Rongeurs

3 320 souris vont être utilisées dans ce projet sur le glioblastome, chacune pouvant passer par une chirurgie intracérébrale de 30 à 40 minutes, cinq injections quotidiennes consécutives, jusqu'à cinq cycles de traitement renouvelés toutes les deux semaines, deux séances d'imagerie par bioluminescence par semaine et quatre prélèvements sanguins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale provoque perte de masse musculaire, prostration, déshydratation et lésions cutanées, et les souris immunodéprimées utilisées courent un risque accru d'infection. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau, la voûte crânienne et les ganglions lymphatiques. Le porteur travaille en parallèle sur des organoïdes de glioblastome intégrant microglie et monocytes, et conditionne le remplacement d'une partie des expériences in vivo aux résultats de ce projet collaboratif.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’étudier les modifications du microenvironnement tumoral après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans trois modèles murins de glioblastome (GBM). Ces modèles complémentaires récapitulent les altérations moléculaires identifiées dans un sous-type de GBM de patients dit mésenchymateux. Ce projet comprend trois volets : (1) Évaluation de l’effet de nouvelles drogues ciblant les cellules sénescentes ou leur activité sur la survie des souris après avoir vérifier que ces molécules sont perméables à la barrière hémato-encéphalique ; (2) Analyse en 3D des réseaux vasculaires sanguin et lymphatique méningé au niveau du cerveau entier et de la voûte crânienne, après marquage des protéines des vaisseaux par des anticorps fluorescents ; (3) Analyse du compartiment immunitaire de la tumeur en utilisant 4 approches : (i) analyse de l'expression des protéines et des ARN messagers (intermédiaires en le gène et la protéine) sur coupes de tissus ; (ii) analyse de l'expression des ARN messagers de cellules dissociées de la tumeur ; (iii) trie de cellules dissociées après marquages fluorescents spécifiques de type cellulaires, de la tumeur, des ganglions lymphatiques cervicaux et des méninges ; (iv) étude de l’action combinée de sénothérapie et d’immunothérapie (thérapie stimulant le système immunitaire).

Bénéfices attendus

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale adulte primitive la plus fréquente et agressive avec une médiane de survie des patients inférieure à 15 mois après diagnostique. Les résultats issus de ce projet permettront de comprendre les mécanismes sous-jacents de l’action bénéfique d’une sénothérapie en étudiant les compartiments immunitaire et vasculaire, au sein de la tumeur et en périphérie. Selon nos résultats, notre projet pourrait proposer une nouvelle approche thérapeutique en combinant une sénothérapie (traitement diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules) et une immunothérapie (traitement stimulant le système immunitaire). Cette dernière de donnant pas à ce jour, de résultats positifs dans la vaste majorité des GBM.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection pré-opératoire, une injection au niveau du cerveau de virus ou de cellules tumorales nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. L'ensemble de ces 7 actes techniques ne sera pas effectué sur la totalité des animaux du projet. L'injection unique pré-opératoire sera d'une durée de 10-20 secondes. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié (anesthésie générale et locale) et analgésié en pré et post-opératoire. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal).

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes majeures où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale consiste en une injection de virus ou de cellules tumorales dans des zones précises du cerveau. Ces injections sont effectuées sous anesthésie/analgésie qui peut entraîner des nuisances, par exemple des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires ou des risques infectieux. De plus, lors de cette étape comme lors de l'imagerie par bioluminescence des risques d'hypothermie et de détresse cardiorespiratoire sont possibles. Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration, déshydratation, lésions cutanées). En outre, les traitements par injections peuvent engendrer une douleur de courte durée, un risque d'irritation du tube digestif et un risque d’inflammation du péritoine. De même, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. Par ailleurs, nous utiliserons des souris immunodéprimées qui présentent un risque acru d'infections

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris contenant une tumeur, la voute crânienne et les ganglions lymphatiques afin de les analyser au niveau moléculaire, histologique et cellulaire.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractérisons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patients collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare et est obtenu grâce à la collaboration avec des neurochirurgiens et des neuropathologistes. Cette étude fondamentale demeure néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans des modèles animaux précliniques. Dans un souci de remplacement et réduction, nous avons initié la génération des tumoroides (ou explants de tissus en suspension) à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire et le réseau vasculaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle de tumoroides conservant de façon fidèle la présence et l’activité du microenvironnement. Un projet collaboratif vise à générer des organoides de glioblastome incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 3320 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 10-18 animaux par groupe. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Pour cette raison, nous visons à obtenir des résultats robustes en utilisant plusieurs modèles murins de glioblastome complémentaires. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, voute crânienne, ganglions lymphatiques, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescente localisée dans le cerveau sera disséquée à la loupe binoculaire. Nous réaliserons plusieurs types d'analyses sur chaque tumeur. Dans certains cas, immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logés par groupes pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris femelle est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous regrouperons cet animal avec un animal de compagnie. Pour les mâles isolées (modèle 3), nous rajouterons un enrichissement (maison en carton) et nous notifierons sur la cage ‘animal isolé’. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposée à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié. Pour les souris immunodéprimées la litière et les aliments seront irradiés, les enrichissements seront autoclavés, et ils boiront de l'eau osmosée afin de réduire les risques d'infections qui sont élevés dans ces modèles.

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Aussi, de nombreuses données de multiomics réalisées à partir de modèles murins de glioblastome sont disponibles et nous aideront à comprendre et analyser nos propres résultats. Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour générer des glioblastomes car cette tumeur se développe chez l’adulte à partir de 30 ans. Ce projet qui vise à évaluer les modifications du microenvironnement tumoral (système immunitaire et architecture des vaisseaux sanguins et lymphatiques) après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans des modèles murins de glioblastome utilisera des souris mâles et femelles. En effet, de nombreuses études ont montré que l’activité du système immunitaire varie selon le sexe.

Sensibilisés à l'ovalbumine ou au pollen d'ambroisie puis exposés à l'allergène dans l'œil, 3 600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Gonflement de la conjonctive, rougeur et larmoiement sont les effets attendus, auxquels s'ajoutent des nodules sous-cutanés au site d'immunisation, des injections péri-oculaires sous anesthésie légère et des prélèvements sanguins. Le porteur souligne que les examens ophtalmologiques employés se pratiquent chez l'être humain en cabinet et chez les autres animaux en clinique vétérinaire, sans anesthésie ni hospitalisation. Environ 360 animaux écartés du protocole pour un défaut anatomique de l'œil détecté avant l'induction de la maladie pourront être réutilisés ailleurs, les 3 240 autres sont tués pour analyses.

Objectifs

Comme l’allergie respiratoire, l’allergie oculaire est associée à une hypersensibilité allergique de type immédiat. Elle concerne essentiellement les conjonctivites allergiques bégnines c’est-à-dire la conjonctivite allergique saisonnière et la conjonctivite allergique péri-annuelle. Cette hypersensibilité concerne aussi pour partie les conjonctivites sévères compliquées de kératite comme la kératite conjonctivale vernale et la kératite conjonctivale atopique. Les allergènes responsables sont des pneumallergènes, aussi responsables de symptômes respiratoires, tels que les acariens ou les pollens ainsi que des trophallergènes comme l’arachide ou le blanc d’œuf. Ce projet a pour but de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux en permettant d’identifier et de tester l’efficacité de substances thérapeutiques visant à diminuer l’effet des allergènes dans la conjonctivite allergique. Dans ce cadre, nous proposons de mettre en place un protocole de sensibilisation à deux antigènes (l’ovalbumine et le pollen d’ambroisie) chez la souris ou le rat. Dans un second temps, nous testerons différents types de traitements.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Les nuisances attendues se manifesteront au niveau local après le challenge par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Les procédures expérimentales nécessitent l'administration de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (pour administrer les anesthésies également). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements de sang se feront par ponction et dureront quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues se manifesteront au niveau local après le challenge par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Au niveau du site d'immunisation, une réaction inflammatoire avec potentiellement la présence de nodules sous-cutanés peut être observée. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes, puis l’animal est replacé dans sa cage d’hébergement. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme. En dehors de ces périodes d’examen ou d’administration de traitement, l’animal est libre de ses mouvements, avec un accès à l’eau et à la nourriture. Lors des prélèvements de sang, le volume sera adapté au minimum pour ne pas nuire à l’animal. Le stress dû au maintien de l'animal, à la piqûre de l'aiguille, une rougeur peut apparaitre au site de prélèvement, ne doit pas impacter le mode de vie de l'animal une fois l'action finie.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, pour réaliser des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de l'allergie (immunisation et/ou challenge), ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative tels que les modèles in vitro (2D, 3D, organoïdes) ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. L’allergie oculaire est une pathologie systémique impliquants plusieurs acteurs biologiques qui ne sont pas simultanément présents ou fonctionnels in vitro. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude correspondant à de jeunes adultes conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Le protocole s'arrête quand une souris atteint le score 2, soit une baisse d'activité des pattes arrière et une courbure du dos marquée, le score 3 correspondant à la paralysie du train arrière. 33 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des anticorps prélevés sur des malades atteints de myopathie nécrosante auto-immune, une injection par jour pendant dix-sept jours, quatre microprélèvements sanguins et trois tests de préhension, avant que leur muscle gastrocnémien soit prélevé. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, et attend de ce protocole qu'il ouvre la voie à de nouvelles thérapies ciblées et à des essais chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif général de notre programme est de tester l'efficacité thérapeutique d’une molécule antagoniste d’une protéine appelée Fn14 (anti-Fn14) dans un modèle murin de myopathie nécrosante autoimmune (MNAI). Ce modèle est obtenu par le transfert d'anticorps de malades souffrant de MNAI. Nous utiliserons des souris immunodéficientes supplémentées avec du complément humain pour ne pas rejeter les composants humains que nous leur injectons, ce qui nous permet d’évaluer correctement le rôle curatif de la molécule anti-Fn14. Plus précisément, nous comparerons trois groupes de souris : 1) des souris non malades (transfert d’anticorps de sujet sain dès J0) ; 2) des souris malades (transfert d’anticorps de malade MNAI dès J0) ; 3) des souris malades et traitées avec l’anti-Fn14 à partir de J8. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires. L’objectif final est de voir si le médicament peut améliorer la force musculaire chez ces souris.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d’un effet bénéfique de la molécule anti-Fn14 ouvrira la voie à l’étude de nouveaux mécanismes d’action des autoanticorps et au développement de nouvelles thérapies ciblées ainsi que d’essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 4 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 17 jours soit 17 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacune. 3 grip test seront réalisés pour chacune des souris, durée moins de 1 minute. Les muscles gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pourront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.

Devenir

Le prélèvement du muscle gastrocnémien (postérieurement à la mesure de la force in situ) pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été réduit à son minimum (n=11) grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expérimentaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis par un calcul de puissance de déterminer exactement les effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologiques obervées lors de ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par les test adaptés.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite (score 2) dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante : Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Une évaluation quotidienne de la douleur par deux personnes indépendantes sera également mise en place par une observation des changements des expressions faciales des animaux et l’apparition de signes comme le léchage et le grattage d’une zone douloureuse, l’automutilation, la déshydratation, l’agressivité, les yeux clos, les postures anormales (dos vouté…), l’activité réduite, la diminution du toilettage, la respiration anormale, ou encore la perte de poids (mesurée par pesée). Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place 24 heures avant la première injection d''anticorps pour les animaux de tous les lots. Lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes sera atteint ou que le traitement préventif ne sera plus suffisant, un anti-douleur sera administré jusqu'à disparition de la douleur. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. De plus, lors de la mesure de la force musculaire in situ, un analgésique (buprénorphine) sera administré 30 minutes avant le début de l’intervention ; l’injection se fera en s.c. à une dose de 0,05 mg/kg.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Une puce implantée sous anesthésie à l'arrivée puis retirée par incision à la fin, une injection par jour cinq jours sur sept pendant dix semaines, un jeûne de 12 heures, jusqu'à 48 heures en cage individuelle : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du sang et des tissus. Nourries d'un régime riche en graisses, elles développent obésité, diabète et résistance à l'insuline, certaines lignées génétiquement modifiées présentant ces troubles dès quatre à cinq semaines. Elles passent aussi des tests de force et de course sur tapis roulant, où le porteur signale de la fatigue et, rarement, une blessure à la patte. Les molécules testées dérivent d'un composé actif in vitro dont les propriétés chimiques interdisent tout essai clinique direct, et le bénéfice annoncé pour les 8,5 millions de personnes obèses en France reste au stade de l'exploration d'une piste.

Objectifs

En 2020, environ 8,5 millions de personnes en France sont touchées par l’obésité, dont 1 million avec une obésité très sévère. Cela représente 17 % de la population. Ce qui inquiète particulièrement, c’est l’augmentation rapide de l’obésité chez les jeunes adultes (18-24 ans). Si cette tendance continue, on risque de voir apparaitre de plus en plus de maladies graves liées à l’obésité. Nos recherches portent sur une protéine, connue pour avoir plusieurs fonctions selon l’endroit où elle se trouve dans la cellule. Elle influence notamment le métabolisme des graisses et des acides aminés. De plus, nous avons montré sur des cultures de cellules qu’en bloquant l’action de cette protéine, on empêche les cellules de stocker la graisse. Ainsi, nous travaillons avec des petites molécules, dérivées d’un composé connu pour détruire spécifiquement la version de notre protéine active in vitro mais dont les propriétés chimiques ne permettent pas d’envisager d’études cliniques directement chez l’humain. Ainsi, ces nouvelles molécules sont conçues pour être plus efficaces, avec une meilleure solubilité et moins de toxicité. Après leur validation in vitro, et afin d’évaluer l’amélioration de leurs propriétés pharmaco biologiques, ces molécules seront testées dans des modèles murins d’obésité dans le but de limiter la prise de poids et in fine de réduire le risque de complications associées à l’obésité chez l’Homme. En résumé, notre projet vise à explorer une nouvelle piste thérapeutique contre l’obésité, en ciblant un acteur clé du stockage des graisses dans les cellules.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un dégradeur d’une protéine spécifique dans la lutte contre l’obésité et les syndromes métaboliques associés. En inhibant cette protéine chez des animaux obèses ou chez des animaux ayant un régime riche en graisse, nous espérons limiter la prise de poids et montrer son rôle clé dans le stockage et l’utilisation des graisses. L’objectif est d’emmener vers l’utilisation de ces dégradeurs spécifiques comme potentielle thérapie dans la lutte contre l’obésité humaine.

Procédures

A leur arrivée, tous les animaux subiront une implantation de puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) utile pour leurs identifications et leurs pesées. Toute la durée de la procédure, tous les animaux seront pesés 1 fois par semaine. Cette mesure prend moins de 30 sec et sera réalisée sur animaux vigiles. En fin d’expérimentation ces animaux subiront une incision cutanée afin de leur retirer la puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) en vue d’analyses métaboliques. Tous les animaux seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) 5 jours sur 7, pendant 10 semaines. Tous les animaux vigiles auront une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte de sang espacés sur 4 heures (10 secondes par prélèvement). Une pesée de tous les animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées pour obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent moins de 2 minutes par souris et sont réalisées sur les animaux vigiles à la fin de chaque procédure. Ces animaux seront aussi soumis à des tests de motricité et de force (3 fois 5 minutes et 3 fois 10 secondes / deux sessions pour tous les animaux) ainsi que des tests de course.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois provoquer des hématomes sous la peau. De plus, l’administration de certains traitements par voie orale (à l’aide d’une sonde spécialisée) peut irriter la gorge. Les animaux pourront ressentir un stress léger dû à la manipulation pendant l’administration du traitement, tests non invasifs (analyse de la composition du corps ou des tests de motricité. Un stress un peu plus important est possible lors d’une mise en cage individuelle de moins de 48 heures, nécessaire pour mesurer leur respiration. Pour un test sur la tolérance au sucre, un jeûne de 12 heures peut entraîner une légère perte de poids et l’administration de sucre par la bouche, peut aussi être une source de stress. Pendant un test sur tapis roulant, certains effets indésirables comme de la fatigue ou, très rarement, une blessure à la patte peut survenir. Les animaux sont cependant surveillés pendant cet exercice. Un régime alimentaire riche en gras peut conduire à des troubles similaires à ceux que l’on observe dans des maladies humaines comme l’obésité, le diabète ou une mauvaise réponse à l’insuline. Certains animaux génétiquement modifiés obèses développent ces troubles spontanément dès l’âge de 4 à 5 semaines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode recommandée pour limiter la souffrance des animaux. Nous prélèverons le sang et différents tissus afin de mener notre étude et analyser les dérégulations métaboliques et l’avancement de l’obésité.

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous menons aussi des expériences en utilisant des cellules en culture, plus précisément des cellules qui peuvent devenir des cellules graisseuses. Ces études ont montré que notre protéine d’intérêt joue un rôle important dans la formation et la composition de ces cellules graisseuses. Mais l’obésité est un problème complexe, impliquant plusieurs composantes du corps et l’étudier seulement sur des cellules in vitro ne permet pas de comprendre toutes les interactions qui se produisent entre différents organes et différents types cellulaires. En effet, l’obésité est une maladie métabolique systémique, c’est pourquoi il est nécessaire de faire des expériences sur des animaux, à l’échelle d’un organisme complet. Ces tests sont essentiels si nous voulons, à terme, développer un traitement contre l’obésité. Pour progresser vers des applications chez l’humain, les tests chez l’animal restent donc indispensables.

Réduction

Nos résultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales in vivo. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour valider ces approches in vitro et tester l’ensemble de nos molécules pour mettre en évidence le meilleur candidat en vue d’une application chez l’Homme.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Nous ajouterons dans les cages des briques de peuplier pour éviter les problèmes de malocclusion (absence d’usure des dents à croissance continue) à cause de la nourriture enrichie en graisse qui est très friable. De plus, les animaux seront pesés une fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Nous avons défini préalablement une grille de score en fonction de laquelle nous procéderons à l’arrêt des expérimentations ou à l’euthanasie de l’animal en cas d’atteinte des points limites. Pour le transport de courte durée (inférieure à 10 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, hydratation et enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée dans le deuxième établissement les souris seront remises en cage d’hébergement. Pour l'implantation et le retrait de la puce d'identification les animaux recevront préalablement une injection d’analgésique et une anesthésie volatile. Dès qu’ils seront endormis, ils seront mis sur tapis chauffant pour éviter le refroidissement. Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord sans mouvement, puis à vitesse réduite. De plus, des points limites ont été établis permettant d’éviter l'épuisement et la blessure.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un génome proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci à l’échelle d’un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 6-8 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeune souris pour suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabète). Cela nous permettra aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des syndromes métaboliques associées à l’obésité. Nous suivrons le poids des animaux une fois par semaine dès l’âge de 8 semaines jusqu’à l’âge de 23 semaines pour 624 animaux et 33 semaines pour 576 animaux, âge auquel la différence de poids entre animaux traités ou non traités devrait être observable.

Créer une lignée de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau, puis mesurer l'effet de très faibles doses de rayonnements ionisants sur leur apparition : 240 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un seul des génotypes obtenus par croisement développe des tumeurs cérébrales agressives, avec perte de poids, baisse d'activité, troubles de la coordination et retard de croissance. Les autres serviront surtout à fournir des cellules pour des analyses en laboratoire, et les animaux gardés pour la reproduction sont tués lorsqu'ils franchissent un point limite. Le RNT affirme qu'"en dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique", alors que la tumeur cérébrale est précisément ce que la lignée est construite pour produire.

Objectifs

Nous créons une lignée de souris spécialement modifiée pour étudier les tumeurs du cerveau. Ces modifications n’agissent que dans les cellules nerveuses et permettent de mieux comprendre comment les cancers du cerveau se développent, afin d’aider à trouver de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

L’objectif est de disposer de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau afin de mieux comprendre pourquoi ces cancers, notamment chez les enfants, sont en augmentation. Le projet étudiera en particulier l’impact de très faibles doses de rayonnements ionisants. Pour cela, différentes conditions d’irradiation seront testées, sur le cerveau ou d’autres parties du corps, afin de mesurer leur influence sur l’apparition des tumeurs cérébrales.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques qui les rendent susceptibles de développer spontanément des tumeurs du cerveau. Ces tumeurs peuvent apparaître au cours de leur croissance et entraîner progressivement différents signes de maladie, comme une perte de poids, une baisse d’activité, des difficultés de coordination ou un retard de croissance. Ces animaux ne présentent pas de déficience immunitaire particulière, mais le risque principal pour leur bien-être est lié au développement de la tumeur cérébrale, qui peut provoquer des troubles neurologiques. Pour cette raison, ils font l’objet d’une surveillance rapprochée, permettant d’identifier rapidement tout signe d’inconfort ou d’atteinte de leur état général. Des critères d’arrêt stricts sont définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. En dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique. Elles sont élevées dans des conditions standards de bien-être animal, avec des soins adaptés et une manipulation précautionneuse, afin de garantir les meilleures conditions de vie possibles tout au long de l’étude.

Impact sur les animaux

Parmi les différentes catégories de souris obtenues après les croisements, une seule développe des tumeurs cérébrales agressives. Ces animaux peuvent présenter des signes de maladie susceptibles d’affecter leur bien-être, comme un retard de croissance. Les autres groupes ne développent pas de symptômes importants. Ils restent en bonne santé et seront surtout utilisés pour obtenir des cellules destinées aux analyses en laboratoire.

Devenir

Tous les animaux seront gardés soit pour le maintien de la lignée ( hors groupe 3) soit à destination de l'expérimentation. Les animaux mis à mort dans le cadre de cette gestion de lignée sont les animaux qui préseront l'un des points limites cités précédement.

Remplacement

Les effets de certaines mutations sur le développement du cerveau, et en particulier les changements qui apparaissent lorsqu’une tumeur se forme, ne peuvent être compris qu’en observant comment le cerveau évolue dans un organisme vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de méthodes uniquement réalisées en laboratoire (in vitro) capables de reproduire toutes les interactions complexes qui se déroulent dans le cerveau. Les neurones, les cellules gliales, les vaisseaux sanguins et même la réaction inflammatoire travaillent ensemble d’une manière très précise, et ces processus sont encore impossibles à recréer complètement dans un modèle artificiel. C’est pour cette raison que l’étude sur l’animal reste nécessaire pour comprendre correctement la formation et la progression des tumeurs cérébrales.

Réduction

Le nombre de souris élevées est calculé avec soin pour répondre exactement aux besoins des projets scientifiques et pour maintenir la lignée, sans produire d’animaux inutiles. La reproduction est planifiée et ajustée en continu selon les demandes réelles. Des outils de suivi permettent d’éviter toute production excessive, et lorsque c’est possible, les animaux sont partagés entre plusieurs projets ayant des besoins similaires. Si des animaux ne sont pas utilisés, les prochaines portées sont réévaluées pour éviter de reproduire inutilement.

Raffinement

Le suivi sanitaire des animaux est réalisé quotidiennement, avec une surveillance renforcée des individus porteurs du génotype 3 (altérations de P53, PTEN et NBS sous le contrôle de Nestin-Cre), susceptibles de développer un phénotype délétère, notamment neurologique et/ou tumoral. Une attention particulière est portée à la détection précoce de toute altération de l’état général (perte de poids, piloérection, modifications du comportement, troubles locomoteurs). Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de limiter la douleur, la souffrance et le stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux stables lorsque leur état le permet, avec enrichissement du milieu (matériaux de nidification, abris). Les manipulations sont limitées au strict nécessaire et réalisées par du personnel formé, afin de réduire le stress lié à la contention. Pour les animaux présentant des signes cliniques, les conditions d’hébergement sont adaptées afin de limiter les contraintes et prévenir toute aggravation : accès facilité à la nourriture et à l’eau (dispositifs abaissés si nécessaire), réduction de la compétition alimentaire et surveillance accrue. Un isolement temporaire peut être réalisé lorsque nécessaire afin de prévenir les interactions délétères, tout en veillant à limiter le stress induit. La durée de maintien des animaux présentant un phénotype altéré est réduite au strict minimum nécessaire. La prise en charge de la douleur et de la souffrance repose sur une détection précoce et une adaptation rapide des conditions d’hébergement. En cas de dégradation de l’état général dépassant le niveau de gravité défini, une mise à mort réglementaire par CO₂ est réalisée conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Dans ce contexte ce modèle n’est pas remplaçable. Sagissant de reproduction d'animaux, ils seront utilisés à l'âge minimum de 9 semaines de vie. Pour le developpement de tumeurs les souris seront utilisees entre 20 semaines et 52 semaines.

Le fer injecté dans la tumeur est chauffé par impulsions de radiofréquences pour léser le tissu environnant sur environ un millimètre cube, trois jours de suite, chez 258 souris immunodéficientes porteuses d'un glioblastome humain, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe sous anesthésie pour l'injection, quinze minutes d'imagerie, trente minutes d'hyperthermie, puis une IRM de trente minutes une semaine après la dernière séance. Le projet annonce des tumeurs contrôlées entre 150 et 200 mm³ qui "ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité", tout en fixant un point limite à 1 500 mm³, et décrit l'injection des nanoparticules tantôt en intratumoral tantôt en intraveineux. Les souris sont tuées sans reprise de conscience à la fin de l'IRM, pour chercher dans les tissus la nécrose de la tumeur.

Objectifs

Sur la base d'études in vitro réalisés fin 2025, visant à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur à une quantité jugée suffisante pour une efficacité in vivo supplémentaire par activation par hyperthermie magnétique, et d'études in vitro qui sont réalisées fin 2025, des études de preuve d'efficacité de l'hyperthermie seront menées. L’hyperthermie magnétique se base sur une impulsion de radiofréquences ciblée. Ceci permet de faire une hyperthermie localisée augmentant la température autour de l’endroit où il y a présence de fer. Injectant le fer à l’intérieur de la tumeur, cela fait une cible dans le tissu autour de la localisation de fer d’environ 1 mm3. Dans ce sens, l'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. Ainsi, pour atteindre cet objectif, un modèle tumoral humain et une voie d'administration du composé intra tumorale sont envisagés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour le projet global sont de valider une nouvelle nanoparticule en lien avec l’hyperthermie magnétique, approche thérapeutique en plein essor. Ce projet nous aidera à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur en quantité suffisante pour une efficacité in vivo par activation par hyperthermie magnétique. L'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. De plus, la robustesse du processus de fabrication de cette molécule d'intérêt pourra être validée également avec un duplicat d'expériences.

Procédures

Les animaux auront une acclimatation à l’animalerie avec marquage et pesées. L’inoculation de la tumeur est prévue 10 jours environ après l’arrivée à l‘animalerie. Deux mesures de poids et de volumes de tumeurs seront faites par semaine avant d’atteindre le volume tumoral ciblé (environ 6 mesures qui se feront avec une légère contention) et réaliser la randomisation des groupes. L’injection intra tumorale des produits d’intérêt sera faite sous anesthésie au gaz et le suivi par imagerie des particules magnétiques et hyperthermie suivra à J0 puis J1 et J2 respectant 30 minutes de repos entre l’injection et imagerie puis hyperthermie. Les pesées et mesures du volume tumoral seront faites encore à J0 ; J2 puis J6 et J9. Une semaine après la dernière séance d’hyperthermie (J9), une IRM sera faite pour vérifier la présence de nécrose tumorale. Sans reprise de conscience, la mise à mort permettra de réaliser des examens post-mortem sur les tissus collectés. Les acquis en imagerie des particules magnétiques dureront environ 15 minutes et se feront sous anesthésie, les séances d’hyperthermie dureront environ 30 minutes et se feront sous anesthésie, la séance d’IRM durera environ 30 minutes et se fera sous anesthésie également ; la mise à mort se fera sans reprise de conscience à la fin de l’IRM.

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Cette étude vise des tumeurs controlées et réduites, entre 150 et 200mm³ qui ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité. Néanmoins, nous prévoyons un point limite si les tumeurs atteignent 1500m³. L’inoculation de la tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs juste après l’inoculation. L’injection des nanoparticules véhiculées dans les cellules est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Concernant l'imagerie et l'hyperthermie, elles se dérouleront sous anesthésie générale sur 15 minutes. Nous nous attendons pas de nuisances supplémentaires.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir réaliser des examens post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui même est une deuxième étude sur la base d’études in vitro réalisées fin 2O25 pour valider la biodistribution de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers grâce aux effets thérapeutiques associés à l'hyperthermie.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre l’évolution de la tumeur pour l’utilisation thérapeutique des nanoparticules. Une permière partie de validation est prévue et une deuxième partie suivra avec ces groupes minimaux. Des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature. Ces simulations ont été faites à l’aide de l’outil en ligne.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de 4 individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Cette surveillance inclut également un scoring avec des paramètres d’interaction sociale, associés à la perte de poids et motricité autour de l’évaluation du point limite. La procédure a été pensée de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés.

Choix des espèces

Concernant le choix des souris, nous nous intéressons aux souris qui sont immunodéficientes et fréquemment utilisées dans les modèles précliniques de cancérologie, en particulier pour greffes de cellules humaines. L'immunité de la souche choisie est spécifique pour une réponse immunitaire très réduite et une très bonne tolérance, ce que améliore la prise tumorale, indispensable à ce projet. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 7-8 semaines à l'arrivée à l'animalerie. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

Toutes immunodéprimées pour accepter un greffon humain, 193 souris athymiques reçoivent sous la peau un fragment de tumeur ovarienne prélevé sur des patientes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'implantation se fait sous anesthésie, l'incision refermée par trois agrafes, puis les molécules testées sont injectées dans l'abdomen ou dans une veine, ou administrées par voie orale sur des animaux éveillés, deux à cinq fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur décrit une douleur temporaire, une perte d'équilibre et une perte de poids après l'opération, puis une baisse de mobilité à mesure que la tumeur grossit, et qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" faute d'alternative pertinente. Aucune souris ne sort vivante du protocole, une grille de suivi déclenchant la mise à mort dès qu'un seuil de dégradation est franchi et celles dont la tumeur ne pousse pas au bout de six mois étant tuées aussi.

Objectifs

Les cancers de l’ovaire sont encore très difficiles à soigner, notamment parce qu’ils arrivent souvent à résister aux traitements classiques comme la chimiothérapie. Pour mieux soigner les patientes, il est donc essentiel de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. Cela signifie : identifier de nouvelles “cibles” dans les cellules cancéreuses, tester de nouveaux médicaments capables de les attaquer, repérer des marqueurs permettant de prédire l’efficacité des traitements, et comprendre pourquoi certains cancers deviennent résistants. Des recherches récentes ont mis en évidence deux cibles particulièrement intéressantes, qui agissent sur des mécanismes complémentaires dans les cellules tumorales. Les résultats obtenus jusqu’à présent sont encourageants. Cependant, avant d’envisager de tester cette stratégie chez des patientes, il est indispensable de démontrer qu’elle fonctionne réellement chez l’animal. Pour cela, on utilise des modèles appelés « xénogreffes », qui consistent à implanter chez l’animal des fragments de tumeurs provenant de patientes. Ces modèles reproduisent fidèlement les caractéristiques du cancer d’origine, notamment dans le cas du cancer de l’ovaire. Ils sont aujourd’hui considérés comme une référence, y compris par l’industrie pharmaceutique, pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. L’étude que nous proposons utilisera deux modèles différents de xénogreffes. Elle a été conçue de manière à répondre à plusieurs questions scientifiques tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés, notamment en partageant certains groupes témoins entre les différentes expériences.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons avant tout vérifier si nos hypothèses sont correctes. Celles-ci reposent déjà sur des résultats préliminaires encourageants, obtenus notamment sur des cellules cancéreuses étudiées en laboratoire. L’étape suivante consiste donc à tester notre stratégie chez l’animal. Cette phase est essentielle pour aller plus loin. Elle pourrait permettre : (i) de préparer la mise en place d’un essai clinique chez des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire. Certaines des molécules étudiées sont déjà testées dans d’autres types de cancers. Nous souhaitons notamment déterminer si le niveau naturel d’expression et d’activité de la cible dans la tumeur peut servir d’indicateur pour prédire l’efficacité du traitement. (ii) de renforcer l’intérêt de développer et valider de nouveaux médicaments dirigés contre une seconde cible complémentaire, avec l’objectif qu’ils puissent être utilisés chez l’être humain. À terme, cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les cancers de l’ovaire, qui restent aujourd’hui associés à un pronostic souvent défavorable.

Procédures

Un petit fragment de tumeur provenant d’un cancer de l’ovaire sera implanté sous la peau de souris dont le système immunitaire est affaibli. Au maximum, 193 souris seront concernées. L’intervention est réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’un antidouleur dérivé de la morphine. La petite incision est ensuite refermée à l’aide de trois agrafes. L’ensemble de la procédure est rapide et dure au maximum cinq minutes. Une fois la tumeur implantée et développée, les souris recevront soit les traitements à tester, soit un produit témoin (sans principe actif). Les médicaments seront administrés selon différentes voies (injection dans l’abdomen, dans une veine, ou par voie orale), en fonction de leurs caractéristiques. Ces injections sont réalisées sur des animaux éveillés et concernent à la fois les groupes traités et les groupes témoins. Dans le premier modèle expérimental, la molécule ciblant notre première protéine d’intérêt sera administrée seule, deux fois par semaine pendant quatre semaines. Dans un second modèle, cette approche sera combinée avec deux autres molécules ciblant une seconde protéine d’intérêt, administrées cinq jours par semaine. Ces traitements seront également testés en association avec un médicament déjà utilisé en cancérologie, l’olaparib, afin d’évaluer si la combinaison améliore l’efficacité globale. L’objectif est de comparer ces différentes stratégies pour identifier celles qui freinent le plus efficacement la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

D’après les données disponibles dans la littérature scientifique, les molécules utilisées aux doses prévues dans notre étude n’induisent pas de toxicité apparente. Les effets indésirables que nous anticipons chez les animaux sont donc principalement liés à deux éléments : l’intervention chirurgicale et le développement de la tumeur. Après l’implantation de la tumeur, les souris peuvent ressentir une douleur temporaire, présenter une légère perte d’équilibre ou perdre un peu de poids. Ces effets sont généralement limités à la journée qui suit l’intervention. Par la suite, à mesure que la tumeur se développe, d’autres signes peuvent apparaître, comme une diminution de la mobilité, des troubles de l’équilibre ou une augmentation visible du volume tumoral. Tous ces paramètres seront surveillés attentivement pendant toute la durée de l’étude, qui ne dépassera pas huit semaines. Si un animal atteint un seuil prédéfini indiquant une altération de son état de santé (évalué à l’aide d’une grille de suivi précise), il sera euthanasié avant la fin de l’expérimentation afin d’éviter toute souffrance inutile.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie jusqu’à l’atteinte d’un point limite ou 8 semaines après le début des traitements. En cas d’absence de pousse tumorale après 6 mois, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

Le recours au modèle animal est indispensable dans le cadre de notre étude puisqu’à l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’évaluation de la toxicité, de la biodistribution et de l’efficacité de traitements anticancéreux innovants.

Réduction

Les molécules (et leurs combinaisons) utilisées pour cette étude ont été présélectionnés en premier lieu sur les organoïdes tumoraux appariés avant de passer chez l’animal pour réduire le nombre de modèles de PDX – et donc d’animaux – utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une animalerie nude dédiée à raison de 3 souris par cage. Les souris peuvent s’accrocher à la grille de nourriture, aux tétines de biberons, à des balançoires (Bio Services B.V) et grimper sur un rebord dans la cage. Les animaux sont hébergés dans des cages NextGen inséres dans un portoir ventilé IVC NextGen souris (Allentown), permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Ces cages contiennent de la litière en copeaux de peuplier à laquelle y est ajoutée des Sizzle-dri (Serlab), des copeaux de litière Alpha-dri plus (Serlab) mettant à disposition des animaux différentes matières pour confectionner un nid. Des batonnets à ronger et des tunnels en cartons (Bio Services B.V) sont également mis à disposition des animaux. Les conditions de cet hébergement répondent aux normes de la directive européenne 2010-63. La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement (7J/7) et 2 fois par jour pendant la période critique de 2 jours suite à l’implantation et le jour des injectionsafin de vérifier le comportement de l’animal.

Choix des espèces

L’implantation de cellules tumorales d’origine humaine n’est possible que chez des animaux immunodéprimés ; les souris Athymiques nude Foxn1nu (ENVIGO, France) sont fréquemment utilisées dans ce type d’étude. Nous avons préalablement comparé différentes souches de souris nude et constaté que celle-ci permettait une prise tumorale optimale (en termes de délai de prise tumorale et d’homogénéité entre les animaux). Les animaux sont reçus à l’âge de 4 semaines et utilisés une semaine plus tard pour implantation des cellules tumorales. Notre expérience montre une homogénéité optimale de la prise tumorale chez des animaux âgés de 5 semaines.