Rongeurs
Approches thérapeutiques des ostéosarcomes murins chez les souris BALB/cByJ, C3H/HeNRj et C57BL/6JRj
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. De jeunes souris reçoivent une injection de cellules cancéreuses près du tibia pour développer une tumeur osseuse, puis des administrations répétées de molécules à tester, avant mise à mort pour prélever tumeur, organes et membres. Le porteur décrit une douleur modérée liée à l'injection près de l'os et une perte de mobilité liée à la tumeur, la taille de celle-ci servant de critère d'arrêt. Sur le remplacement, il affirme que des essais in vitro ont déjà eu lieu et qu'une évaluation chez la souris reste indispensable avant la clinique.
Objectifs
L’objectif scientifique est de vérifier que les résultats obtenus in vitro dans les cellules d’ostéosarcome murin sont applicables aux modèles d’ostéosarcome chez la souris immunocompétente dans un contexte environnemental complexe (vascularisation ; effets secondaires, micro-environnement osseux, implication du système immunitaire ...) avant toute application clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de valider l'efficacité thérapeutique de molécules impliquées dans la résorption osseuse et dans l'activité anti-tumorale avant d'entrer en phase clinique
Procédures
Les animaux seront anesthésiés pendant quelques minutes et sous analgésie pendant 12 heures. L'injection des cellues cancéreuses sera réalisée en site para tibiale (durée : quelques secondes). La mesure du volume tumorale sera effectuée 2 à 3 fois par semaine (animal vigile, durée de la conrtention : quelques secondes). L'injection des molécules à tester sera réalisée par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse (durée : une minute).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour ce projet sont un stress lié à la contention et à l'anesthésie des animaux. Une douleur modérée associée à l'injection en paratibiale (injection intramusculaire proche de l'os). Le développement tumoral, bien que contôlé quotidiennement pourra entraîner une légère perte de mobilité. Une attention particulière sera portée à la mesure du volume tumoral qui constitue un critère d'arrêt décrit dans les points limites.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort l'issue de l'étude pour prélèvement post-mortem (tumeur, organes, membres postérieurs)
Remplacement
Dans le cadre du développement clinique de nouvelles molécules à activité anti-tumorale et impliquée dans la résorption, des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées avec succès. Une évaluation pré clinique est cependant indispensable pour étudier les effets de ces molécules in vivo. Le modèle murin reste le plus adapté à ce type d'étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques. Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=8).
Raffinement
Afin de raffiner les procédures expérimentales, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter le plus précocement possible tout signe de douleur. La manipulation des animaux se fera sous anesthésie générale gazeuse, sur un tapis chauffant lors de la réalisation des gestes techniques. Une analgésie sera appliquée pour l'implantation des cellules tumorales et des points limites strictes et spécifiques du projet seront établis (développés ci-dessous). Les animaux seront hébergés en groupe, à raison de 4 par cage. L'environnement sera adapté afin que les animaux puissent avoir un comportement aussi naturel que possible (litière adaptée à l'espèce, frisottis, maisonnette en carton,...). L'alimentation et l'eau seront fournis
Choix des espèces
L’utilisation de souris immunocompétentes est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs murines dans un environnement in vivo complexe (os et tumeur) sans s’affranchir de l’implication des cellules de l’immunité sur les effets observés. La souris est un modèle particulièrement adapté à l'oncologie. Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs osseuses qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 ou 5 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 ou 6 semaines).
Etude du métabolisme cellulaire des Treg à l’homéostasie
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections dans le péritoine et des gavages de médicaments présentés comme non toxiques, puis sont tuées vers l'âge de deux mois pour prélever rate, ganglions, côlon, foie, poumon, peau et tissu adipeux. Le porteur indique un stress et des douleurs légères liés aux gestes, l'objectif étant de décrire le métabolisme des lymphocytes T régulateurs selon les tissus. Sur le remplacement, il affirme que le métabolisme d'une cellule ne s'étudie pas hors de son environnement tissulaire et annonce un remplacement partiel par la culture cellulaire et la bio-informatique.
Objectifs
Une population de cellules immunes appelée lymphocytes T régulateurs ou « Treg », joue un rôle majeur dans la prévention des maladies auto-immunes. Les patients ou les souris déficients en Treg développent un syndrome auto-immun très sévère. Les Treg sont présents non seulement dans le sang, la rate ou les ganglions lymphatiques mais également dans de nombreux autres tissus dît non-lymphoïdes tels que le poumon, le muscle, le foie, l’intestin, la peau ou le tissu adipeux. Le rôle des Treg des tissus non-lymphoïdes n’est que partiellement connu et varie en fonction de l’organe. Par exemple, il a été décrit que les Treg du tissu adipeux sont capables de contrôler le diabète de type 2 ou l’obésité, que les Treg du muscle sont impliqués dans la réparation tissulaire après blessure, que les Treg de l’intestin contrôlent l’inflammation locale et le microbiote ou encore que les Treg de la peau participent au bon fonctionnement du follicule pileux. Ainsi, au delà de leur rôle de contrôle de l’inflammation, les Treg participent à l’intégrité et au bon fonctionnement des organes. L’environnement métabolique est très variable d’un tissu à l’autre. Ainsi, le sang, la rate ou les ganglions lymphatiques sont riches en glucose et en oxygène, à l’inverse de la plupart des tissus non-lymphoïdes qui ont des taux faibles d’oxygène et de glucose. Les Treg ont alors besoin de s’adapter d’un point de vue métabolique pour pouvoir vivre et fonctionner normalement dans chacun de ces tissus. Pourtant, on ne connaît presque rien sur le profile métabolique des Treg des tissus. Ceci s’explique par le fait que les seules technologies disponibles jusqu’à il y a encore très peu de temps nécessitaient de grands nombres de cellules, nombres inatteignables pour l’étude des Treg des tissus non-lymphoïdes qui sont des cellules rares. L'objectif de ce projet est de faire un état de lieux sur le profile métabolique des Treg des tissus lymphoïdes et non lymphoïdes en utilisant une nouvelle technologie. Grâce à ce travail nous espérons pouvoir caractériser les similitudes et les différences de métabolisme cellulaire entre les Treg de différents tissus à l’homéostasie. Il pourrait permettre de mieux comprendre le mécanisme d’action de certains traitements utilisés en médecine qui affecte le métabolisme cellulaire (Metformine, Sirolimus, Tecfidera) en connaissant mieux leurs effets sur les Treg. Ce projet pourrait aussi permettre de pouvoir mieux manipuler les Treg à des fins thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement du profile métabolique des Treg des tissus lymphoïdes (rate, ganglions lymphatiques) et non lymphoïdes (foie, poumon, colon, peau et tissu adipeux). A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme. En effet, la pharmacopée comprend de nombreuses molécules agissant sur différentes voies métaboliques. Certaines de ces molécules sont largement utilisées en médecine actuellement (metformine, rapamycine, DMF). Notre étude permettra de mieux comprendre comment ces médicaments pourraient agir sur les Treg de différents tissus et mieux comprendre ainsi leur mode d’action. De plus, une meilleure connaissance du profile métabolique des Treg de différents tissus pourrait permettre de proposer des traitements qui pourraient agir, en les stimulant ou en les inhibant, sur certains sous-type de Treg, avec un impact bénéfique sur le fonctionnement de ces tissus.
Procédures
L’expérience consistera à injecter des médicaments non toxiques par voie intra-péritonéale. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. On fera aussi des gavages qui dureront moins de 30 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Enfin, ces souris, seront euthanasiés quand elles auront 2 mois d’âge (compter 5 à 10 secondes par souris).
Impact sur les animaux
Pour le gavage et les injections par voie intra-péritonéale, nous anticipons un stress et des douleurs légères chez les souris. Différents produits seront administrés mais ils ne produiront pas de nuisance supplémentaire aux souris.
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, colon, foie, poumon, peau, tissu adipeux) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.
Remplacement
Le profile métabolique d’une cellule ne peut être étudié en dehors de son environnement tissulaire. Pour étudier le métabolisme des Treg des tissus lymphoïdes et non-lymphoïdes nous avons besoin d’avoir recours à une étude in vivo chez l’animal. Les études précédentes utilisant des cultures de cellules fraichement purifiées ou des lignées cellulaires pour connaître le métabolisme d’un type cellulaire est contestable dans la mesure où l’environnement métabolique de la culture ne peut refléter fidèlement l’environnement métabolique d’un tissu in situ. C’est pourquoi nous faisons ces études in vivo. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des Treg et que nous avons développé au laboratoire un modèle de souris génétiquement modifiées unique qui permet de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Sur les 3 années, nous utiliserons un total de 588 souris de 6 à 10 semaines d’âge. Du fait de la variabilité interindividuelle entre souris, nous utiliserons 2 souris par groupe pour les études de profile métabolique et les expériences seront répétées 4 fois (4 réplicats biologiques), pour avoir un total de 8 souris pour chaque type d’inhibiteur pour l’analyse du profile métabolique des Treg. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences en étudiant en même temps l’effet de 2 inhibiteurs différents. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons tous les organes étudiés (rate, ganglion, foie, poumon, colon, peau, tissu adipeux) afin de collecter et analyser le plus de données possibles par animal.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les souris seront hébergées selon les conditions de la règlementation de la Directive 2010/63 EU en cages ventilées d'une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h et avec accès ad libitum à la nourriture et à la boisson. Le change de la litière sera réalisé 1 fois toutes les 2 semaines et les biberons chaque semaine. Les souris resteront toujours en groupes sociaux (de 2 à 5 souris). L'enrichissement fourni est du sizzlnest pour le nid et une maison rouge dans chaque cage. Les animaux sont vérifiés tous les jours par le personnel du service de zootechnie. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, nous l’euthanasierons. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le système immunitaire de l’Homme et les Treg en particulier. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle du métabolisme cellulaire sur la stabilité des Treg. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Les expériences seront réalisées sur des souris jeunes adultes d’environ 8 semaines (6 semaines pour les plus jeunes et 10 semaines pour les plus âgées).
Evaluation de l’effet de différents traitements dans des modèles d’epilepsie chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 008 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes dans le cerveau, des gavages quotidiens pendant près d'un mois et des injections de substances qui déclenchent des crises, avec des états de mal épileptique pouvant durer deux heures et des isolements, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur reconnaît un stress et une douleur liés à la chirurgie, aux crises et aux administrations répétées, et prévoit d'administrer une benzodiazépine au-delà de deux heures de crise. Il affirme que les crises d'un cerveau entier ne se reproduisent pas in vitro et que la modélisation informatique manque encore de données.
Objectifs
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements (pharmacologiques et probiotiques) sur 1) la prévention et 2) la terminaison de l’état de mal épileptique (status epilepticus) et des crises spontanées, induits chez l’animal. L’état de mal épileptique (status epilepticus) est défini par une crise prolongée (plus de 5 min) qui induit à long terme des altérations neurologiques graves. Bien que la plupart des patients répondent bien aux benzodiazépines (médicament donné en première intention), certains patients sont réfractaires (un tiers) et nécessitent d’autres traitements. L’état de mal épileptique est généralement accompagné par l’occurrence de crises spontanées après une période dite de latence. Nous proposons ici d’utiliser 2 modèles d’épilepsie présentant un état de mal épileptique et des crises spontanées, et de tester l’efficacité de traitements chroniques (administrés par voie orale) sur la prévention et ou la terminaison des crises induites.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de traitements anti-épileptiques pharmacologiques et probiotiques nouveaux sur l’état de mal épileptique et les crises spontanées associées. Le but est de proposer ces traitements chez l’humain, soit pour prévenir de l’état de mal épileptique, présent dans de nombreux syndromes épileptiques, dont le syndrome de Dravet; soit pour terminer un état de mal épileptique afin d’éviter la survenue d’altérations neurologiques. L’état de mal épileptique prolongé (réfractaire aux traitements actuels) touche 1 tiers de patients épileptiques et peut avoir des conséquences délétères pour le cerveau, voire entrainer la mort des patients.
Procédures
- Chirurgie d’implantation d’électrodes EEG : anesthésie générale et analgésie, une fois par animal, 1008 animaux, durée de la chirurgie maximum 1h - Gavage oral : animaux vigile, une fois par jour pendant 27 à 35 jours selon les procédures (336 animaux par procédure) - Injection sous-cutanée : animal vigile, 12 fois pour 336 animaux, 2 fois pour les 672 autres - Injection intrapéritonéale : animal vigile, une fois pour 672 animaux et éventuellement une 2ème fois (pour stopper l’état de mal épileptique) pour 1008 animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue de crises épileptiques et un état de mal épileptique (d’une durée maximale de 2h) , qui peuvent entrainer à plus long terme des altérations neurologiques 2) un stress et une douleur dus à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes et au suivi des crises 3) un stress dû à l’isolement (de 2h à 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises 4) un stress et une douleur dus à l’administration chronique sous cutanée des convulsivants 5) un stress et une douleur dus à l’administration chronique par gavage des traitements proposés Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées au niveau cellulaire chez l’humain. (2) Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier (et ceux malgré le développement de méthodes alternatives). (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord les traitements préventifs avant de tester les traitements curatifs. Selon le « Guidelines for the Design and Statistical Analysis of Experiments Using Laboratory Animals (Festing, Altman) », il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. L’induction d’un état de mal et des crises pouvant entrainer une mortalité, nous envisageons d’utiliser au maximum 14 animaux/groupe afin d’atteindre un nombre minimum de 10 en cas de perte d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec des tunnels en plastiques (ou des huttes en carton après implantation d’électrodes). La température est controlée. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée (environ 45 min avant). Pendant la chirurgie, un gel est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le déssèchement de la cornée. Un spray d’anesthésique local est appliqué au niveau de la peau incisée pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant avec rétrocontrôle. Puis, à la fin de la chirugie, une deuxième dose d’analgésique est administrée dans les 4h (soit 6h après la première) pour réduire la douleur postopératoire, puis un antalgique dans l’eau de boisson est donné pendant 48h. Une distribution d'aliment hydraté pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Lors de l’induction d’un « état de mal » épileptique (status epilepticus), les animaux sont suivis par vidéo-EEG. Si cet état de mal dure plus de 2h, les animaux recevront une dose d’une benzodiazépine afin de stopper le phénomène épileptique, et ainsi limiter les conséquences. Les traitements que nous proposons de tester ont pour but de prévenir et/ou de terminer cet état de mal. Les administrations (intrapéritonéale, sous-cutanée ou par gavage oral) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisi (rat Sprague Dawley) est le modèle le plus décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induit par les proconvulsivants utilisés dans cette étude. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. De plus, la lignée Sprague Dawley choisie montre un taux de survie élevé suite à l’induction des crises proposées. Pour toutes les procédures, des animaux adultes seront utilisés (à partir de P60). Les modèles proposés ont montré leur efficacité chez le rat adulte.
Perfusion in situ de foie de rat adulte à la collagénase
- Enseignement supérieur
30 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques menés sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil par dislocation cervicale. Chacun subit une intervention de moins de deux heures, incision de l'abdomen et pose d'une canule dans la veine porte, non pour produire des connaissances mais pour que des étudiants s'entraînent à prélever un foie et en cultiver les cellules. Le porteur décrit un risque d'hémorragie et de détresse respiratoire pendant les gestes, et prévoit quatre rats par an plus deux de secours en cas d'échec de la canulation. Sur le remplacement, il affirme que la réalisation de cultures primaires impose de tuer un rat pour prélever son foie, sans mentionner d'alternative par don de tissus.
Objectifs
Le Bachelor Universitaire de Technologie Génie Biologique parcours Biologie médicale et Biotechnologie prépare en 6 semestres des techniciens supérieurs ou des assistants ingénieurs polyvalents dans le domaine de la santé humaine et du bien-être, de la santé animale, ainsi que dans celui des biotechnologies. Qu'il exerce dans un laboratoire ou dans une entreprise, le titulaire de ce diplôme possède les compétences techniques requises pour réaliser des examens ou des analyses biologiques, physico-chimiques ou biochimiques, effectuer des tests de contrôle des produits et intervenir en expérimentation animale in vivo et in vitro. Dans le cadre de la formation, une des « compétences ciblées » porte sur les études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé. Parmi les apprentissages critiques, des techniques alternatives et complémentaires à l'expérimentation animale sont mises en œuvre. Les effets de molécules toxiques sont mesurés. Dans le cadre de travaux pratiques du Bachelor Universitaire de Technologie Génie Biologique parcours Biologie Médicale et Biotechnologie, l'objectif est d'établir des cultures primaires d'hépatocytes obtenues en perfusant le foie du rat adulte à la collagénase (enzyme de dissociation tissulaire) in vivo. Ces cultures primaires sont largement utilisées pour les études toxicologiques et métaboliques et sont normalisées. Ce projet va permettre aux futurs actifs de mettre en place des cultures primaires d'hépatocytes afin de tester la cytotoxicité de molécules à différentes concentrations in vitro. Les hépatocytes sont isolés directement du foie de rat et sont ainsi utilisés comme modèles de l'état physiologique in vivo. Des lignées cellulaires immortelles de foie existe mais sont moins représentatives de cellule hépatique normale in vivo.
Bénéfices attendus
La formation professionnelle dispensée aux étudiants leur permet d'appréhender la réglementation relative à l'expérimentation animale et les techniques de dissociation tissulaire et de pouvoir établir ainsi une culture primaire de cellules in vitro.
Procédures
Dans la procédure, les rats sont soumis à une intervention de moins de 2 heures sous anesthésie générale avec antalgie préalable au moins 30 minutes avant de réaliser l'anesthésique. Une incision de la peau de la patte arrière droite puis une injection d'héparine dans la veine fémorale sont effectuées (1 minute). Une incision de la peau et des plans musculaires de l'abdomen est réalisée (quelques minutes). La veine porte est canulée (quelques minutes). A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort réglementairement (dislocation des cervicales).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1- Le stress généré lors de la contention de l'animal au moment des injections de l'antalgie puis de l'anesthésie, durée une minute, de gravité légère. 2-Une hémorragie massive si la veine porte est sectionnée durant les gestes réalisés, durée de moins d’une minute et de gravité modérée. 3-Le stress lié à la détresse respiratoire malgré la trachéotomie, durée une minute et de gravité modérée.
Devenir
Après la perfusion le rat ne peut pas survivre. Par conséquent, à l'issue de la procédure, l'animal est mis à mort par dislocation des cervicales.
Remplacement
L'objectif de la séance de travaux pratiques est de réaliser des cultures primaire à partir de foie ; cela nécessite de mettre à mort un rat pour prélever son foie. L'utilisation d'animaux ne peut être substituée pour générer ces cultures.
Réduction
L'équipe enseignante est consciente de la nécessité de limiter le nombre d'animaux utilisés et s'efforce d'adapter le protocole dans cet optique. Nous avons mis en place les mesures suivantes permettant la réduction du nombre d'animaux : - Quatre rats sont utilisés par an (1rat par groupe de travaux pratiques de 14 étudiants) et deux rats supplémentaires par an sont prévus au cas où la canulation de la veine porte échoue. Dans environ 50 % des groupes de travaux pratiques, le rat supplémentaire est utilisé. Ce projet n'a pas pour objet d'études statistiques.
Raffinement
La raffinement est mis en place dans la pratique de l'antalgie et de l'anesthésie, nos procédures expérimentales étant sans réveil. 30 minutes avant la séance de travaux pratiques, chaque rat est analgésié puis anesthésié par le personnel habilté dans la pièce réservée aux anesthésies. Au cours de la procédure, les étudiants suivent la grille d'évaluation du suivi d'anesthésie et appellent l'enseignant dès qu'un signe de réveil apparait. L'enseignant évaluera la situation et mettra en place les gestes adéquats (réinjections ou mise à mort).
Choix des espèces
Le projet se propose d'utiliser le rat, modèle d'utilisation standardisée, dans les domaines de la recherche et du diagnostic. Les rats sont couramment utilisés pour des études en physiologie et pharmacologie. Le protocole (débit de perfusion et concentration enzymatique) a été élaboré pour des rats adultes d'environ 250g.
Etudes fondamentales et appliquées des interactions entre bactériophages et bactéries chez l’animal
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
Infectées par une bactérie pathogène, 12 916 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec selon les cas des gavages et des recueils de fèces en boîte jusqu'à deux fois par jour et une prise de sang. Toutes sont tuées à l'issue, parce qu'elles peuvent rester porteuses de la bactérie, la plupart pour l'analyse de leurs organes vitaux. L'équipe étudie dans les poumons et l'intestin les interactions entre bactériophages et bactéries, en vue d'élargir l'usage de ces virus contre les bactéries résistantes aux antibiotiques. Une souris qui ne bouge plus et reste prostrée, perd plus de 20 % de son poids ou présente une diarrhée depuis plus de 48 heures est mise à mort. Le porteur attribue à l'infection perte de poids et douleur, la juge "nécessaire pour étudier les paramètres affectant l'efficacité d'un traitement", et n'en précise ni la voie ni la durée.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries. Ils peuvent donc être utilisés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ils présentent l’intérêt d’être très spécifiques des bactéries ciblées. D’autre part, les bactériophages font partie de la flore naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, nous étudierons les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans deux organes cibles : les poumons et les intestins. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors d’une phagothérapie. Ces mécanismes recouvrent non seulement les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. La meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages permettra d’augmenter le nombre de patients traités dans des conditions optimales d’efficacité. Permettre à des patients d’accéder à ce type de traitement alors que les antibiotiques ne sont plus efficaces permettra de réduire le nombre d’impasses thérapeutiques et le coût des frais hospitaliers mais surtout d’améliorer les conditions de vie de ces patients.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes), ou des prélèvements fécaux (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes et jusqu’à 2 fois par jour). Les administrations par gavage (quelques secondes) seront limitées à 2 par jour.
Impact sur les animaux
Les nuisances causées aux animaux seront liées au développement d’une infection bactérienne (perte de poids et douleur dans le respect des points limites) qui est nécessaire pour étudier les paramètres affectant l’efficacité d’un traitement par les bactériophages. Aucun effet indésirable n’a jamais été rapporté lors de l’utilisation de bactériophages que ce soit dans des modèles expérimentaux ou dans les études rapportant des traitements compassionnels.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.
Remplacement
L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbienne d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.
Réduction
D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les animaux infectés seront observés 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation à 3 niveaux (0, 1, 2) permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 déclenchera l’ajout d’un diet gel pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avant d’être mise en place.
Choix des espèces
A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.
Validation d’un modèle de la maladie de Parkinson chez le rat par injection d’un vecteur viral
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce dossier reprend le même protocole qu'une autre demande du lot, une injection virale dans le cerveau pour induire une maladie de type Parkinson, deux IRM de deux heures sous anesthésie, des gavages et des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme que la chirurgie n'induit ni souffrance ni troubles hors de la maladie, tout en reconnaissant plus loin une douleur possible, une perte de poids et une hypothermie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du lien entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : - de valider un modèle rat parkinsonien sur la souche axénique exclusivement employée dans notre établissement utilisateur, souche permettant de contrôler le microbiote des rats. - de caractériser finement les conséquences de la maladie tout au long de l’axe cerveau/intestin par différentes méthodes. - de connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont : - de disposer d'un modèle rat parkinsonien sur la souche employée en conditions axéniques dans notre établissement utilisateur. - de caractériser finement les conséquences de la maladie par des méthodes multisytémiques. - choisir la technique d'IRM non invasive capable de détecter les signes de la maladie au niveau cérébral. - connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie. Si nous constatons une modification du microbiote en lien avec le développement de la maladie de Parkinson, nous proposerons de poursuivre cette étude en modifiant le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration du phénotype de la maladie (transplantation fécale issue de microbiotes de patients humains, introduction de prébiotiques dans l'alimentation). L’objectif à terme de ce projet serait de proposer de potentiels prébiotiques qui pourraient améliorer la qualité de vie des malades atteints de la maladie de Parkinson ou ralentir la progression de la maladie.
Procédures
- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisée 2 fois, en semaine 7 et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale a pour but d’induire une maladie chronique. En dehors de ce dommage durable, le geste chirurgical n’induit ni souffrance, ni altérations comportementales (en dehors de celles directement en rapport avec la maladie de Parkinson). Cependant, les rats peuvent présenter des effets indésirables liés à cette intervention chirurgicale, douleur, perte de poids, hypothermie. L’hébergement individuel des rats pendant 24 h toutes les 7 semaines pour les mesures de temps de transit induit un stress.
Devenir
A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques participant à la validation du modèle de maladie de Parkinson chez cette souche de rat.
Remplacement
L’étude du système nerveux, de par sa complexité d’organisation, de développement, de plasticité et de fonctionnement, demande à être effectuée au sein de l’organisme entier. Seules des approches menées in vivo chez un modèle animal peuvent améliorer la connaissance du cerveau et de son fonctionnement, et ainsi aboutir au traitement de ses pathologies humaines comme la maladie de Parkinson. L'objectif de ce projet est de modifier le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration de la maladie, aussi l’étude du couplage microbiote/système nerveux ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour apporter des résultats statistiques à l’étude. L’imagerie par IRM est un outil non invasif et indolore qui permet le suivi du développement d’une pathologie sur un même animal.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant 7 jours à leur arrivée et lors du transfert entre les 2 animaleries, de l’enrichissement sera mis à disposition dans les cages. Au préalable à chaque procédure, les animaux seront amenés pendant 60 min dans la pièce de l’intervention afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Après chaque anesthésie, que ce soit pour la chirurgie ou l’IRM, les animaux seront placés dans une cage de réveil réchauffée par une plaque chauffante. Ils seront surveillés régulièrement par l’expérimentateur pendant les heures qui suivent l’intervention jusqu’à ce que l’animal ait pleinement récupéré. Pour analyser le temps de transit chez l’animal, une suspension de spores est administrée par gavage orogastrique, technique pour laquelle la douleur et le stress sont limités pour l'animal lorsque le geste est réalisé par des intervenants formés et expérimentés (mise en place d'un conditionnement "pré-contention" avec manipulation régulière des animaux). Toutefois, une surveillance accrue est mise en place à la suite de l'exécution de la technique pour détecter d'éventuels signes de mal être suite à l'intervention.
Choix des espèces
La littérature scientifique montre que le rat est une espèce de choix pour l'étude du fonctionnement cérébral dans la Maladie de Parkinson. Nous pourrons ainsi confronter les données de la littérature utilisant les modèles classiques avec les résultats obtenus grâce à notre nouveau modèle dans le cadre de ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes (environ 200 g en début d'étude), afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur les coordonnées des différentes structures cérébrales dans l’espace.
Validation d’un modèle de la maladie de Parkinson chez le rat par injection d’un vecteur viral
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection dans le cerveau sous anesthésie pour induire une maladie chronique de type Parkinson, puis deux séances d'IRM de deux heures et des gavages, avec des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur reconnaît des effets liés à la chirurgie, douleur, perte de poids et hypothermie, et un stress lié à l'isolement, tout en décrivant par ailleurs le geste comme sans souffrance en dehors de la maladie induite. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du couplage entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : - de valider un modèle rat parkinsonien sur la souche axénique exclusivement employée dans notre établissement utilisateur, souche permettant de contrôler le microbiote des rats. - de caractériser finement les conséquences de la maladie tout au long de l’axe cerveau/intestin par différentes méthodes. - de connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont : - de disposer d'un modèle rat parkinsonien sur la souche employée en conditions axéniques dans notre établissement utilisateur. - de caractériser finement les conséquences de la maladie par des méthodes multisytémiques. - choisir la technique d'IRM non invasive capable de détecter les signes de la maladie au niveau cérébral. - connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie. Si nous constatons une modification du microbiote en lien avec le développement de la maladie de Parkinson, nous proposerons de poursuivre cette étude en modifiant le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration du phénotype de la maladie (transplantation fécale issue de microbiotes de patients humains, introduction de prébiotiques dans l'alimentation). L’objectif à terme de ce projet serait de proposer de potentiels prébiotiques qui pourraient améliorer la qualité de vie des malades atteints de la maladie de Parkinson ou ralentir la progression de la maladie.
Procédures
- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisé 2 fois, en semaine et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale a pour but d’induire une maladie chronique. En dehors de ce dommage durable, le geste chirurgical n’induit ni souffrance, ni altérations comportementales (en dehors de celles directement en rapport avec la maladie de Parkinson). Cependant, les rats peuvent présenter des effets indésirables liés à cette intervention chirurgicale, douleur, perte de poids, hypothermie. L’hébergement individuel des rats pendant 24 h toutes les 7 semaines pour les mesures de temps de transit induit un stress.
Devenir
A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques participant à la validation du modèle de maladie de Parkinson chez cette souche de rat.
Remplacement
L’étude du système nerveux, de par sa complexité d’organisation, de développement, de plasticité et de fonctionnement, demande à être effectuée au sein de l’organisme entier. Seules des approches menées in vivo chez un modèle animal peuvent améliorer la connaissance du cerveau et de son fonctionnement, et ainsi aboutir au traitement de ses pathologies humaines comme la maladie de Parkinson. L'objectif de ce projet est de modifier le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration de la maladie, aussi l’étude du couplage microbiote/système nerveux ne peut être réalisée que chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour apporter des résultats statistiques à l’étude. L’imagerie par IRM est un outil non invasif et indolore qui permet le suivi du développement d’une pathologie sur un même animal.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant 7 jours à leur arrivée et lors du transfert entre les 2 animaleries, de l’enrichissement sera mis à disposition dans les cages. Au préalable à chaque procédure, les animaux seront amenés pendant 60 min dans la pièce de l’intervention afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Après chaque anesthésie, que ce soit pour la chirurgie ou l’IRM, les animaux seront placés dans une cage de réveil réchauffée par une plaque chauffante. Ils seront surveillés régulièrement par l’expérimentateur pendant les heures qui suivent l’intervention jusqu’à ce que l’animal ait pleinement récupéré. Pour analyser le temps de transit chez l’animal, une suspension de spores est administrée par gavage orogastrique, technique pour laquelle la douleur et le stress sont limités pour l'animal lorsque le geste est réalisé par des intervenants formés et expérimentés (mise en place d'un conditionnement "pré-contention" avec manipulation régulière des animaux). Toutefois, une surveillance accrue est mise en place à la suite de l'exécution de la technique pour détecter d'éventuels signes de mal être suite à l'intervention.
Choix des espèces
La littérature scientifique montre que le rat est une espèce de choix pour l'étude du fonctionnement cérébral dans la Maladie de Parkinson. Nous pourrons ainsi confronter les données de la littérature utilisant les modèles classiques avec les résultats obtenus grâce à notre nouveau modèle dans le cadre de ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes (environ 200 g en début d'étude), afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur les coordonnées des différentes structures cérébrales dans l’espace.
Rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire chez la souris femelle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
144 souris femelles vont être utilisées dans une chirurgie terminale menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune subit un acte unique de vingt minutes suivi du prélèvement du cerveau, pour analyser la morphologie des neurones de l'hypothalamus à différents âges entre le dixième et le soixantième jour de vie. Le porteur décrit un inconfort limité à la contention et à l'injection, et renvoie les retombées à de meilleurs traitements des troubles de la puberté et de troubles psychiatriques. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'un réseau neuronal complexe dans l'"organisme entier" exige l'animal vivant.
Objectifs
La puberté est une période critique de développement aboutissant à la maturité sexuelle. C’est un moment de plasticité cérébrale intense, associé à de considérables changements hormonaux, neuraux et comportementaux. Cela est d’autant plus important que la perturbation de l’initiation de la puberté est associée à un risque plus élevé de développer de nombreuses maladies neurologiques. La puberté est déclenchée par la réactivation de l'axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique. L'augmentation pubertaire de la sécrétion des stéroïdes sexuels et la localisation cérébrale des récepteurs des œstrogènes suggère un rôle clé de l’œstradiol dans les changements qui ont lieu à la puberté. L'objectif de ce projet est d'étudier les changements de plasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire. Des souris femelles seront utilisées afin d’étudier la morphologie neuronale au cours du développement hypothalamique et d’identifier les périodes les plus sensibles aux changements hormonaux.
Bénéfices attendus
Les données obtenues contribueront à déterminer les périodes clés de plasticité du cerveau et le rôle des œstrogènes pubertaires dans ces processus. Ceci est particulièrement pertinent dans le contexte du développement de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Les animaux (n=144) subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales. Les produits administrés pour l’anesthésie, l’analgésie et l’euthanasie n’ont pas d’effet douloureux connus, les animaux auront le seul inconfort de la contention et de l’injection (piqure de l’aiguille).
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et morphologiques.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire femelle nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives..
Réduction
Les effectifs utilisés (144 animaux au total) ont été calculés au plus juste afin de garantir la puissance statistique, compte tenu de la variabilité interindividuelle. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement au sein de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...) et de données dans la littérature permettant, d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Ce projet utilisera des femelles à différents jours postnataux (JPN) : JPN10, JPN15, JPN20, JPN25, JPN30, JPN35, JPN40, JPN45 et JPN60. Cela apportera de nouvelles connaissances quant aux changements cérébraux qui ont lieu en particulier dans l’hypothalamus au cours du développement postnatal et pubertaire.
Etude des interactions entre la signalisation oestrogénique et circadienne pour l’amélioration du traitement de la ménopause
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 248 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène pendant cinq jours, une partie subissant l'ablation des ovaires pour reproduire la ménopause et la pose d'une capsule hormonale sous la peau, avec isolement en cage individuelle pour mesurer l'activité sur roue. Le porteur indique un stress comportemental lié à la modification des rythmes et à l'isolement, sans douleur selon lui, avant mise à mort pour prélever foie, utérus, aorte et cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les effets multiples des oestrogènes ne sont pas modélisables in vitro et qu'aucune stratégie de remplacement ne répond au projet.
Objectifs
De nombreuses études ont montré un lien potentiel entre la signalisation oestrogéniques et les rythmes circadiens mais les mécanismes moléculaires sont inconnus, ce qui pourrait pourtant avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit. Afin de déterminer les liens moléculaires et physiologiques entre la signalisation oestrogénique et la signalisation circadienne, les objectifs de ce projet sont de : 1) Evaluer l'impact d'un traitement oestrogénique sur les rythmes circadiens ; 2) Evaluer le rôle de la régulation circadienne sur la signalisation des oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer les liens moléculaires et physiologiques entre la signalisation oestrogénique et la signalisation circadienne, ce qui pourrait avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit. En effet, l'interaction entre la signalisation oestrogénique et les rythmes circadiens représente un levier thérapeutique relevant pour limiter, prévenir et/ou traiter les dysfonctions cardiovasculaires et métaboliques ainsi que les symptomes climatériques et le développement de certains cancers hormono-dépendants chez les femmes menopausées et les travailleurs de nuit.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à la procédure d'injection de tamoxifène (5 jours d'injection par IP). De plus, certains animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales dont une de classe légère (pose de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme) et une de classe modérée (ablation des ovaires mimant la ménopause). Ces deux procédures durent entre 10-20min sous anesthésie générale. Au total, 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène seule ; 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène et l'ovariectomie et 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène, l'ovariectomie et la pose de pellets.
Impact sur les animaux
La modifications des rythmes circadiens ainsi que l'induction d'un syndrome métabolique par une régime hypercalorique va challenger la physiologie des souris et peut donc induire un stress comportemental chez les souris mais pas de douleurs. De plus, l'étude des rythmes circadiens nécessite l'isolement en cage individuelle des souris afin d'avaluer leur activité locomotrice sur roues. En effet, cet appareillage est présent dans l'établissement utilisateur et il n'existe pas d'alternative dans l'établissement utilisateur, sachant que le statut sanitaire des animaux (hébergés en animalerie conventionelle) ne permet pas de les transférer dans un autre établissement.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes (foie, utérus, aorte, cerveaux) et réaliser des analyses moléculaires.
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques des oestrogènes. De même, les rythmes circadiens font intervenir de nombreux tissus dont l'horloge centrale dans l'hypothalamus intégrant le signal jour/nuit régulant les rythmes circadiens. Alors qu'une approche in vitro est utilisée pour définir les mécanismes moléculaires de ces signalisations, l'étude des effets physio(patho)logiques circadiens des oestrogènes ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons uniquement les femelles car ce projet rentre dans le cadre de la mise au point d’un traitement de la ménopause et s’applique donc uniquement au sexe féminin. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs. Les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques (procédures 1 à 6) alors que pour les études d'expression génique uniquement (procédures 7 à 12), les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 5 animaux étaient requis.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. L'étude des rythmes circadiens nécessite également de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur rythme circadien car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet seront hebergés dans une pièce spécifique en cycle inversé afin de manipuler les animaux pendant leur phase d'éveil quand la lumière est éteinte. Cette inversion du cycle jour/nuit plus adapté à l'expérimentation sur les animaux nocturnes participera au bien-être animal. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel a été générée l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes et des gènes REVERBs. De plus, afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.
Impact de l’administration de l’acide-tout-trans-rétinoïque par voie orale sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, sur la croissance et l’immunité tumorale.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des administrations orales de bactéries et d'acide rétinoïque, une injection dans un ganglion et un prélèvement de sang, avant mise à mort pour prélever tumeur, foie, intestins, ganglions et rate. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et un inconfort lors des administrations, l'objectif étant de restaurer l'efficacité des immunothérapies en cas de déséquilibre du microbiote. Sur le remplacement, il affirme que seul un animal vivant et "entier" permet d'étudier l'immunité antitumorale, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant un déséquilibre de la flore intestinale ou dysbiose. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin (MAdCAM-1). L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. De plus, il a été montré que l’acide tout trans rétinoïque (ATRA, all tran retinoic acid) (dérivé de la vitamine A utilisé pour traiter des leucémies) augmente l’expression du ligand de MAdCAM-1 sur les lymphocytes et réprime l’induction de certaines cellules néfastes. Cette surexpression de ce ligand permettrait une meilleure captation des cellules immunitaires intestinales vers l’intestin en cas de dysbiose. Pour comprendre ce lien entre l’ATRA et la réponse anti-tumorale, nous souhaitons dans un contexte de dysbiose supplémenter nos souris en ATRA pour comprendre son effet sur le MI, sur l’effet des immunothérapies, sur l’expression de MAdCAM-1 et de son ligand et sur la migration des cellules immunitaires entre l’intestin et la tumeur. Pour cela, nous voulons administrer l’ATRA par voie orale. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet bénéfique de la supplémentation en ATRA sur la réponse anti-tumorale aux immunothérapies en cas de dysbiose en capturant les cellules néfastes au niveau de l’intestin permettant ainsi la recirculation des cellules immunitaire bénéfiques vers la tumeur.
Bénéfices attendus
Nous voulons ainsi montrer la restauration de l’efficacité des immunothérapies post traitement par l’ATRA (all trans retinoic acid) malgré le contexte de dysbiose intestinale. (dérégulation de la flore) Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunitaires néfastes de l'intestin vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, l’ATRA, déjà disponible dans la pharmacopée humaine semble être une bonne molécule pour atteindre cet objectif.
Procédures
Les interventions seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute) sous anesthésie locale, l’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’ATRA (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) sous anesthésie locale, et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 1min) sous anesthésie locale ou générale suivant les prélvèement..
Impact sur les animaux
Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acide tout-trans-rétinoïque (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Ce résultat statistique sera basé sur l'expression tissulaire de MAdCAM-1 ou sur la différence de taille tumorale entre les groupes. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. Les souris seront donc adultes ce qui permettra un passage plus aisé à l'Homme dans la suite de l'étude.
Etude de l’effet antalgique de l’oligodésoxynucléotide IMT504 sur l’hypersensibilité viscérale d’origine colique dans un modèle d’inflammation intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent du dextran sulfate de sodium qui détruit la barrière intestinale et provoque une colite, subissent des injections quotidiennes pendant cinq jours et un test de distension du côlon au moyen d'un ballonnet, avant mise à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur indique évaluer la sévérité de la colite par la consistance des selles, la perte de poids et la présence de sang, et teste une molécule antalgique, l'IMT504. Il affirme que l'étude du comportement douloureux ne peut se faire que sur l'animal vigile, la caractérisation du mécanisme étant ensuite renvoyée à des modèles cellulaires.
Objectifs
La prise en charge des douleurs viscérales reste, à ce jour, limitée en raison de la faible efficacité des thérapies antalgiques actuellement disponibles, de leurs effets indésirables, notamment sur la physiologie intestinale, et de l’origine de ces douleurs souvent multifactorielle et hétérogène selon les pathologies considérées. Le besoin d’innovation thérapeutique demeure ainsi pressant dans ce domaine de recherche puisque ces douleurs présentent généralement une forte composante cognitivo-émotionnelle pouvant affecter durablement la qualité de vie des patients. L’IMT504 est une molécule agissant sur le système immunitaire initialement développée en tant qu’adjuvant vaccinal permettant de promouvoir la production d’anticorps afin d'accroître l'efficacité des vaccins. Depuis ces premières études, un rôle nouveau de cette molécule a été mis en évidence dans le traitement des douleurs chroniques au niveau cutané en agissant notamment sur le recrutement et l’activation de cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l’inflammation. Le côlon est un organe soumis à une surveillance immunitaire permanente du fait de sa proximité avec la lumière intestinale contenant une multitude de corps étrangers alimentaires et microbiens. La rupture de la barrière intestinale est un évènement fréquemment associé aux pathologies intestinales entrainant, de fait, un passage accru de ces corps étrangers à travers la paroi intestinale aboutissant à une réaction immunitaire et inflammatoire et, consécutivement, à la sensibilisation des neurones innervant l'intestin transmettant l'information douloureuse intestinale. Ce phénomène peut être modélisé chez l’animal par administration de Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez l’animal. Cette molécule, en détruisant les cellules intestinales séparant le contenu du tube digestif du reste de l'organisme, va rompre l’intégrité de la barrière intestinale et, par le biais des mécanismes cités précédemment, provoque une hypersensibilité viscérale. Le but de ce projet est donc, dans un premier temps, d’étudier la cinétique de recrutements de populations de cellules immunitaires dans le modèle d'inflammation colique au DSS et, par la suite, d’évaluer les effets de l’administation d’IMT504 sur la sensibilité viscérale dans ce modèle en lien avec la modulation des populations de cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a un objectif double. Tout d'abord évaluer l'effet de l'IMT 504 sur la douleur viscérale dans un contexte inflammatoire. Actuellement, un projet d'étude clinique réalisé par nos collaborateurs argentins expérimentant l'effet de cette molécule sur des douleurs d'origine somatique va bientôt être mis en oeuvre. Ainsi, cette molécule pourrait constituer une alternative aux molécules antalgiques actuellement disponibles dans le traitement des douleurs viscérales avec un transfert potentiellement rapide chez l'homme. Dans un second temps, l'IMT504 constitue un outil de recherche fondamentale nous permettant de caractériser les interactions entre les cellules neuronales et immunitaires dans un modèle de douleur intestinale. En effet, la capacité de l'IMT504 à recruter des cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l'inflammation nous permettra d'étudier la capacité de ces cellules à réduire l'activité neuronale, et par là-même, le contrôle du message douloureux par les cellules immunitaires. Ainsi, outre le caractère pharmacologique de ce projet, de nouveaux aspects sur la physiopathologie des douleurs viscérales inflammatoires seront étudiés.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une injection sous-cutanée quotidienne durant 5 jours consécutifs d'IMT504 ou de la molécule contrôle (Chlorure de sodium). Pour l'evaluation de la sensibilité colique, les animaux seront soumis à un test de distension colorectale qui consiste à appliquer des pressions de distensions croissantes à l'aide d'un ballonnet préalablement inséré dans le côlon distal des animaux. Chaque distension dure 20s et un intervalle d'au moins 4min est respecté entre chaque épisode de distension. Au total le test de sensibilité colique dure donc 30 minutes.
Impact sur les animaux
L'administration de DSS induit une colite dont la sévérité sera évaluée quotidiennement par l'expérimentateur par la mesure du score DAI (Disease Activity Index) en prenant en compte les 3 critères suivants: consistance des selles, perte de poids, et présence de sang dans les selles.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour la collection de tissus et des analyses mécanistiques réalisées in vitro.
Remplacement
Les études sur le comportement douloureux des animaux ne peuvent être effectués uniquement sur l'animal vigile. Les expérimentations visant à caractériser le mécanisme d'action de l'IMT504 seront ensuite réalisées in vitro sur des modèles cellulaires.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Les animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.
Choix des espèces
Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (10 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Evaluation préliminaire de la marge de sécurité en vue de l’utilisation clinique d’un candidat médicament pour lutter contre la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties en six groupes de doses, elles reçoivent un candidat médicament par voie orale puis subissent des prélèvements de sang à la queue, avant mise à mort pour examiner leurs organes et doser l'accumulation du produit. Le porteur indique qu'une toxicité peut apparaître aux fortes doses, avec des signes d'inconfort, l'objectif étant de fixer la dose maximale tolérée avant des essais réglementaires puis cliniques contre la maladie de Huntington. Sur le remplacement, il affirme que les études de toxicité sont obligatoirement menées sur l'animal et "indispensables" avant le passage en clinique.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Il a été identifié une molécule capable de restaurer le transport neuronal, défaut primaire associé à la maladie de Huntington, dans les neurones humains et murins. Il a ensuite été démontré qu’un traitement sous cutané d’un mois avec ce candidat médicament permettait d’améliorer les défauts moteurs et psychiatriques dans un modèle souris de la maladie de Huntington. Afin de développer le candidat médicament pour des patients atteints de la maladie de Huntington, l’équipe de recherche suit les directives de l’agence européenne du médicament parmi lesquelles figurent l’obligation de réaliser des études de sécurité non-clinique (nommées « études réglementaires ») en amont des études cliniques (voir la guideline européenne ICH M3(R2). Le projet a donc pour objectif de préparer ces études réglementaires pour 1/ aider à identifier la dose maximale tolérée et 2/ réaliser une première évaluation de la marge de sécurité du candidat médicament. Le candidat médicament cible une voie thérapeutique jamais évaluée auparavant, et n’a jamais été utilisé chez l’homme, cette étude préliminaire permet donc d’orienter la conception des études réglementaires notamment en termes de choix des doses.
Bénéfices attendus
Il a été démontré avec des premiers résultats preuve de concept l’intérêt thérapeutique de la molécule dans un modèle souris de la maladie. Il est nécessaire maintenant d’identifier la dose maximale tolérée afin de borner le choix des doses à utiliser pour les études de toxicité réglementaire en dose répétée, études préconisées par l’agence européenne du médicament avant le passage en clinique. L’identification d’une dose maximale tolérée élevée et éloignée de la dose efficace connue permettra également de rassurer quant au profil de sécurité du candidat médicament pour les études cliniques
Procédures
Le traitement sera administré par voir orale. Le geste permettant l’administration orale dure 10 secondes. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après administration du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin. Ces actes expérimentaux n'impliqueront que des nuisances mineures chez l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation. Une toxicité d’une dose unique et rapide induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer visuellement l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de doser l’éventuelle accumulation du produit dans les organes cibles.
Remplacement
Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont indispensables à la validation du profil de sécurité du médicament avant d’envisager le passage en clinique. Notre étude permet de documenter le profil de sécurité du médicament in vivo et les résultats seront utilisés pour concevoir les études de toxicités réglementaires.
Réduction
Pour cette procédure, nous limitons au maximum le nombre d’animaux afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 6 groupes différents (différentes doses). Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations du médicament dans le plasma ainsi que pour écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites, et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement oral et les prélèvements de plasma seront réalisés par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ces deux gestes. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation palliée par une injection de liquide physiologique en sous cutané.
Choix des espèces
Les études preuves de concept et pharmacocinétique précédemment réalisées avec notre candidat médicament ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter notre corpus de données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à définir la dose maximale tolérée et donc à préparer les études de toxicité réglementaire qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.