Rongeurs

349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.

Objectifs

La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.

Bénéfices attendus

Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.

Procédures

prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure

Impact sur les animaux

Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure

Remplacement

Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)

Réduction

Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).

Raffinement

Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).

Choix des espèces

Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance

510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un transporteur dans la formation de la myéline. Une partie reçoit cinq injections de tamoxifène puis subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière sous anesthésie, l'autre, âgée de cinq jours, reçoit les injections avant d'être tuée à divers stades du développement. Le porteur signale des douleurs post-opératoires, un risque d'hémorragie et d'hypothermie et des hématomes liés aux injections répétées, avant prélèvement des tissus. Il présente les modèles murins comme "indispensables" au motif que les cultures et les invertébrés ne reproduisent pas la myélinisation.

Objectifs

Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le contrôle de la formation de la gaine de myéline qui protège les neurones dans le système nerveux central. Dans des conditions pathologiques, la formation d’une nouvelle myéline, processus appelé remyélinisation, est importante pour protéger les fibres nerveuses d’une dégénérescence et pour restaurer la conduction rapide de l’influx nerveux. La myélinisation et la remyélinisation sont des processus contrôlés par de nombreux facteurs et signaux, qui sont souvent altérés dans plusieurs maladies comme la sclérose en plaques. Notre hypothèse est que le lactate, via son transporteur, est une source énergétique importante pour la myélinisation et de la remyélinisation. L’objectif de notre projet est de déchiffrer le rôle de ce transporteur dans le processus de la myélinisation dans des conditions physiologiques et pathologiques afin de développer de nouvelles stratégies de thérapie régénérative pour les pathologies de la myéline. L’étude sera menée sur des souris portant des modifications génétiques qui perturbent le fonctionnement de ce transporteur ainsi que sur des souris contrôles. L’étude nous permettra de mieux comprendre l’implication de ce transporteur ainsi que son rôle dans la réparation des lésions de la myéline.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes pathologiques dans les maladies demyélinisantes du système nerveux central, telle que la sclérose en plaques pour laquelle les thérapies régénératives sont encore limitées. Nos recherches pourraient ainsi contribuer au développement des nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’une protéine qui semble impliquée dans le processus de myélinisation du système nerveux central. Pour cela nous réaliserons une étude du processus de réparation des lésions de la myéline ainsi qu’une étude au cours du développement du système nerveux central de la souris. Nous allons (objectif 1) réaliser 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; volume injecté déterminé par pesée quotidienne de l’animal), puis 48h après la dernière injection, nous induirons une lésion de la moelle épinière, sous anesthésie générale et analgésie (une lésion par animal). Cette opération dure 20-30 minutes par souris. Nous utiliserons 210 animaux pour cette étude. La durée totale de la procédure sera au maximum de 30 jours. Après euthanasie des animaux, on procèdera à la récupération des tissus d’intérêt en vue de leurs analyses. Pour l’étude de cette protéine au cours du développement (objectif 2), nous utiliserons 300 animaux. Les animaux, âgés de 5 jours, recevront 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; chaque injection durant environ 15 secondes). Ils seront ensuite euthanasiés à différents temps expérimentaux afin d’analyser l’impact de la délétion de cette protéine sur la myélinisation.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie (lésions démyélinisantes): hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.

Devenir

Les prélévements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude de processus biologiques complexes comme le processus de myélinisation au cours du développement ou la réparation des lésions de la myéline. Le rongeur est donc l’une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude car il présente un système nerveux myélinisé comme chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement significatives. Nous prévoyons l’utilisation de 210 animaux pour la procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer la remyélinisation et 180 animaux pour réaliser l’étude développementale. Lors de l’étude étude développementale le génotypage des animaux ne pouvant être réalisé avant leur utilisation ; la génération des lots expérimentaux nécessitera l’utilisation de 300 animaux. Soit un total de 510 animaux sur ce projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton, animaux hébergés en groupe), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Durant la procédure de chirurgie, les animaux seront placés sous anesthésie. Les points limites sont ceux définis en amont. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. L’euthanasie de l’animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères absolus.

Choix des espèces

Pour comprendre le rôle d’une protéine d’intérêt dans la réparation de lésions de la myéline, il est nécessaire de réaliser des études in vivo en condition physiologique. L’utilisation de modèles murins, reproduisant certains aspects des pathologies de la myéline chez l’homme, est donc indispensable pour évaluer la fonction de notre protéine en contexte pathologique et pour identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique. Les animaux utilisés seront âgés de 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus, à cet âge, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire des animaux.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le pouvoir pathogène de bactéries E. coli productrices de shigatoxines. Après un jeûne hydrique, elles reçoivent une à deux inoculations orales de bactéries puis subissent prélèvements de fèces, prises de sang et injections, le groupe infecté par des bactéries pathogènes développant faiblesse, diarrhée et déshydratation. Le porteur décrit des points limites et une mise à mort pour prélever les organes, et indique que le projet est financé par l'Argentine, où le syndrome hémolytique et urémique est le plus fréquent. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'est "suffisamment sophistiquée" pour simuler un organisme à plusieurs organes.

Objectifs

Certaines bactéries, appelées STEC, produisent des toxines particulières, qui leur confèrent la capacité à provoquer des infections chez l’homme. Les symptômes liés à ces infections vont de la diarrhée bénigne à des symptômes très graves : hémorragie intestinale, syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3-5% et plus d’un tiers des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La toxine produite par les STEC est une protéine formée non par la bactérie mais par un virus qui infecte cette bactérie (phage). Expérimentalement, chez la souris, une STEC infectée par le phage est pathogène. A l’inverse, les STEC chez lesquelles le phage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Lorsque les bactéries infectées par le phage se trouvent dans un organisme de mammifère et qu’un stress est induit, les phages sont libérés par la bactérie, peuvent atteindre les organes-cibles (ex : le rein), et produire la toxine qui induit des dommages. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans les infections causées par les bactéries STEC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans la production de la toxine dans l’organisme. L’utilisation de souris dépourvues de microbiote intestinal (axéniques) permettra de s’affranchir des interférences avec les bactéries de ce microbiote à deux niveaux : en évitant la transmission possible du phage à des bactéries du microbiote intestinal ; en évitant un « effet barrière » du microbiote intestinal à l’égard des STEC, qui affaiblirait leur pouvoir pathogène. Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certains symptômes. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5%) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique, en particulier lors d’infection par des denrées alimentaires contaminées. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant, ce qui explique que le présent projet soit financé par ce pays.

Procédures

En début de procédure, les souris sont soumises à un jeûne hydrique de 4 heures, suivi d’une inoculation par voie orale. Les souris ont au maximum 2 inoculations orales à 30 min ou 24 heures d’intervalle. Puis des prélèvements de fèces sont effectués quotidiennement pendant 7 jours. Les animaux auront un prélèvement de sang qui dure 30 secondes environ. Les animaux recevront deux injections qui dureront moins de 30 secondes. Des organes et du sang seront prélevés après analgésie et anesthésie profonde (sans réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant les bactéries sans phage sont réduites. L’inoculation par voie orale sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les injections seront également réalisées par du personnel très expérimenté. Les nuisances attendues dans le groupe recevant les bactéries avec phage, donc pathogènes, sont : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures seront mises en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition de symptômes. Des points limites ont été identifiés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Ceci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus sur lesquels seront pratiquées différentes analyses.

Remplacement

L’analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience argentine dans le domaine étudié permet de considérer que 10 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe dans tous les groupes. Dans les groupes inoculés avec la bactérie pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si l’euthanasie est trop précoce, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 30 souris supplémentaires, qui seront utilisées si nécessaires. Au total, nous prévoyons d’utiliser 110+30=140 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus par cages, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, buchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher et hamac dans lequel se percher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement bénéficié les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue. De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté aux souris si elles montrent des signes de déshydratation. Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite de possibles symptômes et décider d’une euthanasie anticipée si les points limites sont atteints. Les bactéries seront administrées par voie orale à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Toutes les injections seront effectuées par du personnel expérimenté. Préalablement à l’euthanasie des souris, de puissants antalgiques et analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris de 3 semaines (semaine suivant le sevrage). Chez l’être humain, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants. Nous utilisons en part égale des souris mâles et femelles car la maladie touche indifféremment les deux sexes.

190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à quatre immunisations par injection sous anesthésie et autant de prélèvements de sang, pour recréer des expositions successives à des pathogènes et étudier la maturation du système immunitaire. Le porteur annonce peu de douleur, avec une perte de poids transitoire et parfois du sang dans les fèces, puis une mise à mort pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce qui se passe dans un "organisme entier" et conclut au caractère "obligatoire" du recours à la souris.

Objectifs

Au cours de sa vie, l’Homme est infecté par une quantité d'agents pathogènes (bactéries, virus, etc…). Cette exposition aux microbes de l’environnement, façonne notre système immunitaire au cours du temps et modifie probablement ces propriétés. Cependant, de façon surprenante, la majorité des études sur le système immunitaire sont basés sur des souris élevées dans des conditions d’hygiène très strictes et très contrôlées. Ces animaux exemptes de pathogènes sont actuellement la référence pour les études scientifiques et pour les tests précliniques. Récemment, plusieurs travaux suggèrent que l'élevage de souris dans un environnement sans agents pathogènes a des effets importants sur l’état de maturation du système immunitaire. En effet, il a été montré que le système immunitaire des souris de laboratoire est proche de celui d’un nouveau-né, alors que le système immunitaire de souris vivants dans la nature est lui, proche et représentatif d’un humain adulte. Dans ce contexte, les différences observées entre souris de laboratoire et souris issues de milieu sauvage, font des souris de laboratoire un modèle inadapté pour les études précliniques et soulignent la nécessité de nouveaux modèles murins qui intègrent des variables environnementales. Ainsi, ce projet vise à tout d’abord à comprendre l’impact, sur le système immunitaire, d’une exposition successive à différents pathogènes qui mimerait ce que l’Homme subit au cours de sa vie. Puis, dans un second temps, ce projet permettra également mieux comprendre les maladies liées à un dérèglement du système immunitaire comme les maladies auto-immunes et le lupus en particulier.

Bénéfices attendus

Cette étude originale permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires anti-infectieuses et d’améliorer les modèles murins actuels de maladie humaine. En effet, ce projet permettra de développer un modèle murin reflétant plus justement le système immunitaire humain adulte et qui intègre des variables environnementales. De plus, les résultats obtenus permettront de mieux caractériser les dysfonctionnements du système immunitaire liés aux pathologies auto-immunes comme le lupus.

Procédures

Les animaux seront soumis à des immunisations (injections, 10 secondes) 1seule fois/animal, ou 4 fois/animal et seront réalisées sur animaux anesthésiés . Des prélèvements de sang seront réalisés sur animaux anesthésiés (10 secondes - 1 seule fois/animal , ou 4 fois/animal avec un mimimum de 14 jours d'intervalle entre les 2 prélevements).

Impact sur les animaux

Peu de douleur est attendue au cours des procédures réalisées. Peu de douleur également attendue au cours des prélèvements de sang. Cependant, une legere perte de poids transitoire peut etre observé après immunisation. De facon rare, des féces molles ou du sang dans les feces peuvent également être observé au cours de la procédure.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélèver les organes et d'étudier plusieurs paramètres immunologiques.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre comment une exposition antérieur à des pathogenes peut génerer des cellules spécifiques protectrices qui vont infiltrer les tissus et y résider de facon permanente. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour comprendre ce mécanisme.

Réduction

Un nombre minimum de souris nécessaire à une analyse statistique sera utilisé en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Ainsi, 5 animaux par groupe seront néccessaire. Un test statistique sera réalisé permettant la comparaison de 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Des enrichissements de l’environnement (composants de nidification et igloo) seront apportées. Précautions particulières : - Immunisation par les différents pathogenes : Les immunisations sont réalisées sous brève anesthésie. Aucun signe clinique, n’est attendu suite à l’immunisation. Néanmoins, afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé, les animaux seront pesés quotidiennement les 7 jours suivant l'immunisation et feront l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques. En effet, bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Les souris seront âgées de 6-10 semaines au démarrage de l’expérience car le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

3 425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les protéines des synapses dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Une partie sert à créer et maintenir les lignées et reste vivante à l'animalerie, l'autre est tuée après biopsie de l'oreille, gavages et prélèvement du cerveau. Le porteur signale qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs vers 7 à 8 mois. Les bénéfices thérapeutiques annoncés sont renvoyés au 'moyen/long terme'.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Nous voulons identifier comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses mais également qui produit ces protéines : le neurone lui-même, ou l’astrocyte, connu pour son interaction étroite avec les synapses. Nous utiliserons des souris P301S, l’un des rares modèles de MA à reproduire la perte synaptique comme observée dans la MA. J'analyserai les protéines synaptiques spécifiquement produites par des neurones ou par des astrocytes chez ces souris. Cette étude nous permettra d'identifier précisément comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses endommagées par la MA, ainsi que l'origine cellulaire de ces protéines (neurone ou astrocyte).

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver un échange astrocyte/synapse physiologique et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.

Procédures

- Une biopsie rapide de l'oreille (2 secondes) - Des traitements par gavage oral 1 fois/24 h pendant 5 jours continus, et dans une diète purifiée pendant un mois et dans l'eau de boisson pendant 2 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injection (unique).

Impact sur les animaux

Le gavage oral ne se fait pas sous anesthésie mais sera fait par des experts animalier afin de réduire le stress des souris lors de la procédure et seront faites sur un temps répété relativement court de 5 jours (un gavage par jour). Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement ANL.

Devenir

Pour la partie du projet permettant la création et maintien de lignées de souris à phénotype dommageable, une partie des souris sera gardée afin de maintenir les lignées à l'animalerie, l'autre partie sera utilisée pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus. Pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.

Réduction

Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.

Choix des espèces

Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (P301S) exprimant la protéine tau humaine mutée. Ces souris développent une perte synaptique et des troubles cognitifs comme chez les patients MA. Les souris P301S croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4 dans un précédent projet, seront utilisées pour l'étude. Pour la procédure 1, les souris seront utilisées pour la reproduction dès 8 semaines. Pour la procédure 2: - Toutes les souris de la procédure 2 seront traitées par gavage à l’âge de 4 mois permettant ainsi l’expression d'une molécule par les neurones ou par les astrocytes. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle