Rongeurs
Identification de biomarqueurs et étude de thérapies ciblées contre la leucémie aiguë à partir d’un modèle murin de xénogreffe
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 440 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou intra-tibiale, puis subissent des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à trente-six ponctions étalées sur dix-huit mois. Le projet vise à anticiper la rechute de patients atteints de leucémie aiguë en amplifiant leurs cellules chez la souris pour tester des médicaments. Le porteur affirme que ni les cellules de patients en culture ni les lignées cellulaires ne conviennent et conclut que la xénogreffe reste le modèle "indispensable".
Objectifs
Les leucémies aiguës sont des cancers agressifs et rares du sang. Les rechutes surviennent dans ~40% des cas et sont presque systématiquement mortelles à défaut de traitement codifié efficace. Pourtant de nouveaux traitements émergent, en particulier les thérapies ciblées. Mais nous ne savons pas quels patients peuvent en bénéficier en situation de rechute. Il est impossible de de réaliser des tests de nouveaux médicaments directement sur la leucémie du patient. La seule méthode actuellement validée dans la littérature est d’injecter les cellules leucémiques du patient au diagnostic dans un modèle de souris immunodéprimée pour amplifier les cellules leucémiques et modéliser la rechute. Aussitôt la greffe obtenue et la leucémie amplifiée, l’expérimentation est arrêtée pour récupérer les cellules leucémiques et réaliser les tests de drogues en laboratoire dont il est établi qu’ils sont parfaitement corrélés avec la réponse thérapeutique du patient en rechute. Il s’agit par conséquent d’anticiper la rechute avec ce modèle afin de proposer au patient un traitement efficace aussitôt qu’il rechute. Nous n’injecterons chez les souris que des leucémies pour lesquelles nous avons identifié qu’elles étaient à haut risque de rechute (~40% des patients).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus se situent à deux niveaux. Le premier niveau est individuel : nous pourrons identifier avant même la survenue de la rechute du patient un traitement prédit efficace par le modèle qui pourra alors être proposé dès la rechute du patient. Le deuxième niveau est collectif : nous pourrons corréler les données de ce modèle avec d’autres informations biologiques collectées dans le laboratoire afin d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité à chacune des thérapies ciblées. C’est un atout majeur, car les patients qui rechuteraient sans avoir bénéficié d’un tel modèle pourront disposer d’un traitement ciblé sur la base de ces biomarqueurs ; et nous pourrons ne plus utiliser le modèle murin lorsque nous aurons identifié des biomarqueurs capables de se substituer à l’utilisation du modèle animal.
Procédures
Injection de cellules leucémiques dans la veine caudale (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile contentionnée, sous anesthésie locale : 1 injection unqiue/souris (durée : 30sec). Injection de cellules leucémiques par voie intra-tibiale (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 injection unique/souris (durée 2 min). Prise de sang au niveau de la veine sub-mandibulaire (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile : 2 fois par mois, puis 1 fois par semaine (durée : 30 sec) jusqu'à atteinte d'un point limite (maximum : 36 prélèvements de 30 sec étalés sur 18 mois). Prise de sang au niveau intra-tibial (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 fois/mois à partir de 3 mois après injection des cellules leucémiques (durée : 2 min, maximum : 15 prélèvements de 2 min étalés sur 18 mois).
Impact sur les animaux
Les éventuels nuisances/effets indésirables peuvent se produire à 3 niveaux : -1/injection (éventuelle douleur post-injection, rapidement résolutive). -2/prise de greffe (éventuelles douleurs, perte de poids, changement de comportement). -3/monitorage biologique (éventuel stress momentané). -4/Le cas échéant, survenue de pathologies liées à l'âge.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les cellules leucémiques de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des médicaments innovants. Ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour les besoins des expériences. L’utilisation de lignées cellulaires de leucémies aigues ne constitue pas une alternative, car elles ne représentent pas les spécificités individuelles des patients. Le modèle murin est le seul pertinent dans cette étude pour modéliser la rechute des patients individuels dans le cadre de la médecine personnalisée. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de xénogreffes dérivées de patients reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des leucémies aiguës, et pour tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme rapporté dans la littérature scientifique.
Réduction
6 prélèvements de patients à haut risque de rechute seront reçus par mois. La prise de greffe se produit pour environ 50% des souris injectées. Pour chaque patient, il est nécessaire de récupérer les cellules leucémiques provenant de 2 souris pour espérer avoir suffisamment de cellules leucémiques pour tester notre panel de médicaments innovants en duplicats et ainsi avoir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, afin de maximiser les chances de greffe et pour espérer obtenir suffisamment de cellules pour tester leur sensibilité aux traitements innovants, les cellules leucémiques de chaque patient seront injectées dans 4 souris âgées de 8 à 12 semaines (âge auquel le taux de prise de greffe est le plus haut).
Raffinement
Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux : Les cages sont ventilées et enrichies à l’aide de cotons, petits bouts de bois et tunnels rouges, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera assuré par un zootechnicien Les responsables du projet tiendront une fiche d'observation des points limites 1 fois/semaine ou plus, si un animal présente des signes de mal-être ou de souffrance. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques au niveau de la veine caudale se fera sous anesthésie local. Les injections et prélèvements au niveau intra-tibial seront effectués sous anesthésie gazeuse (durée totale d'environ 2 minutes) avec couverture antalgique générale (30 min avant l'injection/prélèvement) et locale (immédiatement avant et après l'injection/prélèèvement) au point d'injection. Les prélèvements au niveau de la veine sub-mandibulaire et au niveau tibial pour le suivi de la prise de greffe seront réalisés en alternant successsivement les côtés gauche et droit pour chaque souris.
Choix des espèces
Voici les facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) Les souris immunodéprimées ont été abondamment décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouveau traitements. 2) L'hématopoïèse (=la fabrication des cellules du sang) et la leucémogénèse (=l'apparition de la leucémie) ont été largement étudiés chez la souris. Nous pourrons donc analyser nos résultats à la lumière de toute cette connaissance accumulée chez la souris. 3) Leur durée de vie est particulièrement adaptée par rapport à la cinétique de prise de greffe et pour un programme de recherche sur 5 ans. 4) Les 2 sexes seront utilisés sans distinction car il n'y a pas d'influence des hormones sexuelles sur la survenue des leucémies. Afin de maximiser les chances de greffe et d'obtenir suffisamment de cellules, chaque prélèvement de patient sera injecté dans 4 souris, âgées de 8 à 12 semaines (car présentent le plus haut taux de succès de prise de greffe).
Entretien du caractère de virulence de souches de Mycobacterium ulcerans chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
123 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection sous-cutanée de Mycobacterium ulcerans dans la queue, la bactérie de l'ulcère de Buruli, avant le prélèvement de son tissu cutané après sa mise à mort à 45 jours. Le porteur indique que ce protocole n'est pas de la recherche mais l'entretien de la virulence de souches bactériennes, les souris étant utilisées pour régénérer des bactéries que la culture artificielle rend incapables de produire leur toxine. Il qualifie ce recours d'"indispensable" et décrit l'infection comme indolore, en s'appuyant sur trente ans de pratique.
Objectifs
L’ulcère de Buruli ou infection à Mycobacterium ulcerans est la troisième mycobactériose dans le monde. Cette maladie handicapante causée par M. ulcerans sévit principalement dans les zones tropicales humides de l’Afrique de l’ouest et centrale. Pour lutter contre cette maladie aux conséquences socio-économiques dramatiques, il est nécessaire de développer des approches prenant en compte les spécificités de cette maladie. Elles exigent le développement de projets globaux intégrant différentes facettes de la biologie du bacille. M. ulcerans sécrète une toxine appelée mycolactone. La mycolactone est une toxine lipidique qui est indispensable à la bactérie pour coloniser ses hôtes vertébrés ou invertébrés. Elle présente divers effets biologiques dont les principaux sont l’immunomodulation et l’analgésie. Dans ce contexte, nos projets s’articulent autour de trois axes : - Etudes de la régulation de la synthèse de la mycolactone dans des modèles in vitro puis in vivo - Identification des stratégies déployées par le bacille pour coloniser ses hôtes à l’échelle cellulaire et d’organismes entiers. - Etudes des effets analgésiques de la mycolactone. Ainsi, il nous est donc indispensable d’utiliser des souches produisant la mycolactone. Le génome de M. ulcerans possède plus de 260 séquences d’insertions, qui en raison de leur mobilité rendent les souches incapables de produire la mycolactone après 2-3 passages (repiquages) sur des milieux de culture artificiels, et donc les souches « perdent » leur virulence. A ce jour, malgré nos efforts (recherche de milieux sélectifs…), l’unique moyen de conserver la capacité des bactéries à produire la mycolactone est de réaliser des passages successifs chez l’animal (souris). Depuis trente ans nos souches sont entretenues par ce moyen. Sans recours à l’animal, nous ne pourrions plus développer nos projets de recherche, tout particulièrement ceux utilisant des approches in vitro (limitant l’utilisation d’animaux) ou requérant de la mycolactone purifiée. Ainsi notre présente demande n’est pas d’un projet de recherche sensu stricto mais d’un protocole requérant l’utilisation d’animaux pour obtenir des souches bactériennes « virulentes » qui seront utilisées pour nos différents projets de recherche tout particulièrement pour développer des approches in vitro permettant de limiter l’utilisation d’animaux.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce protocole n’est pas direct puisqu’il ne s’agit pas d’un projet de recherche. Mais il est indispensable à l’ensemble de nos projets de recherche visant à (i) étudier l’effet analgésique de la mycolactone (nouvel analgésique) (ii) comprendre la physiopathologie de l’infection à M. ulcerans incluant les systèmes de régulation de la synthèse de la mycolactone.
Procédures
Pour ce protocole, la nuisance prévue est l’inoculation en sous cutanée de 50 µL d’une suspension contenant M. ulcerans. Pour limiter cette nuisance l’injection se fera sous anesthésie gazeuse. La colonisation des tissus cutanés (uniquement autour du site d’injection) induit une inflammation non douloureuse puisque M. ulcerans produit une toxine aux propriétés analgésiques puissantes (rendant les lésions indolores). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animal vigile. Les prélèvements des tissus cutanés seront effectués 45 jours post inoculation sur des animaux morts. Les animaux subiront une unique injection sous cutanée, (seringue 1mL, aiguille 26G) lors de l’inoculation bactérienne sous anesthésie générale (isoflurane). La durée de l’injection en sous-cutanée dans la queue dura moins de 20 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’injection. L’injection peut produire une douleur légère. Pour atténuer cette douleur, l’injection en sous cutanée se sera sous anesthésie gazeuse. Le risque majeur est lors de l’inoculation de M. ulcerans, où une surinfection peut survenir dans les jours qui suivent. Selon notre expérience (sur 30 ans) les cas de surinfection sont rares ( 2°C à la normale, l’animal sera euthanasié. Si la température est normale mais que le comportement de l’animal ne redevient pas à la normale dans les 48h, l’animal sera mis à mort. Il est à noter que la mycolactone produite lors de l’infection présente un effet analgésique rendant les lésions indolores. Ainsi, nous n’avons jamais observé de gêne chez les animaux infectés par M. ulcerans (perte de poids, changement de comportement).
Devenir
Le but de ce protocole est de prélever le tissu cutané de la queue infectée par M. ulcerans. Dans ce contexte tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. L’utilisation de ces animaux permet de fournir du matériel à l’ensemble des projets de l’équipe permettant ainsi de réaliser de nombreuses expériences/criblage in vitro limitant ainsi l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce protocole est suffisant pour satisfaire l’ensemble des projets de recherche qui en dépendent. Il s’agit là d’un entretien de souche. Ce protocole ne requière pas d’utilisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors de l’inoculation dans la queue, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé et le geste réalisé par une unique personne qui pratique régulièrement cette procédure (le porteur de projet). Il est important de souligner que la colonisation du tissu cutané par M. ulcerans est indolore. En effet, le bacille produit une toxine qui présente des propriétés analgésiques rendant le site infectieux hypo-esthésique. Les animaux subiront une surveillance accrue les 15 premiers jours post inoculation pour surveiller le risque de surinfection lié à l’inoculation (rarement observé ;
Choix des espèces
L’espèce souris est un très bon modèle pour étudier l’infection à M. ulcerans puisque cette espèce est « très sensible à l’infection ». Nos études antérieures ont montré que l’injection de moins de 10 bacilles était suffisante pour permettre une colonisation. De plus, le développement de l’infection est très homogène. Les souris utilisées peuvent être indifféremment des Balb/c ou des Swiss. Nous utiliserons donc souris des Balb/c ou des Swiss en fonction des disponibilités dans les élevages. Les animaux utilisés pour ce protocole devront être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire) minimum.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anti-tabac par une méthode d’imagerie médicale, la tomographie par émission de positons.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est exposée aux fumées de cigarette deux heures par jour, cinq jours sur sept pendant quatre semaines, puis toutes subissent trois séances d'imagerie TEP sous anesthésie et l'injection d'un vaccin anti-tabac, pour mesurer les effets de quatre vaccins en développement. Les retombées annoncées se limitent à compléter une étude clinique en cours, l'objectif immédiat restant l'imagerie du métabolisme cérébral. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut modéliser ces mécanismes et conclut que le recours à l'animal est "nécessaire".
Objectifs
Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts dans le monde chaque année et est reconnu comme un fléau mondial. Il est la première cause évitable de mortalité en France. La lutte contre le tabagisme est une priorité de santé publique. A ce jour, les options pharmacologiques pour arrêter le tabac sont limitées. Un vaccin anti-tabac, qui permettrait de faciliter le sevrage tabagique, serait novateur dans la lutte contre le tabagisme. L’objectif de ce projet est de mesurer les effets de différents vaccins anti-tabac (4 au total) en cours de développement par une approche d’imagerie non-invasive, la tomographie par émission de positons (TEP), qui offre la possibilité d’explorer in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement cérébral, notamment les modifications du métabolisme cérébral en présence et en absence d’une addiction au tabac (avec et sans vaccin anti-tabac). Cette étude sera menée chez un modèle murin : des animaux seront exposés deux heures par jour aux fumées de cigarette pendant 4 semaines puis la moitié recevra une dose de d’un vaccin anti-tabac.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude complèteront une étude clinique en cours et fourniront de nouvelles informations sur l'utilisation de certains vaccins anti-tabac pour faciliter le sevrage tabagique.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : Mise à jeun 6h avant l’imagerie • Réalisation 3 sessions d’imagerie (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 60 minutes au maximum) • Pour la moitié des animaux, exposition quotidienne aux fumées de cigarette (2 heures par jour, 5 jours sur 7 pendant 4 semaines). • Injection d’un vaccin anti-tabac (durée 10 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Mise à jeun 6h avant l’imagerie pouvant entrainer une perte de poids inférieure à 5%. • Exposition quotidienne aux fumées de cigarettes entrainant une perte d’appétit (ralentissement de la courbe de prise de poids) et une irritation des voies respiratoires. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en présence et en absence à une addiction au tabac en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc.., afin d’évaluer le métabolisme cérébral par le radiotraceur avec et sans vaccin anti-tabac n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier le métabolisme cérébral par le radiotraceur avant et après vaccin anti-tabac.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux tout au long de l'expérience ; chaque animal est son propre témoin, ce qui divise par 3 le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les rongeurs seront hébergés par groupes. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. Cette espèce fait partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études sur le tabac. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser l’exposition au tabac ainsi que d'évaluer les différents effets des vaccins testés. Les animaux seront des adultes âgés de 10-11 semaines, étant donné que nous sommes intéressés aux effets cérébraux du tabac à l'âge adulte.
Effet des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma sur le développement à long terme de pathologies cardiovasculaire (cœur/poumon) et troubles du rythme associé chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation gamma du corps entier, que le porteur décrit comme indolore, puis des échographies cardiaques sous anesthésie, des passages sur tapis de course, des mesures de pression à la queue sous contention et une stimulation transœsophagienne. Une perte de plus de 20 % du poids déclenche la mise à mort, et toutes sont tuées en fin d'étude pour prélever cœur et poumons. Le projet cherche à mimer l'exposition de populations vivant en zone contaminée après un accident nucléaire, afin d'alimenter les normes de radioprotection.
Objectifs
Actuellement, des résultats préliminaires de notre précédentes étude ont mis en évidence un effet des doses faibles à modérées (inférieur ou égal à 500mGy) sur le développement d’arythmies atypiques à long terme et également l’observation d’un remodelage des vaisseaux pulmonaires. Il parait alors intéressant de vérifier le rôle du système nerveux sympathique et de l’hypertension artérielle pulmonaire sur la physiologie et le maintien de la fonction cardiaque. Notre l'hypothèse est qu’il existe un seuil pour lequel nous avons le développement de maladies cardiovasculaires et également des troubles du rythme dans le contexte de l’exposition faible à modérée et que cette pathologie cardiaque à long terme est due à un dysfonctionnement du système nerveux sympathique ou un remodelage vasculaire pulmonaire. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le cœur et les vaisseaux du poumon seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur le système vasculaire (pulmonaire et cardiaque), le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection. Il s’agit d’un projet multi-site se déroulant sur 3 EU différents.
Procédures
Les animaux subiront une irradiation corps entier à des doses faibles n’entrainant ni douleur, ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après celle-ci. Des échographies seront réalisées sur les animaux sous anesthésie (1 fois par mois). Cette mesure sera prise 1 fois par mois à une semaine d’intervalle avec les échocardiographies pour limiter le stress et biaiser la mesure de pression artérielle. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Certaines échographies seront précédées d’un temps limité sur un tapis de course (10 min sur le tapis roulant). La mesure de pression artérielle sera réalisée à la queue sur souris vigiles. Le ballonnet est gonflé puis dégonflé pour prendre la mesure, le tout pendant 2-3 min. Les mesures sont répétées 10 fois. Les souris sont d’abord habituées avec une série de 10 mesures par jour pendant 5 jours, avant la première prise de mesure qui sera prise en compte. Et enfin une seule mesure de stimulation transoesophagienne sous anesthésie sera également réalisée une semaine avant la fin de la procédure pour se rendre compte d’un potentiel trouble du rythme.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Néanmoins un stress des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation et lors des mesures de pression artérielle même s’il y a habituation au tube à contention. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections. Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui seront réalisés sous anesthésie générale, n’entrainant pas de douleur pour les animaux.
Devenir
A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer l’exposition corps entier de résidents vivants en zone contaminée après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (cardiomyocytes et fibres nerveuses). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique comme la régulation de la pression artérielle ne peuvent être évalués qu'in vivo, tout comme l’évaluation de la fonction cardiaque, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. Néanmoins pour une partie du projet, dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 252 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 15 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Néanmoins si on considère une mortalité possible due à la longévité des souris pour nos groupes qui seront gardés pendant 3 mois et 9 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 18 animaux pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 15 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont pesés régulièrement. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite, ainsi que l’observation des certains signes d’atteinte de l’état général.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies cardiovasculaires (hypertension artérielles pulmonaire, cardiomyopathies) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Des souris C57BL/6 males seront utilisées pour notre projet afin de pallier les effets cardioprotecteurs des hormones comme les œstrogènes. Néanmoins lorsque nous aurons des résultats sur les mâles et si ceux-ci sont significatifs, nous pourront prévoir la réalisation de ces mêmes expériences sur des souris femelles.
TESTER L’EFFICACITE ANTI-TUMORALE D’ANTICORPS OU CANDIDATS MEDICAMENTS THERAPEUTIQUES DANS UN MODELE ORTHOTOPIQUE DE CANCER DU SEIN
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de tumeur mammaire humaine leur sont greffées sous anesthésie, puis elles reçoivent des injections répétées d'anticorps ou de candidats médicaments, jusqu'à une ou deux fois par jour pendant trente jours, ainsi que des prélèvements sanguins. Le porteur signale une perte de poids, une baisse de locomotion et des complications post-chirurgicales liées au développement de la tumeur. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs et organes, le porteur jugeant "indispensable" le recours à la souris faute de modèle reproduisant l'environnement tumoral humain.
Objectifs
Le projet faisant l’objet de la présente demande correspond à l’études précliniques dans un modèle tumoral mammaire chez la souris. Ce projet a pour objectif scientifique et technique de mettre en place et d’utiliser des modèles tumoraux mammaires chez la souris afin de tester l’efficacité d’anticorps ou de candidats médicaments et ainsi permettre d’accélérer le passage des résultats de la recherche fondamentale vers la clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet va donc consister à la mise en place et l’utilisation au sein de notre animalerie de modèles orthotopiques mammaires en transplantant des cellules tumorales humaines, modifiées ou non génétiquement, permettant ainsi de mesurer l’efficacité des anticorps candidats médicaments. Il permettra ainsi de valider ou non l’intérêt d’un transfert vers la clinique pour ces anticorps/candidats médicaments.
Procédures
Durant les expériences les animaux peuvent être soumis: - à des transplantations de cellules tumorales sur animaux anesthésiés réalisées en 30min par animal (1640animaux max), - à des injections d’anticorps/candidats médicaments sur des animaux vigiles ou sous anesthésie gazeuse. Ces injections sont réalisées 1-3x/semaine sur1 à 8 semaines en 2-5 min/animal ou 1-2x/jour pendant 30 jours max en 2 min/animal selon la voie d'injection choisie sur 1640 animaux, - à des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou anesthésiés et à des fréquences variables (de 1-3x/semaine pendant 4 semaines) d'une durée de 5 min/animal. Nous envisageons de réaliser ces prélèvements sur 1640 animaux.
Impact sur les animaux
Suite à la procédure que nous réalisons dans ce projet, les animaux peuvent subir: - du stress lié à la manipulation des animaux lors des différentes injections, à l’anesthésie chimique, aux mesures de tumeurs au pied à coulisse ou par imagerie, - une perte de poids et de locomotion suite au développement de tumeur ou à un effet toxique des anticorps/candidats médicaments testés, -une déshydration suite à une anesthésie gazeuse, -des douleurs et complications post-chirurgicales suite à un acte chirurgical.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et dès que cela est possible des prélèvements de tumeurs, d’organes et de sang peuvent être réalisés pour être analysés immédiatement ou pour être stockés. Ce stockage pourra permettre d’obtenir une collection d’échantillons exploitables ultérieurement et ainsi éviter la réalisation de nouvelles procédures expérimentales.
Remplacement
L’utilisation des animaux (souris) lors de ces dernières phases des études précliniques pour tester l’efficacité de candidats médicaments est indispensable car aucun modèle de substitution ne permet à l’heure actuelle de recréer un environnement assez proche de celui retrouvé chez l’homme pour le développement tumoral. En effet, le développement tumoral implique des mécanismes et une complexité tissulaire impossible à reproduire à ce jour dans un autre modèle de substitution. Ainsi, seuls des modèles animaux adaptés permettent de reproduire un environnement proche de celui de l’homme qui est un élément crucial dans la réponse thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant à la fois sur les données de la littérature, des expériences « pilotes » et un test statistique de puissance. Ne seront injectés aux souris que les anticorps pour lesquels un effet thérapeutique des anticorps aura été observé au préalable. Le suivi de l’effet des anticorps testés sera évalué au cours du temps par des méthodes peu invasives. Toutes les procédures expérimentales effectuées seront recensées numériquement sur le serveur permettant d’avoir une traçabilité et un suivi des expériences menées, incluant les souris utilisées, les anticorps testés, les résultats obtenus et leurs interprétations ainsi que toute observation ou information pouvant être utile par la suite.
Raffinement
Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (Twist et coton plat), maintien des animaux en groupes de 4 à 5 afin d’éviter l’isolement et une période d’acclimatation de 7 jours est respectée systématiquement avant les manipulations. Afin d'atténuer la douleur chez l'animal, nous avons recours aux analgésiques ainsi qu'à l'anesthésie gazeuse et chimique lors de certains gestes techniques. Durant toute la durée d'une expérience, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement pour s’assurer : des conditions adéquates de stabulation (paramètres environnementaux, litière, alimentation, boisson) et de l’état de santé des animaux (comportement, aspect physique), pesé 2 fois par semaine en temps normal et quotidiennement en cas d’apparition des premiers signes de détresse chez l’une des souris de l'expérience.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce animale de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. Sur cette base, et en adéquation avec nos objectifs le modèle souris apparaît le plus pertinent. L’utilisation d'animaux (souris) permettra d’avoir un environnement permissif au développement tumoral et d’effectuer des greffes de cellules tumorales mammaires humaine chez un individu d’une espèce différente (souris) afin de tester l’efficacité des anticorps ou composés candidats médicaments. Enfin, la maîtrise zootechnique (élevage/confinement), les connaissances actuelles et la diffusion d’information dans le domaine scientifique font que le modèle murin est le plus adapté à la réalisation des objectifs de ce projet. Afin d’avoir un tissu épithélial mammaire bien développé et limiter les biais dans l’expérimentation dus à des animaux à des stades de développement différents, les animaux utilisés seront des souris femelles âgées de 6 à 10 semaines.
Modèles chirurgicaux chez les rongeurs et lagomorphes
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7500
Cochons d'Inde : 1500
Hamsters dorés : 750
Hamsters de Chine : 750
Lapins : 1500
15 000 rongeurs et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Souris, rats, cochons d'Inde, hamsters et lapins subissent des chirurgies destinées à induire une pathologie, dont délétion osseuse pour créer de l'arthrose, plaie cornéenne, plaie cutanée, extraction de dents ou pose d'un cathéter jugulaire, avant application d'une substance test. Le porteur reconnaît douleurs, boiteries, difficultés à s'alimenter et parfois automutilation, puis tue tous les animaux pour analyses. Ces modèles servent à tester substances et dispositifs médicaux pour l'industrie pharmaceutique, présentés comme un préalable au test sur l'humain.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différentes chirurgies chez les rongeurs et les lagomorphes pour induire une pathologie, comme l’arthrose, ou mettre en place des modèles de transplantation, ou encore pratiquer des administrations intraveineuses répétées en perfusion, afin d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux, pour l’industrie pharmaceutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies par chirurgie afin de tester une substance ou un dispositif médical sur des modèles expérimentaux correspondants. In fine, le bénéfice attendu est de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme.
Procédures
Tous les animaux sont anesthésiés et analgésiés avant le début de la chirugie. Pour les modèles de délétion osseuses, les animaux subissent une délétion au niveau des lombaires ou de la trochlée fémorale. Pour le modèle de plaie cornéenne, les animaux subissent une lésion de la cornée avec application d'une substance test. Pour le modèle de plaie cutanée, les animaux subissent une lésion au niveau de la peau avec application d'une substance test. Pour le modèle de chirurgie dentaire, les animaux subissent le retrait d'une ou plusieurs dents, suivi de l'application d'une substance test. Pour le modèle de cathétérisation jugulaire, on met en place un dispositif vasculaire au niveau du cou permettant l'injection d'une substance test. En fonction des projets, différents prélèvements sanguins peuvent être réalisés. A l'issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.
Impact sur les animaux
Les modèles de délétion osseuse peuvent générer de la douleur et des boiteries modérées à plus ou moins long terme. Le modèle de plaie cornéenne peut générer une douleur modérée et une sensibilité ophtalmique jusqu’à cicatrisation. Le modèle de plaie cutanée peut générer une douleur modérée, une sensibilité dermique et une réaction inflammatoire jusqu’à cicatrisation. Le modèle de chirurgie dentaire peut générer une douleur modérée, une réaction inflammatoire, des difficultés à s’alimenter et se toilleter jusqu’à cicatrisation. Le modèle de cathétérisation jugulaire peut générer une douleur modérée et de l'incofort lié au dispositif pendant toute la durée de l’étude. Ces effets peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, auto-mutilation, …). Ces effets sont limités dans le temps et ne dépassent pas deux semaines.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement non clinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe : - Développement du modèle sur un petit nombre d’animaux, inférieur à 10 - Validation du modèle sur un plus grand nombre d’animaux - Etude pilote : application de la substance test sur un petit nombre d’animaux - Etude réglementaire : application de la substance test sur un nombre d’animaux permettant une analyse statistique représentative. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre instalaltion. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel, comme décrit dans les procédures internes. La distribution des données sera vérifiée et les tests statistiques seront sélectionnés en fonction de la normalité des données. Afin de réduire le nombre d’animaux, des échantillons de sang, d’urine, de salive, de LCR, de fécès ou des organes peuvent être prélévés pour des analyses à posteriori.
Raffinement
Pour les rongeurs, de l’enrichissement comme des batonnêts à ronger, des huttes/tunnels et du papier kraft sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Pour les lapins, des bâtonnets à ronger et/ou du foin sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés par un ou deux, entre animaux socialement compatibles. Pour la chirurgie, une anesthésie générale, adaptée en fonction des espèces, est réalisée. Une couverture analgésique adaptée est appliquée et évaluée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids des animaux est enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids est évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal ou du poids maximal de l’animal si celui-ci n'est pas adulte au début de l’étude. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale après chaque traitement peut être réalisée. Une observation accrue des animaux est réalisée 2 à 6 heures après les traitements. Des points limites adaptés sont mis en place.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Les lagomorphes sont des mammifères de taille moyenne ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur métabolisme ainsi que la taille des organes font de cette espèce un modèle pertinent pour l’évaluation de certains produits. De plus, le modèle lapin permet comparer les résultats au modèle rongeur. En fonction des essais et études réglementaires (lié aux caractéristiques de la substance ou du dispositif testé), les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Environ une souris sur cinq de la partie service, celles dont le sang compte moins de 25 % de globules blancs humains, est mise à mort dans les jours qui suivent le contrôle qualité, les autres étant expédiées à des laboratoires. 5 120 souris immunodéficientes de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le champ structuré en déclare 5 000 réutilisées, soit 120 seulement mises à mort. Elles reçoivent une molécule chimique deux jours de suite ou une irradiation de 218 secondes, puis une injection intraveineuse de cellules souches humaines sous anesthésie, et jusqu'à neuf prises de sang en 23 semaines pour les nouvelles lignées, dont les souris sont tuées à l'issue de 32 semaines. Six mois après la greffe, environ 5 % des souris maigrissent, blanchissent aux extrémités et perdent leur énergie. Le porteur décrit une production destinée à "un large panel d'utilisateurs finaux", académiques et industriels, et range le transport jusqu'à eux parmi les sources de stress.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Bénéfices attendus
Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).
Procédures
Aucune procédure chirurgicale ne sera faite sur les animaux dans cette demande. Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.
Devenir
Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >25% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux. Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).
Remplacement
Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.
Réduction
Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. Le projet utilisera des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines) pour une meilleure prise de greffe.
Etudes préliminaires des mécanismes d’action sous-tendant l’effet anti-épileptique de GAO-3-02
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche pharmacologiquement, sur animal vigile, soit une crise convulsive généralisée suivie pendant trente minutes puis interrompue par la mise à mort, soit un état de mal épileptique arrêté au bout de trente minutes. Tous les rats sont tués pour prélever leur cerveau et mener des analyses ex vivo. Le porteur revendique un "besoin fort" de nouveaux antiépileptiques et affirme que ni les modèles in vitro ni in silico ne peuvent reproduire les crises et les comportements associés.
Objectifs
Les épilepsies regroupent un ensemble de syndromes neurologiques se caractérisant par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, allant des absences aux convulsions. Leur origine peut être génétique mais le plus souvent elle est associée à une agression cérébrale sévère initiale, telle qu'un traumatisme crânien, une infection, ou un état de mal épileptique (EME). Bien qu’une épilepsie puisse se manifester à tout moment de la vie, les pics d’occurrence sont observés avant l’âge de 20 ans et après 60 ans. Plus de 20 médicaments sont disponibles pour contrôler les crises. Toutefois, un patient sur trois continue d’en faire malgré la prise de médicaments, et un grand nombre de ceux dont les crises sont contrôlées par ces médicaments se plaint de comorbidités affectant gravement leur qualité de vie. Il existe donc un besoin fort et urgent de développer de nouveaux candidats médicaments permettant non seulement de contrôler les crises pour ceux qui ne répondent pas aux médicaments, mais aussi de réduire le degré d’inconfort qui compromet une bonne observance thérapeutique. Le candidat médicament CM1 a été récemment développé pour répondre aux besoins non satisfaits des patients. Il s’agit d’un candidat-médicament de nature lipidique, dont le mode d’action diffère totalement des anti-épileptiques classiques. Il possède des effets anti-crises d’épilepsie (occurrence d’une seule crise) et des effets anti-épileptiques (occurrence de plusieurs crises spontanées), tout en protégeant certaines fonctions cognitives. Ces observations ont été réalisées dans le cadre d'un projet précédent. Des études in vitro et ex vivo ont montré : 1) que les effets anti-crises pouvaient passer par une augmentation des processus réduisant l’activité cérébrale ; 2) que l’activation d’un récepteur particulier, appelé ici CM1-R1, pouvait potentiellement être responsable des effets bénéfiques du CM1 ; et 3) que le CM1 pouvait modifier le profil lipidique cérébral. Les objectifs de ce projet sont d'apporter des réponses: 1) quant aux mécanismes par lesquels le CM1 augmente la réduction de l’activité neuronale ; 2) sur l’implication du récepteur CM1-R1 et d’un homologue R2 sur les mécanismes décrits en (1) ; 3) quant aux effets du CM1 sur les mécanismes de neurotransmission GABAergique et Glutamatergique, et l’implication de 2 récepteurs dans ces effets ; et enfin 4) sur les modifications de la composition lipidique cérébrale induites par le CM1.
Bénéfices attendus
Les épilepsies constitutent la seconde maladie neurologique après la migraine, et affectent près de 70 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent, mais malgré cela, près d’un tiers de patients continuent de faire de crises malgré la prise de ces traitements. En outre, parmi les personnes qui répondent aux traitements existants, le ralentissement de l’activité cérébrale qu’ils entrainent constitue un effet secondaire fortement handicapant pour une grande part d’entre elles, réduisant de ce fait l’observance du traitement. II est donc impératif de poursuivre le développement de nouveaux traitements, capables non seulement de réduire le nombre de crises ou leur sévérité, mais aussi de maintenir, voire même d’améliorer les capacités cognitives (mémoire). Le projet s’appuie sur le développement d’un potentiel candidat médicament, CM1, dont il a été montré qu’il exerce une activité anti-crise, anti-épileptique et cela sans altérer, voire même en améliorant, les capacités cognitives. L’objectif de ce projet est d’apporter des premiers mécanismes d’action in vivo de cette molécule, étape indispensable à la poursuite du développement de ce potentiel candidat médicament.
Procédures
Dans la procédure n°1, les animaux utilisés seront des rats soumis à un processus de déclenchement unique d’une crise convulsivante généralisée aiguë, induite pharmacologiquement. Les rats sont obligatoirement vigiles, car dans le cas contraire, aucune crise ne pourrait être induite. Dans les procédures 2 à 4, les animaux utilisés seront des jeunes rats soumis à un état de mal épileptique induit pharmacologiquement. Cette induction pharmacologique se fait sur animal vigile. L’état de mal est stoppé au bout de 30 min. Dans les procédures 2 et 4, il est important de chasser le sang des capillaires sanguins de tout l’organisme, en particulier le cerveau.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur 4 procédures, réalisées sur le rat. Pour la procédure n°1, les crises d’épilepsies généralisées, de classe sévère, seront suivies sur une période n’excédant pas 30 minutes, au-delà desquelles les rats seront euthanasiés. Les rats développent en général les premières crises tonico-cloniques généralisées (GTCS) dans les 10-20 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Si le traitement testé a un effet pro-convulsivant, les rats développeront en moyenne les GTCS avant les 10 premières minutes. Au contraire, si le traitement a un effet anti-crise, les GTCS apparaitront après 20 minutes. Ce modèle, très bien standardisé au niveau international, n’excède pas 30 minutes ; en effet, on considère que l’effet protecteur est total quand aucune GTCS n'est observée dans les 30 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Les procédures 2 à 4 seront réalisées chez le rat après un état de mal épileptique (EME, série de crises convulsivantes en continu sur 30 minutes) induit pharmacologiquement à l’âge de 21 jours. A l’issue des 30 min d’EME, il sera stoppé pharmacologiquement. L’EME induit une douleur de type sévère pendant 3 à 5 jours, pendant laquelle aucun analgésique ne peut être administré en raison du blocage provoqué sur le processus même de développement d’une épilepsie. Sur ces 3 à 5 jours, durant lesquels le poids est contrôlé quotidiennement, les ratons ont une activité réduite, avec dos voussé.
Devenir
Pour la procédure n°1, les rats auront tous été soumis à un protocole d’induction d’une crise convulsivante généralisée. Ils seront tous mis à mort pour éviter de prolonger un état épileptique. Pour les procédures n°2 à 4, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés, soit pour des études histologiques, biochimiques ou électrophysiologiques ex vivo.
Remplacement
Compte tenu du fait que les épilepsies regroupent une diversité de syndromes, il existe à ce jour très peu d’alternatives permettant d’évaluer les différents aspects de la pathologie sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, l’analyse de comportements complexes, comme ceux de l’anxiété et de l’apprentissage spatial, et de surcroît la manifestation de crises épileptiques ne peuvent être appréhendées au niveau préclinique autrement qu’in vivo chez des vertébrés, et ne peut aujourd’hui être remplacée par des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation d’un total de 730 rats sur une durée de 5 ans. Ce nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en ne compromettant pas l’atteinte des objectifs de l’étude. Il a été déterminé à l’aide d’outils statistiques, en tenant compte des résultats d’études antérieures (notamment de la variabilité observée) dans le laboratoire sur ces mêmes modèles. Pour les procédures 1 et 2, des étapes GO/NOGO ont été mises en place. En effet, elles ont pour objectifs d’évaluer l’implication de 2 récepteurs potentiels du candidat médicament testé dans les effets observés. Nous commencerons par tester l’effet du récepteur R1. Si tout l’effet du candidat médicament passe par ce récepteur R1, alors les expérimentations visant à étudier l’implications de R2 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux mâles arriveront suffisamment tôt pour permettre une semaine d'acclimatation avant le début des procédures. Leur poids sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être, pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Plus spécifiquement, pour la procédure n°1, qui dure au maximum 30 minutes, la mise à mort de l’animal sera réalisée dès qu’il a atteint la première crise convulsivante généralisée. Pour les procédures n°2 à 4, l’état de mal épileptique induit par la pilocarpine (Pilo-EME) entraîne une souffrance sévère sur les 3 à 5 premiers jours, avec perte de poids pouvant atteindre 25%. Afin de favoriser le recouvrement, nous maintenons les ratons avec la femelle nourricière jusqu’au terme de ces 5 jours (26 jours d’âge). En outre, nous massons quotidiennement l’abdomen des ratons pour stimuler à nouveau le transit intestinal, temporairement interrompu par l’administration de scopolamine (antagoniste des récepteurs muscariniques centraux et périphériques). Depuis que nous avons introduit ces deux améliorations, le taux de survie des ratons est passé de 75% à 95%.
Choix des espèces
L’ensemble des données antérieures de l’équipe a été obtenu sur des rats Sprague-Dawley. L’utilisation de la même souche de rat nous permettra de comparer les données de ce projet avec celles des études antérieures de l’équipe. Enfin, chaque fois que cela est possible, le rat est choisi à la souris du fait qu’il est physiologiquement, génétiquement et morphologiquement plus proche de l’humain. En outre, son répertoire comportemental, notamment au regard de certaines compétences cognitives, le rend plus pertinent que la souris. Nous travaillons sur des ratons jeunes (3 semaines), car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non génétique) chez l’humain se déclare chez le jeune de moins de 20 ans.
Rôle d’un dysfonctionnement lysosomal dans les pertes de neurones et de synapses dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer reçoivent une injection intracérébrale unique sous anesthésie, avec un risque d'hypothermie, d'arrêt cardio-respiratoire ou de douleurs post-opératoires. Une partie est tuée pour prélever le cerveau, l'autre tuée sans prélèvement pour l'entretien de la colonie. Le porteur cherche à savoir si moduler les lysosomes prévient la perte de neurones et affirme qu'aucune méthode autre que le modèle animal ne permet d'étudier cette dégénérescence.
Objectifs
Au cours de la maladie d’Alzheimer (MA), des pertes de neurones et de synapses se produisent dans des régions particulières du cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Cependant, le mécanisme des pertes neuronales reste mal connu. Des études ont montré une altération des lysosomes, de petits organelles intraneuronaux chargés de la dégradation des protéines. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans la MA pourraient être dues à cette altération des lysosomes. Pour cela nous allons déterminer si des traitements modifiant le fonctionnement des lysosomes permettent de prévenir les pertes de neurones et de synapses dans un modèle murin de MA.
Bénéfices attendus
Les mécanismes des pertes de neurones et de synapses dans la maladie d'Alzheimer (MA) sont encore très mal connus, et ce projet a pour objectif de tester un mécanisme qui pourrait orienter vers une thérapeutique. En effet, ces études permettront de déterminer si une modulation du fonctionnement lysosomal est une cible thérapeutique envisageable contre la MA.
Procédures
Un élevage de souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer présentant des pertes de neurones et de synapses sera effectué. Les souris auront une chirurgie consistant en une injection intracérébrale unique sous anesthésie générale, après avoir reçu l’injection en sous-cutanée d’un analgésique. L'analgésique sera également injecté en post-opératoire. Cette procédure durera une heure. Les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien pour prélèvement et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris APPxPS1-KI développent spontanément une pathologie neurodégénérative avec l'âge, mais elles seront euthanasiées avant l'apparition d'un phénotype dommageable. La contention des souris pour l'injection d'un analgésique avant et après la chirurgie ou avant l'euthanasie peut entraîner peur et stress. La chirurgie effectuée sous anesthésie générale comporte des risques associés à l'anesthésie (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). De plus, les souris pourraient souffrir de douleurs post-opératoires suite à la chirurgie.
Devenir
Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélèvement du cerveau et analyses, et l'autre partie euthanasiée sans prélèvement (maintien de la colonie).
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet ces modèles animaux sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de neurones et synapses adultes se produisant dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Les 700 souris générées permettent (1) de renouveler les reproducteurs, (2) de réaliser les injections intracérébrales, et (3) de réaliser des analyses ne nécessitant pas de procédure expérimentale mais seulement la collecte de tissus après une procédure d’euthanasie. Le nombre d’animaux utilisés pour les injections intracérébrales (280) est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les méthodes sont choisies pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification et des batonnets ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) est réalisée ; (iii) une surveillance quotidienne des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur. En cas de blessure, de pathologie, d’hypoactivité et de mouvement anormal, l’avis du vétérinaire sera demandé, et s'il le recommande les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance. Les souris sont anesthésiées durant la chirurgue, et nous administrons un antalgique en pré- et postopératoire pour éviter les douleurs post-opératoires suite à l’injection intracérébrale.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris transgéniques, modèle murin de maladie d'Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. Les injections intracérébrales seront effectuées à 3 mois, avant que les pertes de neurones et de synapses ne soient observées chez les souris, et leurs effets seront analysés 3 mois après injection, quand ces pertes sont significatives. Les géniteurs seront utilisés entre 2 et 8 mois d'âge, période optimale pour la reproduction des souris.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 450
Cochons d'Inde : 1300
Cochons : 1600
Moutons : 140
Bovins : 2000
7 590 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués (7 440) et 150 réutilisés. Souris, rats, cochons d'Inde, cochons, moutons et bovins sont vaccinés puis suivis par prises de sang pour vérifier l'innocuité, l'activité sérologique et la pureté de lots de vaccins vétérinaires. Le porteur annonce n'attendre aucun dommage au-delà d'un léger stress et justifie ces contrôles par les exigences de la Pharmacopée Européenne. Il indique que des tests d'activité passent déjà in vitro mais juge le remplacement des autres impossible en l'état de la réglementation.
Objectifs
Le projet a pour objectifs de confirmer l’innocuité, de déterminer l’activité sérologique, de vérifier la pureté (absence d’agents contaminants) de vaccins, et de confirmer l’innocuité d’adjuvants entrant dans leur composition. Ces objectifs doivent être respectés afin d’être en conformité avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays destinataires pour la constitution d’un dossier de mise sur le marché et pour la fabrication d’un lot commercial. La Pharmacopée Européenne exige la démonstration de résultats, dont certains doivent être obtenus chez l’animal. Les tests sont donc effectués soit sur une des espèces cibles (porc, mouton ou bovin) soit sur espèce alternative (autres espèces d’animaux de rente ou rongeurs) pour limiter le recours à l’espèce cible. Cette alternative peut être réalisée lorsqu’une équivalence entre les modèles animaux a pu être démontrée. Ces tests garantissent une commercialisation de vaccins sans danger pour l’animal et pour le consommateur potentiel.
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs.
Procédures
Tous les animaux passent par une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement avant le début du test : au moins 4 jours pour les animaux de rente, et au moins 2 jours pour les rongeurs. - Pour les animaux de rente, à J0 une prise de sang (si elle est requise) et la vaccination sont faites. Un rappel est possible, en fonction des techniques. Les animaux sont suivis quotidiennement, une prise de sang intermédiaire et /ou terminale peuvent être réalisées si nécessaire. - Pour les rongeurs, à J0 la vaccination est faite. Un rappel est possible, en fonction des techniques. Les animaux sont suivis quotidiennement et, à la fin, une prise de sang terminale peut être réalisée. L’évaluation de l’innocuité et de la pureté sont basées sur l’absence de réactions à la suite de l’injection et se font à l’aide de l’examen clinique local et général ou bien par la vérification d’absence de contaminants à l’issue des titrages des sérums. La détermination de l’activité sérologique est possible grâce au titrage des anticorps. Chez les animaux de rente, les contrôles durent entre 14 et 35 jours pour les porcs, entre 14 et 30 jours pour le mouton et entre 21 et 28 jours chez les bovins. Chez les rongeurs, les contrôles durent entre 7 et 35 jours pour la souris, entre 14 et 42 jours pour les cobayes et 28 jours pour les rats.
Impact sur les animaux
Aucun dommage n’est attendu, un léger stress lié aux manipulations et injection des vaccins peut apparaître. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Ces tests garantissent la qualité du produit pour les animaux et leur environnement.
Devenir
Certains animaux seront réutilisés, les autres euthanasiés
Remplacement
La nécessité de l’utilisation d’animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la pharmacopée du pays destinataire. Ils permettent de démontrer l’innocuité, l’activité sérologique et la pureté. De nombreux tests d’activité sont passés in vitro. Il n’est actuellement pas possible de remplacer les autres tests restants.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est possible grâce au retrait des groupes témoins dans les puretés porc et à la mutualisation de groupes témoins
Raffinement
Dans ce projet, aucune souffrance ou stress significatif est attendu. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ce sont une des espèces cibles ou alternatives pour le porc, l’ovin et le bovin. Les souris, les rats et cobayes servent d’espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de rente. Les porcs doivent être âgés de 3 semaines à 4 mois, ou peser entre 16 et 36 kg. Les ovins sont âgés entre 3 et 6 mois et les bovins entre 20 jours et l’âge adulte. Les souris doivent peser entre 11 et 25g et/ou être âgées entre 5 et 6 semaines. Les cobayes doivent peser entre 250 et 450g et les rats doivent avoir entre 8 et 10 semaines. Les stades de développement varient en fonction des techniques. Ils correspondent à l’âge ou au poids requis pour répondre au dossier déposé aux autorités.
Evaluation de la sécurité préclinique des candidats médicaments dans le cadre d’études avec immuno-modulation
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 240
Macaques à longue queue : 30
1 710 souris, rats et macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la quasi-totalité tués (1 697), une dizaine de macaques réutilisés et trois proposés à l'adoption. Les animaux reçoivent des candidats médicaments immunomodulateurs au moins deux fois par mois et subissent des prélèvements sous anesthésie, dont moelle osseuse et liquide cérébrospinal, avec un risque de choc anaphylactique. La plupart sont tués pour une analyse anatomo-pathologique terminale des organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions du système immunitaire d'un "organisme entier" et retient le primate pour sa proximité avec l'humain.
Objectifs
Les études de sécurité préclinique chez l’animal de laboratoire font partie intégrante de la Recherche et Développement et ont pour but d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments avant leur administration à l’Homme. Ce projet a pour objectif d’affiner l’évaluation de ce risque, en déterminant quelles sont les voies impliquées dans les modulations du système immunitaire, déclenchées par certains candidats médicaments biologiques (anticorps, vaccins, cellules, gènes). Ces réactions immunitaires, impliquant les voies humorales ou cellulaires, sont par exemple l’hypersensibilité immédiate ou retardée, la tempête de cytokines. Leur complexité nécessite la mise en œuvre de modèles animaux mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.
Bénéfices attendus
La détermination des voies impliquées dans les réactions immunitaires permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. Ces données permettront d’encadrer de manière la plus optimale, les études animales réalisées en aval, afin d’éviter des réactions type choc anaphylactique. A plus long terme, cela pourra constituer si nécessaire les bases de gestion de ce risque lors des premières administrations à l’Homme.
Procédures
Les animaux vigiles seront concernés par l’administration de molécules (candidat médicament couplé ou non à une molécule de référence), par différentes voies (le plus souvent veineuse), au moins 2 fois au cours de l’étude sur une durée maximale d’1 mois. Des prélèvements, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, les rats seront implantés avec un cathéter intra-veineux (une chirurgie réalisée le plus souvent chez le fournisseur) lorsqu’il y aura besoin d’un accès vasculaire. Des tests comportementaux observation des animaux dans leur cage d'hébergement, en champs libre et en manipulation pourront-être réalisés 1 à 2 fois au cours de l'étude, leur durée est de 5 à 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets attendus correspondent à ceux de l’administration de molécules immunomodulatrices pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une modification du comportement de l’animal, une modification de la température corporelle, une baisse de la consommation alimentaire, une perte de poids. Dans certains cas, la survenue d’une réaction immunitaire rapide comme l’hypersensibilité de type I pourra entrainer un choc anaphylactique. Par ailleurs, les prélèvements et examens nécessaires au cours des études peuvent entraîner des nuisances type stress de courte durée (ex : contention, prélèvements sanguins, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains primates pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre est d’environ 30%. Certains de ces primates pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, modélisation in silico, tests in vitro (cellulaires par exemple). Le recours à l’animal de laboratoire reste nécessaire car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant les interactions cellulaires complexes du système immunitaire d’un organisme entier (coopération précise entre divers types cellulaires, contacts de cellule à cellule par l'intermédiaire de récepteurs présents à leur surface et échange de messages moléculaires) et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. Les tests statistiques utilisés sont dépendants des paramètres étudiés. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique. Les effets indésirables potentiellement associés au statut immunitaire des animaux (cas des rongeurs immunodéficients par modification génétique) sont contrés par l’hébergement en environnement protégé. La contrainte des prélèvements et administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et training avec distribution systématique de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support ou analgésie) par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire en application des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Afin de mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et les modulations immunitaires provoquées par certains candidats médicaments, les espèces pertinentes sont les souris et les rats, espèces rongeurs habituelles pour les études de toxicologie générale, ouvrant la possibilité de modification génétique d’intérêt (par exemple humanisation de certaines protéines ou immunodéficience), et les primates non humains, qui présentent la plus proche similitude physiologique avec l’Homme. Toutefois, les primates non humains seront utilisés de manière exceptionnelle et uniquement si aucune réponse pertinente ne peut être obtenue chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante les modulations du système immunitaire.
Etude de la capacité d’un mimétique synthétique de l’héparane sulfate à promouvoir la réparation et la régénération du tissu pulmonaire dans un modèle murin de fibrose pulmonaire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
797 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine dans la trachée, puis elles reçoivent des injections répétées d'un mimétique de l'héparane sulfate ou un anti-fibrosant par gavage, avant une exploration respiratoire. Le porteur décrit la fibrose comme indolore mais reconnaît qu'elle peut provoquer une insuffisance respiratoire sévère et tuer 20 à 30 % des animaux avant l'euthanasie prévue pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace l'induction d'une fibrose in vivo et juge la souris plus adaptée à l'approche mécanistique.
Objectifs
Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë, les exacerbations aiguës de maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l'utilisation de mimétiques des héparanes sulfates (HSM) afin d’améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aiguë. Les effets bénéfiques des HSM seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant la matrice détruite, en protégeant les peptides cellulaires communicants (facteurs de croissance, cytokines, chimiokines), et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité d'un agent mimétique de l'héparane sulfate à réduire l'inflammation, les altérations des mécanismes de l'angiogenèse et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d’améliorer les séquelles de lésions pulmonaires aiguës caractéristiques des dommages alvéolaires diffus. En cas de succès, ce projet proposerait une nouvelle approche pour la prévention et le traitement de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’hypothèse de recherche de ce projet est que l'agent mimétique de l’héparane sulfate présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aiguës en fournissant une thérapie régénérative du tissu lésé. Ainsi cet agent (1) remplacera la matrice extracellulaire remodelée consécutive à l’induction des lésions en ciblant les héparanes sulfates (2) améliorera l'angiogenèse et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire, et par conséquent la fibrose pulmonaire.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire (durée 21jours). Dans un premier temps nous déterminerons la dose optimale d'agent mimétique de l'héparane sulfate. Pour cela les animaux recevront 6 injections intraveineuses (durée quelques secondes) de cet agent mimétique ou de serum physiologique. Le groupe contrôle recevra une molécule anti-fibrosante quotidiennement par gavage. Après une exploration fonctionnelle respiratoire (durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes. A partir de la dose optimale identifiée, nous déterminerons les mécanismes d'action de cet agent mimétique de l'héparane sulfate dans les stades précoce (jour 8) et tardif (jour 11) de l'inflammation. Pour cela les animaux recevront respectivement 2 (jour 5 et 7) et 3 (jour 5, 8 et 10) injections intraveineuses d'agent mimétique de l'héparane sulfate ou de serum physiologique. Le groupe contrôle positif recevra une molécule anti-fibrosante par gavage (durée quelques secondes) pendant 4 ou 7 jours respectivement. Suite à cela les animaux seront euthanasiés aux jours 8 ou 11 pour prélèvement des organes (durée 10 minutes). Enfin une étude de la pharmacocinétique et de la pharmacodistribution sera réalisée. Pour cela les organes seront prélevés à 5 min, 30 min, 3h, 6h, 12h 24h après injection intra veineuse d'agent mimétique de l'héparane sulfate.
Impact sur les animaux
Le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale de bléomycine est validé et couramment utilisé dans la littérature internationale. Ce modèle est caractérisé par un pic inflammatoire (D8) précédent l'apparition de la fibrose pulmonaire (D14-D21). L'instillation intra-trachéale de BLM n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement d'une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30%. La technique de plethysmographie corps entier est une technique largement utilisée pour l’étude de la respiration. Elle permet de mesurer les variables ventilatoires sur un animal non anesthésié et non contraint. Afin de diminuer le stress de l’animal, une séance d’acclimatation sera systématiquement réalisée. Concernant les prélèvements, tous les animaux seront anesthésiés au préalable.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes d'action d'un mimétique de l'héparane sulfate dans le cadre d'une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqué est de 797. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d'arrêt d'expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du traitement à la bléomycine (BLM) et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité́ relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'insitllation intra-trachéale de bléomycine, celle-ci sera réalisée sous anesthésie. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale de bléomycine et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivant: immobilité́, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité́ (faiblesse musculaire, ataxie, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé́, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.
Choix des espèces
Ce projet nécessite d'induire une fibrose pulmonaire, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Notre choix c'est porté sur la souris car c'est un modèle qui s'héberge et se reproduit facilement. D'autre part, le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instilation intra-trachéale de bélomycine est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et Il a permis la description de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques. Pour réaliser notre étude, nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. Cependant, les souris jeunes semblent moins sensibles à la bléomycine comparées aux souris âgées. Cependant, Il est bien décrit dans la littérature que les souris C57Bl6/J plus âgées, développent une fibrose pulmonaire plus sévère, ce qui risquerait d’induire une surmortalité. Le compromis qui a été choisis est un âge de 8 semaines.