Rongeurs
Ouverture de la barrière hématomédullaire et traitement anti-inflammatoire chez un modèle murin de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'un modèle de sclérose latérale amyotrophique, elles subissent des injections quatre jours par semaine et une ouverture de la barrière entre le sang et la moelle épinière sous anesthésie chaque semaine pendant cinq semaines, la moitié étant suivies jusqu'au stade terminal de la paralysie. Le porteur reconnaît une perte de force musculaire, une paralysie progressive, et des risques d'hypothermie et d'arrêt cardiaque liés aux anesthésies répétées. Il affirme que ce modèle murin est le seul à reproduire la paralysie progressive de l'adulte, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative grave qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 2 mois en moyenne. Les barrières entre le sang et le cerveau, hémato encéphalique (BHE) et entre le sang et la moelle épinière, hémato médullaire (BHM) sont des structures limitant le passage des molécules du sang vers le système nerveux central et représentent donc un challenge dans le traitement des maladies neurologiques et particulièrement de la SLA, qui ne trouve à ce jour pas de traitement satisfaisant. Il est aujourd’hui possible d’ouvrir cette barrière de manière transitoire et sans danger. Il a été montré que certaines cellules immunitaires dans des modèles murins de SLA permettaient de ralentir la progression de la maladie. L’objectif de notre étude sera de réaliser une approche combinée, avec une stimulation de ces cellules immunitaires associée à une ouverture transitoire de la barrière hématomédullaire, permettant d’augmenter leur infiltration dans le système nerveux central pour ralentir d’autant plus la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie, en induisant une immunomodulation locale par ouverture de la barrière hématomédullaire et stimulation de certaines cellules immunitaires. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’homme est envisagé. Des méthodes existent déjà chez l’homme pour ouvrir la barrière hémato encéphalique et un dispositif d’ouverture adapté aux patients atteins de SLA pourrait voir le jour si l’étude préclinique s’avère positive.
Procédures
Les souris arriveront déjà numérotées par QR code auriculaire donc aucune procédure supplémentaire de numérotation ne sera nécessaire. Un génotypage sur prélèvement d’un petit bout de queue sera réalisé. Ce prélèvement aura lieu sous anesthésie générale, à l’occasion de la première anesthésie réalisée pour ouverture de la barrière hématomédullaire. • Injection d’un traitement immunomodulateur 4 jours par semaine pendant 5 semaines • Ouverture de la barrière hématomédullaire sous anesthésie générale durant une heure, 1 jour par semaine pendant 5 semaines. Cette procédure ne requiert aucune chirurgie et dure 5 minutes. Mesures dans chaque groupe : • 3 Prélèvements sanguins : un prélèvement toutes les 2 semaines • Pesée : une fois par semaine • Force musculaire : 1 fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie et l’effet du traitement. Durée du test 1 minute. Toutes les souris (N=80 souris au total, 4 groupes de 20 souris) seront euthanasiées par surdosage en anesthésiques. Dix souris/ groupe seront euthanasiées au stade symptomatique et 10 seront suivies jusqu’au stade terminal. Des prélèvements de tissus après euthanasie des animaux seront réalisés chez toutes les souris pour analyse du traitement sur la maladie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : • l’effet de la maladie sur les animaux, la perte de force musculaire et la paralysie progressive liée au modèle • le stress éventuel lié au test de force musculaire une fois par semaine sur les animaux entre l’âge de 48 et environ 162 jours, au cours de la maladie • un stress lié à la contention et la douleur de la piqure au cours des injections sous-cutanées répétées (4 jours par semaine et pendant 5 semaines consécutives) de l’immunomodulateur ou de placébo et des prélèvements sanguins • des irritations ou infections potentielles liées aux injections répétées intraveineuses des microbulles (ou placebo) pour l’ouverture de la barrière hémato médullaire une fois par semaine pendant 5 semaines consécutives • des conséquences négatives sur la maladie ainsi des hypothermies, hypoventilations et potentiellement des arrêts cardiaques liés aux anesthésies répétées (une fois par semaine pendant 5 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront utilisés à la fin de la procédure pour des études d’histologie ou de transcriptomique et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine, raison pour laquelle notre projet nécessite l’utilisation de ces souris.
Réduction
Pour mener à bien cette étude et obtenir un résultat interprétable il est nécessaire de former 4 groupes de N=20 souris/groupe selon le traitement administré. Groupe 1: ouverture de la barrière hématomédullaire et stimulation du système immunitaire, groupe 2 : ouverture de la barrière sans stimulation du système immunitaire, groupe 3 :stimulation du système immunitaire sans ouverture de la barrière, groupe 4, contrôle : ni stimulation, ni ouverture de la barrière. Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif d’après les lignes directives publiées et nos études précédentes pour déterminer le nombre de souris par groupe (calcul de puissance), afin de pouvoir obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Nous utiliserons: N=10 souris/groupe pour les courbes de suivi de la maladie et N=10 souris/groupe pour des analyses au stade symptomatique de la maladie. Dans chacun de ces sous-groupes de N=10 souris, N=5 souris serviront à des études histologiques, N=5 souris serviront à des études de transcriptomiques. Nombre total de souris = 80 souris. Tous les effets seront analysés par des tests statistiques appropriés pour les courbes de survie, les analyses histologiques et transcriptomiques.
Raffinement
Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini un point limite. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Un programme d’enrichissement sera suivi en ajoutant dans la cage les éléments suivants : « Mouse house » ou carrés de coton pour nids. Les femelles seront hébergées ensemble à 5 souris par cage. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie SLA) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront dans ce cas isolées avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris/ cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Un soin particulier sera apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Ils seront observés quotidiennement et nettoyés à l’eau stérile en cas de suintement ou à la vétadine en cas de rougeur (suspicion d’infection). Proche du stade terminal, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Bien que la sonication soit parfaitement indolore, afin d’éviter le stress lié à une contention, les animaux recevront une anesthésie chimique.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Nous utiliserons des souris adultes, plus particulièrement au stade symptomatique aux alentours de 5 mois et au stade terminal de la maladie. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers l’âge de 6 mois.
Analyse longitudinale des effets de la stimulation tactile périnatale sur le comportement au cours du développement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
64 souris vont être utilisées, 29 tuées à l'issue pour analyse du cerveau et 35 réutilisées dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des souriceaux sont séparés de leur mère de façon répétée, caressés brièvement puis soumis à des tests de développement, avant l'implantation d'une puce sous anesthésie, pour calibrer une batterie de tests comportementaux sur des animaux sains. Le porteur indique que la séparation mère-petit peut faire chuter la température des souriceaux jusqu'à 20 %, seuil qu'il fixe comme maximum tolérable, et prévoit de les réchauffer après chaque test. Il présente ce calibrage comme un moyen de réduire le nombre d'animaux dans de futures études sur les cancers pédiatriques.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la continuité des études menées par l’équipe sur l’impact comportemental et neurobiologique des cancers et de leurs traitements. Sa finalité est de déterminer l’impact comportemental à court et long termes de gènes de prédisposition à certains cancers pédiatriques associés ou non à la présence d’une tumeur durant la phase de développement post natale. Il permettra également de différencier cet (ces) impact(s) de ceux liés aux traitements proposés actuellement (chirurgie, chimiothérapies, thérapies ciblées) dans le cadre des tumeurs pédiatriques cérébrales. Le recours au modèle animal permet de mesurer, sur un lapse de temps réduit et grâce à une étude longitudinale l’impact des facteurs de risques potentiels et de proposer des méthodes alternatives aux traitements actuels. Il s’agit donc ici de développer de nouvelles compétences en matière d’analyses comportementales animales traitant du développement périnatal. Il s’agit, en outre, d’enrichir la batterie de tests d’analyse comportementale chez l'animal pré adulte et l’adulte afin d’affiner les données recueillies jusqu’alors. La présente demande concerne exclusivement la mise en place et le calibrage de ces tests comportementaux chez des animaux de souche sauvage, non porteurs de gène de prédisposition, non porteurs de tumeurs et non traités avec des substances.
Bénéfices attendus
La présente demande a pour objectif de permettre la mise en place de tests comportementaux évaluant le neurodéveloppement de souriceaux et de tests effectués à l'âge adulte et pré-adulte pour évaluer l'activité exploratoire, l'équilibre et la coordination motrice, la force, l'anxiété, les interactions sociales. Les manipulations permettront de poursuivre prochainement des études portant sur la modélisation de l’impact des cancers pédiatriques et leurs traitements sur le développement, chez la souris. En incluant ces manipulations dans un projet translationnel : de l’Homme à l’animal et de l’animal à l’homme, nous pourrons appréhender les effets d’interventions complémentaires, précoces, non médicamenteuses sur le développement pour contrer les désordres neuro-cognitivo-affectifs induits par les cancers et /ou leurs traitements.
Procédures
Les animaux seront identifiés à partir de leur 3ème jour post-natal (J3) à l’aide de marques au feutre sur la peau, quotidiennement jusqu’à J6, puis quand ils auront grandi, une puce électronique d’identification sera implantée sous la peau, à l’aide d’une aiguille, après anesthésie générale gazeuse. Il n'y a pas de prélèvements effectués sur les animaux vigiles ni de procédures chirurgicales. Une stimulation tactile douce sera réalisée à J3, 5, 7, 9 et 11 sur une partie des animaux (10 mâles et 10 femelles pour le lot de souris stimulées et 10 mâles et 10 femelles pour le groupe « contrôle »), au moment de la pesée : chaque animal du groupe "stimulé" est déposé dans le creux de la main gantée de l’expérimentateur et délicatement caressé sur le dos avec l'autre main gantée pendant 15s. Les animaux du groupes contrôles sont simplement déposés dans la main de l’expérimentateur durant une période identique. L’évaluation du développement et de l’effet de la stimulation précoce seront d’abord analysés au cours d’une phase précoce. Les souriceaux seront observés quotidiennement pendant deux semaines afin de mesurer leur développement physique (ouverture des yeux, décollement des oreilles, soutien de la tête, acquisition de la marche…). Tous les deux jours, des tests comportementaux permettront d'évaluer l'évolution de leur motricité, de leur réactivité et de leur système de communication : chaque test ou manipulation durera 5 minutes maximum. Une phase d’analyse tardive sera entreprise à partir de J30 : mesure de l’anxiété pendant 5 min (J30), de l’exploration pendant 5 min (J32), évaluation de la coordination motrice et apprentissage moteur (2 séries de 3 essais de 60s maximum, tous les 2 jours, pendant 3 jours maximum), évaluation de la mémoire (J38-40 : un test de 5 min par jour pendant 3 jours successifs), test d’interactions sociales avec des animaux naïfs (7 mâles et 7 femelles) (J42-43)pendant 5 min. Puis les animaux seront mis à mort par décapitation après anesthésie gazeuse profonde.
Impact sur les animaux
Les tests périnatals nécessitent une séparation mère-petit qu’il convient de limiter. Le temps maximum cumulé de séparation mère-petit estimé avant sevrage (entre J1 et J16) est de 62 min par petit, s’il échoue à tous les tests. Il n'est pas possible d'estimer précisément et a priori l'amplitude de la baisse de température. Ce projet permettra d'obtenir ces précisions pour les manipulations futures. En fonction des résultats nous pourrons ajuster la durée des séparations mère- petit. La température corporelle des animaux sera vérifiée pendant les manipulations et à distance grâce à un thermomètre infrarouge avant et pendant la séparation. Nous ne disposons pas, à l’animalerie de l’information concernant les variations de température chez les souriceaux, en fonction des conditions d’élevage et de manipulation. C’est notamment l’objet de ce projet de quantifier de telles perturbations. D’après la littérature, dans le nid, les petits souriceaux, bien qu’incapables de thermoréguler, peuvent maintenir leur température corporelle entre 33° et 37°C. Ces oscillations sont sous la dépendance de nombreux facteurs, comme le nombre de congénères, la qualité du nid et le comportement maternel. La littérature indique également une baisse de température de l’ordre de 15 à 20 % lors d’une séparation mère/petit de 7 minutes. Nous considèrerons que 20% sera la variation maximale, tolérable dans cette expérience. Cette amplitude a déjà été observée sans provoquer de séquelle. Dans tous les cas, après chaque séparation, même de moins d’une minute, les animaux seront réchauffés avant le retour au nid, pour atteindre les 33°C. Une nuisance potentielle à prendre en compte concerne le puçage des animaux au jour 6 post-natal. Pour restreindre cette l’impact de nuisance, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale gazeuse avant l'implantation de leur puce d'identification. La séparation avec les petits peut être une source de stress pour la mère, c'est pour cela que les petits seront enlevés un par un du nid pour être testés avant d'être remis à la mère de manière à ce qu'elle en ait toujours plusieurs avec elle.
Devenir
Les cerveaux des animaux impliqués dans l'étude développementale individuelle (20 males et 20 femelles maximum) seront analysés afin de déterminer les effets des stimulations périnatales sur les structures nerveuses. Afin de limiter dans son ensemble le nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale, les 14 souris naïves ayant été utilisées pour les tests d'interactions sociales ainsi que les 10 femelles utilisées pour produire les souriceaux seront utilisées dans d'autres projets autorisés. Les souris réutilisées incluent donc les 10 femelles gestantes, les 14 souris naïves utilisées pour le test d’interaction sociale et les 11 souris surnuméraires (selon un calcul effectué en se basant sur une moyenne de 6,5 souris par portée). Ainsi, 29 animaux seront euthanasiés pour prélèvement et 35 animaux seront réutilisés.
Remplacement
L’approche comportementale renseigne sur le fonctionnement cérébral et vient donc répondre à une problématique qui ne peut pas être abordée avec la plupart des modèles in sillico ou in vitro actuels.
Réduction
L’utilisation de mâles et de femelles et d’une batterie de test suffisamment complète, fine et calibrée permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par la suite dans les expérimentations. Elle nécessite une mise au point rigoureuse afin d’anticiper de futures erreurs potentielles de protocole. Ce faisant, le travail en amont de calibrage du matériel, des durées d’expérimentations et de planification des manipulations permet, in fine, de limiter le nombre d’animaux qui seront intégrés dans les futures expérimentations. De plus, une bonne maitrise du protocole permet de limiter les durées de séparation mère-petits dans les futures manipulations et, de fait, l’éventuel stress associé à cette séparation. Contrairement aux projets transversaux, l’avantage des projets longitudinaux est de permettre un suivi individualisé des animaux. Il permet, en outre de réduire considérablement le nombre des animaux utilisés dans les protocoles. L’effectif par groupe expérimental a été estimé à partir d’un test de puissance et à partir de données sur le développement de la littérature pour mettre en évidence une différence significative. Le nombre 10 par groupe est la valeur limite basse pour observer des différences significatives. L’étude des comportements sociaux chez les animaux adultes nécessite d’exposer un animal expérimental à un animal naïf, n’ayant pas été manipulé au préalable. Ces animaux naïfs seront au maximum au nombre de 7 mâles et 7 femelles et pourront être utilisés dans un autre projet. Les stimulations périnatales ont un effet qui est la plupart du temps bénéfique sur le développement de souris porteuses de lésions cérébrales précoces. Il demeure néanmoins important de déterminer l’intensité de cet effet chez des animaux sains, ceci afin de limiter, là encore, le nombre d’animaux dans les futures études.
Raffinement
Les analyses comportementales entreprises visent notamment à isoler l’impact de différents facteurs sur la réactivité émotionnelle. Le but ultime du projet est de définir une méthode de remédiation des désordres neuro-cognitivo- affectifs induits par le cancer ou les traitements actuels des tumeurs pédiatriques. Le projet nécessite par essence de réduire au maximum tout facteur induisant un stress chez les animaux. Les périodes de séparation mère-petit bien que nécessaires pour les manipulations et pour reproduire au mieux les périodes périnatales humaines, seront limitées à leur maximum. Cette réduction du temps de manipulation nécessite une bonne maitrise du protocole et des manipulations. Les animaux ne seront pas soumis à des à des environnements sonores ou olfactifs identifiés comme stressants (odeurs de prédateur par exemple). Les tests comportementaux décrits plus loin ne font pas usage de contraintes importantes (i.e. pas de contention, de privation alimentaire, de chocs électrique ou manipulation de longue durée). Ils sont, pour la plupart, basés sur de l’exploration spontanée et/ou des comportements naturellement exprimés par les animaux (retournement, orientation olfactive, marche rythmée, évitement d’obstacles lors de la déambulation, exploration libre d’un environnement…). Une surveillance du comportement de la mère envers ses petits après toute séparation sera appliquée. Les gants seront plongés dans la litière du nid avant toute manipulation des petits et seront changés entre chaque portée. Un suivi de la température des animaux sera fait à plusieurs reprises avec un thermomètre infrarouge afin de détecter l’apparition d’une éventuelle hypothermie (voir 3.3.2.4). De plus, des tapis chauffants seront utilisés lors des séparations et les animaux seront réchauffés au creux des mains de l'expérimentateur après chaque test effectué jusqu'à ce qu'ils aient acquis une fourrure suffisante. A partir du 3ème jour post-natal (J3), les souriceaux seront identifiés à l’aide de marquages cutanés avec des feutres permanents non toxiques. A partir de J6, les souris seront identifiées grâce à une injection sous-cutanée d'une puce d’identification faite sous anesthésie gazeuse afin de réduire le stress des animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, et permettra ainsi de déceler d’éventuels signes de souffrance (perte de poids de plus de 15%, exclusion du nid, hypothermie non résolue non alimentation), considérés comme point limite.
Choix des espèces
Le travail entrepris a pour but de développer une batterie de test chez la souris car les gènes de prédisposition aux cancers pédiatriques qui seront étudiés dans les prochains travaux sont proposés avec ce modèle animal. La demande d'autorisation de projet a pour objectif de mettre en place une batterie de tests pour analyser le développement chez la souris : nous mesurerons plusieurs items de développement au cours des 16 jours postanatals, avant le sevrage des animaux. Cette période est par ailleurs critique pour la mise en place des structures d’intérêt qui seront étudiées dans les futurs protocoles. les animaux seront ensuite retestés lors d'une période correspondant à la période d'adolescence chez l'humain (entre le jour 30 et le jour 45) car les futurs projets cibleront cette période critique de développement.
Réponse antidépressive et modèles pharmaco-résistants chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont isolées en cage individuelle jusqu'à la fin de l'expérience, soumises à des stress répétés, injection d'ACTH et nage forcée, puis reçoivent des substances et des prises de sang, pour créer un modèle de dépression résistante aux traitements et tester l'effet de la lumière. Le porteur justifie l'effectif de dix animaux par groupe autant par la puissance statistique que pour "éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication". Il affirme que l'usage d'animaux vivants est "incontournable" pour analyser une dépression pharmaco-résistante, malgré des approches in vitro déjà menées.
Objectifs
La dépression majeure concerne environ 17 % de la population française, ce qui en fait le trouble psychiatrique le plus fréquent. La classe d’antidépresseur prescrite en première intention sont les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, mais 50% des patients déprimés ne répondent pas correctement à ce type de traitement, d'où l'importance de chercher de nouvelles stratégies capables de potentialiser leur effet.
Bénéfices attendus
Nous prévoyons que ces deux modèles induisent des comportements pseudo-dépressifs stables et résistants à des traitements classiques mais également en développements. De même, le traitement par la lumière seule ne devrait pas avoir d’effet antidépresseur. En revanche, le traitement par la lumière permettrait de potentialiser la réponse antidépressive des antidépresseurs résistants.
Procédures
Les interventions prévues sont : 1) Les animaux seront isolés dans des cages individuelles jusqu’à la fin de l’expérimentation. Cependant, les animaux pourront voir leurs congénères et auront aussi accès à leurs odeurs et bruits. 2) Les animaux subiront des administrations de substances actives et de prélèvements sanguins sur animal vigile, 3 fois moins de 7 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) dès réception et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. Cependant, les cages sont placées dans une armoire, et les animaux ont donc accès aux odeurs et bruits de leurs congénères. 2) les animaux subiront un changement de cycle pendant 14 jours pour pouvoir effectuer les tests comportementaux à l’obscurité. 3) Les animaux subiront des stress (injection ACTH, nage répétée) afin de valider le modèle de dépression pharmaco résistant. 4) Les animaux subiront des administrations de substances actives et des prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations. Ayant subi un protocole pharmacologique et/ou de stress chronique, les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans une autre étude pour éviter tous biais.
Remplacement
Des approches in vitro sont déjà réalisées au laboratoire (évaluation de la neurogène et de la synaptogenèse, électrophysiologie in vitro). Cependant, l'utilisation de modèles complexes, i.e. d'animaux vivants, est incontournable afin d'analyser les réponses antidépressives dans des modèles de dépression pharmaco-résistants.
Réduction
Les groupes sont formés de 10 animaux. Le nombre d'animaux utilisés est fonction de la réponse physiologique mesurée et est basé sur nos travaux précédents. Il correspond également au nombre classiquement utilisé dans la littérature pour la validation de cette réponse. Le nombre d'animaux est réduit à une valeur minimale (10 animaux par groupe) permettant d'une part d'atteindre une significativité statistique pour la validation et l'évaluation des réponses mesurées et d'autre part d'éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication. Pour réduire le nombre total d'animaux, nous réalisons plusieurs tests chez le même animal et certaines mises au point techniques seront réalisées en réutilisant le même animal.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. Pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière afin de vérifier le bon développement du model. En cas de problème d’alimentation, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupe dans la cage. L’observation des animaux sera effectuée tous les 2 jours et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les points limites sont basés sur l'apparition de signes généraux évocateurs de souffrance : dyspnée, chute de température. En cas de signe de douleur (grille de score de la douleur >5), une injection analgésique de buprenorphine sera prodiguée. En cas de dépassement du point limite, les animaux seront mis à mort par anesthésie systémique avec de la kétamine et une injection létale d’euthasol. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié.
Choix des espèces
Les rongeurs sont choisis car il s'agit des plus petits mammifères ayant un cerveau encore suffisamment homologue à celui de l'homme pour mener des études expérimentales en neuropsychiatrie. Des animaux adultes seront utilisés car chez l'homme, les antidépresseurs sont majoritairement prescrits chez l'adulte.
Etude de la biocompatibilité d’un dispositif médical (DM) sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de cobaye.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
17 955 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'effectif de loin le plus élevé du lot. Ils reçoivent des injections dans la peau et des applications cutanées répétées de dispositifs médicaux, dont des applications sur le pénis, pour tester leur pouvoir irritant et sensibilisant avant mise sur le marché. Le porteur indique que ces tests peuvent provoquer des rougeurs allant jusqu'à la nécrose de la peau, des escarres et une destruction de l'épiderme et du derme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est reconnu pour ces dispositifs et que ces essais sont imposés par la réglementation européenne.
Objectifs
Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (implants, prothèses, instruments…) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Pour cela il existe des tests règlementaires de toxicité qui peuvent évaluer les potentiels risques de réactions allergiques et/ou d’irritation cutanée de ces DM. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’évaluer les risques biologiques potentiels de l’utilisation des DM sur la santé humaine. Ceci dans un but de commercialisation des DM sans risque pour la santé de l’homme.
Procédures
- SMKiso : sur 15 (ou 30 dans le cas d’extraits) animaux vigiles, 6 injections intradermiques, une application locales occlusive pendant 48h et une application locale pendant 24h. 3 pesées, observations locales. Injection IP pour la mise à mort - SMBiso : sur 30 animaux vigiles, 3 à 9 applications occlusives locales de 24 heures, 3 pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort. - MP : au moins 4 applications locales sur le pénis sur au moins 6 animaux, pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort.
Impact sur les animaux
Un phénomène de sensibilisation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 35 jours. Selon l’intensité des effets observés, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Il peut y avoir, assez rarement, des effets de toxicité systémique. - test SMKiso : À la suite des injections intradermiques, il peut y avoir de l’érythème allant jusqu’à la nécrose du derme. À la suite des applications locales, peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. - test SMBiso : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. Un phénomène d’irritation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. -test MP : peuvent apparaître des érythèmes, de l’œdème, de la sécheresse cutanée.
Devenir
- SMKiso et SMBiso : Les animaux ayant reçu des traitements sur différentes parties de leur corps ceux-ci ne peuvent donc pas être réutilisés pour une procédure différente utlérieurement. Ils sont donc euthanasiés en fin d’essai. - MP : les animaux sont euthanasiés en fin d’étude pour prélèvement des pénis et analyse histologique.
Remplacement
Les relations quantitatives structure-activité et les modèles in vitro ne sont pas encore suffisamment élaborés à l’heure actuelle pour un rôle significatif dans l’évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des substances ; on doit donc continuer à déterminer ce potentiel sur des modèles in-vivo. Les tests in vitro permettant d’évaluer la sensibilisation du produit à tester ne sont pas reconnus pour les DM. Tout matériau irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2 ou ≥12.5 ne doit pas être testé et doit être étiqueté comme irritant potentiel. Par ailleurs les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent petre obtenues par d’autres moyens. Il n’existe pas de modèle in-vitro validé pour l’irritation pénienne. L’évaluation du potentiel sensibilisant et irritant des DM est imposée par la règlementation européenne pour leur mise sur le marché et les industriels ne peuvent se passer de réaliser ces tests.
Réduction
Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les normes demandent de réaliser des groupes témoins positifs à chaques tests. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin positif tous les six mois et non à chaque essai. Lorsque plusieurs DM sont testés dans un même temps, le lot contrôle sera communs aux différentes études dans la mesure du possible (3 DM maximum par lot commun pour les SMKiso et SMBiso et autant de DM que nécessaire par lot commun pour les MP).
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 2 ou 3, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. En cous d’étude (pendant une phase de repos) les animaux sont passés en cages plus grandes, par 5, toujours dans un souci de respect des règles de bien être animal (surface au sol). Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter toute souffrance animale inutile. Des points limites (basés sur l’état général de l’animal) sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le cobaye, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de sensibilisation cutanée et d’irritation des tissus péniens. De plus la capacité de sensibilisation du cobaye est assez voisine de celle de I'homme. L’espèce et le stade de développement des animaux est imposé par les normes correspondantes. Cobayes jeunes adultes de 3 à 6 semaines pesant au moins 300g au début d’étude et arrivant à environ 800g à 1kg en fin d’étude. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.
Formation aux procédures peu ou faiblement invasives en expérimentation animale dans le cadre d’une formation réglementaire « Formation à l’expérimentation animale – Concepteur de projet ».
- Formation professionnelle
Rats : 150
300 souris et rats vont être utilisés, tous maintenus en vie à l'issue puis réutilisés, replacés ou adoptés, dans des procédures classées en souffrance modérée. Sur les animaux vivants, seuls les gestes de préhension et de contention sont pratiqués, pendant une formation réglementaire de concepteurs de projet, les injections et prélèvements étant réalisés sur des animaux déjà morts ou sur un simulateur. Le porteur indique avoir réduit à ces deux gestes ce qui était auparavant pratiqué en entier sur l'animal vivant, après avoir observé un surcroît de stress. Il justifie le maintien d'animaux vivants par le principe "jamais la première fois sur l'animal vivant" et la nécessité de ressentir les mouvements de l'animal dans la main.
Objectifs
La formation des personnes qui utilisent des animaux à des fins scientifiques est obligatoire et rentre dans un cadre réglementaire au sens de la directive du 1er février 2013. L’objectif du projet est de couvrir la partie pratique relative à l’initiation et à l’apprentissage aux gestes techniques dans le cadre de la formation « Concepteur de projet ». Cette formation est dédiée aux étudiants et auprès des doctorants ainsi que des professionnels. Cette formation réglementaire doit permettre l’initiation et l’acquisition de compétences théoriques ainsi que pratiques permettant le travail avec des animaux dans le respect du bien-être animal. Le TP portera sur les bonnes pratiques pour la réalisation des méthodes de préhension, contention, d’injection et prélèvement chez le modèle rongeur (rat et souris). Dans un souci de bien-être animal et pour limiter le stress, seuls les gestes de préhension et de contention seront réalisés avec des animaux vivants. Concernant les gestes techniques d’administration et de prélèvement, ils seront faits sur des animaux décédés issus de précédent TP ou récupérés auprès d’un fournisseur et sur le rat Koken. Il y a 2 sessions de 2 jours par an et 40 participants environs par session. Les participants sont repartis en 3 à 4 groupes de 10 à 13 participants.
Bénéfices attendus
Les objectifs pédagogiques sont : -la familiarisation et sensibilisation des participants avec les animaux vivants et au respect du bien-être animal. -l’apprentissage des règles sanitaires et sécuritaires à la manipulation des animaux. -la connaissances du choix du matériel, la préparation pour les administrations et les prélèvements -la mise en situation dans des conditions réelles par l’utilisation d’animaux décédés et d’animaux vivants.
Procédures
Seuls les gestes techniques de préhension et de contention seront réalisés sur les animaux vivants. L’exécution de ces gestes techniques dure 45 minutes (20 min pour la préhension et 25 min pour la contention) sur l’ensemble d’un TP de 3h30.
Impact sur les animaux
Ce projet fait suite à une précédente demande dans laquelle tous les gestes techniques (préhension, contention, administration et prélèvement) ont été faits sur animaux vivants. Nous avons observé un supplément de stress aux animaux lié à la présence de beaucoup de participants autour du poste et à l’inexpérience des participants pour la réalisation des gestes techniques. C’est pourquoi, nous avons fait le choix de réduire le nombre de gestes effectués sur l’animal vivant à ceux de préhension et de contention uniquement. Sur ces 5 derniers années, nous n’avons pas eu de décès ou de mise à mort lié à une mauvaise manipulation par participant. Malgré tout, l’équipe encadrante reste vigilante lors de la manipulation des animaux vivants et une observation accrue sera faite pendant 3 à 4 jours après les TP. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués.
Devenir
Les animaux après le TP seront : Tous les animaux sont gardés en vie et peuvent être réutilisés pour un autre projet (procédure sans réveil), replacés ou adoptés avec l’aide d’une association après avis vétérinaire.
Remplacement
L’axiome stipulant « Jamais la première fois sur l’animal vivant » est important pour le respect de l’animal et du bien-être. La formation utilisant des animaux vivants est primordiale pour encadrer les gestes techniques et apprendre les bons gestes et réflexes pour le travail avec l’animal vivant. Les gestes techniques (administration et prélèvement) pouvant être trop invasif et générer une douleur évitable ne seront faits que sur des simulateurs de type rat Koken ou animaux décédés issus d’autres projets antérieurs. L’utilisation des animaux vivants ne concernera que la préhension et la contention pour apprendre aux participants à ressentir les mouvements de l’animal dans la main ce qui n’est pas possible avec un simulateur.
Réduction
Lors de la précédente de demande, nous avons sollicité une demande pour 670 animaux pour 5 ans soit 134 animaux par an. La modification de la progression d’apprentissage et l’introduction de simulateur (rat Koken, par exemple), nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés à 300 animaux pour 5 ans soit 60 animaux par an. Cela représente une diminution de 55%.
Raffinement
L’installation des différents postes permettra d’avoir des groupes de 3 à 5 participants par poste afin de réduire le stress autour des animaux. De plus, l’utilisation d’animaux décédés et du rat Koken permet de raffiner l’apprentissage du geste technique en maintenant un réalisme dans la formation. S'agissant d'une simple préhension avec ou sans contention aucune anesthésie n'est prévue. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs (rat et souris) sont les modèles les plus utilisés en expérimentation. L’utilisation de 2 espèces permet aux participants de réaliser qu’il est important d’adapter le geste à l’espèce pour des considérations techniques mais aussi comportementales. Jeunes adultes (7-8 semaines). Il s’agit du stade de développement le plus couramment utilisé en laboratoire de recherche.
Étude de l’activité d’une souche clinique bactérienne de Porphyromonas instillée en prophylaxie contre les infections pulmonaires à Pseudomonas aeruginosa dans un modèle murin (souris)
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa leur est provoquée par voie nasale sous anesthésie, après administration d'une bactérie censée protéger, la survie étant suivie sur sept jours. Le porteur indique que l'infection entraîne une perte de poids, une mobilité réduite puis une inactivité pouvant atteindre une intensité sévère, et prévoit un modèle de survie plutôt qu'une mise à mort anticipée. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de conclure sur la survie d'un animal à une infection pulmonaire, justifiant le maintien du modèle souris.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Suite à des résultats prometteurs d’une bactérie à potentiel probiotique actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa, il est nécessaire de consolider nos résultats. L’objectif est de tester l’effet bénéfique de notre bactérie à potentiel probiotique, à savoir une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa dans les poumons des souris. Ces résultats seront validés dans un modèle de survie sur une période de 7 jours.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux seront pucés sous anesthésie gazeuse d'environ 1 minute. L'implantation de la puce prendra environ aussi 1 minute. Les animaux seront anesthésiés deux fois et recevront durant 1 minute dans la narine du sérum physiologique ou un probiotique puis la seconde fois une suspension bactérienne sur une durée de 1 minute.
Impact sur les animaux
Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment lors de la préhension de l’animal pour les suivis, les pesées et la prise de température (2 à 3 fois par jour maximum) : intensité faible, durée environ 1 min. Les animaux auront au total soit 3 anesthésies médicamenteuses, intensité forte, durée environ 2 heures soit 3 anesthésies par isoflurane : Intensité faible, durée environ 2 min. (En fonction des résultats obtenus lors de la procédure 1) Des pertes de poids, une mobilité réduite voire, une inactivité après le début de l’infection pulmonaire peuvent être observées, elles sont d’intensité progressive avec l’évolution de l’infection pouvant aller jusqu’à une intensité sévère sur une durée de 7 jours maximum.Les pesées et prise de température des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 1 min Les analgésies des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 30 secondes. Selon les procédures, les suivis de températures et pesées seront de 7 jours pour la procédure 1 et 2 et de 4 jours pour la procédure 3.
Devenir
A l'issu du projet tous les animaux ayant été infectés, seront mis à mort. Et certains auront des prelevements de tissus.
Remplacement
Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal.
Réduction
Lors des procédures 1 et 2, l’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7ème jour, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 15 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de ne pas réaliser le groupe contrôle (sérum physiologique) car nous n’attendons pas de mortalités. De plus, nous réduisons au minimum le nombre de souris dans notre groupe recevant uniquement notre probiotique car nous n’attendons aucune mortalité. Lors de la procédure 3, le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous réaliserons des analyses statistiques afin de vérifier la différence au niveau de la quantité de pathogène dans les poumons. Afin de garantir une puissance statistique, 6 souris minimum sont nécessaires dans chaque groupe lorsque ce groupe est comparé au groupe contrôle P. aeruginosa. Par ailleurs, dans nos 3 procédures, nous nous limitons à une seule souche clinique de Porphyromonas alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon
Raffinement
Avant toute inoculation d'une goutte d'un produit dans la narine de la souris, les animaux seront préalablement anesthésiés et analgésiés. Les animaux seront suivis. Un analgésique, en complément des injections en journée, sera mis à disposition dans les cages la nuit afin de prendre en charge la douleur si des critères étaient observés.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Role de la proteine de densite post-synaptique PSD-95 dans la myelinisation et la remyelinisation du systeme nerveux central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle épinière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la myéline leur est provoquée par injection d'un agent dans la moelle épinière sous anesthésie, précédée de cinq injections quotidiennes, pour étudier le rôle d'une protéine dans la réparation de la myéline, comme dans la sclérose en plaques. Le porteur indique un risque d'hypothermie, de saignement et une douleur postopératoire légère de 48 heures, ainsi que des hématomes liés aux injections répétées. Il affirme qu'après des essais sur cellules, seul le modèle animal reproduit les lésions observées dans la maladie humaine.
Objectifs
L’établissement de la gaine de myéline du système nerveux, processus nommé myélinisation, vise à protéger l’axone et à accroître considérablement la vitesse de conduction de l’influx nerveux. Dans le système nerveux central, cette myélinisation est assurée les oligodendrocytes. Au cours du développement, la formation de la gaine de myéline requiert que ces cellules subissent deux processus : la migration/prolifération des progéniteurs, appelé progéniteurs d’oligodendrocytes, puis leur différentiation en cellules capables de myéliniser. L’établissement de la gaine de myéline est crucial et les déficits occasionnés résultent en de lourdes pathologies telle que la sclérose en plaques dans le système nerveux central. L’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la myélinisation est donc vitale afin d’accéder à une meilleure connaissance de ce processus physiologique en conditions normale et pathologique. Des études récentes ont montré que les cellules oligodendrogliales expriment des protéines synaptiques, protéines dont les fonctions sont bien établies dans les neurones. Plusieurs études scientifiques récentes suggèrent un rôle de ces protéines dans le processus de myélinisation. Notre projet a donc pour objectif de déterminer les fonctions précises de certaines de ces protéines dans le contrôle de la myélinisation et de la remyélinisation du système nerveux central.
Bénéfices attendus
La protéine synaptique qui nous intéresse est connue pour être impliqué dans certaines maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, et dans lesquelles une hypomyélinisation est aussi observée. Il est donc intéressant d’étudier l’implication spécifique des protéines synaptiques dans les oligodendrocytes afin de déterminer son implication dans le processus de myélinisation et de remyélinisation du système nerveux central. In fine, ce projet pourrait nous permettre de découvrir de nouvelles cibles moléculaires pour les thérapies de neuromodulation visant à promouvoir la régénération de la myéline dans les maladies démyélinisantes.
Procédures
Afin de répondre à notre question scientifique, nous allons générer un modèle de démyélinisation de la moelle épinière par injection de lysophosphatidylcholine (LPC). Ce modèle consiste pour chaque animal âgé de 12 semaines, en une injection dans la moelle épinière, effectuée sous anesthésie générale, d’un agent induisant une lésion focale de la myéline. Cette intervention dure environ 30 minutes par animal. L’analyse de la lésion permettra d’évaluer l’impact de notre protéine sur la réparation des lésions de la myéline semblable à celles observées lors de la sclérose en plaques. Nous allons utiliser 126 animaux. Dans le cadre de notre étude, une semaine avant la procédure de chirurgie, les animaux âgés de 12 semaines recevront 5 injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs sur animal vigile (5 secondes par animal). 48 heures après la dernière injection, les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour une injection unique dans la moelle épinière (30 minutes par animal). Ils seront maintenus pendant différents temps post-chirurgie (4, 7, 14, 21 ou 30 jours). A l’issue du temps de maintien prévu, les animaux seront tous euthanasiés selon une méthode réglementaire en vue des prélèvements des moelles épinières. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions, quand cela s’avèrera nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors des procédures sont liées à la chirurgie : risque hypothermique, lésion musculaire, saignement et douleur post-opératoire légère (faim, soif, stress physique et/ou thermique) durant 48 heures. Il est aussi possible d’observer un stress ainsi que l’apparition d’hématomes dus à l’injection quotidienne répétée de solutions, avant la chirurgie.
Devenir
Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Après des essais préalables sur différents modèles cellulaires, seul le modèle animal est pertinent pour cette étude car nous pouvons ainsi analyser l’effet de ces molécules dans un contexte in vivo reproduisant le mieux les caractéristiques des lésions observées dans la pathologie humaine.
Réduction
Ce modèle a déjà démontré sa pertinence pour l’analyse des mécanismes de réparation des lésions de la myéline. Le nombre d’animaux (126 au total) est limité au stricte nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et coton), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées quotidiennement. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie recommandées par les normes européennes. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe dans un nid). Les points limites sont : - perte de poids rapide ou progressive de 20 pourcents en 24h par pesée tous les jours pendant la première semaine puis 2 fois par semaine avant euthanasie ; - tumeur dont le volume est supérieur à 2 cm3; - état de choc, léthargie, inconscience, immobilité; - difficultés respiratoires L’euthanasie de l’animal sera réalisée si on observe l’un de ces critères.
Choix des espèces
Pour établir si notre protéine d’intérêt a un effet positif ou négatif sur les processus de myélinisation et de remyélinisation, la souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’Homme. De plus, la facilité d’élevage et le cours temps de reproduction de cette espèce sont des avantages. Grâce à nos collaborations, l’obtention des lignées transgéniques déjà préétablies, nous a permis d’accélérer considérablement le temps nécessaire à l’obtention de la réponse scientifique, mais aussi de réduire le nombre d’animaux à générer. Notre étude aura lieu sur des animaux mâles et femelles. Ce modèle murin de démyélinisation et de réparation de la myéline est bien établi dans la littérature et au sein de notre laboratoire. La chirurgie de démyélinisation sera réalisée sur des animaux lorsqu’ils seront âgés d’au moins 12 semaines (jeunes adultes), afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central. De plus, à ce stade du développement, la chirurgie de la moelle épinière est facilitée par la relative faible masse musculaire et de tissus graisseux des animaux, permettant ainsi une meilleure accessibilité à la moelle lors de la chirurgie. Par la suite, les animaux seront euthanasiés à 4, 7, 14, 21 et 30 jours post-lésion, afin d’observer respectivement : -Le recrutement des cellules progénitrices des oligdendrocytes au site de lésion (4 jours post-lésion), -Leur pic de prolifération (7 jours post-lésion), -Leur pic de différenciation (14 jours post-lésion), -Et le processus de remyélinisation (entre 14 et 30 jours post-lésion).
Etude de l’impact du dysfonctionnement de la connectivité neuronale cérébelleuse sur l’ataxie de Friedreich
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une partie subit une chirurgie lourde du crâne de deux heures et demie, pose d'une fenêtre crânienne et injection de virus dans le cervelet, d'autres passent des tests de coordination motrice, pour étudier l'ataxie de Friedreich sur un modèle de souris privé d'une protéine. Le porteur reconnaît une douleur postopératoire possible après la chirurgie du crâne, mais qualifie les tests comportementaux de non invasifs et non stressants. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire en culture des réseaux neuronaux aussi complexes, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive des neurones sensoriels. Elle mène à l’apparition de symptômes ataxiques, comme la perte de coordination des mouvements volontaires, mais affecte aussi d’autres organes comme le cœur et le pancréas. L’AF peut être déclenchée par plusieurs facteurs et est due à un déficit de la protéine frataxine (FXN) dans tous les tissus. Un modèle murin a été créé pour comprendre la maladie. Les résultats de nos collaborateurs et de notre laboratoire montrent que le modèle murin utilisé présente les symptômes de l’ataxie et peut donc être un bon modèle pour notre projet. Le projet va se diviser en plusieurs parties. En premier lieu, nous allons caractériser le comportement de ces souris à plusieurs temps, en utilisant des tests non douloureux et sans stress pour les animaux. En parallèle, nous caractériserons les cellules du système nerveux impliquées dans l’évolution de la maladie. La deuxième partie du projet vise à pratiquer de l’imagerie in vivo afin de visualiser l’activité du cervelet. Ceci nous permettra d’observer d’éventuels changements dans les réseaux neuronaux de façon directe chez les animaux. Ceci sera fait avant et après apparition des symptômes. Le dernier axe visera à utiliser les données d’imagerie obtenues précédemment afin de moduler les circuits neuronaux du cervelet par des approches chimiogénétiques. Cette approche consiste à injecter sous anesthésie différents types de récepteurs qui pourront être activés par un composé qui sera distribué dans l’eau de boisson des animaux. Ceci est dépendant des données obtenues précédemment, et notre approche sera adaptée au cours du projet. Nous espérons ainsi compenser les déficits comportementaux et obtenir des données fondamentales pour mettre en place le développement d’une thérapie. Ce projet présente donc deux intérêts majeurs, qui sont en premier la récolte de données fondamentales indispensables à une meilleure compréhension de la maladie, afin que la communauté scientifique puisse en bénéficier, et l’avancée vers un développement d’une thérapie pour traiter les patients atteints de l’AF.
Bénéfices attendus
Ce projet combine plusieurs techniques afin d’obtenir des données les plus complètes possibles sur ce nouveau modèle. En effet, bien que plusieurs modèles aient déjà été générés par le passé, notre modèle murin est celui qui est le plus proche génétiquement de ce qu’il se passe chez le patient, car il présente une quantité de la protéine Frataxine très basse dans tout le corps, dès le développement de l’embryon. Nos approches combinées de comportement, biologie moléculaire et microscopie vont permettre d’avoir une vue d’ensemble des événements responsables de l'évolution de la maladie. Ce projet permettra d'isoler des pistes pour mettre en place un traitement. Nous pourrons partager ces données avec l’ensemble de la communauté scientifique afin que d’autres travaux puissent utiliser ces connaissances et progresser dans la recherche fondamentale et pré-clinique. Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques. De plus, les techniques utilisées pour ce projet pourront être déclinées sur d’autres modèles. Les mécanismes sous-jacents de l’AF sont en cours d’étude et de nombreux éléments ne sont pas encore compris. Ce projet va permettre de rassembler une quantité de données non négligeable dans la compréhension de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes : -Tests comportementaux pour la caractérisation neurologique à 3, 6, 9, et 12 mois. 80 animaux au total (10 témoins et 10 mutants par temps). Les tests effectués visent à évaluer la coordination générale des animaux, et ne sont pas invasifs ni stressants. Comme pour toutes les procédures de comportement, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant plusieurs sessions avant le début des tests. Les tests ont une durée comprise entre 30 secondes et 5 minutes, et une période de repos est prévue entre chaque test. Au total, chaque souris passe au maximum 15min à être évaluée en comportement. Les tests comportementaux seront répétés à 4 temps différents. -Imagerie in vivo à 40j et 150j. 48 animaux au total. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique pour l’implantation d’une fenêtre crânienne et l’injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. L’intervention dure 2.5h par souris, et se fait sous anesthésie générale avec suivi vétérinaire quotidien pendant les 10 jours suivant l’intervention. -Modification chimiogénétique des circuits neuronaux cérébelleux par injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. 240 animaux au total, injectés à 40j et 150j -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, activés chimiquement via un produit dans l’eau de boisson (CNO) -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, qui ne seront pas activés chimiquement -40 animaux injectés avec un virus ne codant pas pour les récepteurs -20 animaux injectés avec le virus codant les récepteurs et traités au CNO -20 animaux injectés avec le virus non codant, traités également au CNO Les 4 premiers groupes seront utilisés pour les tests de comportement décrits précédemment, ainsi que des études histopathologiques. Les 2 derniers groupes seront utilisés pour des études protéomiques. Tous ces animaux seront soumis à l’intervention d’1h décrite précédemment, avec le même suivi vétérinaire.
Impact sur les animaux
Les données recueillies par nos collaborateurs et notre laboratoire montrent que notre modèle murin de l'AF ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois. A partir de 4 à 5 mois, des symptômes légers d’incoordination motrice commencent à apparaître. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs ni stressants, et ne causent donc aucun dommage aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection et d’implantation de fenêtre crânienne est une chirurgie lourde, et les mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires ont été prises en amont. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. Les traitements pharmacologiques pour les animaux concernés se fera via l’eau de boisson, et n’apportera donc aucun stress pour les animaux. Lors des sessions de microscopie, la tête des animaux sera immobilisée sur une courte période de 30min maximum par souris, pour assurer une acquisition optimale des images.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques. Tous les animaux sont réutilisés d’un autre projet de notre laboratoire dont l’un des axes vise à étudier le comportement néonatal des souriceaux. Ces 2 projets sont donc complémentaires et permettront l’obtention de données sur toute la durée de vie des animaux. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l’Ataxie de Friedreich affecte de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. De plus, nous effectuons un marquage de couleur à la base de la queue avec une encre légère non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Pour la prise en charge de la douleur per-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet, comprenant plusieurs molécules, avec la vétérinaire référente de la structure. Pour éviter au maximum de séparer les animaux lors de la phase post-opératoire, nous allons tester un système séparateur de cage qui permettrait aux animaux de se voir, se sentir et d’avoir des contacts sociaux réduits afin qu’ils soient moins stressés lors de cette période critique du projet. Pendant cette période, de l’enrichissement supplémentaire sera fourni pour prévenir toute apparition de comportement stéréotypique, marqueur de souffrance. De plus, un suivi vétérinaire sera effectué quotidiennement pendant 10j, avec une grille de score adaptée et plusieurs types d’analgésiques disponibles pour prévenir toute douleur post-opératoire. Des points limites adaptés à cette chirurgie ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Ceux-ci comprennent notamment l’évaluation de la consommation d’eau et de nourriture, le toilettage et les mouvements de chaque animal. L’administration de molécules pharmacologiques sera faite via l’eau de boisson, qui sera sucrée pour en masquer le goût. Ceci permettra un traitement sans aucune manipulation supplémentaire, ce qui ne stressera pas les souris.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Ce nouveau modèle va permettre de raffiner l’étude de l’AF car il s’agit du premier modèle disponible qui présente une perte de FXN dans le corps entier. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale de la progression de la maladie. La caractérisation neurologique par tests comportementaux se fera à 3, 6, 9 et 12 mois. A 3 mois, les souris ne présentent pas encore de symptômes, mais il est possible que des dégradations neuronales soient déjà en cours. Les 3 stades suivants nous permettront de relier l’évolution des symptômes avec l’état de dégradation du système nerveux central. Pour les expériences d’imagerie in vivo, les animaux seront opérés à 40j puis observés à 70j pour la partie pré symptomatique. Pour la partie post symptomatique, ils seront opérés à 150j et observés à 180j. comme précédemment, ceci nous permet de mesurer les paramètres d’intérêt avant et après l’apparition de la maladie, pour déterminer la gravité des changements qui ont lieu.
Altération de l’activité corticale et maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau, reçoivent des injections pendant sept jours et passent des tests comportementaux, dont un conditionnement par la peur, pour étudier les altérations précoces de la mémoire dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur qualifie le conditionnement par la peur de peu stressant en s'appuyant sur des projets antérieurs, et reconnaît un inconfort modéré et une perte de poids possible après la chirurgie. Il affirme qu'aucun modèle in silico ne reproduit le cerveau entier et que seule la souris réunit les critères recherchés.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie progressive, mortelle et est la cause principale de syndrome démentiel et en représente au moins deux tiers des cas la plus courante. MA commence bien avant le stade démentiel par l’apparition de troubles cognitifs donc le diagnostic précoce est un objectif important pour la recherche préclinique et clinique sur la MA. Il peut représenter une fenêtre thérapeutique critique où les interventions peuvent être initiées avant que ne se produise un déclin cognitif sévère. Une accumulation de peptide bêta-amyloïde (Aß) dans le cortex préfrontal est corrélée à un oubli rapide. Ensable, ils constituent un symptôme précoce de la MA qui peut être détecté par des mesures d'évaluation cognitive expérimentale et clinique bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers symptômes rapportés par les familles de patients. Aβ a des effets sur les signalisations impliquées dans la régulation des diverses formes de plasticité corticale et donc la formation de la mémoire. L'objectif de notre projet actuel est d'aboutir à une meilleure compréhension des processus neurobiologiques qui sous-tendent les mécanismes sous-jacents de la formation de mémoire altérée aux premiers stades de la maladie. Nous proposons d'explorer les altérations corticale en tant que marqueur précoce de l'oubli anormal dans la MA.
Bénéfices attendus
La diagnose précoce de la maladie d`Alzheimer est l'étape la plus importante dans l'identification : i) de l'altération cérébrale initiale et par conséquent ii) des thérapies possibles. L'oubli précoce pourrait représenter une cible pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'apparition de formes plus sévères de la MA. Notre projet vise à relier l'oubli précoce aux changements moléculaires responsables de l'altération de l'activité corticale en offrant une nouvelle voie pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent les interventions chirurgicales (< 40 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementale se compose de deux épreuves, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque épreuve dure 6 à 7 minutes). Ils reçoivent également des injections pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un ou deux brèves procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces procédures sont un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Les autres procédures expérimentales de ce projet comprennent des tests comportementaux : conditionnement par la peur (CdP) et procédure sans reveil. Le conditionnement par la peur peut être un événement stressant pour les souris. Afin de réduire le stress, nous gardons le groupe d'animaux en cage, ce qui leur permet d'exprimer leur comportement social naturel et nous permet de suivre le toilettage mutuel et la nidification des animaux après l'exécution de la tâche. Les projets précédents qui ont utilisé cette tâche comportementale ont montré que les animaux expriment leur comportement naturel dans les 15 minutes qui suivent la tâche, ce qui signifie que cette procédure n'entraîne pas une augmentation significative du niveau de stress. Le test est également effectué dans une pièce différente, avec des odeurs différentes de celles de la cage, afin de désactiver le lien entre la cage d'origine et l'événement redoutable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la mémoire dans le néocortex et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et par conséquent ne sont pas adaptés à l'objet de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : Selon les caractéristiques de nos données (normalité, variance, cohérences avec les critères de chaque test), nous appliquons les tests statistiques. Selon les caractéristiques de nos données certains tests supplémentaires seront effectués.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Manipulation quotidienne des animaux avant les expériences pour réduire le niveau de détresse. iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. vii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant la production d’amyloïde beta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Selon les données précédemment rapportées et les données sur le développement de la pathologie, nous les utilisons à l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave.
Impact des mutations du gène Kcnk3 sur la fonction ventriculaire droite consécutive à un banding de l’artère pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance est déclarée pour partie légère et pour partie sévère. Une insuffisance cardiaque droite leur est provoquée par la pose d'un clip serrant l'artère pulmonaire sous anesthésie, avant un suivi par échographie puis une mise à mort pour analyse du cœur et des poumons. Le porteur indique que cette chirurgie conduit à un essoufflement à l'effort et à de la fatigue, sans détailler la surveillance de la douleur au-delà d'un analgésique postopératoire. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable", les cellules cardiaques adultes ne pouvant selon lui être maintenues en culture.
Objectifs
Chez le patient atteint d'hypertension artérielle pulmonaire, le déclencheur de la transplantation ou de la mort du patient est le développement d'une insuffisance ventriculaire droite. Cependant les mécanismes moléculaires responsables de cet état pathologique sont peu connus. L'objectif de ce projet est déterminer comprendre les mécanismes moléculaires de l'insuffisance cardiaque droite.
Bénéfices attendus
Chez le patient atteint d'hypertension artérielle pulmonaire, le déclencheur de la transplantation ou de la mort du patient est l’état du ventricule cardiaque droit. Ce projet nous permettra comprendre comment se met en place l'adaptation cardiaque puis l’insuffisance cardiaque droite, ce qui représente un enjeu majeur pour soutenir la fonction cardiaque des malades atteints d’HTAP. A l’heure actuelle les mécanismes responsables du développement de l’insuffisance cardiaque droite sont mal connus c'est pourquoi nous allons induire une insuffisance cardiaque droite chez le rat afin d'étudier les mécanismes mis en jeu.
Procédures
Pour la animaux du groupe Banding de l'artère pulmonaire: Sous anesthésie gazeuse (isofluorane) les rats subiront la chirurgie de banding de l'artère pulmonaire (durée de la chirurgie 20-40min), puis une échocardiographie sera réalisée 4 semaines post-chirurgie. Les animaux contrôles subiront la mème procédure chirurgicale sans la pose du clip autrou de l'artère pulmonaire (20-30 min). Leur fonction cardiaque sera également suivie par échocardiographie. A la fin de la chirurgie, puis toutes les 24 heures pendant 3 jours un analgésique sera injecté au rat en sous cutané. Les rats sont laissés sur la couverture chauffante jusqu’au réveil complet. Des prélèvements de sang (200 µL) (durée du prélevement 5min) seront réalisés à la fin de la procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Comme décris précédement, la chirurgie de Banding de l'artère pulmonaire conduira au développement d'une insuffisance cardiaque droite. Les effets secondaires importants et les atteintes cardiaques (essouflement à l'effort, fatigue) conséquences de la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dysfunction ventriculaire droite induite par banding de l'artère pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l’impossibilité d’obtenir des lignées de cellules cardiaques adultes (les cellules cardiaques ne se divisent pas), par le fait que les cellules cardiaques ne conservent pas un phénotype stable et ne survivent pas au-delà de 24h après isolement cellulaire. Il se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque, et les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Plusieurs approches expérimentales seront utilisées par différents expérimentateurs sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le test statistique adéquat permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. De l'enrichissement (rouleau, coton) sera ajouté dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaliers surveilleront quotidiennement l'apparition de points limites précoces, notamment la perte de poids.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celles de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant des rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Jeune adulte (6 à 8 semaines, 100-200g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide, et chez l'homme la pathologie se développe chez les jeunes aldultes.
Evaluation in vivo de la biocompatibilité et de la dégradation de polymères à visée thérapeutique chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
2 588 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des disques de polymère leur sont implantés sous la peau ou dans un muscle sous anesthésie, puis les rats sont gardés de un à vingt-quatre mois avant mise à mort pour analyser la dégradation et la tolérance des matériaux. Le porteur ne décrit que des effets transitoires, léthargie, douleur et perte de poids après l'opération. Il affirme que les tests in vitro ne suffisent pas à reproduire les propriétés d'un organe entier et présente l'étape in vivo comme un préalable à l'implantation chez l'humain, sur l'un des effectifs les plus élevés du lot.
Objectifs
La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation, notamment fonctionnelle, des tissus, et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. L’objectif de notre laboratoire est de développer des systèmes de réparation sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales sont développés pour différentes applications de la réparation des nerfs périphériques aux hernies abdominales. Les formulations d’adhésifs et d’implants développées à ce jour ont démontré une efficacité pour restaurer la fonction de certains tissus avec une grande biocompatibilité. Pour étendre les indications possibles pour la réparation des tissus, notre laboratoire développe de nouvelles formulations de polymères applicables à de nouveaux tissus. Le développement de ces systèmes de réparation nécessite de caractériser le comportement in vivo des matériaux qui les constituent, notamment en termes de biocompatibilité et dégradation. Pour cela, les différents matériaux seront synthétisés sous forme de disques qui pourront être implantés chez l’animal en sous-cutané (dégradation) ou en intramusculaire (biocompatibilité). Les disques seront analysés avant implantation, puis à différents temps après implantation pour déterminer leur dégradation et leur biocompatibilité au cours du temps. Ces informations sont cruciales pour caractériser nos produits avant implantation chez l’Homme. Afin de réaliser cet objectif, le rat a été choisi comme modèle expérimental pour sa pertinence. Nous intégrerons, au maximum, 2588 rats dans l’étude sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider au niveau préclinique le comportement de nos polymères, notamment en termes de biocompatibilité et de dégradation. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à une implantation sous-cutanée ou intramusculaire de disques de polymère effectuée sous anesthésie et analgésie (durée de la chirurgie 30 minutes). Les animaux seront ensuite maintenus et suivi durant une période comprise entre 1 mois et 24 mois selon les groupes et euthanasié selon une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les deux procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer la dégradation et la biocompatibilité des disques de polymère.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet in vivo consiste à caractériser la biocompatibilité et la dégradation des polymères in situ dans un individu intégré et autonome pour permettre un développement optimal pour la clinique.
Réduction
Au maximum, 2588 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. 3 à 4 disques seront implantés chez un animal en sous-cutané et 1 en intramusculaire. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres formulations. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=8 animaux exploitables par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats/cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois avec eau et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et/ou une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée 24h après la chirurgie pour évaluer la récupération de l'animal. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifées seront déposés directement dans le fond de cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront ajoutées à l'alimentation ususelle pour diversifier l'enrichissement. Suivi tout au long de l'étude: suivi quotidien. Une grille de score et des points limites seront mis en place.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. L’efficacité de nos systèmes de réparation tissulaire est testée sur des animaux adultes du même âge. Pour assurer une reproductibilité des résultats, l’étude de biocompatibilité/dégradation est réalisée au même âge. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est un critère important pour notre projet qui implique un suivi sur 24 mois pour certains groupes expérimentaux.
Effet d’une infusion centrale chronique d’hormones thyroïdiennes sur l’expression de l’hibernation chez le hamster syrien mâle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
219 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque hamster est hébergé seul seize semaines en conditions hivernales, exposé au froid à 8 °C pour entrer en hibernation, et subit deux chirurgies, la pose d'un capteur de température puis d'une pompe diffusant des hormones, la moitié des animaux étant en plus castrés. Le porteur indique que des injections pratiquées pendant la torpeur peuvent provoquer une douleur aiguë et le réveil de l'animal, et que la castration peut entraîner une hémorragie et des douleurs supplémentaires. Il affirme que l'hibernation met en jeu l'organisme entier et qu'aucun moyen de substitution ne permet de la modéliser, justifiant le recours au hamster syrien.
Objectifs
L’hibernation est une adaptation physiologique et comportementale qui permet la survie de l’espèce pendant les périodes saisonnières défavorables (en hiver : température extérieure basse et pénurie des ressources alimentaires). Tout au long de l’hibernation, afin d’économiser de l’énergie, l’animal va réaliser des cycles d’éveil/sommeil, alternant entre des phases actives avec une température corporelle à 37°C et des épisodes de torpeur, caractérisés par un endormissement profond associé à une hypothermie corporelle sévère. La température corporelle s’ajustant sur les températures extérieures froides de l’hiver peut descendre à 5°C. Des travaux antérieurs suggèrent que les hormones thyroïdiennes du cerveau seraient impliquées dans ces processus d’hibernation. Nous allons vérifier cela chez une espèce hibernante : le hamster syrien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet concernent les connaissances obtenues en recherches fondamentales sur le système nerveux central, le métabolisme ainsi que sur la biologie d'un animal hibernant.
Procédures
Les hamsters syriens seront hébergés seul pendant 16 semaines dans des conditions où les jours sont courts comme en hiver mais également exposés au froid afin d'obserser les comportements hibernatoires des animaux. Les animaux subiront deux actes chirurgicaux à 2 semaines d'intervalle. Le premier acte durera moins d'une heure 1 h pour l'insertion d'un capteur télémétrique de température corporelle, permettant le suivi à distance de l'hibernation des animaux. Le deuxième acte, d'une durée de 2h30 maximum pour la mise en place d'une mini-pompe diffusant des hormones. Ils seront exposés au froid (8°C) pour entrer en hibernation. Lors d'utilisation de pompe rechargeable, des injections transcutanées sont réalisées en phase de torpeur (animaux profondément endormis). Une castration est ajoutée à la première chirurgie pour la moitié des animaux. L'évolution de l'hibernation des animaux est surveillée pendant 6 semaines environ.
Impact sur les animaux
Lors des chirurgies, l’anesthésie générale peut induire une hypothermie, de la sécheresse occulaire et une légère déshydratation. Au niveau du site d’incision, il y a des risques de douleur, d’inflammation et d’infection de la plaie. Une perte de poids légère (inférieure à 5%) sur 24h est attendue, mais devrait être transitoire. Elle pourrait se maintenir en cas de complications post-chirurgicales (inflammation, infection, douleur). L’insertion de la pompe sous la peau du dos pourrait éventuellement gêner la motricité de l’animal (encombrement, frottements) si celle-ci est trop proche du cou ou des membres antérieurs. Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur, des injections transcutanées sont réalisées et peuvent induire une douleur aigüe légère et son réveil. La castration peut induire une hémorragie et de douleurs supplémentaires.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements en fin d'expérience.
Remplacement
L’expérience doit être réalisée sur l’animal entier. Les processus impliqués dans l’hibernation font intervenir l’ensemble de l’organisme, aussi est-il impossible, en l’état actuel de nos connaissances, de réaliser une telle étude sur des organes isolés. Aucun moyen de substitution ne permet de modéliser les différentes étapes de l’hibernation et les processus liés à chaque étape ni les relations entre les organes périphériques et le cerveau.
Réduction
Le nombre d'animaux (8 par groupe) a été calculé pour obtenir des résultats statistiquement robustes et de faible variance pour comparaisons inter-groupe.
Raffinement
Pour éviter les agressions dans les jours courts comme en hiver, les animaux seront hébergés en cages individuelles enrichies avec de la frisure de nidation et un bâton à ronger. Lors des chirurgies, les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale et d'analgésiques locaux. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera administré en post-chirurgie. La longueur du cathéter entre la canule et la pompe est tout particulièrement ajustée afin de pas gêner le hamster syrien dans ses mouvements. Des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le hamster syrien (Mesocricetus auratus) car c’est un animal hibernant. Les animaux sont des adultes mâles (entre 3 et 9 mois ; poids corporel moyen 120 g) car notre expérience requiert qu’ils soient sexuellement matures et ce sexe nous permet de voir facilement si le système reproducteur de l'animal est activé ou inhibé grâce à la taille des testicules.