de mort et une molécule fluorescente nous permettant de détecter cet agent par imagerie. Les résultats obtenus in vitro nous encouragent à tester cet agent dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous nous attendons à visualiser la présence de cet agent, injecté chez la souris, uniquement sur les tumeurs exprimant le récepteur de mort. L’effet anti-tumoral de cet agent devrait être augmenté par l’induction de l’hyperthermie induite par le laser. Nous nous attendons à avoir la régression totale des tumeurs exprimant le récepteur de mort et donc la guérison des souris. A terme, cette thérapie pourra être proposée en clinique aux malades porteuses de cancer du sein résistantes aux différents traitements proposés actuellement.
Procédures
Les animaux recevront 1 injection en sous-cutané de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (en 5-6 secondes). Le traitement aura lieu une fois par semaine sur 4 semaines (4 injections au total), en IV sous anesthésie gazeuse. L’imagerie nécessitera une injection intrapéritonéale préalable (en 3-4 secondes), soit 7 injections. La stimulation laser localisée au niveau des tumeurs sera réalisée sur une durée de 5 à 10 minutes sous anesthésie gazeuse. Le prélèvement de sang en intra-cardiaque nécessitera l’injection intrapéritonéale de l’anesthésiant (injecté en 3-4 secondes) et ce prélèvement sera réalisé en moins de 1 minute. L’irradiation par laser des tumeurs aura lieu pendant 5 à 10 minutes, la durée exacte étant déterminée par mesure de l’hyperthermie modérée (41-43 °C) mesurée par la caméra thermique.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales pour le développement d’une tumeur sous-cutanée au niveau des flancs de la souris n’est pas sensée induire d’inconfort notoire tant que le volume tumoral ne dépasse pas la taille de 2000 mm3 et que la tumeur ne gêne pas la motricité. Une diminution de mobilité des souris. La perte de poids engendrée par la réduction de capacité à se nourrir. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires. Le traitement localisé au laser (au niveau des tumeurs), qui aura lieu sous anesthésie à l’isoflurane, peut engendrer un peu d’irritation. Une potentielle déshydratation des yeux des souris.
Devenir
La croissance tumorale (point limite), ainsi que le prélèvement de sang final et des organes justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.
Remplacement
Toutes les expériences in vitro portant sur l’effet cytotoxique de l’agent théranostique associé ou non à une activation par laser ont été réalisées et ont montré l’effet désiré (synergie de l’induction d’apoptose spécifiquement dans les cellules exprimant le récepteur de mort). Pour aller plus loin dans la preuve de concept de l’utilisation de cet agent associé à l’induction d’une hyperthermie modérée comme traitement anti-cancéreux, l’utilisation des modèles de souris porteuses de tumeurs est nécessaire. Aucune méthode alternative n’est disponible pour réaliser cette étude. Ce projet nécessite la réalisation d’une étude de biodistribution et de toxicité, ainsi que l’évaluation du ciblage spécifique de la tumeur et de son potentiel antitumoral. Ce type d’étude n’est possible qu’avec des système complexes vivants. De plus, l’étude du rôle du système immunitaire dans l’approche thérapeutique proposée, et notamment sur les cellules tumorales murines exprimant le récepteur de mort humain, permettant de tester notre anticorps ciblant ce récepteur humain, n’est possible que dans des souris immunocompétentes.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum, tout en respectant nos objectifs scientifiques. Pour augmenter cette réduction, nous implantons deux tumeurs à la fois sur les souris, une tumeur n’exprimant par DR4 (tumeur contrôle) et une tumeur exprimant DR4 (tumeur test). Cette double implantation évite de devoir utiliser un groupe supplémentaire afin de tester la spécificité de ciblage de nos anticorps (expérience de compétition en injectant une quantité 100 X plus importante d’Ac non marqué). Le nombre d’animaux est déterminé à priori par une analyse de puissance et représente le nombre minimal d’animaux permettant de produire des résultats statistiquement interprétables. En effet, des analyses de puissance statistique sur le logiciel G*Power ont été réalisées pour déterminer la taille d’échantillons minimum à utiliser. Le test de Wilcoxon est le plus approprié pour l’analyse de nos résultats. L’analyse de variance à un facteur peut être utilisée pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les groupes. Des tests post-hoc, tels que le test de Tukey ou la correction de Bonferroni, seront utilisés pour identifier les différences spécifiques entre les groupes.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés où ils bénéficieront du raffinement de rigueur. Les souris seront habituées aux gestes techniques (contention, injections…) avant l’expérimentation. La croissance tumorale sera mesurée tous les deux jours pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessives. En cas d’apparition de signes anormaux la fréquence de surveillance sera augmentée. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Une grille de score d’évaluation des points limites sera mise en place pour réduire la souffrance des souris utilisés. Différents paramètres seront observés pour limiter la douleur tels que : - Apparence physique (poils, oreilles, yeux, posture) - Perte de poids - Comportement / réponse aux stimuli - Volume tumoral - Nécrose tumorale - Déshydratation - Gêne à la mobilité L’addition du score de chaque critère donnera une note sur 21. Un score de 12 ou un critère atteignant 3 points entraînera la mise à mort des souris par dislocation cervicales après anesthésie à l’isoflurane.
Choix des espèces
Dans un premier temps, cette étude sera réalisée avec des souris immunodéficientes BALB/c Nude. Ces souris immunodéficientes nous permettront de réaliser des greffes de cellules humaines de cancer de sein (exprimant ou non le récepteur de mort). Ces dernières seront injectées en sous-cutané afin d’évaluer l’effet antitumoral des traitements que nous allons tester. Des souris BALB/c WT de fond génétique identique à des cellules cancéreuses mammaires de souris seront également utilisées pour montrer le rôle du système immunitaire dans l’efficacité antitumorale Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g). Cela nous permettra la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire bien développé (BALB/c WT) ou du moins mature (BALB/c Nude).
Etude du rôle des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans l’initiation et la progression tumorale du carcinome associé à la colite (CAC)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cancer colorectal leur est induit par un carcinogène et un promoteur d'inflammation, avec une centaine d'injections intrapéritonéales en dix semaines et sans anti-inflammatoire, puisque le projet étudie précisément le rôle de l'inflammation. Le porteur reconnaît des douleurs et une perte de poids, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever côlon et rectum. Il indique disposer de cultures in vitro qui "ne récapitulent pas" la complexité de l'organe et conclut au recours aux souris.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier le rôle des cellules immunitaires appelées neutrophiles dans l'initiation et la progression tumorale du cancer colorectal. Plus précisemment nous souhaitons étudier une des fonctions des neutrophiles : la formation de « Pièges Extracellulaires», appelés "NETs", dans le developpement cancéreux. Les NETs sont composés d’ADN recouverts de protéines et sont libérés à l'exterieur des neutrophiles, afin de piéger et tuer les pathogènes lors d'une infection. Cependant des études ont montré que ces NETs ont également des propriétés pro-tumorales. Notre hypothèse est que les neutrophiles et NETs entrainent la progression du cancer colorectal via i) l’activation de cellules saines de soutien des tissus ; ii) l’inhibition de la réponse immunintaire anticancéreuse. En effet, ces évènements sont indispensables au développement des tumeurs et à la progression du cancer. Plus spécifiquement, nos résultats montrent que les NETs activent les cellules de soutien des tissus qui sont capables de modifié l'environnement des cellules permettant ainsi l'apparition et le developpement du cancer. De plus, nous avons identifié 2 protéines clés présentent dans les NETs connues inhiber la réponse immunitaire anti-tumraole. Il en résulte un environnement propice au développement des cellules cancéreuses. Nous souhaitons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle AOM/DSS (Azoxymethane : carcinogne / Dextran Sodium Sulfate : promoteur) de cancer colorectal. En effet nous nous attendons à un retardement de l’initiation du cancer et une diminution de la progression du cancer lorsqu'on empeche l'action des neutrophiles et la formation de leur NETs. Le but est d'utiliser ce modèle pour confirmer le rôle des voies de signalisation impliquées dans l'activation des neutrophiles, la formation des NETs, et dans leur capacité à empecher la réponse immunitaire anticancéreuse et à modifier l'environnement des cellules.
Bénéfices attendus
Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais permettra de comprendre précisemment le(s) lien(s) entre inflammation et cancer et pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints d'un cancer colorectal.
Procédures
Les animaux seront manipulés par contention classique quotidiennement pour inspecter leur état général et leur administrer par injection intrapéritonéales les différents traitements (piqures en bas de l'abdomen, quotidiennement pour les inhibiteurs et 3 fois par semaine pour les anticorps) pendant 10 semaines. La contention de chaque animal durera en moyenne 20 – 25 secondes et sera réduit autant que possible dès que les conditions le permettront afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, chaque animal sera pesé 3 fois par semaine, ce qui nécessitera une manipulation supplémentaire de l’animal courte (environ 5 secondes) pour le déposer sur la balance et le remettre dans sa cage. Les animaux recevrons 100 injections en 10 semaines et ces injections ne dureront que quelques secondes chacune.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des signes de douleurs et une perte de poids (entre 5% et 10% du poids de l’animal après chaque cycle de DSS). Cette perte de poids est normale et elle est récupérée et généralement augmentée quelques jours après la fin d’un cycle de DSS (pendant la periode de récupération). La perte de poids ne devrait donc jamais excéder les 15% du poids initial à jour 0 des souris. Des signes de stress induits par l'injection répétée en intra-péritonéale des traitements peuvent aussi apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience car nous aurons besoin de prélèver ensuite la le colon et le rectum des animaux pour analyser les tumeurs qui se seront développées en réponse au traitement cancérigène AOM/DSS.
Remplacement
Nos recherches ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l’invasion cancéreuse. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur les capacités tumorales des cellules de cancer colorectal (CCR). Cependant ces cultures ne récapitulent pas en totalité les caractéristiques du carcinome colorectal (contrairement au modèle AOM/DSS de carcinome associé à la colite) et la complexité de l’organe, nous avons donc recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un nombre de souris minimum. Le nombre de souris se justifie par la fréquence des lésions tumorales observées après 10 semaines de traitement et l’hétérogénéité possible des différents stades cancéreux auxquels seront les tumeurs après le traitement par l'AOM/DSS. Pour l’étude des lésions cancéreuses très avancées et invasives, il nous faudra suffisamment d’animaux par groupes ayant développé spontanément ces lésions avancées pour avoir des analyses statistiques fiables. Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. En effet, le fait que ce modèle soit largement utilisé et décrit par la communauté scientifique nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Ainsi nous avons générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme, 4 souris par cages, avec un cycle jour/nuit de 12h, eau/nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (mouse house, carrés de coton, bâtons à ronger). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d’acclimatation sera de 5 jours. Le suivi se fera 3 fois par semaine et la santé des animaux sera évalué via une liste de critères, de symptomes et de points limites. Aucun anti-inflammatoire ne sera donné puisque nous souhaitons caractériser le rôle de l’inflammation dans le développement du carcinome associé à la colite.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans l'inititation et le développement du carcinome associé à la colite (CAC) . Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, le modèle AOM/DSS reproduit fidèlement les caractéristiques de carcinogenése inflammatoire que nous souhaitons étudier et il a été bien caractérisé et est largement utilisé pour sa reproductibilité dans la communauté scientifique pour ce type d’étude. L’administration d’agents chimiques induisant la carcinogénèse sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 10 semaines après initiation au AOM/DSS, ce qui correspond à la formation de carcinome colorectal.
Induction de tumeurs pulmonaires dans un modèle de souris mutantes K-rasG12D et implication de la protéine Atad2 (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent sous anesthésie une injection intra-trachéale unique de particules virales déclenchant une mutation cancéreuse dans les poumons, avant d'être tuées pour analyse pulmonaire. Ce volet ajoute un groupe de souris témoins pour renforcer des données sur le rôle d'un facteur à bromodomaine dans le cancer du poumon. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reflète la dynamique observée in vivo et conclut à la nécessité du modèle animal.
Objectifs
La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Cette modifcation du projet concerne l'addition d'un groupe de souris contrôles pour renforcer nos données.
Bénéfices attendus
Le gène étudié au cours des 15 dernières années a été largement décrit comme étant surexprimé dans tous les tissus cancéreux humains étudiés et présentant un facteur de mauvais pronostic. Après analyse des articles scientifiques sur ce gènee et le cancer, il s'avère que toutes les études ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur le degré d’implication de ce gène dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer impliquant directement cette protéine. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité de la protéine d'intérêt est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais encore inconnu, mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.
Procédures
Les animaux recevront par voie intra-trachéale une injection unique et sous anesthésie de particules virales induisant la mutation désirée dans les poumons. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale n'est prévu durant cette période. La préparation des particules virales dure 30 minutes environ. La durée de l'anesthésie est de 5 minutes par souris. Une fois anesthéssiées, les souris recevront par voie intratrachéale une dose de particules virales. Cette étape dure 1 à 5 minutes par souris. À la fin de cette étape, les animaux seront placés pendant 10 à 15 minutes sur une plaquante chauffante dans un environnement calme afin de leur permettre de se réveiller.
Impact sur les animaux
Dans cette partie du projet, les souris recevront les particules virales.
Devenir
A l'issue de cette procédure, toutes les souris seront sacrifées et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.
Remplacement
Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.
Réduction
Après avoir discuté avec nos biostatisticiens nous nous étions fixés un nombre minimal de 4 animaux par groupe nécessaire afin de réaliser une cinétique d'infection pour suivre l'évolution des tumeurs (sur le plan histologique mais aussi et surtout au niveau moléculaire) et pouvoir l'analyser statistiquement, car les tumeurs pulmonaires sont très hétérogènes. D'autre part, d'après notre expérience, il arrive que des animaux décèdent lors de l'expérimentation. Une réduction de nos groupes expérimentaux initiaux rendrait caduque l’interprétation et l'analyse de nos données, c'est pourquoi nous comptons faire un individu supplémentaire si besoin. Enfin, contrairement à la version précédemment autorisée nous ne réaliserons des prélèvements qu’aux 2 temps les plus pertinents par rapport aux données déjà obtenues (6 et 12 semaines) et plus à 5 temps (4, 6, 8, 10 et12 semaines), ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. C’est pourquoi nous avons n=5 animaux par groupe x 2 lignées 2 temps d’analyse différents.
Raffinement
Les injections de particules virales sont faites sous anasthésie générale pour limiter la douleur et le stress. Les souris seront maintenues sous tapis chauffant pour éviter une perte de tempréature. Du gel occulaire sera appliqué pour éviter la déshydratation. Des points limites seront mis en place pour maintenir un état de douleur léger.
Choix des espèces
Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que des effets de l'intubation intratrachéale.
Fourniture de souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
250 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le projet consistant à leur greffer une tumeur puis à les livrer à un chercheur extérieur. Une lignée de cellules de glioblastome humain leur est implantée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis elles sont expédiées au demandeur dans les quinze jours, avant l'apparition annoncée de nuisances. Ce laboratoire se limite donc à greffer une tumeur et à fournir les animaux à un tiers, qui les utilisera pour tester des sondes d'imagerie. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.
Objectifs
Ce projet a pour but de fournir, à la demande d'un chercheur extérieur à notre laboratoire, des souris modèles de cancer cérébral. Ces souris modèles seront ensuite utilisées chez le chercheur afin d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant en particulier le métabolisme du tryptophane. La lignée cellulaire tumorale d'origine humaine U87 MG Luc correspond aux besoins du chercheur. L’objectif du financement ANR du chercheur est le transfert en clinique de radiopharmaceutiques innovants pour l’imagerie TEP en oncologie et neurologie et la radiothérapie moléculaire. Il est donc nécessaire des réaliser ce projet sur une lignée cellulaire humaine. Les souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée seront envoyées au chercheur 15 jours maximum après leur induction.
Bénéfices attendus
Le métabolisme du tryptophane via la voie de la kynurénine médiée par l'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) joue un rôle dans l'immunomodulation et est devenu une cible plausible pour l'immunothérapie contre le cancer. Ce projet permettra au chercheur d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant le métabolisme du tryptophane. L'imagerie TEP est un outil diagnostique de choix en cancérologie chez l'homme.
Procédures
Souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse en sous cutanée au niveau du flanc des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Pesée des animaux vigiles , dure 30 secondes, 1 fois par semaine minimum. Mesure de la tumeur au pied à coulisse, se fait sous anesthésie gazeuse, dure moins de 1 minute, 1 fois / semaine maximum. Si l'envoie des souris se fait 15 jours après l'induction: pour chaque souris 3 pesées minimum et 2 mesures de tumeur au pied à coulisse).
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur sous cutanée. Dans ce modèle, il n'y aura pas de métastases. Les souris seront envoyées au chercheur avant l'apparition de nuisances ou d'effets indésirables soit 2 semaines maximum après l'induction des tumeurs. La douleur infligée par l’injection des cellules correspond à celle d’une piqûre d’aiguille et se fait sur souris anesthésiée (Isoflurane 2% dans l'air) tout comme la mesure de la tumeur au pied à coulisse qui est indolore. Les souris immonodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficiences qui n'apparait pas puisqu'elles sont hébergées en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux du projet (50 souris x 5 envois= 250 souris) seront uniquement induits puis hébergés dans nos locaux pendant 2 semaines maximum. Ils pourront ensuite être fournis au chercheur demandeur de ce modèle pour des projets expérimentaux autorisés réalisés dans son UE. Nous lui fournirons la grille de scoring et le suivi pondéral des animaux dans nos locaux.
Remplacement
Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro nous permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
Ce modèle de cancer chez la souris a pour finalité d'être utilisé par un chercheur pour l'étude de nouvelles sondes d'imagerie. D'une part, nous avons déterminé avec lui le nombre minimal de souris nécessaire pour mener à bien son projet et d'autre part le chercheur mettra en œuvre une technique d'imagerie (Tomographie d'émission de positon) qui permettra de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Pour chaque série expérimentale, il analysera les images ce qui permettra de comparer l’accumulation du traceur dans différentes zones (« zones d’intérêt ») entre les temps d’imagerie pour chaque groupe, et entre les groupes. Les différences d’accumulation du traceur dans chaque zone d’intérêt seront analysées statistiquement.
Raffinement
Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et afin d’éviter toute souffrance avant leur départ chez le chercheur, nous mettrons en place une grille de score et utiliserons des points limites adaptés et un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Etude du rôle de la voie IL-1/IL-1R1 sur la réponse à la chimio-immunothérapie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont greffées sous la peau du flanc, puis elles reçoivent des chimiothérapies et immunothérapies par voie intrapéritonéale, la masse tumorale pouvant gêner leurs mouvements avant leur mise à mort lorsque la tumeur devient trop volumineuse ou pour en prélever le tissu. Le projet vise à comprendre le rôle de la cytokine IL-1 dans la résistance aux traitements de trois cancers parmi les plus mortels. Le porteur affirme que l'évaluation de ces combinaisons "doit être réalisée sur les organismes vivants" et conclut au recours à des souris immunocompétentes greffées.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer le rôle de l’ IL-1sur l’efficacité des traitements de chimiothérapies et d’immunothérapies utilisés en clinique. Nous étudierons également la présence de cellules immunitaires dans les tumeurs. Ainsi, nous pourrons évaluer l’efficacité des traitements et déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.
Bénéfices attendus
Les cancers du côlon du pancréas et du poumon font partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Leur traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies qui malheureusement ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie, visant à activer le système immunitaire, a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas et pour certains cancers colorectaux et pulmonaires. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. L’IL-1 est une cytokine inflammatoire pouvant être produite à la suite d’un traitement par chimiothérapie. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de l’ IL-1, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.
Procédures
- Injection sc des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1600 souris C57BL/6, 800 souris C57BL/6 Il1b-/- et 800 souris C57BL/6 Il1r1-/-. - Traitements par chimiothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 800 souris C57BL/6, 400 souris C57BL/6 Il1b-/- et 400 souris C57BL/6 Il1r1-/-. - Traitements par immunothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 800 souris C57BL/6, 400 souris C57BL/6 Il1b-/- et 400 souris C57BL/6 Il1r1-/-.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important..
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsque la taille des tumeurs sera trop importante. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les différents modèles (cancers du pancréas, du poumon et du colon) utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon l’organe d’origine, les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. De plus, selon le type de cancers, les régimes de chimiothérapies seront différents afin de se rapprocher de la clinique. Ces traitements affecteront également de manière différentielle les cellules du microenvironnement. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe. Certains points limites peuvent survenir, ce qui conduira dans un premier temps à un arrêt des traitements, puis si persistance à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence des souris C57BL/6 génétiquement modifiées pour ne plus exprimer l’IL-1R1 ou l’IL-1β renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Rôle des changements épigénétiques liés à l’âge dans les cellules oligodendrogliales sur la cognition des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1734 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à modéré, les cohortes expérimentales tuées à l'issue et une lignée conservée pour de futures études. Elles subissent un génotypage par prélèvement d'oreille ou de queue, des injections répétées de tamoxifène, une chirurgie stéréotaxique du cortex moteur et des tests d'apprentissage moteur sur roue à échelons, une perte de poids atteignant 20 % déclenchant la mise à mort. Le projet vise à décrire le rôle de cellules de la myéline dans le déclin cognitif lié à l'âge, le porteur renvoyant au conditionnel et au long terme l'espoir de "rajeunir" ces cellules chez l'humain. Il affirme que les organoïdes "ne suffisent pas" et présente le recours à la souris comme "nécessaire".
Objectifs
La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules oligodendrogliales dans la plasticité cérébrale et la cognition. Notre équipe a récemment découvert un activateur épigénétique dépendant de l'âge (enzyme Ten-Eleven Translocation 1 (TET1)), nécessaire à la différenciation et à la remyélinisation des oligodendrocytes, mais défaillant dans le vieillissement. Nous avons développé une lignée de souris, dans laquelle l'ablation de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (lignée de souris Tet1cKO) imite un phénotype myélinisant semblable au vieillissement, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier le rôle des cellules oligodendrogliales dans le vieillissement. Nous avons également identifié une cible TET1 spécifique à l'oligodendrogliale : le symporteur SLC12A2, dont l'expression à l'interface neurogliale diminue avec l'âge, entraînant directement une myélinisation défectueuse (caractérisée par un gonflement). Dans ce projet, nous allons 1/ Caractériser le rôle du vieillissement oligodendroglial sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, en utilisant notre modèle de souris Tet1cKO ; 2/ Identifier les gènes cibles TET1 réactivés lors de tâches d'apprentissage moteur ; 3/ Caractériser le rôle de l'ablation de Slc12a2 sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, à l'aide d'un modèle de souris (Slc12a2icKO) et d'un lentivirus Scl12a2KO. En caractérisant mieux le rôle dépendant de l'âge des cellules oligodendrogliales sur la fonction neuronale et les capacités comportementales, notre projet aborde pleinement le rôle de la myélinisation sur la cognition, ce qui pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des oligodendrogliaux dans le vieillissement, en particulier autour de la compaction de la myéline, et l'identification des voies spécifiques aux oligodendrogliaux nécessaires aux fonctions cognitives. À long terme : développer des stratégies pour rajeunir les cellules oligodendrogliales, pour favoriser les fonctions cognitives dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage. Certains peuvent être génotypés de manière non invasive (lampe UV, 5 secondes, une fois). D'autres devront être génotypés avant sevrage, en prélevant un échantillon de queue (sous anesthésie, 5 secondes, une fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux (1 à 2 semaines, une fois). Les souris seront injectées en IP pour la recombinaison du tamoxifène (4 fois par semaine, une fois). Des souris seront injectées chirurgicalement dans la zone corticale motrice (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être sacrifiées (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Au cours de cette DAP, les animaux subiront les différents génotypages soit par punch à l'oreille pour les adultes ou le prélèvement d'un bout de queue pour les souriceaux. Il subiront, en fonction de la procédure, ou de l'anesthésie à l'isoflurane (en induction (4%) et/ou en entretien (2 à 3%)) ou de l'anesthésie injectable kétamine - Xylazine. Les animaux seront soumis à différents tests d'apprentissge, et de mémorisation. Lors du test d'apprentissage moteur dependant de la plasticité myélinique, à l'aide de dix cages équipées d'un roue à 38 échelons, les animaux seront hébergés à un animal par cage. Quelques animaux pourront recevoir du Tamoxifène en injection intrapéritonéale. Enfin certains animaux subiront une chirurgie stéréotaxique d'une durée de 30 minutes.
Devenir
Toutes les cohortes expérimentales seront euthanasiées à la fin de l'étude, afin de corrélerer l'analyse comportementale par une anlayse au niveau moléculaire et/ou cellulaire. Une cohorte des lignées de souris générées sera conservée dans notre animalerie, pour des études ultérieures.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions et dysfonctionnements cognitifs au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques et de voies moléculaires dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et d'iPSCs. En effet, pour notre approche lentivirale Slc12a2KO, nous allons d'abord optimiser notre protocole sur des lignées cellulaires (Olineu), afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 9 ou 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes. Pour les animaux sacrifiés pour les cultures de tissus, nous devons mettre en commun 3 tissus de souris par expérience. Notre expérience avec ce modèle de co-culture suggère de prévoir 4 répétitions par test in vitro, pour chaque analyse (immunohistochimie, électrophysiologie,...).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un cycle obscurité-lumière de 12h à 21°C(±1°C) dans des cages ventilées (12vol/h), sous environnement contrôlé et enrichi (alternance entre dôme en carton et en plexiglax, coton Nestlets). Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers dévoués et formés, chargés de veiller à leur bien-être. Lors de l'apprentissage face à une roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans sa cohorte de groupe. Pour les injections IP, nous alternerons les côtés et les souris seront surveillées pour détecter toute perte de poids, éruption cutanée ou infection. Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris recevront une injection de buprénorphine (0,5-1 mg/kg, IP), le jour de la chirurgie et deux fois par jour les 2 jours suivants. Pendant la chirurgie, nous appliquerons une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et couvrirons les yeux pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure, nous procéderons à une infiltration de lurocaïne avant incision de la peau. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, l'animal sera placé sous une lampe chauffante jusqu'au réveil anesthésique avant de retourner dans la pièce d'hébergement. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage pour les animaux, afin de fournir un soutien trophique général et de garantir que la perte de poids est contenue (inférieure à 20 % du poids corporel d'origine). Si l'état général du corps semble médiocre (perte de mobilité, dos arqué, incapacité à se toiletter) ou si la perte de poids est égale ou supérieure à 20 %, les souris auront atteint des points limites et seront euthanasiées et retirées de l'étude.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. Notre modèle Tet1cKO, que nous allons recréer dans notre installation, combine les lignées Olig1-cre et Tet1-flox, induisant une ablation constitutive de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (cellules Olig1+). Le modèle Slc12a2icKO sera créé dans l'institut en combinant les lignées Plp-creERT et Slc12a2-flox, induisant une ablation inductible par le tamoxifène de Slc12a2 dans les oligodendrocytes matures (cellules PLP+). La lignée transgénique PDGFRa-eGFP est une lignée, dans laquelle la fluorescence GFP imite le schéma d'expression de PDGFRa, permettant la détection et l'isolement de cellules progénitrices d'oligodendrocytes. Pour études comportementales, des souris adultes seront utilisées à l'âge de 2 mois, âge idéal pour cette approche, puisque les souris sont jeunes et actives. Pour établir des modèles in vitro, les souriceaux de 7 jours et des animaux de 2 mois et 12 mois seront utilisés pour collecter les tissus cérébraux, nécessaires à une culture tissulaire efficace et viable.
Etude des effets thérapeutiques lors du traitement par radiothérapie interne via l’utilisation de nanoparticules chargées au Rhénium-188 et d’un bio-implant dans le cas du glioblastome chez le rat (1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de glioblastome leur est implantée dans le cerveau, suivie de la pose d'implants biodégradables et de séances de radiothérapie interne au rhénium-188 et externe, cette dernière imposant un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres, avec un suivi IRM hebdomadaire. Le porteur reconnaît une fatigue, du stress, une mauvaise cicatrisation, une perte de poids et une prostration possibles, et prévoit la mise à mort de tous les rats pour éviter la souffrance liée à la croissance tumorale. Il indique avoir mené des essais préalables sur cellules et sphéroïdes mais présente le recours à deux modèles de rats comme "indispensable" pour obtenir des données transférables à la clinique.
Objectifs
Le développement de ce projet chez le rat permettra d'évaluer si l'attraction de cellules cancéreuses résiduelles dans un implant biodégradable en zone confinée (la cavité d'ablation de la tumeur dans le cerveau) apporte un bénéfice préclinique en synergie d'une radiothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements du fait de l'inclusion d'un acte de radiothérapie externe à distance du site principal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavité d'éxérèse dans le glioblastome en synergie d'irradiation pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) - la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h) - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h30) - l'association ou non à des radiothérapies (durée d'environ 30 minutes fractionnée en 2 ou 3 fois selon le type de radiothérapie). En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire. L'un des actes (radiothérapie externe) inclue un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
La thématique de recherche de notre équipe concerne le développement d’approches thérapeutiques pour le traitement du glioblastome et l’étude des modalités de mise en place posant à la fois des questions fondamentales et des questions de biotechnologies pour la santé. Le projet ici proposé a pour but l’étude du piégeage tumoral au travers de bio-implants polymères pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes de piégeage (au travers d’un leurre environnemental) et celle d’élimination (au travers de l’application d’une procédure de radiothérapie interne vectorisée). L’utilisation de deux modèles pour valider ces procédures et obtenir des données interprétables par la suite valorisables par la publication et transférables à la clinique est indispensable pour répondre aux questions et livrables scientifiques indiqués dans le résumé non technique.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur des cellules dissociées ainsi que des sphéroïdes ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Un groupe référence incluant la radiothérapie externe est introduit, toutefois sans modifier le nombre initial d'animaux prévus pour l'étude, tout en devant générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Ce projet sera développé chez le rat, permettant des gradients d’infusion de chimio-attractant et des migrations cellulaires sur des volumes et distances plus importants que chez la souris. La possibilité d’utiliser deux types cellulaires dans deux types de rats est envisagée afin d’investiguer les réponses dans un cadre de xénogreffe d’une part et dans un cadre syngénique d’autre part (permettant d’étudier le rôle de l’immunité). En effet, nous avons validé des cellules humaines modifiées (de niveau sécuritaire 1) sur-exprimant le récepteur CXCR4, jouant un rôle dans les réponses aux radiations, et une protéine de fluorescence ; ce modèle sera utilisé chez le rat nude. Par ailleurs la lignée cellulaire F98 (modèle de GB de rat) sera utilisée chez le rat Fischer pour les études syngéniques. Les rats seront utilisés à 8 semaines car ils seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.
Etude du rôle de nouveaux gènes dans les pathologies osseuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Certaines subissent le retrait des ovaires sous anesthésie, d'autres une arthrite provoquée, avec injections, prises de sang et biopsie de la queue, pour étudier le rôle d'un gène dans l'érosion des os. Le porteur indique que l'arthrite provoque rougeurs, gonflements des pattes et douleurs des membres, prises en charge par une grille de score et des analgésiques. Il affirme, après des études sur cellules, que le modèle animal est "indispensable" pour répondre dans un contexte physiologique et pathologique.
Objectifs
Avec le vieillissement de la population Européenne, les maladies inflammatoires chroniques deviennent un problème de santé publique majeur (100 millions selon l’OMS). En plus de l’inflammation, elles sont souvent associées à de l’érosion osseuse (localisée ou généralisée) responsable de douleurs et d’une augmentation du risque de fractures. Les thérapies anti-résorptives actuelles sont très efficaces pour bloquer l’érosion osseuse mais ont des effets secondaires délétères à long terme sur le remodelage osseux, affectant la qualité osseuse et augmentant le risque de fractures et d’ostéonécrose. Parce que le bon fonctionnement du tissu osseux repose sur un équilibre entre formation et érosion de l’os, il est nécessaire de comprendre la biologie de l’érosion osseuse pour développer des thérapies ciblées anti-résorptives qui n’affectent pas la formation osseuse. Dans l’organisme, la seule cellule responsable de l’érosion osseuse est l’ostéoclaste et l’objectif de ce travail est d’étudier le rôle d’un gène d’intérêt dans ces cellules et l’érosion osseuse.
Bénéfices attendus
- Impact scientifique et technologique : Identification d’un nouveau gène jouant un rôle clé dans la formation et l’érosion des os, acquisition de nouvelles connaissances dans le domaine de la biologie de l’os et de données qui seront mis à disposition de la communauté scientifique internationale pouvant servir à d’autres disciplines de la biologie. - Impact sociétal et économique : ce projet peut déboucher sur l’identification de gènes candidats qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques intéressantes pour développer des traitements anti-résorptifs et/ou des marqueurs de la qualité osseuse utilisables en cliniques.
Procédures
Les prélèvements sanguins seront effectués sur animal anesthésié (2 minutes). Certains animaux recevront une injection intra-péritonéale (30 sec). Certains animaux seront opérés sous anesthésie générale et avec analgésique pour retirer les ovaires (30 min). Afin d’identifier les animaux porteurs de la modification génétique voulue, une biopsie de queue est réalisée avant le sevrage (2-3 secondes).
Impact sur les animaux
Dans le cas de l’arthrite, les effets indésirables attendus sont : rougeurs, gonflements des pattes, douleurs des membres, altération légère de la marche. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, des gels de nourriture hydratée seront placés dans la litière. Ils sont euthanasiés à J21 maximum. Les animaux sont observés quotidiennement et les signes de souffrances sont recherchés et scorés en suivant une grille de score. Dans le cas du retrait des ovaires, des douleurs post-opératoires au niveau des cicatrices peuvent apparaitre et seront prises en charge par les mesures analgésiques adaptées.
Devenir
Euthanasie pour prélèvement d’organes.
Remplacement
En préliminaire à cette saisine, nous avons mené toute une série d’études in vitro pour étudier le rôle de notre gène dans la formation et les fonctions érosives des ostéoclastes. Nos résultats nous ont conduit à émettre l’hypothèse que l’élimination de ce gène chez l’animal altérerait la dynamique du remodelage osseux pendant la croissance chez des animaux sains, et améliorerait les phénomènes d’érosion osseuse dans des pathologies inflammatoires comme l’arthrite ou l’ostéoporose. Le modèle animal est donc indispensable pour répondre à cette question dans un contexte physiologique et dans différentes pathologies.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au minimum avec des outils statistiques.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours y compris le weekend et les jours fériés et les signes de souffrance seront recherchés. En cas d’apparition, ces manifestations cliniques seront scorées suivant une échelle prenant en compte plusieurs paramètres, avec établissement de points limites entrainant euthanasie des animaux si nécessaire. Pour les animaux arthritiques, afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, des gels de nourriture hydratée sont placés dans la litière.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés pour étudier le gène d’intérêt. Tous les animaux seront utilisés à un âge adulte (à partir de 8 semaines).