Rongeurs

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivi d'injections d'une thérapie combinant vésicules extracellulaires et un traitement moléculaire. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 % et des déficits neurologiques présentés comme réversibles en une semaine, et utilise des rats hypertendus pour se rapprocher des patients. Tous les rats sont mis à mort pour prélever le cerveau, les retombées cliniques étant renvoyées au long terme avec un impact socioéconomique décrit comme "très important".

Objectifs

Face au manque de l’efficacité des traitements actuels contre l’AVC et de leur courte fenêtre thérapeutique, ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle thérapie combinant les vésicules extracellulaires (VE) et un un traitement moléculaire mimétique des héparanes sulfates, à la suite d’une ischémie cérébrale chez le rat. Les effets bénéfiques des VE et du traitement moléculaire, administrés séparément, ont déjà été montrés dans des modèles in vitro et in vivo, y compris dans notre laboratoire. Les VE seront issues des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines préalablement traités ou non par le traitement moléculaire. La préexistence de l’hypertension artérielle chronique (HTA) est connue pour être un facteur de risque et un facteur aggravant important pour l’AVC. Aussi, pour se rapprocher le plus possible des conditions cliniques, nous utiliserons dans ce projet des rats normotendus et des rats hypertendus.

Bénéfices attendus

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un problème majeur de santé public. Ils représentent la 2ème cause de mortalité et la 1ère cause d’handicap chez l’adulte. Plusieurs facteurs de risque favorisent le déclenchement de cette pathologie dont l'hypertension artérielle chronique qui est le facteur de risque le plus important. Dans les AVC de types ischémiques, la thrombolyse et la thrombectomie mécanique sont les seules interventions approuvées par les autorités de santé. Cependant, ces interventions ne sont applicables que chez une minorité de patients. Aussi, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les AVC. Dans ce contexte, notre projet devrait permettre le développement d’une nouvelle intervention thérapeutique associant les VE et le RGTA pour protéger et réparer le cerveau et améliorer la récupération neurologique après un AVC. L’impact socioéconomique d’un tel développement sera très important.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (induction de l’AVC sous anesthésie générale) : 1 heure maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 240 animaux sont concernés. - Injection intra-artérielle (animal anesthésié ) : 1 fois (1 h après l’induction de l’AVC) ; 5 minmaximum par animal, les animaux du groupe 2, 5 et 6 sont concernés, donc 120 animaux au total. - Injection intraveineuse (animal anesthésié) : 1 fois, 24 h après l’induction de l’AVC ; 10 min maximum par animal. Les animaux des groupes 2, 3, 4, 5 et 6 sont concernés, donc 200 animaux au total

Impact sur les animaux

Dans le modèle d’ischémie utilisé, les animaux décrivent une perte de poids (10% environ) ainsi que des déficits neurologiques (diminution de l’activité locomotrice) pendant les 3-4 jours suivant l’induction de l’ischémie cérébrale. Cependant, la perte de poids et les déficits neurologiques sont réversibles et les animaux récupèrent spontanément un bon état général au bout d’une semaine. Ces critères seront pris en compte dans les points limites de l’étude.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort , sous anesthésie profonde, dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses en post-mortem.

Remplacement

L’AVC, une pathologie complexe, fait intervenir différents acteurs moléculaires (molécules de signalisation cellulaire intervenant dans le fonctionnement cellulaire, l’inflammation et la mort cellulaire) ainsi que des acteurs cellulaires (y compris neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales). Bien que des tests aient déjà été réalisés sur des modèles cellulaires in vitro, pour l’instant, il n’existe aucun modèle de substitution qui permet de mimer dans sa complexité la physiopathologie de l’AVC. De plus, l’utilisation d’animaux présentant des facteurs de comorbidité (HTA) permet d’avoir un modèle se rapprochant de l’humain et de déterminer ainsi la stratégie à suivre pour le traitement de l’AVC ischémique.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’investigation non invasives telles que l’imagerie par IRM et les tests de comportements se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux. Celles-ci permettent de suivre l’évolution de l’AVC à différents temps sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. Dans le but de pouvoir réaliser des tests statistiques, l’estimation du nombre d’animaux par groupe est basée sur les données de nos études antérieures chez le rat et le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique. Par conséquent, nous estimons que 20 rats par groupe est suffisant pour réaliser les tests statistiques. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront mis en groupe sociaux (2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes Européennes. Ils auront un temps d’adaptation avant toute expérimentation et ils bénéficieront également d’enrichissement via des stimulations sensorielles par différents objets disposés dans les cages. Tout au long du protocole, un personnel compétent surveillera les animaux afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale : les modèles d’ischémie focale sont bien connus et de nombreux mécanismes de cette pathologie ainsi que des essais de neuroprotection ont ainsi été étudiés chez cette espèce animale. En effet, l’anatomie ainsi que la circulation cérébrale sanguine du rat sont bien décrites et, par ses grands traits, semblables à celles de l’Homme. De plus, cette espèce se prête facilement à l’étude fine des capacités sensorimotrices et cognitives par l’intermédiaire de tests comportementaux appropriés. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour l’étude de l’ischémie cérébrale. Les animaux utilisés ont un poids d’environ 250-350 g, âgés de 12 semaines au début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC chez le rat. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.

154 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 114 tués à l'issue et 40 reproducteurs maintenus en vie pour l'élevage. Modèles de la myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intracardiaques ou intramusculaires de cellules souches humaines et un traitement immunosuppresseur, et subissent des prélèvements sanguins, des échographies et des tests musculaires, avant la mise à mort de la plupart pour prélever muscles et organes. Le porteur affirme n'attendre pas d'effets indésirables majeurs de ces injections, en s'appuyant sur des essais antérieurs chez le chien. Il justifie le rat dystrophique par les limites du modèle souris et le coût du modèle chien.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus fréquente des dystrophies musculaires avec un garçon nouveau-né sur 3500. C’est une maladie génétique caractérisée par une mutation du gène codant une protéine musculaire : la dystrophine et entrainant son absence dans les fibres musculaires. Ceci entraîne une destruction des fibres puis le remplacement du muscle par du tissu fibreux et graisseux. Cliniquement, une réduction de la masse musculaire et une faiblesse musculaire sont observées conduisant au décès des patients vers l’âge de 20-30 ans. Il n’existe aucun traitement de la maladie à ce jour. L’injection de cellules saines fait partie des orientations thérapeutiques prometteuses. L’identification de populations de cellules souches au sein de tissus adultes ces dernières années et la démonstration de leur potentiel myogénique (capacité à régénérer des fibres musculaires, à en former de nouvelles ou des progéniteurs myogéniques de réserve) offrent des perspectives intéressantes. Notre équipe a isolé une population de cellules souches dérivées du muscle squelettique (cellules MuStem) et démontré son efficacité chez le chien malade en montrant des propriétés phénotypiques (propriétés à exprimer un ensemble de marqueurs de lignées cellulaires) et comportementales similaires à celles décrites pour la population canine. L’objectif du projet est de poursuivre la caractérisation des potentialités de la population hMuStem pour renseigner si celle-ci peut être présentée comme un support de biothérapie innovante pour les dystrophies musculaires. Pour cela, nous souhaitons déterminer l’innocuité (absence de caractère nuisible) et l’efficacité de son administration dans la circulation sanguine chez le rat dystrophique (DMDmdx). Ce modèle se révèle être un très bon modèle animal de la DMD pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de nouveaux produits thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle l’étude de biodistribution (dissémination au sein de l’organisme avec étude du comportement de l’agent à coloniser les tissus musculaires et/ou s’accumuler dans les organes filtres comme le poumon, le foie ou encore le rein) et d’impact de la population hMuStem sur la fonction et la reconstruction du muscle a été définie dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le projet décrit ici repose sur un ensemble conséquent de résultats in vitro et in vivo (chien, rongeurs, primate-non-humain) acquis progressivement ces 12 dernières années et qui tendent à montrer un potentiel thérapeutique des cellules MuStem dans le cadre de la prise en charge des affections musculaires et en particulier de la DMD. Pour progresser sur la qualification de cet agent dans le but de statuer sur son positionnement ou non comme médicament innovant, des données in vivo sur sa biodistribution et son efficacité de réparation musculaire (fonction et tissu) en contexte dystrophique sont fondamentales à ce stade du programme de recherche et pourraient permettre de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique pour une pathologie musculaire qui reste à ce jour sans traitement curatif.

Procédures

Partie I : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem par injection intracardiaque (IC) unique, sous anesthésie générale et analgésie, plus contrôle échographique. Durée : 2 min. (ii)3 prises de sang en ante mortem, sous anesthésie, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. (iii)4 animaux supplémentaires auront une injection intraveineuse de produit de contraste afin de calibrer le protocole d’administration par voie IC sous contrôle échographique, pendant l’anesthésie générale préalablement au sacrifice. Durée : 1 min. Partie II : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem, en une seule fois, par injection intramusculaire (2 injections sur 3 muscles différents d’un membre), sous anesthésie générale et analgésie. Le même protocole d’injection sera mené sur le membre opposé avec du sérum physiologique. Durée : 10min (ii)3 jours au préalable, un traitement immunosuppresseur sera administré par voie sous-cutanée (SC) sur animaux vigiles ou sous légère tranquillisation, à raison de 4 injections à 10 jours d’intervalle. Durée : 3min (iii)5 prises de sang sur animal tranquillisé, à la veine jugulaire ou sous anesthésie avant sacrifice, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. Partie III A : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem ou du sérum physiologique sous forme de 3 IC espacées de 6 à 9 jours, sous anesthésie générale et analgésie. Durée : 2 min. (ii)un traitement immunosuppresseur identique à la Partie II (iii)prises de sang : n= 6 pour les suivis 2 mois, n=8- pour les suivis 4 mois. (iv) Un électrocardiogramme (ECG) et une échocardiographie en pré- injection, et avant sacrifice. Durée : 2 min (v)Une évaluation musculaire : 2 tests d’exploration fonctionnelle (test d’agrippement et test d’endurance) et un test d’évaluation motrice (test d’actimétrie) seront réalisés sur chaque animal à raison d’une fois au cours de son suivi . Durée : 25 min. Partie IIIB : Même protocole que la partie IIIA, mais avec un suivi des animaux de 7mois post injection. Les interventions seront donc identiques mais en nombre plus élevés : (i) prise de sang : n=11 (ii) 4 ECG et 4 échocardiographies en pré-injection, J60, J120 et J210 (iii) 3 évaluations musculaires (motrices et fonctionnelles) à J60, J120 et J210

Impact sur les animaux

L’administration par voie intra-cardiaque des cellules hMuStem ne devrait pas occasionner d’effets indésirables si on s’en réfère aux résultats que nous avons obtenus précédemment avec ce type cellulaire dans le cadre de protocoles d'injection systémique (intra-artérielle et intraveineux) chez le chien dystrophique. Néanmoins, nous serons attentifs à la formation d’agrégats cellulaires comme cela a été relaté pour d’autres types cellulaires, lesquels peuvent être à l’origine de troubles de la circulation sanguine. L’administration intra-musculaire des cellules hMuStem induira un dommage local avec le passage de l’aiguille. La mise en place du traitement immunosuppressif par voie sous cutanée ne devrait pas non plus occasionner d’effets indésirables majeurs mais un point de vigilance sera porté sur l’apparition d’éventuels dérèglements biochimiques et/ou hématologiques. L’échocardiographie et l’électrocardiogramme, les tests de force et d’endurance et le test d’actimétrie sont des techniques d’abord non invasives pour lesquelles il n’est pas identifié d’effet indésirable.

Devenir

A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux inclus dans cette étude (n=114 maximum) seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses qui ne peuvent pas se faire du vivant de l'animal. Les prélèvements concerneront certains muscles squelettiques, diaphragme, coeur et organes filtres correspondant au poumon, foie, rein et rate, et comporteront au moins 4 fragments par tissu. Seuls les animaux reproducteurs, au nombre de 40, seront maintenus en vie pour maintenir la production de l'élevage de rats DMDmdx.

Remplacement

Il ne sera pas possible dans cette étude dans la mesure où il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pertinente et robuste pour tester l’effet d’un traitement de médecine régénérative in vivo. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact de cette thérapie dans différents organes et sur le phénotype de l’animal malade.

Réduction

Le nombre d’animaux qui a été fixé par groupe dans les 3 parties du projet repose sur notre expérience précédente dans la mise en place de protocoles de médecine régénérative lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Ainsi, ces nombres, validés par un agent agrégé en biostatistiques, sont minimaux et permettent d’assurer la robustesse (au sens de l’analyse statistique) des résultats sans être excessif en termes d’animaux à inclure. Les jeux de données acquis seront analysés selon des modèles linéaires généralisés qui pourront être complétés par des analyses multivariées type « analyse factorielle multiple - AFM. Par ailleurs, le projet a été structuré en 3 parties séquentielles afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux dans le sens où les parties I (biodistribution) et II (preuve de concept) seront déterminantes pour la suite du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement (3R), le bien-être animal passera par : - de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois et hébergement à deux animaux). - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), - l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie), - une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille d'évaluation de la douleur par une liste de comportements /constatations à évaluer dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates - la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie).

Choix des espèces

Les modèles animaux de la DMD les plus souvent utilisés sont des modèles rongeurs et plus spécifiquement le modèle de la souris mdx. Ce modèle souffre néanmoins de sérieuses limitations, notamment la mise en place de mécanismes de compensation aboutissant à des lésions musculaires très limitées et une faiblesse musculaire quasiment inexistante. Ces éléments limitent grandement la transposition des résultats obtenus sur ce modèle à l’Homme. Le chien Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. Ainsi, le choix du modèle de rat DMDmdx s’avère pertinent dans le sens où ce dernier présente un phénotype fonctionnel et tissulaire proche de celui décrit chez le patient DMD, caractérisé par une nécrose des fibres musculaires, une fibrose, une adipose ainsi qu’une faiblesse musculaire et une cardiomyopathie dilatée. Les rats seront inclus à l’âge 2 mois afin de se placer dans un contexte de lésion musculaire suffisamment avancé pour pouvoir détecter un éventuel effet sur la fonction musculaire et/ou le remodelage tissulaire. Par ailleurs, la mortalité des rats DMDmdx étant observée particulièrement à partir de 8 mois d’âge, il était important que l’inclusion des animaux se fasse précocement pour être en mesure d’avoir un suivi de l’impact éventuel sur une période satisfaisante mais aussi de possiblement observer une répercussion sur la durée de vie des animaux traités.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par un parasite intestinal par voie orale, reçoivent des injections, sont mises à jeun, puis subissent une chirurgie du ventre sous anesthésie sans réveil pour prélever le contenu de l'intestin. Le porteur affirme que la balance "bénéfice/risque" est "clairement favorable" et présente l'enjeu comme une piste de santé publique contre les parasites. Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui d'étudier ces interactions et qu'il privilégiera les modèles ex vivo quand c'est possible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est simple, et consiste à démontrer que certaines cellules épithéliales du tractus digestif, nommées cellules tuft, sont capables de produire des composés antiparasitaires. Cette démonstration est d’une importance majeure en termes de santé, puisqu’ouvrant la voie à de nouvelles pistes en matière de lutte contre les parasites, qui touchent des millions de personnes dans le monde. Nos données obtenues montrent clairement que les souris dont les cellules tuft sont dans l’incapacité de produire de l’acétylcholine sont très sensible aux infections parasitaires. L’idée de ce projet consiste à montrer le lien direct entre cellules tuft, acétylcholine et ciblage des parasites, en démontrant spécifiquement la présence d’acétylcholine produite au sein de l'intestin. Notre stratégie expérimentale consistera à infecter des souris avec un parasite classiquement utilisé comme modèle expérimental, utilisé avec succès dans notre équipe par le passé. Nous doserons, en fin de procédure, le taux d’acétylcholine produite, via une procédure contrôlée sous anesthésie générale, pour récupérer le contenu intestinal. Ce travail devrait nous permettre de revisiter les modalités de la réponse de l’hôte contre des parasites entériques, dans une étude originale et potentiellement impactante en termes de santé publique.

Bénéfices attendus

La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Cette procédure nous permettra d’obtenir les données nécessaires pour démontrer le rôle des cellules tuft comme cellules productrices de composés antiparasitaires. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, les infections entériques avec des parasites touchant des millions de personnes dans le monde.

Procédures

Contention lors de l'étape d'infection parasitaire, administration de substances par voie intra-péritonéale, procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les étapes susceptibles d’être une source de stress pour les souris sont principalement celles de l’inoculation des parasites par voie orale, les injections de substances par voie intra-péritonéale, la mise à jeun de 4 heures, la réaction immunitaire liée à l'infection parasitaire, ainsi que la procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les tissus digestifs et la ponction luminale.

Remplacement

Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains parasites. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse lors d’une précédente étude, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. De manière claire, toute possibilité d’utilisation des modèles ex vivo sera priorisée pour compléter les données acquises avec cette étude.

Réduction

A ce jour, nous avons le recul nécessaire d’un projet précédent, ce dernier nous ayant permis d’obtenir des données encourageantes. Les résultats seront obtenus via des analyses statistiques comparant la réponse antiparasitaire de nos groupes d'animaux. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction du nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité, selon des points limtes ayant été précdemment validés et déterminés. Afin de réduire le stress pendant les infections, les animaux seront anesthésiés. La phase expérimentale de prélevement durera 60 minutes, sous anesthésie générale contrôlée dans le cadre d’une procédure de chirurgie sans réveil. Cette procédure sera réalisée avec des substances anesthésiques, un analgésique local, ainsi qu'un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal.

Choix des espèces

Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l'homme et nos modèles génétiquement modifiés nous permettent de répondre à nos questions et finaliser notre étude. Ces dernières seront utilisées à l'âge de 8 semaines, lorsque le système digestif est mature.