Rongeurs

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Opérées au cerveau, elles reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant 20 jours, subissent un test comportemental, puis sont tuées pour l'électrophysiologie. Le projet étudie l'effet du cannabis sur la mémoire à l'adolescence, les souris étant utilisées à 28 jours pour mimer cette période. Le porteur affirme que ces circuits neuronaux ne peuvent être étudiés ni par simulation numérique ni chez des invertébrés.

Objectifs

Le noyau accumbens (NAc) est une région du cerveau impliquée dans la récompense et l'une des principales cibles des drogues illicites. L'hippocampe, une région du cerveau impliquée dans la formation de la mémoire, envoie des informations au NAc. Certaines drogues illicites, comme le cannabis, modifient les connexions neuronales entre l'hippocampe et le NAc, entraînant des troubles de l'apprentissage, mais on ne sait pas comment ces connexions sont régulées et modifiées après la consommation de cannabis. Il est important de noter que la consommation de cannabis commence généralement à l'adolescence, une période où le cerveau subit de nombreux changements. Il est donc important de comprendre comment la consommation de cannabis pendant l'adolescence influe sur la mémoire. Ce projet étudiera ces questions en se concentrant sur un candidat potentiel pour la régulation de ces connexions neuronales : les récepteurs CB1 astrogliaux. Le récepteur CB1 est le principal récepteur cérébral des effets du cannabis et on sait qu'il est exprimé dans les astrocytes, les principales cellules du cerveau. Notre nouvelle hypothèse est que l'activation des récepteurs CB1 dans les astrocytes pendant la consommation de cannabis entraîne des changements dans les connexions hippocampe-NAc et des déficits de la mémoire. En outre, nous étudierons ces effets sur des souris adolescentes, de sorte que notre étude fournira des informations sur les effets néfastes de la consommation de cannabis sur la mémoire des adolescents.

Bénéfices attendus

La consommation de cannabis à l'adolescence est en constante augmentation, mais ses effets nocifs à cet âge ne sont pas bien compris. Il est bien connu que la consommation de cannabis entraîne des déficits de la mémoire, mais les mécanismes neurobiologiques sous-jacents sont inconnus. Le récepteur CB1 étant la cible endogène des molécules psychoactives du cannabis, comprendre comment les récepteurs CB1 des astrocytes (les principales cellules du cerveau) régulent les connexions hippocampe-NAc (impliquées dans la mémoire) fera progresser nos connaissances sur ces processus. Par conséquent, ce projet nous aidera à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le cannabis modifie ce circuit neuronal, altérant ainsi la mémoire et, de cette manière, visant à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des effets nocifs de la consommation de cannabis.

Procédures

Tous les animaux seront opérés (durée de l'opération 90 min + 4 jours de suivi postopératoire). Une fois rétablis, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (15 sec) par jour pendant une période de 20 jours consécutifs. Le test comportemental sera réalisé pendant 4 jours consécutifs (1h/jour maximum).

Impact sur les animaux

L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Le taux d'apparition de signes d'infection de la plaie après ce type d'opération est très faible. Les traitements médicamenteux et les injections IP sont bien contrôlés en laboratoire et ne provoquent pas d'inconfort pour l'animal. De plus, les produits utilisés (et leurs doses) sont bien tolérés par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour être utilisés en électrophysiologie.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations numériques fiables pour étudier les changements qui se produisent. En outre, l'utilisation d'invertébrés, dont le système nerveux est complètement différent, serait inappropriée. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur les mammifères reste nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne doit pas dépasser 15 animaux, c'estàdire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Les chiffres attendus garantissent une bonne interprétation des résultats. Toutefois, si l'expérience montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Les animaux sont logés dans des cages collectives avant et après la manipulation. Les souris sont hébergées avec du matériel de nidification en coton dans des conditions optimales de température, d'humidité et de lumière. Les souris sont observées quotidiennement par du personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs formés conformément à la réglementation en vigueur, afin que des mesures d'analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. L'établissement des points limites est basé sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux, comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, tant préopératoires que postopératoires, comprennent également l'utilisation d'analgésiques pour la gestion de la douleur et doivent être effectuées par des expérimentateurs formés à à la chirurgie des rongeurs, conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

À ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères, y compris l'homme, et surtout leur plasticité, ne permet pas de concevoir et de mettre en oeuvre des simulations numériques fiables permettant d'étudier les changements qui se produisent. De plus, l'utilisation d'invertébrés dont le système nerveux est complètement différent serait inappropriée. Dans ce contexte, l'expérimentation animale reste nécessaire. La souris est le modèle idéal pour ces trois raisons 1) Possibilité d'étudier des mutants pour une protéine donnée (dans ce cas le récepteur CB1), 2) Reproductibilité et comparabilité avec d'autres résultats obtenus dans le laboratoire et la communauté scientifique au sens large. 3) Les installations sont équipées pour les études sur les rongeurs. Les animaux seront utilisés à l’âge de 28 jours, car nous avons l'intention d'étudier les effets du cannabis pendant l'adolescence. En outre, une fois que toutes les procédures expérimentales in vivo (chirurgie, traitement pharmacologique et tests comportementaux) seront terminés, les animaux seront sacrifiés et utilisés pour l'électrophysiologie in vitro. En raison de la difficulté d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur des souris adultes, le protocole que nous avons établi permettra d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques après que toutes les procédures auront été achevées sur des souris raisonnablement jeunes.

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie sous anesthésie pour modifier l'expression d'un gène dans le cerveau de leurs embryons, les mères étant tuées après le sevrage et les petits à l'âge adulte pour prélever le cerveau. Le projet cherche à comprendre la survie anormale de neurones transitoires dans certaines épilepsies, les retombées thérapeutiques restant hypothétiques. Le porteur affirme que la complexité du cerveau ne peut être reproduite dans aucun modèle in vitro.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux impliquent un dysfonctionnement cérébral résultant d'une altération de l'assemblage du cerveau au cours du développement embryonnaire. Ils comprennent l'autisme, le trouble déficitaire de l'attention/hyperactivité, la déficience intellectuelle, l'infirmité motrice cérébrale et diverses formes d'épilepsie. On estime que jusqu'à quinze pourcents des enfants des pays développés peuvent souffrir de troubles neurodéveloppementaux, dont certains symptômes durent toute la vie. Il est donc extrêmement important de comprendre les déficits impliqués dans ces troubles pour trouver des stratégies thérapeutiques permettant de guérir ces patients. Divers mécanismes peuvent être impliqués dans le développement anormal du cerveau, notamment la génération de neurones, leur migration vers leur destination finale et leurs connexions adéquates. En outre, une forme de mort cellulaire programmée apparaît comme un nouveau mécanisme, encore peu étudié, du bon développement du cerveau. Ainsi, certains n'apparaissent que de manière transitoire au cours du développement du cerveau, où ils participent à la construction des circuits neuronaux, et sont programmés pour mourir à la fin de la maturation cérébrale. Une survie aberrante de ces neurones a été constatée chez des patients atteints de troubles neurodéveloppementaux associés à l'épilepsie. De plus, nos travaux récents révèlent que le fait de forcer certains de ces neurones à survivre après la naissance perturbe le câblage du cerveau, ce qui entraîne une activité cérébrale aberrante et des crises d'épilepsie. Notre projet vise à étudier comment la survie aberrante des neurones transitoires chez la souris et l'homme conduit à une activité cérébrale altérée dans les troubles du développement neurologique. Au cours de ce projet, nous identifierons certains mécanismes clés de la "mort cellulaire programmée" au cours du développement du cerveau et évaluerons son rôle dans certains troubles du développement neurologique associés à l'épilepsie, ouvrant ainsi la voie à l'identification de nouvelles cibles ou stratégies d'intervention thérapeutique dans ces troubles.

Bénéfices attendus

La survie anormale des neurones transitoires est une caractéristique des troubles du développement cortical associés notamment à des formes d’épilepsies focales sévères. Comprendre les déterminants cellulaires qui contrôlent le destin de ces cellules permettra de mieux comprendre leur survie anormale dans la pathologie et de concevoir des stratégies visant à y remédier. Une meilleure connaissance de l’intégration de de ces cellules dans les réseaux corticaux et de leur impact sur l’activité corticale permettra à la fois de mieux comprendre comment leur survie anormale promeut l’émergence d’activités pathologiques, et ainsi révèlera de nouvelles cibles à visée thérapeutique dans les affections neurologiques impliquant une survie anormale des neurones transitoires.

Procédures

Un groupe de souris gestantes sera soumis à une courte chirurgie sous anesthésie et analgésie (45 min) pour induire l’expression d’un gène spécifique dans le cerveau de leurs embryons. Une fois les petits nés un antibiotique leur sera administré via la lactation (antibiotique placé en continu dans l’eau de boisson de la mère) afin de permettre l’expression de ce gène. Les mères seront euthanasiées après le sevrage des petits et les petits seront euthanasiés à l’âge adulte par une procédure adaptée. Un autre groupe de souris gestantes sera aussi soumis à une courte chirurgie (45 min) sous anesthésie et analgésie pour induire l’expression d’un virus non pathogène dans le cerveau de leurs embryons. Une fois ces embryons adultes, ils seront eux-mêmes soumis à une chirurgie d’une heure sous anesthésie et analgésie pour induire l’expression d’un second virus non pathogène dans leur cerveau. Les mères seront euthanasiées après le sevrage des petits et les petits seront euthanasiés à l’âge adulte par une procédure adaptée.

Impact sur les animaux

La contention peut provoquer un stress chez l’animal. Les étapes d’anesthésie peuvent provoquer une détresse respiratoire, et une perte de chaleur de l’animal. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance et risque d'infection de la cicatrice. Les administrations d'antidouleur/anesthésiques peuvent entrainer une douleur et un stress de courte durée associée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

Les animaux seront mis en oeuvre dans des expériences in vitro ou des marrquages histologiques, nécessitant un prélèvement du cerveau. Ils seront donc nécessairement euthanasiés en fin d'experimentation et ne pourront être réutilisés.

Remplacement

Les études menées dans ce projet portent sur le développement du cerveau et les connections entre neurones dans le cerveau adulte. Ainsi, les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées sur des cerveaux intacts, prélevés sur des souris au stade embryonnaire ou adulte, et ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement/adulte. En effet, nous disposons d’outils génétiques puissants chez la souris nous permettant de spécifiquement cibler les neurones d’intérêt ce qui en fait un modèle de choix. De plus, la complexité anatomique du cerveau et des réseaux neuronaux qui s’y établissent ne peuvent être mimés dans aucun modèle in vitro.

Réduction

Les expériences de chirurgie antérieures de nos collaborateurs sur ce type d’étude et de modèle animal indique qu’un échantillon de 6 animaux par condition pour une expérience donnée est suffisant pour mettre en évidence une différence mesurable et significative entre les conditions. A l’aide de ces calculs, nous estimons devoir utiliser 696 animaux dans le cadre de ce projet. Les effectifs ont été confirmés par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans un environnement avec enrichissement (sizzle, cabane en plastique) avec eau et nourriture à volonté. Les animaux seront regroupés en groupe sociaux avant la gestation (pour la mère) et après le sevrage (pour ses petits). Entre ces deux temps, la mère disposera d’une cage seule afin de minimiser le stress lors de la gestation et d’une cage seule avec ses petits avant le sevrage. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Après les chirurgies, les souris seront laissées seules pour une période de convalescence de 24 heures avant d’être remises en groupes sociaux. Après les chirurgies, une litière utilisée spécifique pour les animaux opérés permet de diminuer les risques d'infection de la cicatrice. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, anesthésiée et un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place, en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites, des mesures appropriées seront mises en place.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte, à la fois car c’est un modèle présentant un développement très bien caractérisé et stéréotypé mais surtout en raison des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’Homme. De plus, l’organisation de notre structure d’intérêt du cerveau est très similaire chez la souris et l’homme (organisation en couches, morphologie…). Les femelles gestantes sont des adultes. L'expérimentation est menée sur des souris du stade embryonnaire (E11.5-E12.5) jusqu’à l’âge adulte. En effet, les chirurgies concernant l’injection de gène/virus chez l’embryon doit se faire chez l’embryon lors de la neurogenèse de nos neurones d’intérêts et l’analyse de la survie neuronale et des circuits neuronaux doit se faire chez l’adulte car nous nous intéressons aux propriétés du cerveau de la souris adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des périodes d'hypergravité en centrifugeuse, qui provoquent stress, baisse d'activité et perte de poids les premiers jours, puis soumises à une série de tests comportementaux, boîte noir et blanc, reconnaissance d'objet, labyrinthe en Y et piscine de nage. Elles sont ensuite mises à mort pour prélever le cerveau. Le porteur relie le projet aux troubles cognitifs des astronautes et affirme que l'effet de la gravité sur un organisme entier ne peut être modélisé in vitro ou in silico.

Objectifs

Lors des voyages spatiaux, les astronautes sont soumis à des modifications de gravité qui compromettent leurs performances cognitives, et qui représentent encore l’un des principaux écueils concernant les vols de longue durée. Ce projet consiste à comprendre les mécanismes cérébraux, en particulier hippocampiques, induisant ces perturbations provoquées par des changements de gravité. En effet, si le système vestibulaire est le système sensoriel initialement impliqué dans le mal de l’espace, l’hippocampe, structure centrale auquel il est étroitement connecté, représente une cible potentielle de choix. Notre hypothèse est qu’une partie des troubles cognitifs des astronautes seraient liés à des modifications de la plasticité fonctionnelle des réseaux neuronaux hippocampiques, propriété reconnue comme support biologique des processus mnésiques.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe et des structures associées. En effet, on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est indirectement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulement à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération des fonctions cognitives qu’ils subissent lors de changements de gravité au cours des vols spatiaux. En utilisant différentes durées d’exposition à l’hypergravité, nous cherchons à évaluer à la fois les adaptations qui s’opèrent dans les premiers jours mais aussi sur le plus long terme et comment s’effectue la réadaptation à 1G post-exposition à l’hypergravité.

Procédures

Les animaux seront exposés à une période d’hypergravité . Ensuite, 96 animaux seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse pour permettre des prélèvements de tissus (expositions de 24h, 48h, 15j). Les autres seront soumis à des tests comportementaux. Les animaux effectuant des tests comportementaux seront divisés en 2 lots avec des protocoles de comportement différents (exposition à 24h, 15 j ou 30 j d’hypergravité). Pour le premier lot, le premier jour après la sortie de la centrifugeuse, les souris feront un test de la boite noire et blanche (10 min par souris). Ce test vise à évaluer l’anxiété des souris. Le deuxième jours le test de reconnaissance de place d’objet sera utilisé (test qui permet d’évaluer la mémoire spatiale et de reconnaissance à long terme) (2 sessions de 10 min à 4h d’intervalle par souris). Le 3ème jour la sociabilité et la reconnaissance sociale des souris sera évaluée grâce à un dispositif comportemental (2 sessions de 10 min par souris). Le 4ème jour les souris effectueront la première session d’un test d’évitement passif, la seconde partie du test sera effectuée une semaine plus tard (entre 1 et 5 min par souris)(mémoire émotionnelle). Après ces différents tests, soit 2 semaines après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structures et des enregistrements électrophysiologiques. Pour le lot 2, le jour de la sortie de la centrifugeuse les animaux effectueront le test d’enfouissement de billes (évaluation de l’anxiété,20 min par souris). Le jour 2, les souris effectueront un test d’alternance spontanée dans un labyrinthe en Y (mémoire de travail, 5min par souris). Le 3ème jour les souris commenceront un protocole en piscine de Morris. Ce test, réparti sur 5 jours donnera des indications sur la mémoire spatiale et l’apprentissage (4x4 essais de 1min max par jour). Une semaine après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structure et des enregistrements électrophysiologiques. Ces études vont nous permettre d’évaluer si les modifications sont concomitantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe).

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui provoque une augmentation du niveau du stress chez le rongeur, lié à la perturbation de perception de la gravité, et à la difficulté initiale à se déplacer. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont présenter une faible activité motrice pendant une période de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitataire et reprendre une activité normale. Une baisse de la température corporelle due à l’inactivité des animaux se produira lors des 3 premiers jours d’exposition. De nombreuses études ont aussi montré une diminution de la masse corporelle les premiers jours de centrifugation. Cette perte de poids est due à une hypophagie médiée par une réaction au stress vestibulaire induit par la centrifugation, au bout de 3 à 4 jours les animaux recommenceront à s’alimenter normalement et reprendront du poids.

Devenir

Les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure (soit 300 souris) pour la réalisation d'analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculosquelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements électrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveaux d’organismes ayant été exposés à une hypergravité, qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisamment proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=12 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. En effet, un calcul d’effectif sur le site biostatgv.sentiweb.fr nous a permis d’aboutir à ce nombre sur la base de données précédentes acquises au laboratoire. Dans une optique de réduire le nombre d’animaux nous avons décidé de n’utiliser qu’un seul groupe d’animaux témoins et non pas un groupe témoins pour chaque temps d’exposition à l’hypergravité. Aussi, les animaux serviront en plus de la récupération de leur cerveau à des prélèvements sanguins afin d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Une semaine de manipulation des animaux sera réalisée avant les expérimentations afin de réduire le stress lié à la manipulation. Pendant cette semaine les animaux des groupes utilisés pour l’étude comportementale seront aussi habitués à être transportés dans un tunnel en polycarbonate rouge. Le tunnel sera placé à demeure dans la cage puis la souris sera encouragée à entrer dans le tunnel qui sera soulevé afin de faire ensuite délicatement glisser la souris dans la main. Cette méthode permet de ne pas soulever les souris par la queue et enlève par conséquent un facteur important d’anxiété. Lors des tests comportementaux les souris seront placées dans la pièce expérimentale 30 minutes avant le début des tests afin de leur permettre de s’habituer à ce nouvel environnement. De la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition à l’hypergravité (il en sera de même pour les animaux témoins). Leur environnement est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement leur état de santé et particulièrement d’éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe (poils hérissés, blessures…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle euthanasie (cf grille de points limites).

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille, peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse et supporte bien une modification de la gravité jusqu’à 2G. Nous avons également choisi d’utiliser des souris C57BL6 car leur génome est connu et que des modifications de leur génome est possible et pourrait nous être utile par la suite (OGM sans otoconies par exemple). C’est aussi une souche qui est beaucoup étudiée au laboratoire et sur laquelle nous avons donc une importante base de données. Nous utilisons des souris adultes entre 3 et 5 mois car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soient atteints. De plus, les astronautes sont toujours adultes, nos données seront donc plus facilement transposables à l’humain.

1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une contention de 30 minutes en tube avec prélèvements sanguins pour tester la réponse au stress, une chirurgie d'injection d'un virus dans l'hippocampe sous anesthésie, puis un test de nage en labyrinthe aquatique, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le projet cherche à comprendre pourquoi certains individus vieillissants gardent la mémoire et d'autres non, les retombées pour la maladie d'Alzheimer restant renvoyées au long terme. Le porteur conclut qu'une approche intégrée exige l'animal vivant et qu'aucune technique de remplacement n'est possible.

Objectifs

Au cours du vieillissement, certains individus voient leur mémoire décliner beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients qui conservent de bonnes capacités mnésiques. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. L’hippocampe est une structure cérébrale jouant un rôle clé dans les mécanismes de mémoire, qui reposent en partie sur la génération de nouveaux neurones tout au long de la vie, processus appelé neurogenèse adulte. Un des mécanismes permettant d’expliquer les différences inter-individuelles de mémoire au cours du vieillissement serait la capacité de ces nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer (individus résilients) ou pas (individus vulnérables) dans le réseau de l’hippocampe. Il est important de noter que les astrocytes, aussi appelés cellules gliales, sont des partenaires actifs des neurones, notamment au cours des processus de mémoire. En effet, les astrocytes sont capables de détecter l’activité neuronale et d’y répondre en libérant des messagers chimiques. Nous proposons d’identifier si la libération de ces messagers est importante pour l’intégration des nouveaux neurones dans le réseau de l’hippocampe et donc le maintien des capacités mnésiques au cours du vieillissement. Enfin, le stress est connu pour avoir un fort impact sur le vieillissement des individus, et la réponse au stress est un facteur prédictif de vieillissement cognitif. De plus, la neurogenèse et l’état des astrocytes peuvent tous deux être affectés par un événement stressant (aigu ou chronique). Dès lors, il est important de connaître la réponse au stress des animaux pour pouvoir établir une corrélation avec l’état fonctionnel des astrocytes associés aux nouveaux neurones de l’hippocampe et le vieillissement cognitif des individus (résilients/vulnérables).

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences inter-individuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d'Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 6 : • Test de réponse au stress : Les animaux seront placés 30min dans un tube de contention de façon à induire un stress et 3 prélèvements sanguins seront réalisés, à 3 temps différents (1600 animaux seront concernés). • Injections intra-cérébrales de virus : Les animaux seront sous anesthésie gaseuse durant toute la chirurgie (≈1h/animal) qui consiste en une injection de virus dans l’hippocampe, structure cérébrale impliquée dans la mémoire (1600 animaux). • Injections sous-cutanées d’un marqueur de prolifération cellulaire (400 animaux). • Labyrinthe aquatique : Au cours de ce test, les rats nagent dans une piscine et doivent apprendre à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Ils passeront au maximum 6min dans l’eau par jour (4 essais consécutifs de 90s maximum), pendant 6 à 15 jours (1400 animaux). • Euthanasie par injection intra-péritonéale d’un mélange d’anesthésique/euthanasiant suivie d’une perfusion intra-cardiaque de fixateur sur cœur arrêté pour l’étude immunohistochimique (400 animaux). • Anesthésie profonde par injection intra-péritonéale d’un mélange d’analgésique/anesthésique suivie d’une perfusion intra-cardiaque de liquide cérébro-spinal artificiel pour l’étude électrophysiologique (1200 animaux).

Impact sur les animaux

Comme lors de tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux, il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adpatées. En effet, même si cela est relativement rare, il se peut que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales s’infectent. De même dans les 2 jours suivant la chirurgie, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie) ou présentent des signes de douleur. C’est pourquoi les animaux seront suivis quotidiennement au cours des 3 jours suivant ces actes afin de s’assurer de leur bien être. Au cours de ce suivi, l’expérimentateur en charge du projet remplit une fiche de suivi du bien-être animal avec une grille de score. Enfin, au sujet de l’isolement, certes les animaux seront hébergés en cage individuelle mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

Toutes les parties du projet nécessitent le prélèvement du cerveau des animaux afin de réaliser des analyses à l’échelle cellulaire. Les animaux seront de ce fait mis à mort à l’issue de chaque expérience pour réaliser ce prélèvement.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’interaction entre astrocytes et nouveaux neurones de l'hippocampe, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents de l’équipe, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales, des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus de l’étude), ainsi que du nombre minimum d’animaux nécessaires à l’observation de différences inter-individuelles au niveau comportemental (test d’apprentissage spatial) qui constituent l’objet de notre étude. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocément que prévu

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies (nids de fibres de peupliers compressées) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité, réactivité, aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. 10 à 30 min avant la chirurgie, un antalgique sera administré à l’animal afin de prévenir la douleur per-opératoire. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si besoin, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Nous utilisons des grilles d’évaluation permettant de scorer (0 à 15) de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies mensuellement par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera mis à mort par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la neurogenèse adulte est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’homme. Enfin, cette étude vient compléter les investigations déjà menées sur cette espèce par notre équipe, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante pour contrôler les résultats. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intra-cérébrales. Ensuite, les différentes études seront réalisées 1 à 15 mois après les chirurgies. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : un groupe début de vie adulte (rats de 4 mois), deux groupes milieu de vie (rats de 8 et 12 mois) et un groupe fin de vie (rats de 18 mois). Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale de l’interaction entre astrocytes et néo-neurones en comparant les animaux âgés à des animaux plus jeunes.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux à trois injections d'un candidat vaccin contre Klebsiella pneumoniae, deux à trois prélèvements de sang par section d'une partie de la queue au scalpel sous anesthésie, puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique tester différents protocoles d'immunisation pour comparer leur efficacité, les retombées pour des patients étant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'est pas encore possible de se passer du modèle animal pour produire des anticorps.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie (infection généralisée). Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin a déjà montré une protection significative dans un modèle de septicémie à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à l’administration de ce candidat vaccin. L’objectif du présent projet est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez la souris en testant différents protocoles d’immunisation et en comparant leur efficacité et également d’analyser la spécificité du vaccin.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer le meilleur protocole d’administration et à évaluer la variabilité de réponse à son administration ainsi que sa spécificité. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - 2 à 3 administrations du candidat vaccin par voie intramusculaire à J0, J21 +/- J42 (une administration correspond à une injection par cuisse) sur animal vigile _ 3 secondes par injection - 2 à 3 prélèvements sanguins à la queue à J0, J7 +/- J28 par section d’une partie de la queue au scalpel après anesthésie gazeuse _ 5 minutes dans la cage à induction pour l’anesthésie puis 10 secondes pour le prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intrapéritonéale (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de sang (30 secondes) qui se terminera par une dislocation cervicale (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Jusqu’à 3 administrations intramusculaires à J0, J21 +/- J42 (chaque administration correspond à 2 injections : cuisse droite + cuisse gauche) _ Le candidat vaccin ainsi que l’adjuvant ont déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 2 à 3 prélèvements sanguins par section d’une petite portion de la queue à J0, J7 +/- J28 réalisés sous anesthésie gazeuse _ Prélèvements réalisés sous anesthésie et uniquement sur 10 souris par groupe. - 1 anesthésie générale par injection intra péritonéale (IP) directement suivi d’une ponction intracardiaque de sang qui se terminera par une dislocation cervicale pour assurer la mise à mort. _ La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 100 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 28 ou 49 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance.

Remplacement

La production d’anticorps est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé en fonction de la quantité de sérum souhaité en fin d’expérience. Un volume correspondant au prélèvement de 20 souris sera nécessaire afin de réaliser des expériences in vitro de l’activité bactéricide sur plusieurs souche de K.pneumoniae. L’efficacité de l’immunisation sera analysée après 2 et 3 administrations ce qui impose un nombre de 40 animaux pour les groupes recevant le vaccin ou les cellules porteuses. En revanche, pour le groupe témoin (adjuvant) pour qui aucune production d’anticorps spécifique à K.pneumoniae n’est attendue, l’analyse du sérum après 3 injections uniquement sera suffisante et permettra de réduire l’effectif de ce groupe à 20 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Également, les prélèvements sanguins à la queue ont été limités à seulement une partie des animaux de chaque groupe.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris, proche de celui de l’homme, en fait un modèle de choix pour les études d’immunisation. Également, la suite du projet impliquera de tester ce vaccin dans un contexte d’infection pulmonaire à K.pneumoniae qui est un modèle infectieux que notre laboratoire a déjà développé chez la souris. Souris de 6 à 8 semaine de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante, capable de produire une réponse IgG.

675 souris et 75 rats vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Lors d'une séance de travaux pratiques de deux heures, des stagiaires s'entraînent au gavage, aux injections et au prélèvement de sang à la veine mandibulaire, chaque animal subissant au plus une administration et une prise de sang. Le porteur justifie la mise à mort en indiquant qu'il s'agit d'animaux de surplus d'élevage destinés à être éliminés. Sur le remplacement, il décrit des mannequins, des planches et des cadavres pour les gestes de base, mais affirme la nécessité d'animaux vivants dès que la contention est maîtrisée.

Objectifs

Conformément à la réglementation, les personnes chargées de réaliser les protocoles scientifiques et d'appliquer les procédures expérimentales sur les animaux doivent suivre, dans l'année suivant leur prise de poste, une formation spécifique. Cette formation vise à sensibiliser les personnels impliqués afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux lors des procédures expérimentales. Ce projet s'inscrit dans le cadre de la formation réglementaire et qualification du personnel utilisant des animaux à des fins scientifiques: Arrêté du 1er février 2013 relatif à l'acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d'animaux utilisés à des fins scientifiques. Son objectif est la réalisation d'une séance de travaux pratiques sur animaux, lors de chaque session de formation réglementaire en expérimentation animale destinées aux personnes appliquant les procédures expérimentales sur animaux. L'organisme de formation spécialisé dans le domaine de l'animal de laboratoire, dispense chaque année des sessions de cette formation d'une durée totale de 45h (volume horaire réglementaire), intégrant des cours théoriques (38h), des travaux dirigés (5h) et des travaux pratiques (2h). Ces travaux pratiques seront réalisés sur souris et/ou rats, espèces les plus utilisées en recherche scientifique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnels travaillant au quotidien sur l'animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d'une culture de bientraitance des animaux.

Procédures

Au cours de la séance de 2h de travaux pratiques, quelques techniques simples d'administration de substances (sérum physiologique) et de prélèvement sanguin peuvent être réalisées, selon le niveau de maîtrise des participants: ces gestes ne seront réalisés sur une animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maîtrisée par les stagiaires et validée par l'encadrant. Les gestes qui peuvent alors être appris sont: - le gavage par voie orale - l'injection intr-péritonéale - l'injection sous-cutanée - le prélèvements sanguin à la veine mandibulaire Chaque animal pourra faire l'objet au maximum d'une administration (gavage ou injection) et d'un prélèvement sanguin. Chaque geste dure 1 à 3 minutes). En cas d'échec lors d'une administration oud'un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l'encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum) Au total, le durée maximale des procédures appliquées à chaque animal sera de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles pour les animaux sont: - le stress lié à une préhension et contention d'un manipulateur non expérimenté, - la souffrance pouvant être liée à une administration de produit ou prise de sang incorrectement réalisées. La durée de ces effets est un maximum de 2h, durée de la séance de travaux pratiques. Si un animal présente des signes de stress ou de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l'encadrant prendra la décision adéquate pour l'animal (mise à mort si nécessaire, voir points limites).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car il s'agit d'animaux de surplus d'élevage destinés à être éliminés, indépendamment de la réalisation des travaux pratiques. Une fois euthanasiés, les cadavres peuvent être utilisés pour réaliser les gestes techniques n'ayant pas pu être pratiqués sur animal vigile, lorsque la contention n'est pas suffisament maitrisée.

Remplacement

Diverses méthodes ont été mises en oeuvre au cours de notre formation pour remplacer l'animal. Ainsi, les travaux dirigés d'anatomie sont exclusivement réalisés à l'aide de planches anatomiques et d'un puzzle 3D inerte. Les méthodes d'identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstration de contention.

Réduction

Afin de réduire le nombre total d'animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d'élevage, qu'il est prévu de mettre à mort dans la semaine, issus majoritairement soit de l'élevage de l'établissement d'acceuil, soit éventuellement d'un éleveur agrée. Nous réduisons également au maximum le nombre d'animaux utilisés pour chaque stagiaire. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal (au maximum: contention, 1 administration, 1 prélèvement sanguin), 3 animaux par participant sont necessaires. Afin de limiter également le nombre de participants, nos formations ne sont dispensés qu'aux personnes ayant l'obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.

Raffinement

En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commencant les travaux pratiques par une approche douce: en présentant simplement, un à un, leur main dans la cage des animaux, les stagiaires prennent tout le temps nécessaire pour maîtriser leur propre appréhension et habituer les animaux à leur présence. Une grande importance est donnée à l'observation des animaux, la detection et la prise en compte de tout signe de stress de l'animal afin de préserver son bien-être. Pour la contention, les différentes méthodes montrées sont parmi les moins stressantes pour l'animal, en utilisant par exemple pour les souris un tube de plexiplas transparent ou les 2 mains en "bol". Les notions d'entrainement des animaux , de bientraitance, de raffinement des techniques sont enseignées. Pour des raisons ethiques, les gestes techniques (administration et prélèement sanguin) ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maîtrisée par les stagiaires, avec validation de l'encadrant. Lorsque la contention n'est validée, les gestes sont uniquement appliqués sur cadavres. Aucune anesthésie n'est mise en oeuvre car l'objectif est une manipulation des animaux vigiles. Aucune analgésie n'est appliquée car les gestes sont peu invasifs et peu douloureux. Toute gêne ou douleur éventuelle doit pouvoir être observée et identifiée, dans le cadre de l'apprentissage, par le participant. Des points limites sont alors appliqués: si un animal présente des signes de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue. Le nombre de gestes techniques appliqués à chaque animal est limité: chaque animal fait l'objet au maximum d'une administration (gavage ou injection) et d'un prélèvement sanguin. En cas d'échec lors d'une administration ou d'un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l'encadrant sur le même animal, mais pas au delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum) Enfin l'encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l'éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques, au respect des points limites et peut prendre toute décision nécessaire pour mettre fin à une procédure.

Choix des espèces

La formation réglementaire dispensée comprend un module général (13h) et un module spécifique des rongeurs et lagomorphes (32h). Les animaux utilisés pour cette formation sont donc spécifiquement des rongeurs ou des lagomorphes. Les participants travaillant au quotidien sur rongeurs. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au dela, car les gestes doivent etre appris sur un animal ayant une anatomie et une physiologie d'adulte.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-trachéale de particules virales sous anesthésie pour induire des tumeurs pulmonaires, sont transférées entre deux établissements, puis suivies pour la détérioration liée au développement tumoral avant la mise à mort et le prélèvement des poumons. Cette version du projet ajoute un groupe de souris témoins pour renforcer les données. Le porteur étudie le rôle d'une protéine à bromodomaine dans le cancer du poumon et juge le modèle animal nécessaire, les cultures cellulaires restant selon lui trop éloignées de la physiologie.

Objectifs

La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Cette modifcation du projet concerne l'addition d'un groupe de souris contrôles pour renforcer nos données.

Bénéfices attendus

Le gène étudié au cours des 15 dernières années a été largement décrit comme étant surexprimé dans tous les tissus cancéreux humains étudiés et présentant un facteur de mauvais pronostic. Après analyse des articles scientifiques sur ce gènee et le cancer, il s'avère que toutes les études ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur le degré d’implication de ce gène dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer impliquant directement cette protéine. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité de la protéine d'intérêt est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais encore inconnu, mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.

Procédures

Les animaux recevront par voie intra-trachéale une injection unique et sous anesthésie de particules virales induisant la mutation désirée dans les poumons. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale n'est prévu durant cette période. La préparation des particules virales dure 30 minutes environ. La durée de l'anesthésie est de 5 minutes par souris. Une fois anesthéssiées, les souris recevront par voie intratrachéale une dose de particules virales. Cette étape dure 1 à 5 minutes par souris. À la fin de cette étape, les animaux seront placés pendant 10 à 15 minutes sur une plaquante chauffante dans un environnement calme afin de leur permettre de se réveiller.

Impact sur les animaux

Dans cette partie du projet, les souris recevront une injection unique de particules virales sous anesthésie générale. Elles seront hébergées dans un premier établissement utilisateur avant d'être transférées dans un second établissement où elles seront suivies et observées pour le développement tumoral. Une détérioration de l'état général des animaux lié au développement tumoral sera étudié.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.

Remplacement

Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.

Réduction

Après avoir discuté avec nos biostatisticiens nous nous étions fixés un nombre minimal de 4 animaux par groupe nécessaire afin de réaliser une cinétique d'infection pour suivre l'évolution des tumeurs (sur le plan histologique mais aussi et surtout au niveau moléculaire) et pouvoir l'analyser statistiquement, car les tumeurs pulmonaires sont très hétérogènes. D'autre part, d'après notre expérience, il arrive que des animaux décèdent lors de l'expérimentation. Une réduction de nos groupes expérimentaux initiaux rendrait caduque l’interprétation et l'analyse de nos données, c'est pourquoi nous comptons faire un individu supplémentaire si besoin. Enfin, contrairement à la version précédemment autorisée nous ne réaliserons des prélèvements qu’aux 2 temps les plus pertinents par rapport aux données déjà obtenues (6 et 12 semaines) et plus à 5 temps (4, 6, 8, 10 et12 semaines), ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. C’est pourquoi nous avons n=5 animaux par groupe x 2 lignées 2 temps d’analyse différents.

Raffinement

Les injections de particules virales sont faites sous anasthésie générale pour limiter la douleur et le stress. Les souris seront maintenues sous tapis chauffant pour éviter une perte de tempréature. Du gel occulaire sera appliqué pour éviter la déshydratation. Des points limites seront mis en place pour maintenir un état de douleur léger.

Choix des espèces

Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Les souris utilisées dans cette étude viennent d'un laboratoire de recherche américain. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que des effets de l'intubation intratrachéale.