Rongeurs
Evaluation de l’efficacité de traitements anticancéreux en utilisant des modèles précliniques chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 3750
3 750 souris et 3 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des cellules tumorales ou des agents cancérogènes, puis des substances testées quotidiennement pendant jusqu'à trois mois, sont hébergés seuls en cage métabolique et mis à jeun, dix d'entre eux subissant en plus une ablation des ovaires. Le porteur décrit des douleurs tumorales, des diarrhées sanglantes dans les modèles de colite et des tumeurs assez volumineuses pour limiter les déplacements, effets pouvant durer jusqu'à la fin de l'étude. Sur le remplacement, il écrit en trois phrases qu'il est "nécessaire" de tester une substance dans un organisme complexe, sans détailler les tests in vitro préalables.
Objectifs
Le projet vise à évaluer l’efficacité de traitements candidats anticancéreux dans des modèles expérimentaux. L’étude repose sur trois approches complémentaires : un modèle de tumeur implantée permettant l’analyse rapide de la réponse tumorale, un modèle de cancérogenèse colique et un modèle de cancérogenèse mammaire. L’objectif principal est d’identifier et de caractériser des composés présentant un potentiel thérapeutique, en analysant leur impact sur la croissance tumorale, l’incidence des tumeurs et leur progression. Ce projet contribuera à améliorer la compréhension des mécanismes d’action des traitements anticancéreux et à sélectionner les candidats les plus prometteurs pour un développement ultérieur.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de substances candidates dans des modèles précliniques pertinents de cancer chez le rongeur. Ces études sont destinées à contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la prise en charge des cancers chez l'Homme. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des administrations de cellules tumorales, d’agents carcinogènes ou de substances testées. Ces administrations seront réalisées en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement du modèle. Ces administrations seront quotidiennes pendant plusieurs semaines, avec une durée maximale de trois mois. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intranasale ou orale. Ces administrations sont de courte durée (2 minutes maximum) et sont réalisées sur animaux vigiles, sauf si un stress est observé, auquel cas une anesthésie gazeuse de courte durée peut être utilisée (5 à 10 minutes maximum). Dans les modèles de cancer mammaire et cancer colorectal, les animaux seront soumis à une administration d’un agent carcinogène suivie de cycles d’induction chimique. L’administration de l’agent carcinogène est réalisée une seule fois (2 minutes maximum). Les cycles d’induction sont réalisés via l’eau de boisson pendant des périodes de 5 à 7 jours. Une intervention chirurgicale (ovariectomie) sera réalisée une seule fois chez un groupe composé au maximum de 10 animaux. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La durée de la chirurgie est de 15 à 30 minutes par animal. Les animaux seront hébergés individuellement en cage métabolique afin de permettre la collecte des urines et des fèces. Cet hébergement implique un isolement des congénères et pourra être associé à une mise à jeun lorsque celle-ci est requise par le protocole expérimental, pour une durée de 4 à 24 heures maximum. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés chez l'ensemble des animaux en cours d'étude ou en fin de procédure afin d'évaluer les paramètres biologiques nécessaires à l'atteinte des objectifs scientifiques de l'étude (par exemple : suivi de l'activité de la substance test, dosage de biomarqueurs ou paramètres biochimiques). Ces prélèvements sont de courte durée (5 à 10 minutes maximum) et réalisés sous anesthésie si besoin. En fin d'étude, tous les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Sous anesthésie, les prélèvements et interventions nécessaires à l'obtention des échantillons biologiques requis pour les objectifs de l'étude seront réalisés, puis les animaux seront mis à mort sans réveil. Cette intervention dure au maximum 10 à 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux et inflammatoires peuvent générer une douleur liée au développement des tumeurs ou à l’inflammation induite, ainsi qu’un stress lié aux administrations répétées et aux manipulations. Les administrations de substances peuvent également entraîner des réactions locales au point d’injection (rougeur, irritation, inflammation). Les signes cliniques peuvent se manifester par une diminution de l’activité locomotrice, une perte de poids, une diminution de la prise alimentaire et hydrique, une altération de l’état général, ainsi que des modifications du pelage. Dans les modèles de colite, des diarrhées, parfois associées à la présence de sang, peuvent être observées. Le développement tumoral peut entraîner une gêne fonctionnelle en fonction de la localisation et de la taille des masses, pouvant aller jusqu’à une limitation des déplacements. Les interventions chirurgicales peuvent induire une douleur post-opératoire ainsi qu’un stress lié à l’anesthésie et à l’acte chirurgical. Ces effets peuvent apparaître progressivement au cours de l’étude et durer plusieurs jours à plusieurs semaines, voire jusqu’à la fin du projet. Une partie de ces effets est réversible avec l’arrêt des procédures ou avec la mise en place de traitements adaptés.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses biologiques/biochimiques qui permettront d’atteindre les objectifs du projet.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque groupe est composé de 10 animaux au maximum, conformément aux pratiques couramment décrites dans les modèles tumoraux précliniques et aux données historiques internes. Pour obtenir un effet statistique significatif, nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Certains modes d’administration des substances nécessiteront la mise en place d’une analgésie adaptée. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière sera réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) sera mis en place chez les animaux présentant des signes cliniques susceptibles d'affecter leur mobilité ou leur état général, afin de renforcer le suivi du bien-être animal. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement sera réalisée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites. Pour la chirurgie, une anesthésie générale sera réalisée. Pendant toute la durée de la procédure, les animaux sont placés sur des tapis chauffants et endormis par une anesthésie générale fixe ou gazeuse. Une couverture analgésique adaptée sera appliquée en pré-opératoire et en post-opératoire. L’analgésie est adaptée en fonction de l’observation des animaux. L’analgésie pré-opératoire est complétée par une analgésie locale. Le choix de l’anesthésie dépend du produit à tester et des possibles interactions médicamenteuses. Des points limites adaptés seront mis en place.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un des mécanismes biologiques similaires à ceux de l’Homme. Leur génotype est connu. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire ce modèle d'étude. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Implication d’un dérivé lipidique sécrété par les macrophages dans le mauvais fonctionnement des cellules adipeuses thermogéniques qui aident à brûler les calories
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
2 200 souris vont être utilisées, dont 920 nourries seize semaines au régime gras, 280 isolées 48 heures en cage métabolique et 240 placées à 5 °C pendant six heures ou dix jours, avec mesure de la température rectale. 560 d'entre elles subissent trois tests métaboliques comportant sept piqûres sanguines chacun, 640 une injection quotidienne pendant sept jours, et 1 560 un prélèvement à la veine temporale juste avant leur mise à mort. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées pour récupérer organes et sang. L'objectif affiché est d'identifier une enzyme des macrophages comme cible future de médicaments contre l'obésité, perspective renvoyée à d'éventuels développements ultérieurs.
Objectifs
Dans notre organisme, il existe deux grands types de cellules graisseuses, appelées adipocytes. Les adipocytes blancs stockent les graisses issues de notre alimentation, tandis que les adipocytes bruns et beiges les brûlent pour produire de la chaleur. Cette combustion joue un rôle essentiel pour maintenir la température du corps lorsqu’il fait froid, mais aussi pour éliminer l’excès de calories après un repas. Chez les personnes souffrant d’obésité, ces adipocytes « brûleurs de graisse » fonctionnent moins efficacement. Mieux comprendre les mécanismes responsables de cette défaillance pourrait donc ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour restaurer leur activité et favoriser la perte de poids. Des travaux scientifiques ont montré que certaines cellules immunitaires, appelées macrophages, présentes dans les tissus adipeux, participent au bon fonctionnement de ces adipocytes grâce à un dialogue étroit entre cellules. Cependant, en situation d’obésité, ces macrophages changent de comportement et se mettent à produire des substances qui freinent l’activité des adipocytes brûleurs de graisse. L’une de ces substances pourrait être un dérivé lipidique fabriquée par les macrophages grâce à une enzyme spécifique. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si et comment, la production de ce dérivé lipidique par cette enzyme des macrophages contribue au dysfonctionnement des adipocytes bruns et beiges.
Bénéfices attendus
L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de ce dérivé lipidique produit par les macrophages dans la dysfonction des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer l'enzyme le synthètisant comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Des souris (920) seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles (1200) par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 2 min/souris. Pour les mesures en cage métabolique, les souris (280) seront en hébergement individuel pendant 48 h. Des souris vigiles (560) recevront seront soumises à 3 tests d’explorations métaboliques nécessitant une injection par test. Pour ces 3 tests, ces souris seront soumises à 7 prélèvements d’une goutte sang d'environ 1µl (soit environ 7µL de sang prélevé par test) pour mesurer la glycémie. Les tests seront espacés de 2 semaines. Un prélevement de sang à la veine temporale sera également réalisé sur certaines souris (1560) avant la mise à mort dans certaines procédures. Des souris vigiles (640) recevront une injection et des souris vigiles (640) recevront une injection par jours pendant 7 jours. Des souris (920) seront hébergées à thermoneutralité (30 °C) pendant 18 semaines maximimum. Pour les expériences d'adaptation au froid par mesure de la température rectale, les souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h (120 souris) ou 10 jours (120 souris). 7 mesures espacée d'1h seront faites sur les souris hébérgées à 5°C pendant 6h et 1 mesure par jour sera faite sur les souris hébérgées à 5°C pendant 10 jours. 2 mesures espacées de 10 j seront faites sur des souris hébergées à 21 C °(120 souris).
Impact sur les animaux
Les injections sur animaux vigile entrainent une douleur légère et de courte durée. Le prélevement d'une goutte de sang lors des tests d'exploration métabolique peut engendrer une légère douleur de courte durée. Le prélevement de sang à la veine temporale immédiatement avant la mise à mort entraine une douleur légère et de courte durée. La mesure de la masse grasse/maigre nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. La mesure de la dépense energétique en cage métabolique nécessite que les souris soient en hébergement individuel pouvant induire un stress modéré qui sera atténué par une augmentation de l'enrichissement de l'environnement. L'exposition au froid dans les conditions que nous utiliserons induit un stress modéré et une baisse d'environ 2-2.5 °C de la température corporelle mais sans entrainer d'hypothermie sevère car les souris comme tous les animaux à sang chaud (homéothermes) sont capables de mettre en jeux différents processus pour maitenir leur température corporelle interne stable, dans certaines limites, indépendamment de la température extérieure. La mesure de la température rectale s’effectue à l’aide d’une sonde de petit diamètre mais son insertion dans l'anus de la souris vigile peut être inconfortable pour l’animal et donc susceptible de générer un stress supplémentaire en plus de celui lié à la contention.
Devenir
Mise à mort pour récuperer des organes et du sang pour différentes analyses moléculaires
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études cellulaires qui ont montré que ce dérivé lipidique inhibe le développement/fonction des adipocytes thermogéniques qui participent au contrôle de la prise de poids et à la thermorégulation. Cependant, les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques ainsi que de la thermorégulation et de la régulation de la dépense energétique sont complexes, faisant intervenir un dialogue entre différentes cellules et organes. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de la production ce dérivé lipidique par les macrophages sur la fonction des adipocytes bruns et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet . Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Nous avons utilisé un logiciel dédié pour calculer le nombre d'animaux minimum nécessaire permettant d'avoir un effet statistiquement significatif en utilisant des données préliminaires qui permettent de prendre en compte la variabilité de l'effet étudié. Une des procédures est dépendantes du résultat de deux autres et ne sera réalisée uniquement si ces procédures donnent des résultats montrant une différence significative entre les génotypes, afin de réduire le nombre de souris utilisées dans ce projet.
Raffinement
L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, buchette de bois). Cet environnement a été adapté selon les conditions experimentales pour favoriser le bien-être des souris et des comportements naturels. L'observation quotidienne des animaux permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes et de prendre les mesures correctives nécessaires en fonction des points limites définis adaptés à chaque procédure. Une grille d'observation avec conduite à tenir adaptée à chaque procédure a été mise en place afin de prendre les mesures appropriées. Avec le recul que nous avons sur les experiences proposées, nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux pour les différentes procédures mais dans l’éventualité d’apparitions de points limites définis, les mesures retenues seront mises en oeuvre.
Choix des espèces
L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a un tissu adipeux brun très développé qui contribue à leur dépense énergétique et constitue donc un modèle de choix pour identifier de nouveaux mécanismes régulant la fonction thermogénique de ce tissu et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en lipide, elle devient rapidement obèse. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'Homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux seront étudiés au stade adulte (age 12-23 semaines selon les procédures).
Impact des paramètres de contrôle qualité des lots de vecteurs viraux AAV sur la réponse immunitaire chez la souris, en contexte de thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une chirurgie intracérébrale de 20 à 30 minutes, ou une injection dans l'orbite de l'œil sous anesthésie, sert à administrer des vecteurs viraux à 1 598 souris, dont 1 568 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent trois prélèvements sanguins au sinus veineux rétro-orbitaire et sont tuées pour analyse des tissus cérébraux, y compris les reproducteurs, mis à mort en fin de période de fertilité. Certaines lignées utilisées vieillissent de façon accélérée et meurent vers dix mois, d'autres font des crises d'épilepsie spontanées entraînant une mortalité précoce. Le projet annonce cinq tests comportementaux qualifiés de peu stressants pour évaluer les capacités cognitives, sans préciser lesquels.
Objectifs
La thérapie génique est une approche prometteuse qui consiste à corriger certaines maladies en apportant une version fonctionnelle d’un gène défectueux. Pour cela, des vecteurs viraux sont utilisés comme « transporteurs » afin d’acheminer ce gène dans les cellules du patient. Cette stratégie a déjà permis des avancées importantes dans le traitement de maladies rares. Cependant, des effets secondaires graves ont été observés lors de certains essais cliniques, en particulier lorsque des doses élevées de vecteurs sont nécessaires. Ces effets sont en partie liés à une réaction excessive du système immunitaire. L’un des enjeux majeurs actuels est donc de rendre ces traitements plus sûrs, en réduisant les doses administrées tout en conservant leur efficacité. Une piste importante consiste à améliorer la qualité des vecteurs produits, afin qu’ils soient plus performant et mieux toléré. Ce projet vise à mieux comprendre comment la qualité des vecteurs viraux influence la réaction du système immunitaire. Plus précisément, il s’agit d’identifier quels critères de qualité permettent de limiter les réactions indésirables. Nous étudierons également l’impact de certains paramètres, comme la composition des vecteurs viraux , sur leur efficacité et leur tolérance par l’organisme receveur. Ces recherches seront menées chez la souris, modèle essentiel pour étudier à la fois les effets du traitement et les réactions biologiques dans un organisme entier. Une partie du projet portera sur la maladie d’Alzheimer, afin d’évaluer le potentiel de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux seront donc évalués sur leur capacité d’apprentissage avant et après traitement avec un vecteur viral codant un gène médicament.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’améliorer la sécurité et l’efficacité de la thérapie génique, une approche innovante qui pourrait transformer le traitement de nombreuses maladies graves, notamment des maladies génétiques et neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Elle a déjà fait ses preuves dans le cas de maladies génétiques rares. En comprenant mieux comment la qualité des vecteurs utilisés influence la réaction du système immunitaire, cette étude permettra d’identifier des critères essentiels pour produire des traitements mieux tolérés par l’organisme. À terme, cela pourrait réduire les effets secondaires observés chez certains patients et rendre ces thérapies accessibles à un plus grand nombre de personnes, y compris dans des maladies nécessitant des doses élevées. Les résultats attendus apporteront également de nouvelles connaissances sur les interactions entre les traitements et le système immunitaire, un enjeu clé pour le développement de nombreuses approches thérapeutiques. Au-delà de la santé humaine, ce projet contribuera à améliorer les méthodes de production et de contrôle qualité des vecteurs utilisés en recherche biomédicale, ce qui bénéficiera à l’ensemble de la communauté scientifique. À plus long terme, ces avancées pourraient accélérer le développement de nouveaux traitements plus sûrs et plus efficaces pour diverses maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - Une partie des animaux recevra un vecteur viral par chirurgie intracérébrale à l’âge adulte (durée : 20 à 30 minutes), à la suite de quoi les animaux récupèrent généralement en quelques heures. - Une partie des animaux recevra le vecteur viral par injection rétro-orbitaire à l’âge adulte (cet acte dure moins d’une minute et se pratique sous anesthésie). - Une partie des animaux sera soumise à 5 tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacités cognitives et d’apprentissage. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris et par jour. L’ensemble des tests est effectué sur une période de 4 à 6 semaines en fonction du nombre de tests prévus (4 à 5). - Pour le suivi de la réponse immunitaire, l’ensemble des animaux subiront trois prélèvements sanguins (effectué en quelques secondes au niveau du sinus veineux rétro-orbitaire) avant injection, puis 1 jour et 1 mois après-injection.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui entraineront les effets indésirables différents : - Les effets secondaires liés à l’injection se limitent à une douleur transitoire au niveau du point d’injection. - Une des souches de souris présente un vieillissement accéléré qui se traduit par une surmortalité survenant vers l’âge de 10 mois environ. - Une des souches de souris peuvent présenter des crises d’épilepsie spontanées conduisant à une mortalité précoce - L’injection peut entraîner une hémorragie légère au site d’injection qui se résorbe spontanément en quelques minutes. - Les tests comportementaux sont réalisés sur animaux vigiles et peuvent entraîner un stress léger. Ce stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session d’étude. - Les prélèvements sanguins ou injection peuvent conduire à une légère hémorragie au site d’injection, facilement jugulée par compression légère.
Devenir
Tous les animaux sont destinés à une étude des tissus et/ou analyse et de l’expression des gènes au niveau des régions atteintes du cerveau, ce qui nécessite leur euthanasie. Les animaux reproducteurs des différentes lignées utilisées seront euthanasiés en fin de période de fertilité. Ces animaux ne seront en effet plus utilisables dans le cadre du projet, et ne pourront pas non plus être réutilisés dans d’autres projets du fait des potentiels biais expérimentaux induits par la période de reproduction active . L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées.
Remplacement
Ce projet fait appel à des modèles de souris déjà caractérisés de la maladie d’Alzheimer. A l’heure actuelle, ce projet ne peut être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet, les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être reproduits que chez l’animal, notamment dans les modèles murins. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur une espèce modèle mammifère comme la souris, qui possède un cerveau complexe doté d’un système permettant d’exprimer des comportements sophistiqués. De plus la proximité entre l’espèce humaine et la souris maximisera la pertinence des cibles thérapeutiques identifiées au cours de ce projet.
Réduction
Une étude statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe nécessaire pour observer des effets significatifs. Cette étude est basée sur des données obtenues dans la littérature scientifique et sur les valeurs que nous avons observées dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 1578 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum, a été déterminé en fonction des expériences à réaliser pour pouvoir répondre à la question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous avons prévu les procédures au fur et à mesure avec une réduction du nombre de groupes possible s’il apparait qu’un ou plusieurs des facteurs étudiés apparaissent sans impact sur la réponse étudiée.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’atteinte des points limites, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience à l’aide d’une grille de scoring. Les protocoles d’anesthésie et de diminution de la douleur des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.
Choix des espèces
Choix de l’espèce modèle : L’objectif de ce projet est d’améliorer les connaissances sur la maladie d’Alzheimer afin d’identifier de nouvelles solutions thérapeutiques. La région initialement la plus gravement atteinte dans la maladie d’Alzheimer est celle qui gère la mémoire et les émotions. Les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas cette zone. Il est donc nécessaire de mener ce projet sur une espèce dotée d’un tel système, similaire à celui retrouvé dans l’espèce humaine. Les rongeurs, et la souris en particulier, possèdent une zone très proche de celle de l’espèce humaine. De plus, la grande proximité entre le génome de la souris et le génome humain assure une pertinence maximale des cibles thérapeutiques qui seront identifiées au cours de ce projet. Les souris qui seront utilisées reproduisent les différentes lésions anatomiques retrouvées dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Elles présentent également des altérations cognitives (défauts de mémoire spatiale et de mémoire de travail) qui sont caractéristiques de cette maladie. Ces déficits peuvent être quantifiés par des tests comportementaux qui sont réalisés en routine au laboratoire. Choix du stade de développement étudié : La maladie d’Alzheimer se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits discrets apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les modèles animaux à un temps précoce et à un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin de la maladie, soit entre 4 et 14 mois selon les différents modèles de la maladie qui seront étudiés.
Evaluation de nouvelles thérapies dans des modèles de tumeurs intracrâniennes
- Recherche appliquée
- Cancers
Les doses testées, les voies d'administration et le calendrier suivent les besoins du développement d'un médicament, jusqu'à la prédiction des doses cliniques chez l'être humain. 940 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées directement dans le cerveau au cours d'une chirurgie de 45 minutes, ou par voie intraveineuse et intracardiaque, avant jusqu'à trois séances d'imagerie par semaine pendant huit semaines et des gavages ou injections répétés jusqu'à deux fois par jour. Le porteur reconnaît que les tumeurs cérébrales peuvent provoquer tremblements et convulsions, et prévoit de réutiliser dans un autre projet les 100 souris qui n'auront pas développé la tumeur attendue, les autres étant tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer chez la souris de nouveaux traitements pour les cancers du cerveau et/ou les métastases cérébrales, dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits. Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du cerveau, soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le cerveau des souris par injection intracrânienne ou injectées par voie intraveineuse ou intracardiaque pour mimer le processus métastatique (modèle disséminé). En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur ou de métastases cérébrales, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance tumorale. Les mesures de concentrations permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et la pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité préclinique, de toxicologie réglementaire et enfin pour prédire les doses en développement clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Chaque année, environ 5 900 nouveaux cas de cancer du cerveau sont diagnostiqués en France dont 500 chez les enfants. Il est la première cause de décès par cancer chez les enfants, adolescents et jeunes adultes. Les métastases cérébrales, quant à elles, concernent environ 20% des patients adultes atteints de cancer tout confondu. La prise en charge des cancers du cerveau combine chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie en fonction de son stade de développement, du type de tumeur identifié, de sa localisation et de son agressivité. Lorsque cela est possible, la première phase du traitement d’un cancer du cerveau consiste à utiliser la neurochirurgie pour retirer le maximum de tissu tumoral, sans provoquer de handicap. Il en est de même pour les métastases cérébrales. Contrairement aux tumeurs localisées ailleurs dans l’organisme, le neurochirurgien ne peut se permettre de retirer du tissu sain autour de la tumeur cérébrale pour éviter d’éventuelles récidives, sous peine de séquelles neurologiques graves et irréversibles. En parallèle de la chirurgie, la radiothérapie est un traitement très largement utilisé pour soigner les cancers du cerveau et métastases cérébrales. Elle consiste à délivrer une forte dose de rayons ionisants pour cibler les cellules tumorales tout en limitant les dommages aux tissus sains. Cependant ce type de traitements entraînent des effets secondaires importants et parfois à long-terme. Enfin, la chimiothérapie vise quant à elle à détruire les cellules tumorales avec des médicaments. Elle peut être utilisée seule ou combinée avec la radiothérapie, avant ou après une chirurgie, pour réduire la taille des tumeurs ou éliminer les cellules cancéreuses résiduelles. L’efficacité de ces traitements peut cependant être limitée par plusieurs facteurs, en particulier par la barrière hématoencéphalique qui protège le cerveau en empêchant certains médicaments d’atteindre les tumeurs. Au regard des limitations des traitements actuels pour le cancer du cerveau et des métastases cérébrales, il est primordial de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
1) Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales par voie intracrânienne : chirurgie d’une durée de 45 minutes incluant l’anesthésie jusqu’à la période de réveil, 1 seule fois pendant l’étude. OU • Greffe des cellules tumorales par voie systémique : administration IV ou intracardiaque unique de maximum 5 min sous anesthésie gazeuse, 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine pendant max 8 semaines. • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée, max 8 semaines). • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max2xjour), intrapéritonéale (max2xjour), sous-cutanée (max2xjour), intramusculaire (max2xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. OU o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irradiation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude dans certaines études demandées par le client. 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine faciale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour).
Impact sur les animaux
Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés du cerveau ou ayant des métastases cérébrales, il est possible que les animaux présentent des signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des convulsions. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).
Devenir
Les animaux sont mis en mort en fin de procédure pour prélèvements d’organes/de sang, sauf si les animaux n’ont pas développé les modèles tumoraux escomptés et pourraient être ré-utilisés dans un autre projet dans le cadre de la Réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.
Remplacement
Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorale. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
Réduction
Si le modèle le permet, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme) et de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Nous évaluons à 940 le nombre de souris maximal utilisé pour ce projet. Les animaux de la procédure 1 ou 2 pourront parfois basculées en procédure 3 ou 4 ce qui réduira le nombre d’animaux total du projet.
Raffinement
Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages de 5 animaux contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique type Lacryvisc est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de l’instillation des cellules cancéreuses, une injection en sous-cutanée d’analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées (voir annexe page 39). En fonction de l’état des animaux la surveillance sera renforcée à 2 fois par jour si besoin. Ainsi, à partir d’un total de 4, les animaux seront observés par un vétérinaire et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limites établi, il sera immédiatement euthanasié. Par ailleurs, les souris immunodéficientes utilisées sont hébergées dans des locaux isolés des souris immunocompétentes avec renforcement des équipements de protection individuelle pour éviter qu’elles soient contaminées par des opportunistes.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles de cancer du cerveau/métastases cérébrales chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1) sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2) la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes.
Etude de l’effet de la fibrose sur la croissance du cancer du poumon – MODIFICATIONS
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
Anesthésiées, la peau et les tissus incisés pour dégager la trachée, les souris reçoivent une injection unique d'une molécule qui déclenche une fibrose pulmonaire, puis la plaie est suturée. Deux semaines plus tard, une seconde intubation sous anesthésie leur inocule des particules virales qui déclenchent un cancer du poumon. 640 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des difficultés respiratoires, une posture de repli et une perte de poids possibles. Toutes sont tuées à trois échéances différentes, l'établissement indiquant que leur mise à mort est "nécessaire" au prélèvement des poumons.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique grave, entrainant la mort en 3 à 5 ans. La fibrose est la formation d'une quantité anormalement abondante de tissu cicatriciel. La cause et les mécanismes qui sous-tendent le développement et l’évolution de cette maladie dans le poumon sont inconnus. Elle se manifeste par une perte d’élasticité du tissu de soutien pulmonaire, résultant en une altération des échanges entre les alvéoles contenant l’oxygène et les vaisseaux sanguins. Le poumon devient progressivement trop abimé pour assurer l'oxygénation du sang et le patient développe une insuffisance respiratoire chronique conduisant au décès. Les médicaments disponibles sont uniquement capables d’en ralentir la progression. Ces traitements permettent d'augmenter la survie de ces patients mais on peut craindre l’apparition de cancer du poumon. En effet, les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus susceptibles de développer des cancers du poumon. Avec l'émergence de nouveaux traitements prometteurs contre la fibrose pulmonaire, il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes favorisant la survenue de ces cancers, menaçant potentiellement les patients atteints de fibrose pulmonaire. Les mécanismes conduisant à l'apparition du cancer chez les patients FPI sont encore mal connus. Notre hypothèse est que la fibrose va favoriser la croissance des cancers chez ces patients atteint de fibrose pulmonaire. Nous étudierons des souris génétiquement modifiées pour modéliser le développement du cancer pulmonaire dans le contexte de la fibrose pulmonaire. Ainsi, nous utiliserons des modèles de fibrose pulmonaire établis chez la souris, impliquant une injection au niveau de la trachée sous anesthésie générale de différentes molécules favorisant le développement de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
Les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus enclins à développer des cancers du poumon (une des formes de cancers les plus courantes et mortelles dans le monde). Nos travaux de recherche permettront d’identifier le rôle de la fibrose sur le développement de ces cancers afin 1) d'identifier de nouvelles thérapies potentielles et 2) de permettre une meilleure prise en charge de ces patients fragiles.
Procédures
En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Deux semaines plus tard, les souris recevront une injection unique de particules virales qui activera la formation du cancer du poumon. L’injection se fera via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale gazeuse (durée de la procédure: 5 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à 3 temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.
Impact sur les animaux
Il faut noter que l'induction de la fibrose pulmonaire et d'éventuelle lésions cancéreuses chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général (posture de repli...) avec perte de poids. Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est également possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des cancers associés à la fibrose pulmonaire.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des modèles alternatifs comme des cultures d'alvéoles pulmonaires reconstituées en laboratoire ou de tranches de poumon. Cependant, ces méthodes alternatives ne permettent pas de modéliser la réponse d’un organe entier vivant dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire et du cancer du poumon.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.
Raffinement
1) Surveillance quotidienne: nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. 2) Surveillance clinique en lien avec les procédures: les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement en préopératoire. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur et permettra de détecter une éventuelle souffrance. Selon la grille de surveillance mise en place, la douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques si nécessaire. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront également suivies de manière rapprochée. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés (des antalgiques seront administrés avant l’euthanasie).
Choix des espèces
Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte. Le modèle murin est pertinent du fait de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme.
Formation aux gestes de bases en expérimentation animale
- Formation professionnelle
Réformées de l'élevage, âgées de 6 à 8 mois, 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, ce choix évitant d'en produire de nouvelles. Chacune subit quatre à cinq contentions, un gavage, une injection intrapéritonéale, une à deux injections sous-cutanées, une injection intraveineuse sous anesthésie et une prise de sang, gestes exécutés par des personnes en cours de formation. Le porteur signale que le gavage mal fait peut provoquer stress, irritation et fausse route, et prévoit que le formateur interrompe le geste et mette l'animal à mort si nécessaire. Toutes sont tuées à l'issue, le RNT indiquant qu'elles ne peuvent pas être replacées et qu'elles seront trop vieilles pour être réutilisées.
Objectifs
La présente demande d'autorisation de projet s'inscrit dans un contexte de formations des personnes pratiquant l'expérimentation animale. Notre objectif est de former nos utilisateurs à un ensemble de gestes expérimentaux pratiqués de manière fréquente. Notre service est ouvert à l'ensemble de la communauté scientifique souhaitant mener des projets de recherches in vivo et remplissant les conditions de formations réglementaires. L'enjeu de cette demande d’autorisation de projet s’inscrit dans un contexte de formation et d'acquisitions des gestes de bonnes pratiques d'expérimentations animales. Les bénéfices attendus sont très importants car au-delà du respect de la législation notre objectif est de réduire le nombre d'animaux utilisés au cours des projets ainsi que la souffrance des animaux grâce à l’acquisition des bonnes pratiques.
Bénéfices attendus
A court terme, cette formation permettra à l'ensemble des personnes effectuant des actes expérimentaux sur animal, de le faire d'une manière limitant au maximum la souffrance des animaux. A moyen terme, la répétabilité de la qualité des gestes permettra de limiter le nombre d'animaux nécessaires dans les procédures. Et à long terme, cela s'inscrit dans une démarche d'amélioration continue pour la réduction du nombre d'animaux nécessaires et le raffinement des expérimentations..
Procédures
Pour chaque animal il y aura : 4 à 5 contentions vigiles d'environs 10 secondes, 1 gavage, de 10 à 20 secondes, 1 injection intrapéritonéale de 30 secondes, 1 à 2 injections sous cutanées de 20 secondes, 1 injection intra-veineuse de 30 secondes sous anethésie et un prélèvement sanguin sous anesthésie de 1 minute..
Impact sur les animaux
Le gavage effectué par des personnes en formation peut provoquer plusieurs types de nuisances, stress et irritation (léger) pendant quelques minutes et la fausse route. L'injection sur animal vigile peut générer une douleur légère au point d'injection au moment de la réalisation de l'acte pendant quelques secondes. Les autres gestes sont effectués sous anesthésie et peuvent provoquer une douleur légère au site d'injection/prélèvement dans le cas d'un réveil non souhaité.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à l'issue de la procédure. Ils ne peuvent pas être replacés et seront trop vieux pour être réutilisés.
Remplacement
Avant de participer à cette formation, les personnes sont au préalable formée au cours d'une formation initiale règlementaire. Il est aussi évalué le besoin en fonction des projets, si ces derniers ne nécessitent aucun des gestes présent dans cette formation, alors elle ne sera pas administrée. En revanche, à ce jour, pour qualifier les gestes justifiant ce projet, nous sommes encore dans l'obligation de le pratiquer sur animal vivant.
Réduction
Nous prévoyons pour une formation efficace, par expérience, un maximum de 5 animaux par formation, un pour la demonstration des gestes par le formateur et 4 pour la personne formée. Dans un but de réduire, à chaque fois que ce sera possible, il y aura un regroupement des formations pour réduire le nombre d'animaux utilisés pour la démonstration. De la même manière la personne formée ne travaillera qu'avec le nombre d'animaux strictement nécessaire à la réussite de tous les gestes visés par sa formation, cela peut-être moins que 4 étant donné que tous les gestes sont réalisé sur chaque animal de formation. Donc dans les faits il y aura souvent moins de 5 animaux par personne formée. Les animaux utilisés sont des animaux de réforme des élevages, donc on ne produit pas d'animaux à but exclusif pour ce projet.
Raffinement
Pour éviter le déclenchement du phénotype dommageable des animaux immunodéficients, l'hébergement se fait en cage ventilée et les gestes expérimentaux sont effectuées dans des conditions stériles. Des points limites directs sont mis en place pour détecter et anticiper toute souffrance animale. Le formateur veille à ce que chaque geste soit effectué correctement et intervient pour stopper et mettre à mort si nécessaire. L'anesthésie sera appliquée pour les gestes la nécessitant.
Choix des espèces
La totalité des procédures effectuées par les personnels formés se font sur souris, c'est donc le meilleur modèle pour la formation car directement adaptable à leurs futurs projets. Les animaux utilisés auront entre 6 et 8 mois car se sont des animaux de réforme de production pour éviter d'avoir à produire de nouveaux animaux dans le cadre de la formation.
Décrypter les mécanismes biologiques de la radiothérapie spatialement fractionnée sur la réponse vasculaire et immunitaire chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1780
Les animaux qui montrent des signes cliniques anormaux plus de trois jours sont mis à mort. 1 780 souris et 1 780 rats vont être utilisés dans ce projet, dont 2 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever poumons et cerveau. Les souris reçoivent une irradiation du thorax qui peut provoquer fibrose, rougeurs, croûtes, détresse respiratoire et mort au bout de cinq à six mois, les rats une irradiation du crâne suivie de dépilations et d'ulcérations pendant cinq à six jours. La rubrique décrivant les procédures reste à l'état de formulaire, l'instruction "pour chaque intervention préciser : durée, nombre de fois et nombre d'animaux concernés" y figurant en lieu et place des réponses.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement largement utilisé contre le cancer. Elle repose sur l’irradiation ciblée des tissus tumoraux afin de détruire les cellules cancéreuses ou de limiter leur progression, tout en cherchant à préserver au mieux les tissus sains situés à proximité. Malgré les progrès techniques importants réalisés ces dernières années, les effets indésirables sur les tissus non ciblés restent une contrainte majeure de ce type de traitement. Dans ce contexte, il apparaît nécessaire d’explorer de nouvelles approches permettant d’améliorer le rapport entre l’efficacité du traitement et la protection des tissus sains. Parmi ces approches, certaines visent à modifier la manière de déposer la dose dans le volume irradié. Ces stratégies innovantes s’écartent volontairement des pratiques conventionnelles en proposant une distribution volontairement non homogène du traitement. Des travaux antérieurs menés dans différents modèles expérimentaux ont montré que ce type d’approche pourrait à la fois améliorer le contrôle de la maladie et réduire les atteintes aux tissus sains. Des résultats encourageants ont également été observés dans des contextes cliniques exploratoires, suggérant un fort potentiel de transfert vers une utilisation thérapeutique plus large. Cependant, les mécanismes biologiques à l’origine de ces effets favorables restent encore insuffisamment compris. Une meilleure connaissance de ces phénomènes est indispensable pour sécuriser, optimiser et étendre l’utilisation de ces nouvelles modalités de traitement. Ainsi, l’objectif principal de ce projet est d’améliorer la compréhension des réponses biologiques induites par cette approche innovante, en s’intéressant plus particulièrement aux réactions des vaisseaux et du système immunitaire. Ces connaissances permettront d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette stratégie et de contribuer à terme au développement de traitements plus efficaces et mieux tolérés.
Bénéfices attendus
Les enjeux autour de ces nouvelles techniques de radiothérapie (SFRT) sont nombreux : • Anticiper leur déploiement rapide, voire imminent, en pratique clinique. • Questionner la justification de ce type de techniques en termes de radioprotection des patients, puisqu’elle repose sur un changement de paradigme important. • Saisir l’opportunité du positionnement de l’institut et de la France autour de cette question Acquérir des connaissances et des compétences autour des concepts liés aux modifications du volume d'irradiation pour alimenter l’expertise concernant la radioprotection des patients.
Procédures
- Irradiations sous anesthésie - Prélèvements de sang sous anesthésie - Imagerie scanner sous anesthésie - Echo doppler sous anesthésie Pour chaque intervention préciser : durée, nombre de fois et nombre d’animaux concernés
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Pour le modèle souris, les irradiations localisées au niveau des poumons pourront conduire à de la fibrose radio-induite aux temps tardifs (plus de trois mois post-irradiation). Les souris pourront également développer des lésions cutanées (rougeurs, érythèmes, croutes) suite à l’irradiation. Aux temps les plus tardifs de l’étude (5-6 mois post-irradiation), les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder. Les animaux devront donc être surveillés de près et euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être, comme une perte de poids, une mobilité réduite. Concernant le modèle d’irradiation localisée cérébrale chez le rat, suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours). Pour les deux modèles, compte-tenu de l’objectif qui est d’étudier la réponse vasculaire pulmonaire de ces nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire de fixer un temps d’étude long, ici de 6 mois, pour toutes les études envisagées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, les organes d’intérêt (poumon, cerveau notamment) seront prélevés pour des analyses histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales et immunitaires dans leur environnement tissulaire complet, qui joue un rôle sur la réponse moléculaire des cellules. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude des lésions pulmonaires et cérébrales tardives radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques sur les analyses histologiques, des microscanners, des analyses moléculaires, des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide d’un logiciel statistique. Pour mettre en évidence une différence de 25%, biologiquement significative, entre groupes traités et groupes témoins, il nous faudra inclure 20 animaux par groupe. Dans certains cas, le nombre d’animaux contrôle est augmenté car toutes les irradiations ne peuvent pas être réalisées le même jour. Les animaux seront suivis 6 mois maximum.
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 fois par semaine semaines après l’irradiation. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, de réactivité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie. Lors des irradiations, afin d’assurer un meilleur réveil, les animaux seront placés en thermacage dès la fin de l’irradiation. Des poches d’eau gélifiées ainsi que des croquettes seront également placés dans les cages de transport. Les souris pouvant montrer des signes d’agressivité, des enrichissements supplémentaires seront mis dans les cages (bâtonnet en bois, dôme en carton, coton, papier kraft si nécessaire).
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet nous utiliserons des rats et des souris qui sont des modèles les plus utilisés pour les modèles précliniques. Le modèle d’irradiation thoracique chez la souris est un modèle très utilisé depuis de nombreuses années au sein du laboratoire pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions pulmonaires radio-induites. Le modèle d’irradiation cérébrale rat est un modèle maitrisé par nos collaborateurs du projet qui participeront aux expériences. Nous choisissons des animaux de même âge, et jeunes adultes, pour éviter l’éventuelle hétérogénéité de la réponse liée à l’âge. Il s’agit de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée. Comme tenu du potentiel caractère agressif des souris mâles, notamment en vieillissant, ils seront hébergés par 3 à 4 avec un enrichissement augmenté par rapport aux standards de l’animalerie. En cas de bagarres et/ou de blessures, les animaux pourront être hébergés en cages individuelles.
Rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans l’immunité antibactérienne et la vaccination chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 998 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont gavées trois fois à une semaine d'intervalle avec des salmonelles atténuées, puis une fois avec la souche sauvage, reçoivent des injections intrapéritonéales de bioparticules et des prises de sang, dont certaines par ponction rétro-orbitaire. Une partie voit ses pattes arrière irradiées sous kétamine et xylazine, le reste du corps protégé par un écran de plomb, avant de recevoir une greffe de moelle osseuse. Le porteur prévoit perte de poids, pelage hirsute, yeux larmoyants, posture voûtée, prostration et anorexie, et note qu'une mortalité aiguë peut survenir sans aucun signe clinique préalable.
Objectifs
Salmonella enterica est une bactérie intracellulaire qui infecte les humains et les animaux et constitue une menace majeure pour la santé publique, étant l’une des principales causes de maladies d’origine alimentaire dans le monde. De la gastro-entérite auto-limitée à la bactériémie mortelle, chaque année elles touchent plus d’un milliard de personnes. L’augmentation des résistances aux antibiotiques souligne le besoin urgent de nouvelles stratégies, notamment de vaccins, dont il n’existe actuellement aucun pour les souches non typhiques. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules immunitaires innées reconnues pour leur rôle dans les réponses antivirales. Cependant, leur contribution à la défense contre les bactéries a été sous-estimée et reste peu comprise. Nos travaux récents montrent que Salmonella peut activer ces cellules et induire une inflammation. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle murin pour comprendre comment ces cellules contribuent à la défense contre Salmonella et comment elles peuvent participer à la réponse immunitaire après vaccination. Nous déterminerons d’abord leur fréquence, leur activation et leur statut métabolique lors de l’infection. Ensuite, nous évaluerons le rôle des pDC dans les réponses antibactériennes in vivo, présentant un déficit sélectif de ces cellules, ainsi que l’importance de certains récepteurs pour cette réponse. Nous utiliserons également deux plateformes vaccinales afin de comparer comment les pDC contribuent à l’immunité protectrice selon différents modes d’activation immunitaire, depuis la stimulation induite par le pathogène jusqu’à la délivrance d’antigènes via des micro-technologies.
Bénéfices attendus
Les infections bactériennes chroniques représentent un fardeau majeur pour la santé publique, avec des niveaux élevés de morbidité et de mortalité, ainsi que des impacts économiques et sociaux importants. L’absence de vaccins efficaces et la dépendance actuelle aux antibiotiques rendent le contrôle de ces maladies particulièrement difficile. Le développement de stratégies visant à stimuler la réponse immunitaire de l’hôte constitue une approche prometteuse pour améliorer la protection contre les infections, comme la salmonellose, tout en réduisant les effets secondaires et la durée des traitements antibiotiques. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux mécanismes et cibles pour développer des stratégies alternatives renforçant l’immunité contre les bactéries intracellulaires, avec pour objectif ultime de réduire l’infection et d’améliorer la santé publique. Salmonella sera utilisé comme pathogène modèle, avec la possibilité d’étendre cette approche à d’autres bactéries intracellulaires d’intérêt médical. Ces travaux ont des implications thérapeutiques importantes, notamment face à la hausse des souches bactériennes multirésistantes. En outre, considérant la salmonellose comme une maladie zoonotique, les résultats pourraient également être pertinents pour la médecine vétérinaire, s’inscrivant dans le concept One Health qui favorise une approche intégrée de la santé humaine et animale pour une meilleure prévention et prise en charge des maladies. Enfin, l’analyse fonctionnelle et phénotypique des pDC lors d’infections bactériennes intracellulaires est encore très limitée. Ce projet sera l’une des premières études à explorer le rôle des pDC murines au cours d’une infection bactérienne intestinale, avec un objectif mécanistique clair.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. 1- Le gavage des souris sera effectué avec les salmonelles selon le schéma expérimental suivant : pour l’immunisation avec les salmonelles atténuées, l’administration sera réalisée trois fois, à une semaine d’intervalle, tandis que le challenge avec la souche sauvage sera effectué une seule fois sur des souris vigiles. Les gavages seront pratiqués sur souris vigiles pour maintenir le réflexe de déglutition 2- L’injection intrapéritonéale des biopuces (10 secondes par injection) sera réalisée une à trois fois, à une semaine d’intervalle, sur des souris vigiles. 3- Dans certaines expériences, nous préleverons du sang chez les souris immunisées ou infectées. Cela sera réalisé une fois par semaine dans le cadre du schéma d’immunisation, et une seule fois chez les souris infectées, juste avant mise à mort, sur des animaux anesthésiés sous gaz (isoflurane). 4- Pour certains expériences, les pattes arrière des souris dépourvues de pDC sont irradiées, tandis que le reste du corps est protégé par un écran en plomb (« shield »). Les souris « shield » sont préalablement anesthésiées sous kétamine et xylazine afin d’éviter tout mouvement pendant l’irradiation. Une fois l’irradiation terminée, les souris sont immédiatement reconstituées par injection intraveineuse avec les cellules de moelle osseuse du donneur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de courte durée attendus (incluent le stress, un inconfort léger et la douleur modérée) sont les anesthésies sous gaz nécessaires à l'injection des biopuces, aux prélèvements rétroorbitaux ainsi qu’aux injections intrapéritonéales et gavages sur des souris vigiles. Dans des études précédentes, nous avons démontré que l’injection de ces bioparticules n’induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Le procédé de génération de chimères de moelle osseuse est considéré comme présentant un niveau de douleur léger. Pour la procédure impliquant une infection par les salmonelles, les symptômes classiques de la maladie chez la souris, seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs : perte de poids, pelage hirsute, yeux tirés larmoyants, posture voûtée, dos rond, prostration, anorexie). Une mortalité aiguë peut survenir sans signes cliniques dans les infections fulminantes chez les individus très sensibles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure et les tissus d’intérêt seront prélevés en vue d’analyses immunologiques (cytométrie en flux, mesure des cytokines et des anticorps), moléculaires (séquençage de l'ARN en cellule unique (scRNA-seq)) et microbiologiques (charge bactérienne).
Remplacement
Des expériences in vitro utilisant des cellules immunitaires primaires sont systématiquement réalisées afin d’évaluer les mécanismes d’activation des pDC, ainsi que la cytotoxicité, l’activation cellulaire et les doses optimales des biopuces ICARO. Ces approches in vitro et ex vivo permettront de réduire de manière substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. Cependant, l’évaluation de l’efficacité protectrice et des corrélats immunitaires de cette stratégie vaccinale innovante, ainsi que l’étude de la dynamique des réponses des pDC lors d’une infection par Salmonella, nécessite l’utilisation d’un modèle murin entier, reproduisant fidèlement l’infection systémique et l’immunité de l’hôte observées chez l’homme (recherche préclinique). Des expériences in vitro supplémentaires avec des pDC humaines et des lignées cellulaires sont également développées au sein de notre équipe afin d’étudier la biologie des pDC et les mécanismes sous-jacents, ce qui réduira drastiquement le nombre de souris nécessaires dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Par exemple, chaque souris permet l’analyse de différents organes (par exemple : plaques de Peyer, lamina propria, ganglions lymphatiques mésentériques, rate, foie), maximisant ainsi les informations obtenues. De plus, Les procédures correspondant à l'étude des mécanismes moléculaires (génération de souris chimères SBMC et analyse de l'effet de la délétion de gènes candidats dans les pDC) ne sera réalisée que si les résultats des étapes précédentes sont positifs, pour l’analyse du rôle des pDC au cours de l’infection par Salmonella et lors des réponses immunitaires induites par un vaccin vivant atténué ou par des biopuces, évitant ainsi l’utilisation inutile d’animaux. L’utilisation de souris de fond génétique pur réduit la variabilité interindividuelle et permet de constituer des groupes expérimentaux de taille réduite comparé à des fonds génétiques mixtes. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet a été calculé à l'aide de méthodes statistiques validées afin d’obtenir une puissance statistique. Ce calcul inclut le regroupement d’échantillons pour les analyses transcriptomiques ainsi que la réalisation de mesures multiples par animal afin de réduire le nombre total de souris utilisées.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Elles seront hébergées dans des cages de 530 cm² avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Les souris seront anesthésiées à l'isoflurane pour réaliser les injections des biopuces et les prélévements sanguins rétroorbitaux. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Le score de souffrance animale sera calculé à l’aide d’une grille de scoring, en fonction des points limites des 4 catégories suivantes : apparence générale (absence de toilettage, poils hirsutes, dos rond, yeux mi-clos), prise alimentaire et poids corporel, détection de signes cliniques (difficulté respiratoire plus ou moins importante) et comportement général (mouvements ralentis, isolement, atonie, prostration). Les points limites ont été définis dans chaque procédure. De la nourriture en pâte sera aussi fournie directement dans la cage pour aider à l'alimentation des animaux affaiblis. Suivant les cas des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le SBEA et le vétérinaire référent. Tout le personnel impliqué sera formé et autorisé à la manipulation des animaux ainsi qu’au suivi de leur bien-être. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés préalablement caractérisés constitue une approche pertinente pour affiner les études animales, car elle permet d’éviter l’utilisation de médicaments destinés à bloquer un processus biologique susceptible d’entraîner des effets secondaires imprévus.
Choix des espèces
En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, le recours à un modèle organisme est indispensable pour approfondir nos connaissances des réponses des pDC. Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella enterica Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour évaluer le rôle fonctionnel des cellules immunitaires in vivo et leur impact sur l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet également d’étudier les réponses immunitaires spécifiques aux antigènes bactériens et modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d’analyser précisément les populations immunitaires et leur état d’activation, grâce au grand nombre d’anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce. Afin de limiter les variations expérimentales qui seraient dues à des différences d'âge, les souris seront utilisés à l'âge adulte entre 6 et 8 semaines. Cet âge est suffisant pour que le système immunitaire soit mature et que les animaux soient de taille suffisamment grand pour faciliter les manipulations requises pour la procédure.
Nouvelle thérapie anti-inflammatoire dans un modèle murin de colite aigüe et chronique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Des injections provoquent une colite aiguë ou chronique chez 1 200 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec douleurs abdominales, perte de poids et changements de comportement. Une nouvelle molécule anti-inflammatoire leur est ensuite administrée, seule ou combinée à d'autres, l'étude durant d'une à quatre semaines selon le protocole. Toutes sont tuées pour analyser la réponse de leur système immunitaire, ce que la rubrique consacrée au devenir ramène à "certains animaux" mis à mort "de manière réglementaire". Le RNT ne nomme ni le produit qui déclenche la colite, ni les tests de suivi, ni les seuils des scores cliniques annoncés, et indique que l'anesthésie ne sera utilisée "que si la situation l'exige".
Objectifs
Certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle clé dans l’inflammation, qu’elle soit aiguë ou chronique. Lors de maladies inflammatoires, un déséquilibre entre différents types de cellules immunitaires contribue à entretenir et aggraver l’inflammation. Nous cherchons donc à tester de nouvelles molécules capables d’agir spécifiquement sur ces cellules afin de rétablir l’équilibre. En laboratoire, ces molécules ont déjà montré qu’elles réduisent les substances responsables de l’inflammation et augmentent celles qui la freinent. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité dans différents modèles de maladies inflammatoires et d’estimer leur potentiel comme futurs traitements
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester une nouvelle molécule qui agit sur un mécanisme précis du système immunitaire afin de réduire l’inflammation. Son efficacité sera comparée à celle des traitements déjà existants pour vérifier son intérêt. L’étude permettra aussi de mieux comprendre comment cette molécule agit sur le fonctionnement des cellules immunitaires. Enfin, nous évaluerons des traitements combinant plusieurs cibles du système immunitaire. Ces approches pourraient être plus efficaces que les traitements actuels ou que l’utilisation d’une seule molécule.
Procédures
Les animaux recevront des injections pour provoquer la maladie étudiée et pour administrer les traitements. Des prises de sang pourront également être réalisées si nécessaire, sous anesthésie afin de limiter tout inconfort. Chaque intervention sera courte et l’ensemble de l’étude se déroulera sur une période allant d’une à quatre semaines, selon le protocole prévu.
Impact sur les animaux
La colite, qu’elle soit aiguë ou chronique, peut provoquer des douleurs abdominales, une perte de poids et des changements de comportement chez les animaux. Afin de suivre leur état de santé et de limiter ces effets, des évaluations régulières basées sur des scores cliniques et pathologiques seront mises en place. Ces outils permettront de surveiller au mieux l’évolution de la maladie et le bien‑être des animaux.
Devenir
Après les injections, les animaux seront replacés dans leur cage. À la fin de certaines étapes de l’étude, certains animaux seront mis à mort de manière réglementaire afin d’analyser la réponse du système immunitaire et mieux comprendre les effets des traitements.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode capable de reproduire entièrement le fonctionnement du système immunitaire en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire pour cette étude. Des essais réalisés auparavant en laboratoire sur des cellules ont montré que la molécule testée avait un effet biologique. Ces résultats ont permis de mieux préparer l’étude chez l’animal et de choisir les éléments à observer pour évaluer son efficacité.
Réduction
Tous les animaux prévus ne seront pas forcément utilisés. Des études supplémentaires ne seront réalisées que si un effet du traitement est observé. Dans ce cas, des analyses seront menées pour mieux comprendre comment le traitement agit, en examinant certains animaux à différents moments de l’évolution de la maladie, avant l’apparition de signes sévères. Afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux, le nombre a été fixé à 10 animaux par groupe, ce qui permet une analyse statistique pertinente avec un nombre réduit d’animaux.
Raffinement
L’objectif principal est de comparer le niveau d’inflammation observé entre différents groupes de souris afin d’identifier des effets clairs et fiables des traitements testés. Une attention particulière sera portée au bien‑être des animaux : leur état de santé sera surveillé régulièrement et des mesures seront prises pour limiter autant que possible la douleur et la souffrance. Si l’état d’un animal se dégrade au‑delà d’un certain seuil, il sera retiré de l’étude et pris en charge de manière appropriée. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, un rythme jour/nuit équilibré et un environnement enrichi pour réduire le stress. Le nombre d’animaux par cage sera limité afin d’éviter la surpopulation, et des ajustements seront faits en cas de comportements agressifs. Les procédures ont été conçues pour minimiser le stress et la douleur tout en permettant une évaluation scientifique fiable. Des traitements contre la douleur seront administrés lorsque nécessaire, et l’anesthésie ne sera utilisée que si la situation l’exige.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche, notamment pour les études fondamentales et précliniques, car elle est bien connue et dispose de nombreux outils permettant d’analyser le fonctionnement du système immunitaire. Les modèles d’inflammation développés chez la souris reproduisent de manière satisfaisante ce qui est observé chez l’être humain. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines. À cet âge, les réponses inflammatoires sont plus homogènes et reproductibles que chez des animaux plus jeunes ou plus âgés, dont le système immunitaire fonctionne différemment. Cela permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables entre les groupes étudiés.
Impact de la surexpression protéique sur le phénotype CMT-like du modèle hétérozygote
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
80 souris issues du croisement de deux modèles de maladies neuromusculaires vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À 8 ou 9 semaines, chacune passe 22 heures seule en cage d'actimétrie, court sur un tapis roulant et reste suspendue à une grille retournée pendant une minute au maximum, un effort que le porteur reconnaît susceptible de surcharger des muscles déjà myopathiques. La série se termine par une mesure de force sur le muscle tibial antérieur, jusqu'à une heure, sous anesthésie profonde et sans réveil. Le RNT justifie ce sort en notant que les prélèvements ont lieu après la mise à mort, "ce qui évite toute douleur supplémentaire".
Objectifs
La myopathie centronucléaire (Myopathie Centro Nucléaire) BIN1-CNM est une maladie héréditaire du muscle squelettique, caractérisée par une faiblesse musculaire progressive et un handicap moteur. Les mutations perturbent l'organisation membranaire et le couplage excitation-contraction, entraînant des noyaux centraux dans les fibres musculaires. Aucune thérapie curative n'existe à ce jour. Des études récentes montrent qu'une surexpression d'une protéine associée aggrave plusieurs formes de CNM. Notre équipe a démontré qu'une réduction fonctionnelle de cette protéine corrige partiellement les phénotypes d'un modèle murin MTM1-CNM. Nous testons donc si sa diminution atténue les altérations du modèle BIN1-CNM (Myopathie Centro Nucléaire) par croisement avec un modèle CMT (Charcot Marie Tooth) à perte partielle de fonction. Ce projet évalue le potentiel thérapeutique de cette modulation pour corriger les anomalies musculaires et élucide les mécanismes communs aux CNM.
Bénéfices attendus
Ce projet explore les mécanismes physiopathologiques communs aux myopathies centronucléaires (Myopathie Centro Nucléaire) et aux neuropathies périphériques, notamment la maladie de Charcot-Marie-Tooth (Charcot Marie Tooth). En combinant un modèle murin de myopathie centronucléaire avec un modèle de perte partielle de fonction protéique, il vise à identifier des cibles moléculaires modulant la gravité de la maladie. Les bénéfices attendus consistent à déterminer si une réduction de cette protéine prévient ou atténue les manifestations de la myopathie centronucléaire, tout en éclairant les mécanismes communs entre myopathie centronucléaire et Charcot-Marie-Tooth, ouvrant des perspectives thérapeutiques ciblées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions, à 8-9 semaines d’âge, avec une durée globale limitée et des procédures répétées uniquement lorsque cela est scientifiquement justifié. Phénotypage comportemental et locomoteur non invasif : tests d’activité locomotrice spontanée (actimétrie), de locomotion fine (tapis roulant) de force musculaire (grille retournée), réalisés chez l’animal vigile, sans anesthésie. L’activité locomotrice spontanée de l’animal sera acquise pendant 22 h au maximum, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement, sans toutefois subir un isolement sensoriel (pas d’isolement olfactif ni auditif). Le test de locomotion fine (tapis roulant) et de grille retournée ont chacun une durée maximale de 1 minute avec un maximum 1 test par jour pour limiter le stress. Mesures de force musculaire in situ : intervention chirurgicale mineure sous anesthésie générale profonde et anti douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Chaque séance dure maximum une heure et est réalisée une seule fois par animal, sans réveil, en fin de procédure (8 semaines). Ces interventions sont conçues pour être aussi brèves et peu répétées que possible, tout en permettant la collecte des données nécessaires à la caractérisation complète du phénotype musculaire et à l’analyse moléculaire et histologique.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux dans ce projet découlent des manipulations expérimentales (génétique, tests comportementaux, chirurgie, anesthésie, euthanasie) : 1. Tests fonctionnels et comportementaux: Test de la grille retournée (hanging test): Stress aigu dû à la sensation de chute imminente et à la contrainte physique (maintien en suspension). Risque minime de chute sur une surface constitué de 5 cm de litière, pouvant une anxiété transitoire. Effort musculaire intense mais bref (≤ 60 s), sans lésion musculaire attendue chez des animaux sains, mais surcharge possible chez les souris déjà myopathiques. Analyse de la démarche (tapis roulant/Digigait): Stress léger à modéré lié à la nouveauté de l’environnement et à la contrainte de marche forcée. Fatigue musculaire transitoire sans lésion durable attendue. Actimétrie (cages avec capteurs): Stress modéré lié au changement de cage, à l’isolement partiel et à l’enregistrement prolongé (22 h), mais sans manipulation directe. Perturbation possible des rythmes circadiens ou du comportement d’exploration en raison de l’environnement artificiel. 2. Mesure de force musculaire in situ sur le tibial antérieur: Les souris peuvent présenter, de manière transitoire, une gêne ou une douleur légère à modérée liée aux procédures chirurgicales, mais cette douleur est prévenue et traitée par une anesthésie générale et une analgésie adaptée. Les injections intrapéritonéales nécessaires à l’induction de l’anesthésie générale peuvent provoquer un stress et une gêne transitoires (manipulation, douleur ponctuelle à l’injection). La contention de l’animal pour l’injection est brève, d’une durée maximale de 15 secondes, réalisée par du personnel formé, avec une prise en charge rapide par l’anesthésie, ce qui limite la durée de ces effets.
Devenir
Le sort prévu pour tous les animaux, consiste en leur mise à mort pour la collecte de tissus. La collecte terminale de muscles et d’organes est nécessaire pour corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires/histologiques/ ultrastructurales. Les prélèvements sont réalisés après la mise à mort, ce qui évite toute douleur supplémentaire.
Remplacement
Dans ce projet, le Remplacement n’est pas possible car l’objectif est d’évaluer l’effet d’une réduction fonctionnelle protéique sur les phénotypes musculaires dans un modèle de myopathie centronucléaire, ce qui nécessite de reproduire la pathologie musculaire in vivo, avec toute sa complexité tissulaire, mécanique et systémique. Les modèles cellulaires (myotubes, lignées musculaires) ou organoides ne permettent pas de recréer la fonction intégrée du muscle squelettique, ni les interactions nerf-muscle, ni les réponses comportementales et locomotrices mesurées ici. De même, les approches in silico ou in vitro ne suffisent pas à tester les paramètres fonctionnels tels que les tests comportementaux, la force musculaire in situ ou les analyses histologiques et ultrastructurales, qui exigent un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé de manière à respecter le principe de Réduction tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques. Pour chaque groupe expérimental, un effectif de 10 animaux par sexe (soit 20 souris/groupe) a été retenu après calcul de puissance préalable, basé sur les données de variabilité observées dans les modèles murins de myopathies et de neuropathies, afin d’éviter tout suréchantillonnage. Ce nombre repose également sur notre expertise préalable dans la caractérisation de modèles murins de myopathies et de tests de force musculaire. La distribution des données sera évaluée (Shapiro–Wilk ou Kolmogorov–Smirnov), puis des analyses adaptées appliquées : ANOVA (ou Kruskal–Wallis si non normale), tests post hoc (Tukey/Dunn), et t/Mann–Whitney pour comparaisons ponctuelles. Le plan maximise l’information par animal (phénotypage fonctionnel complet, analyses histologiques/moléculaires), limitant le total à 80 animaux. Les procédures sans réveil et la standardisation rigoureuse réduisent les répétitions expérimentales. La cohérence des groupes (contrôle, mutation protéique, modèle pathologique, modèle combiné avec une amélioration du phénotype attendue) optimise les conclusions sans multiplier les conditions.
Raffinement
Les moyens de raffinement mis en œuvre dans ce projet visent à minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des souris tout au long de l’expérimentation. Les animaux sont logés en groupe, dans des conditions de température, d’hygrométrie et d’éclairage contrôlées, avec litière et abris adaptés, et bénéficient d’un enrichissement environnemental (tunnels et matériel de nidification) pour favoriser le bien être et limiter les comportements stéréotypés. Une manipulation douce et progressive, ainsi qu’une phase d’habituation aux dispositifs de tests (grille retournée, tapis roulant, cage d’actimétrie), sont mises en place pour réduire l’anxiété liée aux manipulations et à la nouveauté. Les protocoles comportementaux sont courts et espacés, avec des temps de repos suffisants, afin d’éviter la fatigue et la surcharge musculaire. Pour la chirurgie in situ (mesure de force musculaire), des anesthésiques et analgésiques adaptés sont utilisés, et l’intervention est conduite sous anesthésie profonde dans le cadre d’une procédure sans réveil, ce qui évite toute douleur post opératoire. Une surveillance clinique régulière (poids, état général, locomotion, alimentation, hydratation) est assurée, avec des critères de mise à mort précoce clairement définis pour interrompre l’expérimentation en cas de souffrance manifeste. Les critères de points limites de Morton & Griffiths sont appliqués systématiquement, avec une mise à mort immédiate en cas de perte de poids >15% sur une semaine, de prostration prolongée ou de paralysie sévère, et en cas de mortalité postnatale importante. Enfin, les protocoles sont standardisés (heure de test, conditions environnementales, manipulateurs formés) et les méthodes non ou moins invasives (tests comportementaux, actimétrie) sont privilégiées, ce qui réduit la variabilité et limite le besoin de répéter les expériences sur de nouveaux animaux, tout en préservant la qualité scientifique des données.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris) est retenue comme modèle de référence pour l’étude des myopathies et neuropathies périphériques, grâce à sa physiologie musculaire et neuromusculaire hautement conservée avec l’humain. Elle permet de reproduire fidèlement les phénotypes fonctionnels (faiblesse progressive, altérations locomotrices, atrophie), absents chez les invertébrés ou poissons zèbres. Les animaux sont utilisés du stade juvénile (8-9 semaines) à adulte jeune, correspondant à l’installation complète du phénotype pathologique sans progression excessive. À 8 semaines (équivalent ~20 ans humain), la faiblesse musculaire est pleinement exprimée, idéale pour les tests comportementaux (grille retournée, tapis roulant, actimétrie) et la force in situ sur tibial antérieur. Ce stade évite les biais néonataux (variabilité élevée) ou âgés (comorbidités), maximisant la pertinence scientifique et le respect des 3R.
Développement d’un modèle murin d’infection cutanée par Borrelia afzelii
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Faute de modèle animal existant pour une complication cutanée tardive de la maladie de Lyme, ce projet en construit un avec 105 souris sans poils, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leurs organes. Le geste infligé tient en une seule injection de Borrelia afzelii sous la peau, de quelques secondes, sur animal éveillé. La souffrance attendue vient donc de l'infection elle-même, réaction inflammatoire locale puis arthrite possible, et non de l'acte. Le porteur écrit que l'absence de douleur au point d'injection dispense d'analgésie, sans indiquer combien de temps les souris seront gardées infectées, alors que la lésion visée survient chez l'humain des années après la piqûre de tique.
Objectifs
L'Acrodermatite Chronique Atrophiante (ACA) est une manifestation cutanée tardive de la borréliose de Lyme européenne due quasi-exclusivement à l’espèce Borrelia afzelii. Elle représente 3 à 5% des cas de borréliose de Lyme et survient des années voire parfois des décennies après un érythème migrant (EM) non traité, souvent au même site anatomique, ce qui suggère que cette bactérie a à la fois une capacité notable à persister pendant une longue durée dans la peau humaine sans être détectée et le potentiel d'induire une inflammation destructrice chronique tout en résistant à l'éradication par le système immunitaire. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle animal d’ACA qui pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Les souris utilisées comme modèle d’étude sont des souris sans poil non consanguines utilisées en cancérologie et dermatologie car les lésions cutanées sont plus facilement observables. Aucune étude des conséquences cutanées d’une infection de ces souris par des souches de Borrelia afzelii provenant de patient ayant présenté une ACA n’a été réalisée à ce jour. L’objectif principal de ce projet de recherche est de mettre au point un modèle d’infection cutanée de souris sans poil par des souches pathogènes de Borrelia afzelii afin de permettre l’étude des mécanismes impliqués dans l’ACA. L’objectif secondaire de ce projet est de caractériser l’infection chez cette souris : dissémination, séroconversion (apparition d’anticorps anti Borrelia).
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mettre au point un modèle murin d’acrodermatite chronique atrophiante afin de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie, encore très peu connue, notamment dû à l’absence de modèle existant. La mise en place d’un modèle murin d’ACA pourrait dans un second temps permettre de décrire les facteurs d’hôte (par exemple système immunitaire) et bactériens expliquant la persistance de Borrelia afzelii dans la peau et l’inflammation tardive de ce tissu.
Procédures
Injection, 1 seule fois par souris, sur souris vigile, quelques secondes
Impact sur les animaux
Dans les suites de l’injection intradermique de Borrelia une faible réaction locale inflammatoire peut apparaitre. Dans un second temps, une arthrite peut potentiellement se manifester. Un léger stress peut être ressenti par la souris lors des manipulations
Devenir
Les souris ne peuvent être réutilisées, puisque le prélèvement de leurs organes est nécessaire à l’expérimentation. Elles seront donc mises à mort.
Remplacement
Les explants de peau ou les organoïdes ne sont pas utilisables pour répondre à la question scientifique pour 2 principales raisons : -Ils ne permettent pas d’observer des lésions cutanées tardives (maintien en culture de l’explant a une durée limitée de 10-15 jours) -Ils ne permettent pas d’étudier la dissémination de la bactérie (autres zones cutanées, autres organes) et les effecteurs du système immunitaires recrutés à partir du sang dans le tissu cutané.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour ce protocole a été calculé au minimum des exigences de publications internationales. Cependant, dans un but de réduction, le nombre de contrôle a été réduit à son maximum.
Raffinement
Concernant le bien être général des souris, elles disposeront d'un tunnel, d'un barreau à ronger, de coton et du carton ciselé pour réaliser un nid et seront regroupées en groupes sociaux. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce selon, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Concernant : - L’inoculation intradermique : l'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques, même si un inconfort lié à l’inflammation de la piqûre peut être observé à la suite de celle-ci. En cas de réaction inflammatoire qui serait trop importante un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - L’apparition d’une d’arthrite. Si une gêne douloureuse de la souris est observée, un suivi sera réalisé et un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - Les souris sans poil étudiées possèdent des vibrisses, mais les cils sont soit extrêmement rudimentaires, soit totalement absents. Une attention particulière sera portée sur l’observation des yeux et l’apparition d’une éventuelle conjonctivite. De plus, l’enrichissement utilisé ne produit pas particulièrement de poussière. Les souris sont mises à mort à 1 mois, 6 mois ou à 1 an selon leur groupe ou si elles présentent des lésions évocatrices d’une ACA. Pendant toute la durée expérimentale, l’état des souris est évalué quotidiennement, des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance inutile.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et des nymphes de tiques. Les souris « contrôle » sont sensibles à l’infection par Borrelia sl et sont classiquement utilisées en recherche scientifique sur ce sujet. Les souris étudiées dans notre protocole sont sensibles à l’infection par Borrelia afzelii, et constituent le meilleur modèle d’observation d’une éventuelle pathologie cutanée en raison de leur absence de poil. Des animaux sevrés à partir de 3 à 4 semaines seront utilisés. Pour le bon développement des souris, il est important qu’elles soient sevrées avant d’être séparée de leur mère. Il semble dans la littérature que l’inoculation des souris jeunes par Borrelia permet des manifestations cliniques plus marquée par rapport à une inoculation à 12 semaines.
Evaluation des plaquettes dans la pathologie du Sjogren
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Porteuses de mutations qui leur font développer un syndrome de Sjögren, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent du clopidogrel ou des anticorps qui détruisent leurs plaquettes, par gavage et par injection intraveineuse, avec des prises de sang pratiquées sur animaux éveillés. Les contraintes subies sont "faibles" et les traitements plaquettaires "ne relatent pas de mal-être animal", affirme le porteur, dont l'étude repose sur le vieillissement d'animaux construits pour tomber malades. Il conclut qu'aucune méthode alternative n'existe, la cytométrie en flux exigeant selon lui un grand nombre de cellules prélevées dans les organes immunitaires.
Objectifs
Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle des plaquettes dans la syndrome du Sjögren (SjS). Le syndrome de SjS est une maladie rare, touchant entre 0,01% et 0,3% de la population adulte (selon les critères historique « AECG » de 2002), mais reste la maladie auto-immune systémique la plus fréquente après la polyarthrite rhumatoïde (PR). Cette pathologie inflammatoire systémique affecte majoritairement les glandes salivaires, lacrymales et les muqueuses, lié à une infiltration des glandes correspondantes par des cellules immunitaires, essentiellement des lymphocytes T et B. L’activation lymphocytaire B est un élément central de la maladie, comme en atteste la production de nombreux auto-anticorps (en particulier les anti-Ro60/TROVE2/SSA, anti-Ro52/TRIM21/SSA et anti-La/SSB, présents chez 2/3 des malades et associés à des formes plus sévères. Cependant, ex vivo, après analyse d’une cohorte de plus de 100 patients, ils s’avèrent que d’autres cellules seraient activées pendant la maladie et notamment les plaquettes. Or les plaquettes sont aussi des cellules immunitaires en plus d’être des cellules hémostatiques. Il est donc important d’évaluer leur impact et de choisir le bon modèle murin. Il existe plusieurs modèles murins mimant le SjD, les souris TgIL14 (mime la physiopathologie du SjD, modèle cellules T dependant) et les souris MRL/lpr (présence d'autoanticorps du SJD, modèle cellule B dépendant) Axe 1. Evaluation de l’implication des plaquettes dans le modèle TgIL14 Axe 2. Evaluation de l’implication des plaquettes dans le modèle MRL/lpr
Bénéfices attendus
Le choix d’utiliser le modèle de Sjogren TgIL14 et le modèle MRL/lpr a été basé sur la littérature, la présence d’autoanticorps (modèle MRL/lpr), la physiologie de la pathologie (TgIL14). Par ailleurs, le modèle MRL/lpr est « T-dépendant » alors que le modèle « IL14 » est « B-dépendant » ce qui permet de récapituler les principaux éléments de la physiopathologie du syndrome de Sjögren. Afin d’étudier le rôle des plaquettes dans la physiologie du syndrome de Sjogren, nous avons décider d’inhiber les fonctions plaquettaires en utilisant le clopidogrel mais aussi de depleter le système des plaquettes avec un anticorps deplétant. Une étude a été réalisée in vitro avec le clopidogrel et donne de bon résultat, mais n’intègre pas la diversité des cellules d’un organisme. Par ailleurs, il est complexe de modéliser les interactions de toutes les cellules circulantes en enlevant les plaquettes, dans des essaies in vitro. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’implication des plaquettes dans le syndrome de Sjogren.
Procédures
prélèvèments sur animaux vigiles, injections intraveineuse, gavage tous les animaux de l'étude
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des gavages et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Cependant, les modèles utilisant le clopidogrel ou les anticorps depletant ne relatent pas de mal-être animal, dans des souris de type wild type. Une attention particulière et un monitoring sera effectué sur les souris TgIL14 et MRL/lpr qui subiront l’un ou l’autre des traitements plaquettaires.
Devenir
tous les animaux de la procédure 1 et 2 seront mis a mort
Remplacement
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’implication des plaquettes dans une pathologie nécessite l’évaluation sur un modèle vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons au préalable évaluer in vitro le statut d’activation des plaquettes chez l’homme (cohorte de patient atteint de Sjogren et de donneur sain). Afin de réduire le protocole, une étude pilote commune à l'axe 1 et 2, dont les résultats seront utilisés. Cette étude pilote utilisera 40 souris afin d’optimiser d’évaluer le traitement clopidogrel et d’anticorps depletant dans l’animalerie. Dans l’étude principalede l’axe 1 et 2, un groupe contrôle ainsi que 3 groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 6 par groupe experimentale . Un test statistique approprié sera appliqué en fonction des comparaisons effectuées entre les différentes mesures/groupes. Ainsi, lorsque la condition de normalité de la distribution de valeurs est remplie, un test T de student sera appliqué entre les moyennes. Lors d’analyse longitudinale, les corrections pour mesures apportées ou des tests tolérants à la non independance des données seront appliquées de façon appropriée. La bonne approche statistique permettra de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique de pathologie inflammatoire comme le syndrome de Sjögren. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 6 mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.