Rongeurs
Travaux pratiques sur rongeur dans le cadre de la formation réglementaire opérateur de projet.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 150
450 rongeurs, 300 souris et 150 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des stagiaires s'exercent sur eux à la contention, aux injections et aux prélèvements de sang, non pour produire des connaissances mais pour valider une formation réglementaire. Le porteur mobilise des mannequins et des vidéos, mais affirme que le contact avec l'animal vivant reste "incontournable" pour des gestes comme les prélèvements rétro-orbitaires. Les animaux sont tués juste après les manipulations, pris en partie sur des surplus d'élevage déjà destinés à l'euthanasie.
Objectifs
Le projet a pour but d’appliquer les recommandations de la commission nationale de la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (dite CNEA) proposant précocement aux étudiants qui seraient amenés à utiliser des animaux à des fins scientifiques de suivre des formations réglementaires a minima de niveau applicateur. De plus, les mauvais gestes de prélèvement ou d’injection chez les petits animaux peuvent engendrer des dommages ou du stress pour l’animal. Ces perturbations peuvent avoir un impact significatif sur le bien-être animal et sur la valeur scientifique des résultats. Les travaux pratiques de cette formation enseignent les bonnes pratiques de préhension, de contention, de prélèvement et d’administration chez la souris et le rat dans le respect des principes d’éthique et de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
Ce projet fait appel à différentes procédures expérimentales à visée éducative. Il a pour but de familiariser les stagiaires avec les rats et les souris, raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux et d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera pratiqué sur des animaux vigiles (les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant chaque procédure de prélèvement) Des injections (intrapéritonéale, sous cutanée, intradermique) seront faites sous anesthésie locale sur animaux vigiles (rat et souris). Nous fixons le seuil d’une voie d’administration (durée d’environ une minute) et de deux voies de prélèvements par animal qui durent environ deux minutes (une minute par voie de prélèvement).
Impact sur les animaux
Douleur suite à l’introduction des aiguilles dans les sites d’injection et de prélèvement. Les pratiques de contention et de manipulation peuvent engendrer de stress pour les animaux.
Devenir
A la fin de chaque séance de formation, les animaux ayant subi des interventions d’injection et/ou de prélèvement ne seront pas conservés en vie pour éviter des souffrances inutiles.
Remplacement
Nous allons remplacer l’utilisation de l’animal vivant par des modèles d’imitation rat et souris pour initier : à la contention, l’injection dans la veine caudale et le gavage. En outre la familiarisation des stagiaires avec les animaux nécessite un contact direct avec les animaux, en plus il n’est pas possible de pratiquer certains gestes techniques sur des mannequins ou des tissus artificiels comme les prélèvements rétro-orbitaires ou sub-mandibulaires. L’usage de l’animal est incontournable.
Réduction
Les études statistiques requises habituellement dans les études scientifiques ne peuvent pas être appliquées car le projet sera réalisé dans un but éducatif. Le nombre total des animaux dépend du nombre de participants qui est limité à 50. Les stagiaires seront répartis en 5 groupes de 10 et chaque groupe réalisera 1 TP sur les souris et 1 autre TP sur les rats. Le TP1 sur les bonnes pratiques de préhension, de contention, de prélèvement et d’administration chez la souris pour lesquelles 12 souris seront nécessaires (2 souris pour l’enseignant et une souris par stagiaire). Le Tp2 sur les bonnes pratiques de préhension, de contention, de prélèvement et d’administration chez le rat pour lesquelles 6 rats seront nécessaires (1 rat pour l’enseignant et un rat pour 2 stagiaires). Soit au total 60 souris et 30 Rats par an pour la formation de 50 stagiaires. Le nombre total d’animaux pour les 5 années est donc de 150 rats et de 300 souris. Néanmoins le projet a été pensé de manière à mettre en place plusieurs dispositions pour réduire l'effectif d’animaux nécessaire : -L’utilisation des modèles d’imitation souris et rats. -Des vidéos éducatives sur l’ensemble des gestes techniques. - l’utilisation des animaux de réforme destinés à l’euthanasie.
Raffinement
Avant les procédures, les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des micro-environnements enrichis par la présence de tunnels en carton pour les rats, des maisonnettes en plastique et dômes pour les souris, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes spécifiques et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribuées à volonté. Tous les animaux recevront une analgésie adéquate avant les manipulations. Les injections seront faites sous anesthésie locale avec du sérum physiologique qui sera réchauffé à l’aide d’un bain-marie ou tapis chauffant afin d’éviter la diminution de la température corporelle lors de l’administration. Les prélèvements sanguins seront faits sous anesthésie générale. Les animaux seront contrôlés systématiquement avant le début des TP et si nous constatons qu'un animal présente une blessure ou des signes d'inconfort (baisse d'activité, diminution des interactions, réduction de la prise alimentaire), il sera mis à mort sans rentrer dans la procédure. Pendant la procédure les encadrants mettent en place un environnement pour le contrôle des procédures d’injection et prélèvement par les stagiaires et de la souffrance animale. Les animaux n’auront pas le temps d’exprimer des signes de douleur ou d’inconfort car ils seront mis à mort directement après les procédures.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les principales espèces utilisées au sein de notre université Dans le but de faciliter la contention la manipulation pour les participants, nous utiliserons des souris et rats adultes (de 25 à 35 g pour les souris et de 300 à 350 g pour les rats).
Rôle de la vasopressine et de l’apeline dans la prééclampsie chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 4664
Livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation pour les rates, accouplées sur place pour les souris, 4 664 rates et 2 420 souris, soit 7 084 femelles, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit une chirurgie, pose d'une pompe osmotique sous la peau ou ligature des artères utérines, un recueil d'urine de 18 heures en cage spéciale, douze jours de mesure de la pression au brassard sur la queue, et des injections quotidiennes sous la peau pendant 4 à 21 jours ou une injection intraveineuse. L'équipe déclenche une prééclampsie, entre autres par perfusion de vasopressine ou de dDAVP, puis teste des peptides censés la traiter sans traverser le placenta. Toutes sont mises à mort pendant le dernier tiers de leur gestation, et le résumé ne dit rien du sort des fœtus, alors qu'une procédure mesure le passage des molécules vers eux.
Objectifs
La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rongeur. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 21 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rongeurs, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rongeurs jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.
Devenir
Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation à la fin de chacune des procédures expérimentales. Les souris seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation à la fin de chacune des procédures expérimentales.
Remplacement
Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.
Réduction
Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rates ou 15 souris par condition différentes, les difficultés de mesures étant plus importantes chez la souris. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces pertinentes pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat et la souris dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates et souris gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Les souris seront commandées et livrées non-gestantes. L’accouplement se fera sur place à l’animalerie. Les souris seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison soit de la semaine précédant leur accouplement jusqu’au dix-neuvième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.
Ciblage thérapeutique de protéines intracellulaires dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
86 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une sclérose en plaques leur est induite, avec une paralysie progressive pouvant gagner la queue puis les membres postérieurs, des injections répétées dont une voie rétro-orbitale et une perfusion intracardiaque terminale, avant le prélèvement de la rate, des ganglions et de la moelle épinière. Le porteur reconnaît que ses essais in vitro réduisent déjà le développement des cellules immunitaires en cause, mais affirme que l'auto-immunité ne peut pas être étudiée sans un organisme vivant. Les retombées annoncées pour les patients restent au conditionnel, l'objectif immédiat étant de valider des cibles médicamenteuses chez la souris.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux central. Une dysfonction du système immunitaire y entraine des lésions qui provoquent des perturbations motrices et sensitives. La prise en charge thérapeutique des patients est à ce jour imparfaite. La maladie est médiée par une population de globules blancs spécifique, et il a été proposé que les protéines X et Y sont nécessaire au développement de ces cellules. L’objectif de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de candidats médicaments ciblant X et Y, dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris, pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes et les mécanismes de la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre non seulement de mieux comprendre les mécanismes contribuant au développement de la sclérose en plaques, mais aussi de mettre en évidence de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de cette maladie.
Procédures
-2 injections par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse isofluorane (2*5 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -2 injections par voie intra-veineuse rétro-orbitale sous anesthésie isofluorane (2*2 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -5 injections par voie intra-péritonéale sur animaux vigiles (5*2 secondes/souris) -1 perfusion intra-cardiaque terminale sous anesthésie médicamenteuse (3 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les injections permettant l’induction de la maladie peuvent induire une douleur légère (traitée par analgésiques). Les symptômes de la maladie se manifestent par une paralysie progressive, commençant par la queue, puis les membres postérieurs et enfin les membres antérieurs. Dans notre animalerie, la sévérité se limite à la paralysie des membre postérieurs. Comme chez l’homme, la maladie peut être associée à des douleurs. Après avoir atteint le score maximum, les animaux entrent dans une phase de rémission (variable, de partielle à complète). Les scores cliniques et le poids sont évalués tous les deux jours et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les rates, ganglions lymphatiques et la moelle épinière seront prélevées pour analyses histologiques et analyse du phénotype immunitaire.
Remplacement
Nos expériences in vitro ont permis de démontrer que le développement des cellules immuntaires responsables de la sclérose en plaques est fortement réduit en présence des inhibiteurs de X et Y. Néanmoins, à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la bio-informatique, l'étude de l’auto-immunité, le rôle du système immunitaire in situ et la validation des cibles médicamenteuses potentielles ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 3 à 10 souris par groupe.
Raffinement
Certaines procédures peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un antalgique (paracétamol). Les animaux auront accès à de la nourriture gélifiée placée dans le fond de chaque cage. Pour attester de la consommation d’eau, les biberons seront pesés tous les deux jours. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. La procédure 1 a pour but de déterminer la méthode de mise de mise à mort la moins douloureuse pour l'animal en obtenant les résultats attendus.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de sclérose en plaques, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle pathogénique des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire et reflète la maladie humaine qui se déclare généralement chez de jeunes adultes. L’âge sera homogène dans chaque procédure.
Impact des mutations du gène Orai1 sur le développement de l’hypertension pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une hypertension pulmonaire leur est provoquée par une substance toxique ou par trois semaines d'hypoxie, avec échographies, prélèvements de sang et un cathétérisme cardiaque droit et gauche, avant la mise à mort pour analyse du cœur et des poumons. Le porteur décrit des atteintes pulmonaires aiguës, essoufflement et fatigue, comme effets attendus. L'étude cherche à savoir si le canal calcique Orai1 constitue une "cible thérapeutique", perspective encore à établir.
Objectifs
Nous souhaitons explorer le rôle du canal calcique Orai1 dans les mécanismes responsables du remodelage vasculaire pulmonaire au cours de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) en utilisant des rats déficients pour Orai1. Nous étudierons si l’absence d’Orai1 peut réduire le développement de l’HTAP afin de déterminer si il s’agit d’une potentielle cible thérapeutique.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de comprendre l'implication du canal calcique Orai1 dans le développement de l’hypertension artérielle pulmonaire, et permettra de déterminer si ce canal Orai1 peut être envisagé comme une nouvelle cible thérapeutique dans le développement de cette pathologie. Au vu de l'absence de thérapeutique curative pour lutter contre le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
60 animaux seront exposés à la monocrotaline à J0 sous anesthésie avec des aiguilles Stériles de 25G. 60 animaux seront en hypoxie (O2 à)10%) durant 3 semaines. Tous les animaux auront une echographie sous anesthésie à J7, J14 et J21 (20 min par animal). Les prélèvements sanguins à la veine caudale sous anesthésie seront réalisés à J21 au moment des échocardiographies (5 min par animal). A J21 tous les animaux subiront un cathétérisme cardiaque droit et gauche sous anesthésie (30 min par animal).
Impact sur les animaux
Développement d'une hypertension artérielle pulmonaire dont les effets secondaires importants sont des atteintes pulmonaires aigües (essouflement à l'effort, fatigue).
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre le rôle du canal calcique Orai1 dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'hypertension artérielle pulmonaire qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque, et les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Plusieurs approches expérimentales seront utilisées par différents expérimentateurs sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le test statistique adéquat permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. De l'enrichissement (rouleau, coton) sera ajouté dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celles de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant des rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Jeune adulte (6 à 8 semaines, 100-200g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide
Impact de la relocalisation nucléaire de la protéine FUS dans un modèle murin de la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent un traitement par gavage puis un suivi mensuel de la force musculaire, des tests de sociabilité et un test du nid avec isolement d'une nuit, avant un électromyogramme sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur teste si la relocalisation de la protéine FUS dans le noyau des neurones rétablit les capacités motrices. Il présente une extension possible à l'humain comme un axe futur, sans traitement existant à ce jour.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par une paralysie des muscles qui entrainent le décès des patients par insuffisance respiratoire. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Le but du projet est de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones et de voir si cela suffit à rétablir les capacités motrices de nos souris.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace de la SLA. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche en remettant une protéine qui s’est déplacée à cause de la maladie dans sa localisation normale puis d’évaluer si cette stratégie permet de rétablir les capacités motrices de ces souris. Si en remettant FUS à sa place, nous arrivons à réduire les troubles moteurs et sociaux observés, nous pourrons envisager que les prochains axes de recherche se tourneront vers la possibilité de trouver un moyen pour relocaliser FUS dans le noyau des patients souffrants de SLA.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage d’un traitement durant 5 jours. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire) sur un dispositif dédié afin de voir l’évolution de la maladie. Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe et de l’enrichissement sera mis à disposition dans leur cage d’élevage. Nous réaliserons deux tests de sociabilité 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal (à 4, 10 et peut-être 14 mois selon l’évolution de la maladie). Le premier test dure 5 minutes tandis que pour le second, les souris passeront 4 sessions de 5 minutes chacune (avec des phases de retour en cage de 8 minutes entre les sessions). La passation du premier et du second test sera espacée d’une semaine. Le test du nid sera réalisé 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal et nécessitera que les souris soient isolées durant une nuit. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.
Impact sur les animaux
Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement. Pour éviter cela, l’expérimentateur en charge de cette partie a suivi des formations pour apprendre à réaliser ce geste et s’est entrainé un grand nombre de fois. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation du test moteur et des tests de sociabilité. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour les procédures nécessitant plusieurs passages successifs pour le test moteur. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. Un délai d’une semaine sera appliqué entre chaque test social. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures 1 et 2 car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier 1. la relocalisation nucléaire de FUS mais aussi 2. pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible de remettre à sa place une protéine dont le changement de localisation entraine la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de la sociabilité) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote pour valider l’approche expérimentale utilisée et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduite de moitié les animaux nécessaires à la réalisation de la seconde partie du projet.
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.
Choix des espèces
Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.
Analyses moléculaires des effets d’un peptide en traitement pré et postnatal sur le cerveau d’un modèle murin de trisomie 21.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
455 souris vont être utilisées, 450 tuées à l'issue et 5 mâles reproducteurs réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées pendant vingt-huit jours, de la gestation jusqu'à trois semaines après la naissance, et les souriceaux sont tués pour prélever leur cerveau. Le porteur teste un peptide censé limiter la mort neuronale dans un modèle murin de trisomie 21. Il inscrit ce traitement dans le cas où les parents décident de poursuivre la grossesse après un diagnostic prénatal.
Objectifs
La trisomie 21 est le syndrome génétique le plus fréquent dans la population générale. En raison des différentes politiques de dépistage et d’interruption médicale de grossesse, cette maladie concerne 1 naissance sur 700 à 1 naissance sur 2000 dans les pays industrialisés. Le projet s’inscrit dans une étude visant à développer une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les désordres neurologiques impliqués dans la trisomie 21. Agir sur le nombre de neurones pourrait permettre de diminuer le risque de déficience intellectuelle dans cette pathologie et de changer son pronostic. Pour cela, le but est de trouver un traitement pour protéger le cerveau lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse. Notre étude s’intéresse à une molécule d’origine embryonnaire qui possède des propriétés neuroprotectrices et qui diminue la mort des neurones. Il pourrait donc protéger contre de tels désordres neuro-développementaux. Notre première étude a montré des effets positifs sur le cerveau de souriceaux présentant des caractéristiques de la trisomie 21, traités pendant la gestation. Dans cette étude, le traitement sera administré par injection sous-cutanée à la mère durant la gestation et durant 21 jours après la naissance. Des analyses seront réalisées sur les cerveaux de la descendance ayant reçu ou non le traitement afin de déterminer de quelle façon il est protecteur, d’évaluer son innocuité et sa persistance à l’âge adulte. 5 mâles reproducteurs et 30 femelles seront nécessaires pour le traitement et quatre groupes de souriceaux seront constitués : des témoins traités et non traités et des trisomiques traités et non traités, pour un total de 420 souriceaux.
Bénéfices attendus
Cette pathologie, associée à une déficience intellectuelle, à des troubles du comportement et du langage, impacte l’autonomie des personnes porteuses de ce syndrome. Ce projet permettrait de continuer à explorer les mécanismes conduisant à des anomalies cérébrales dans la trisomie 21 ainsi que de pouvoir définir les mécanismes impliqués dans les effets du traitement administré. Ce traitement pourrait être considéré comme une approche thérapeutique dans le but de diminuer la déficience intellectuelle lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse suite à un diagnostic prénatal de trisomie 21.
Procédures
5 mâles seront utlisés pour la reproduction. 30 femelles recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ou du traitement. Ce geste sera réalisé sur l’animal vigile, à partir du 14ème jour de gestation, jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux soit durant 28 jours. Les souris issues des femelles gestantes seront utilisées pour étudier les mécanismes impliqués dans l’effet du traitement sur le cerveau.
Impact sur les animaux
Les injections aux femelles gestantes de la molécule seront effectuées sur l'animal vigile et effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires et n'induisent pas de douleur ou d’inconfort à l'animal autre que la piqûre de l'aiguille ainsi que du stress engendré par la manipulation.
Devenir
Tous les souriceaux utilisés seront mis à mort afin de prélever les cerveaux pour effectuer des analyses sur le nombre de neurones, la mort neuronale ainsi que pour déterminer les mécanismes d’action du traitement. Toutes les femelles pour les analyses du foie et des reins afin de confirmer la sécurité du traitement. Les mâles reproducteurs seront réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
Pour atteindre les objectifs du projet basé sur un traitement, un organisme entier et vivant est nécessaire, n’ayant pas la possibilité de créer artificiellement la complexité d’un organisme avec tous les différents types de cellules présentes dans le cerveau.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé après avoir établi l’ensemble des procédures expérimentales à l’aide d’un test de puissance statistique en se basant sur la variabilité entre animaux et la distribution des valeurs.
Raffinement
Afin de garantir le bien-être des animaux, le milieu sera enrichi par l’ajout d’un nid végétal et d’un rouleau en carton. Pour les femelles gestantes et avec leurs petits, de l’enrichissement supplémentaire sera apporté sous forme d’une cabane en carton. Les approches expérimentales seront accompagnées d’une surveillance journalière afin de vérifier tout comportement anormal traduisant une souffrance, comme des signes de prostration, d’agressivité, d’apparence physique. Le poids des femelles gestantes sera relevé tous les jours lors de l’injection du traitement. Une absence de prise de poids sera particulièrement surveillée afin de déterminer s’il s’agit d’une dégradation de l’état de santé de l’animal et/ou d’une interruption de la gestation afin de retirer l’animal de l’étude. Du gel enrichi pourra être proposé dans la cage. Concernant plus spécifiquement les souriceaux, ils seront observés lors des pesées ayant lieu trois fois par semaine selon des critères spécifiques liés à leur âge (coloration, mouvement, respiration, comportement, etc). Lors de la manipulation des souris, les mains de l’expérimentateur seront systématiquement frottées avec de la litière de la cage afin de favoriser des odeurs familières moins stressantes pour les petits et la mère. Un changement de gants aura lieu entre 2 cages de femelles gestantes.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris dans ce projet nous permet de pouvoir réaliser des analyses sur un modèle établi comme modèle de la trisomie 21. Les injections du traitement seront réalisées sur des femelles adultes à partir du 14ème jour de gestation jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux (soit durant 28 jours) afin de réaliser le traitement durant la gestation et après la naissance. Les analyses réalisées sur le cerveau des souris 30 jours après leur naissance permettront d’étudier l’effet du traitement sur les désordres neurodéveloppementaux et d’évaluer la persistance de son efficacité au stade jeune adulte. Ceci permettrait également à l’étude d’évaluer le potentiel thérapeutique transposable à l’Homme dans le cas d’une administration chez la femme pendant la grossesse pour corriger très précocement la déficience intellectuelle associée à la trisomie 21.
Etude de la compensation Adcy6/Adcy5 dans les Cellules de Schwann in vivo
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'objectif en une phrase et ne détaille comme acte qu'un tatouage et une biopsie à quatre jours, alors que la mutation de deux gènes peut empêcher la myélinisation. Il indique que les souriceaux pourraient présenter dès la naissance des rétractions articulaires les rendant immobiles, avant une mise à mort pour prélever les nerfs sciatiques. L'écart est net entre un effectif de plus de mille animaux et une justification scientifique réduite à quelques lignes.
Objectifs
Cette étude vise à confirmer l’importance de deux protéines dans la formation du système nerveux et leur impact en développement humain.
Bénéfices attendus
Dans le cas de de maladies neurogénératives telles que Charcot-Marie-Tooth, les neuropathies périphériques ou l'arthrogrypose , les causes précises restent parfois obscures et, malheureusement, aucun traitement curatif n'existe. Nous identifierons ainsi un nouvel acteur qui pourra être utilisé en diagnostic et qui pourrait être une cible thérapeutique
Procédures
Les animaux sont tatoués et prelevés par biopsie à 4j, sous anesthésie afin de les identifier. Cette procédure unique dure moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Comme la mutation des 2 gènes risque d’impacter le développement de la myéline périphérique, les souriceaux pourraient présenter des rétractions articulaires qui les rendraient immobiles dès la naissance
Devenir
Tous les animaux seront euthanasies pour prélèvement des nerfs sciatiques post-mortem pour analyse de celui-ci par différentes méthodologies complémentaires
Remplacement
L'arthrogrypose est une maladie musculaire et articulaire avec une atteinte de l’intégrité des axones, suite à leur non myélinisation. Ce phénotype a été visualisé chez l'Homme. Les multiples tissus impactés et l' interaction entre différents types de cellules impliquées dans la mise en place du système nerveux périphérique est donc nécessaire pour faire cette étude et nécessite donc un organisme entier mammifère. Aucun système cellulaire ex vivo ne peut rendre compte de la physiologie du développement qui fait intervenir des interactions cellulaires (contact entre nerfs et muscles), molécules informatives véhiculéee par le sang (hormones, cytokines) ou des effets environnementaux. Cette complexité est donc difficile voir impossible à reproduire in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux notamment dans notre cas et le remplacement complet n’est pas possible. De plus, l'inactivation d'un gène dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études n'est possible que chez le rongeur.
Réduction
D ans un 1e temps, nos lignées sont le plus souvent hétérozygotes pour le gène étudié. Ensuite, ces derniers seront croisés entre eux pour générer les homozygotes et les contrôles au sein de la même portée afin de limiter les animaux ne protant pas mutations. Le nombre d'animaux utilisés à des fins de recherche a été calculé en tenant compte de la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes sociaux dans une animalerie agrée, dans des conditions de températures et hygrométrie controlées. Elles ont acces ad libitum à la nourriture et l'eau. Les cages présentent un enrichissement du milieu et sont quotidiennement surveillées (week end inclus). Des protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis en cas de souci et tous les prévelements sont post-mortem. Des points limites précoces ont été clairement définis afin d'éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris. Ces animaux constituent un excellent modèle pour l’étude du développement, des processus morphologiques et des pathologies, observées chez les Mammifères. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris mutées et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. De plus,l'inactivation du gène d'intérêt dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études, n'est possible que chez le rongeur. Les stades de développement choisis sont ceux qui sont aussi pertinents chez l'Homme afin de pouvoir transposer les résultats
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 460
3 880 rongeurs, 3 420 souris et 460 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 348 en gravité sévère. Ils subissent des chirurgies du nerf sciatique, une induction de neuropathie et, pour certains, un diabète db/db provoquant obésité morbide et hyperglycémie, avec un risque d'automutilation après section nerveuse. Le projet sert aussi à la formation de personnels, au-delà de la seule recherche, et tous les animaux sont tués pour prélever leurs nerfs. Le porteur annonce des essais chez l'humain entre 2024 et 2026 et une mise sur le marché entre 2026 et 2029, retombées lointaines face à des atteintes immédiates.
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé dans les pattes arrière permettant à la fois de les faire bouger et de ressentir des sensations perçues au niveau de ses pattes (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une membrane autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire), comme les maladies de Charcot-Marie-Tooth (CMT) ou l’hypersensibilité héréditaire à la pression ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie traumatique (causée par une blessure). Il n’existe actuellement aucun traitement. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif du projet est de valider notre approche thérapeutique, basée sur une thérapie génique qui utilise des vecteurs viraux, pour introduire dans les cellules des nerfs des patients, des candidats médicaments au potentiel anti-démyélinisant pendant plusieurs années lors desquelles les troubles moteurs existants et la progression de la maladie seront diminués. Ces vecteurs sont inoffensifs et ne partagent pas leur matériel génétique avec celui des patients. Afin de savoir si nos traitements seront efficaces aux stades précoces et tardifs de la maladie, nous administrerons les traitements soit en amont, soit après l’apparition des premiers symptômes dans des modèles de rongeurs de ces maladies. D’autre part, nous analyserons les nerfs prélevés sur les animaux à la fin de chaque procédure afin d’évaluer l’effet des candidats médicaments sur l’état de myélinisation des nerfs malades.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme Ce projet doit nous permettre de valider notre stratégie thérapeutique pour réaliser par la suite des essais cliniques et créer une banque de tissus pour des analyses ultérieures. Les résultats seront publiés. Avantages à long terme Cette approche thérapeutique permettrait d’administrer une fois tous les 10 ans, un traitement non toxique et stable aux patients. Il n’existe pas encore de traitement pour ces maladies et nous cherchons à en développer un qui diminuerait les symptômes existants et empêcherait la maladie d’évoluer. Nous prévoyons les premiers essais chez l’Homme entre 2024 et 2026 et l’approbation pour la mise sur le marché entre 2026 et 2029.
Procédures
Nuisances - Stress : hébergement individuel des femelles gestantes jusqu’à la mise bas (une semaine) car les cages jetables sont plus petites que les cages standards lavables. - Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours) - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines) - Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) - Nuisance associée au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive). -Deux types de chirurgies oLa première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez la majorité des animaux car elle consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques. Elle durera 30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisée. oLa deuxième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. -L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. -Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
Nuisances : - Stress : hébergement individuel des femelles gestantes jusqu’à la mise bas (une semaine) car les cages jetables sont plus petites que les cages standards lavables. - Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours), biopsie (oreilles) - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines). -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour). Effets indésirables : -Effets indésirables du diabète, souris db/db : obésité morbide, une hyperglycémie, une myocardie et un retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive). -Automutilation (nerf coupé lors d’une chirurgie) d’une durée maximale de quelques heures car nous euthanasierons l’animal si nous en faisons le constat. Les données historiques montrent que 1,5% des animaux pourraient être concernés. Les différents modèles animaux présenteront une faiblesse musculaire d’intensité légère à modérée au niveau des pattes arrière qui ne se voit pas par simple observation de l’animal et ne sera mise en évidence que dans nos tests comportementaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons leurs nerfs pour étudier l’effet du traitement sur leur pathologie.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Il existe des méthodes pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
En nous basant sur la littérature et nos données internes, nous avons réalisé des tests statistiques afin de déterminer le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental et limiter ainsi le nombre d’animaux aux stricts besoins des procédures en place. Le test statistique utilisé pour l’analyse des résultats sera une one-way ANOVA suivie d’un test-post-hoc de comparaison multiple Dunnett. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée tous les jours durant une minute par les expérimentateurs avant de débuter les tests comportementaux en vue de diminuer le stress.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de souris, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements au début de l’apparition des symptômes, pour stopper la démyélinisation pathologique (stade précoce), ou une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin d’essayer de stimuler la régénération. Rat/souris : juvéniles et adultes Nouveau-nés : J1 à J4 pour les souris, J6 à J7 pour les rats Femelles gestantes pour fournir les nouveau-nés : elles arrivent pendant le dernier tiers de gestation et sont gardées jusqu’au sevrage de leur portée
Effet de la consommation de farines produites à partir de graines de protéagineux et d’oléoprotéagineux enrichies en acides gras polyinsaturés sur le métabolisme musculaire du rat âgé.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
60 rats âgés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont hébergés seuls pendant 65 à 70 jours, un isolement que le porteur reconnaît comme un stress et un hébergement non adapté à l'espèce, puis placés en cage métabolique et soumis à des mesures de composition et de fonction musculaires. Tous sont tués pour prélever muscles et sang, afin de comparer des farines végétales enrichies en oméga-3 à des protéines animales. L'objectif est de documenter la valeur nutritionnelle de protéines végétales pour les séniors, un enjeu présenté comme lié à la démographie mondiale.
Objectifs
La croissance démographique mondiale pose la question de la disponibilité des ressources alimentaires et notamment des protéines. Une des solutions est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Toutefois, l'essor des protéines végétales nécessite une meilleure connaissance de leur valeur nutritionnelle, de leur cinétique de digestion et de leur biodisponibilité (capacité des protéines à fournir réellement tous les acides aminés nécessaires pour les synthèses protéiques corporelles). En effet, il est important d’étudier les qualités nutritionnelles des protéines végétales avant de pouvoir recommander leur consommation comme source protéique de substitution aux protéines animales, notamment pour certaines populations spécifiques comme les séniors. Le vieillissement est associé à une perte de la masse et des fonctions musculaires, appelée sarcopénie, qui se traduit par une augmentation du risque de chutes, une perte d’autonomie et une réduction de la qualité de vie. Aussi, préserver la masse et les fonctions musculaires est un objectif clé pour prolonger les capacités fonctionnelles des personnes âgées. Pour tenter de prévenir la sarcopénie, il faut notamment augmenter la quantité de protéines ingérée, limiter la consommation de graisses saturées et assurer un apport suffisant en acides gras polyinsaturés Omega 3 (w3). Les sources alimentaires végétales à la fois riches en protéines et en acides gras w3 présentent donc un intérêt certain pour l’alimentation du sujet âgé. De par leur richesse en protéines et / ou en acides gras w3, les protéagineux (20 à 35 % de protéines - Pois, lentilles, féverole, lupin…) et les oléoprotéagineux (15 à 35 % de protéines - Colza, tournesol) pourraient être une option intéressante pour la définition de nouveaux aliments végétaux adaptées à la population âgée. Les farines d’oléagineux disponibles commercialement proviennent des tourteaux qui sont des coproduits obtenus après extraction de l’huile. Ces tourteaux contiennent très peu d’huile résiduelle. Pour tester l’effet combiné de leurs protéines et de leurs acides gras w3, il faudra rajouter des acides gras polyinsaturés à la farine de tourteaux. Dans ce contexte, le projet vise à étudier la digestibilité de régimes riches en protéines végétales de protéagineux et d’oléagineux enrichies ou non avec des acides gras w3, et leur impact sur la fonction et le métabolisme musculaires dans un modèle de rats âgés.
Bénéfices attendus
L’une des solutions pour répondre au besoin accru en ressources alimentaires et notamment en protéines, est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Pourtant, il manque encore des preuves scientifiques qui permettent de considérer les protéines végétales comme source protéique de substitution aux protéines animales notamment pour certaines populations spécifiques comme les séniors. Les études décrites dans la littérature portent majoritairement sur les protéines issues de graines de légumineuses (pois, lentilles), ou issues du soja mais peu s'intéressent à la valeur nutritionnelle des protéines provenant d’oléoprotéagineux tels que le colza ou le tournesol. De plus, aucune d'entre elles n’envisage un éventuel effet synergique des lipides et des protéines issues des oléoprotéagineux tant sur leur digestibilité que sur leurs effets santé. Les plantes oléagineuses offrent un double intérêt nutritionnel car elles apportent des protéines mais également des lipides, notamment des acides gras polyinsaturés qualifiés d'acides gras indispensables car le métabolisme de l'Homme et des animaux est inapte à les synthétiser. Seule l'alimentation est capable de fournir à l'organisme, ces acides gras indispensables à un certain nombre de fonctions physiologiques. Du fait de leur forte teneur en lipides, les plantes oléoprotéagineuses sont principalement cultivées pour la production d’huiles végétales. Les procédés d'obtention de l'huile conduisent à un coproduit appelé tourteau. Ce dernier ne contient qu'une faible teneur en matières grasses résiduelles, mais est concentré en d'autres nutriments, notamment en protéines. Cette caractéristique fait des tourteaux d’oléagineux un des principaux ingrédients protéiques pour l’alimentation animale. Le présent projet fournira des données scientifiques nouvelles qui permettront d'apprécier l'intérêt de sources végétales comme les oléoprotéagineux qui combinent les protéines et les lipides tant sur la valeur nutritionnelle des protéines que sur leur éventuels bénéfices santé, résultant d'une synergie entre le métabolisme des lipides et des protéines. Ce projet pourrait donc à terme permettre de développer à partir de ces tourteaux, des "ingrédients" riches en protéines végétales (concentrats, isolats, et hydrolysats de protéines) et enrichis ou non avec des acides gras polyinsaturés w3, qui pourraient présenter un intérêt chez la personne âgée.
Procédures
L'ensemble des interventions décrites ci-après concernent l'ensemble des 60 rats. Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur mise à mort soit 8 semaines plus 10 jours d'acclimation. Les 60 rats subiront diverses interventions au début et à la fin du protocole. Elles auront pour but de : (1) mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée 2 fois et d’une durée de 2 minutes à chaque fois. (2) mesurer la fonctionnalité musculaire de façon non invasive et sur animal vigile. Cette mesure fait intervenir 3 appareils. Ces mesures seront réalisées sur la base du « volontariat » car il est impossible d’obliger les animaux à réaliser les exercices. L’appareil 1 servira à mesurer la force et sera utilisé 2 fois pour une durée de manipulation de l’animal de 30 secondes à chaque fois. L’appareil 2 permettra d’évaluer l’équilibre et la coordination motrice et sera utilisé 2 fois. La durée dépendra de l’endurance et de la volonté du rat à réaliser l’exercice (5 minutes au maximum). Enfin, l’appareil 3 permettra d’appréhender l’activité ambulatoire totale et ne sera utilisé qu’à la fin du protocole. L’expérience dure 10 minutes et est non stressante. (3) mesurer la rétention azotée (azote ingérée – azote excrétée) au niveau corps entier. Cette mesure nécessite la récupération de la totalité des fèces et de l’urine produits. Les rats seront alors seront hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite au maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet. (4) mesurer la synthèse protéique dans les muscles squelettiques en fin de protocole. Après avoir été mis à jeun la veille, les 60 rats subiront, le matin, une injection permettant de mesurer la synthèse protéique 50 minutes avant l’euthanasie. Tous les rats seront ensuite mis à mort sous anesthésie générale gazeuse.
Impact sur les animaux
-isolement des animaux pendant 65-70 jours ce qui constitue un stress et un hébergement non adapté pour l’espèce. -hébergement des animaux pendant les 4 derniers jours du protocole dans une cage métabolique ce qui occasionnera un stress. -mesures de la composition corporelle et de la fonctionnalité musculaire sur animaux vigiles ce qui engendrera de légers stress liés aux appareils et à la manipulation par les expérimentateurs. -injection d’une molécule non toxique n’induisant pas de douleur par elle-même diluée dans du sérum physiologique, par voie sous cutanée. Cette injection induira un stress lié à l'injection elle-même (douleur de la piqure) et à la phase de contention de l'animal.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer le statut inflammatoire des rats et réaliser leur bilan sanguin.
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines (protéagineux ou oléoprotéagineux) enrichies ou non avec des acides gras polyinsaturés w3, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, les farines, isolats ou concentrats protéiques issus de tourteaux de colza ou de tournesol disponibles commercialement ne sont destinés qu’à l’alimentation animale et ne peuvent pas être utilisé pour la consommation humaine. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux rats les farines, concentrats ou isolats protéiques seront analysés d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.
Réduction
Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir d'autres végétaux (céréales) ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est de 60. Pour analyser les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons plusieurs tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptées à leur poids. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur un cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi le rat comme modèle animal et plus particulièrement le rat Wistar car ces animaux présentent différents avantages pour les études de vieillissement, notamment au niveau des modifications métaboliques et nutritionnelles. Le rat Wistar a une prévalence de développement tumorale et d’insuffisance d’organe (rein, foie, cœur) plus faible que les autres souches de rat, le rendant plus adapté à l’étude du vieillissement. De plus, ces vieux animaux présentent des modifications anthropomorphiques et morphologiques proches de celles observées chez l’Homme avec l’avancée en âge (augmentation de la masse grasse, diminution de la minéralisation osseuse et réduction de la masse musculaire squelettique). Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de protéines végétales issues de protéagineux ou d’oléoprotéagineux sur le métabolisme musculaire dans un contexte de vieillissement. Les animaux seront livrés à l’animalerie à l'âge de 22 mois. Après 10 jours d'acclimatation, ils seront soumis à différents régimes pendant 8 semaines et auront donc 24 mois à la fin du protocole.
Etude d’une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de maladies autoimmunes du foie sur modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à sept actes en un peu plus d'un mois, dont des injections, deux anesthésies rapprochées, une hyperthermie localisée et un prélèvement de sang intracardiaque terminal, pour tester des nanoassemblages contre l'hépatite auto-immune. Le porteur obtient ce total en triplant un effectif de 896 animaux, soit trois répétitions indépendantes. Le bénéfice annoncé, un traitement ciblé épargnant l'immunité globale, reste une perspective, ces produits n'ayant jamais été administrés à des animaux.
Objectifs
Les maladies auto-immunes comme le diabète de type I, la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque résultent d’un dérèglement du système immunitaire. Parmi ces maladies, l’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie rare avec une prévalence en Europe de 16 à 18 cas pour 100 000 habitants. Ce dérèglement hépatique provoqué par une attaque du foie par des lymphocytes T peut entraîner des défaillances hépatiques et/ou des cirrhoses. Le traitement actuel, non-spécifique (à base d’immunosuppresseurs combinant des corticostéroïdes et de l’azathioprine) présente de nombreux effets secondaires et entraîne une rémission complète en 18 mois pour seulement 75% des patients. De plus, 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après arrêt du traitement. Des nouveaux traitements sont donc nécessaires. Nous souhaitons tester une nouvelle approche de thérapie sous la forme de nanoassemblages (NA) complexes combinant plusieurs stratégies. Une première étape de caractérisation, de validation, et de test de toxicité dans des cellules en culture a été réalisée pour plusieurs formulations, à l’issue de laquelle, 4 différentes formulations ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une poursuite d’étude dans un modèle animal. Nous disposons de 2 modèles murins complémentaires d’une atteinte autoimmune hépatique. Les objectifs du projet sont de tester l’innocuité des 4 formulations sélectionnées sur des souris sauvages, puis de tester l’effet thérapeutique de ces NA sur les modèles murins d’hépatite. Ces travaux permettront in fine de combler l’absence actuelle d’approche thérapeutique ciblée pour le traitement de l’hépatite autoimmune.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir l’efficacité d’une nouvelle approche pour le traitement de l’hépatite autoimmune. Le traitement actuel de cette maladie n’a pas évolué depuis plus de 30 ans et consiste en une immunosuppression non spécifique prise au long cours, qui présente des effets indésirables certains. L’approche testée dans ce projet permet d’envisager un traitement ciblé, permettant de ne pas altérer l’immunité globale du patient.
Procédures
Au maximum, les animaux subiront 7 actes, sur une période de 34 à 37 jours. Des animaux recevront une injection (durée 1 minute, animal anesthésié), suivie 10 jours après d’une injection (durée 30 secondes, animal vigile), puis deux injections seront réalisées à une semaine d’intervalle (durée 1 minute chacune, animal anesthésié). Des souris subiront deux anesthésies à des temps rapprochés, la première pour une injection (durée 1 minute) et la seconde, 6 heures après, pour une phase d’hyperthermie modérée localisée (durée 30 minutes), Enfin, un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Des animaux subiront deux anesthésies gazeuses rapprochées (6 heures d’intervalle), ce qui pourrait engendrer un stress. De plus la seconde anesthésie, d’une durée de 30 minutes pourrait entrainer une dépression cardiovasculaire transitoire, ainsi qu’une diminution de la température corporelle de l’animal. Les modèles d’hépatite utilisés provoquent tous deux une hépatite modérée qui n’entraine pas d’effets indésirables notoires. Pour ce qui est des traitements testés, on ne peut pas savoir à l’avance puisqu’ils n’ont jamais été utilisés chez l’animal. Toutefois en se basant sur la bibliographie utilisant des produits comparables, aucun effet indésirable n’a été rapporté. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après les traitements.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer le foie, les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses d’histologie, de microscopie, de biologie cellulaire et d’immunologie.
Remplacement
Les étapes de mise au point ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser en vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 2688 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 112 lots de 8 animaux = 896 ; 3 répétitions indépendantes : 2688 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. S’il s’avère qu’un traitement présente une toxicité, l’étude de ce traitement ne sera pas poursuivie dans les procédures suivantes. Dans un but de réduction, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les concentrations sont les mêmes pour plusieurs produits et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les manipulations invasives seront précédées d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. A notre connaissance, il n’existe pas de modèle pertinent autres pour notre étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 8 à 10 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de la pathologie et dans la réponse au traitement.
Impact de la consommation précoce de psychotropes médicamenteux sur la physiologie cérébelleuse.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 062 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent cinq à huit injections intrapéritonéales de psychotropes à l'adolescence, puis une série de tests comportementaux mesurant locomotion, coordination, anxiété, dépression, sociabilité et impulsivité, avant la mise à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur qualifie les injections de très bien supportées, tout en prévoyant une prise en charge de la douleur si des signes de souffrance apparaissent. L'étude cherche à comprendre les effets à l'âge adulte des médicaments prescrits contre l'hyperactivité, dont d'éventuels comportements addictifs.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’étudier l’impact de la prise de psychotropes médicamenteux à l’adolescence sur la physiologie cérébelleuse à l’âge adulte, en étudiant l’activité du couple neurone-glie du cortex cérébelleux. Des animaux mâles et femelles seront utilisées pour comparer cet impact sur les différents genres, car il est connu qu’un fort dimorphisme sexuel existe au niveau du cervelet.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre d'une meilleure compréhension de l'action dans le cerveau des psychotropes médicamentaux prescrits dans les troubles attentionnels avec hyperactivité. Les résultats obtenus lors de la réalisation de ce projet permettront également de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que le développement de comportements addictifs ou des troubles de l'impulsivité.
Procédures
La procédure prévoit des injections intrapéritonéales (cinq à huit par animal, étalées sur plusieurs jours). Chaque injection dure au maximum 10 secondes entre la contention de l'animal et l'injection. Les tests de comportement permettront d'évaluer l'impact de la prise précoce de psychotropes sur différents comportements à l'âge adulte: locomotion, coordination, anxiété, dépression, sociabilité, impulsivité. Ces tests ont une durée comprise entre 5-10 min dans la majorité des cas, entre 30 min et 1h pour certains (sociabilité, impulsivité, locomotion). Chaque test sera répété qu'une fois, à l'exception du protocole d'impulsivité qui, incluant des phases d'habituation et d'apprentissage, prévoit des séances étalées sur plusieurs jours (maximum un mois).
Impact sur les animaux
La procédure prévoit des injections intrapéritonéales qui, selon notre expérience, sont très bien supportées par les animaux. Cependant nous resterons vigilants et, si des signes de souffrance étaient détectés, on mettra en place une procédure de prise en charge de la douleur ou mise à mort si un point limite est atteint. Afin de minimiser le stress des animaux, chaque test de comportement sera exécuté qu'une fois par animal et ils seront étalés sur plusieurs jours. Tous les animaux seront habitués à l'expérimentateur (manipulation régulière de l'animal) et aux pièces d'expérimentation (mouvement des cages dans les pièces au préalable).
Devenir
Tous les animaux passeront de façon consécutives dans les 3 procédures et seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives (modèles in vitro, modélisation in silico), n'impliquant pas d'animaux vivants, permettant l'évaluation de l’impact des psychotropes sur la physiologie cérébelleuse à l’âge adulte.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. En plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de mettre en place les tests comportementaux, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Des femelles et des mâles seront utilisées, ainsi que tous les animaux d’une même portée (transgéniques positifs et négatifs) afin de limiter le nombre d’animaux générés sans être utilisés pour l’expérimentation.
Raffinement
En vue du RAFFINEMENT des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Ainsi, les souris sont hébergées en cages collectives présentant un environnement enrichi, dans une pièce dédiée, avec régulation de la température, de l’humidité et de la luminosité. Avant les expériences, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, les doses de psychotropes utilisées sont les doses minimales pour observer un effet physiologique tout en limitant les effets délétères, et les animaux sont surveillés étroitement pendant
Choix des espèces
La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées d'animaux transgéniques exprimant l'enzyme Cre recombinase nous permettant ainsi d'identifier les neurones d’intérêt et d'invalider par recombinaison homologue (système Cre/Lox) nos protéines d'intérêt. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. Les souris utilisées dans cette étude seront traitées par 5 injections de psychotropes sur 10 jours, juste après le sevrage des animaux (de P23 à P31) puis les animaux seront utilisés à l’âge adulte (P75 – 6 semaines plus tard) pour étudier l’impact de la consommation de psychotropes à l’adolescence sur la physiologie cérébelleuse à l’âge adulte.
Triple combinaison : radiothérapie, nanoparticules et immunomodulateurs pour lutter contre les cancer ORL
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, suivie d'injections de nanoparticules d'or et d'immunomodulateurs, de séances d'imagerie et d'une irradiation localisée. Le porteur indique que la tumeur et le traitement peuvent réduire l'alimentation et affaiblir fortement les souris, tuées ensuite car porteuses de tumeurs. La triple combinaison est présentée comme "prometteuse" pour les patients, mais l'apport reste une évaluation d'efficacité chez l'animal.
Objectifs
Le projet répond au besoin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour augmenter la sensibilité des tumeurs aux rayonnements (radiosensibilité). Augmenter la dose maximale de radiation dans les tissus tumoraux tout en cherchant à réduire les dommages aux tissus normaux a toujours été un grand défi en radiothérapie. Les développements technologiques ces dernières décennies ont permis une amélioration croissante de l’indice thérapeutique (différence entre la dose thérapeutique et la dose toxique). En outre, plusieurs stratégies ont été développées et testées pour surmonter la radiorésistance de la tumeur et pour augmenter l’efficacité de la radiothérapie comme l’utilisation de radiosensibilisants. Les radiosensibilisants sont des produits chimiques ou des agents pharmaceutiques qui peuvent améliorer l’effet destructeur sur les cellules tumorales en accélérant les dommages à l’ADN et en produisant indirectement des radicaux libres. À cet égard, le rôle émergent de la nanomédecine pour le traitement de différents types de cancer peut représenter une approche prometteuse pour équilibrer l’efficacité de la thérapie et les effets secondaires. En particulier, l’utilisation d’une nouvelle classe de nanoparticules améliorant le rayonnement pourrait constituer une approche révolutionnaire pour le traitement local des tumeurs solides traitées par radiothérapie. L’objectif principal de ce projet est de mettre au point des nanoparticules synergiques et non persistantes pour la chimio-radiothérapie en vue de la gestion avancée du cancer. Afin d’améliorer l’application potentielle aux cliniques des nanoparticules, leur efficacité sera évaluée dans des modèles in vivo avancés, avec un intérêt particulier pour le carcinome de la tête et du cou qui est globalement le sixième cancer le plus fréquent par l’incidence dans le monde et il est caractérisé par une résistance aux médicaments importants.
Bénéfices attendus
Les nanoparticules métalliques sont développées de plus en plus comme agents prometteurs en oncologie en tant que vecteurs de médicaments et radiosensibilisants. Avec ce projet, nous allons évaluer l'efficacité anti-tumorale des nanoparticules d’or. Nous eallons évaluer l'efficacité de la triple combinaison radiothérapie, nanoparticules métalliques et immunomodulateurs pour obtenir des effets antitumoraux systémiques. Cette triple combinaison propose un modèle original et nouveau de coopération thérapeutique pour lutter contre le cancer, qui pourrait améliorer la prise en charge des patients de cancers des voies aériennes et digestives supérieures.
Procédures
Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux subiront aussi une injection de nanoparticules et, pour certains, une injection d'immunomodulateur (durée 1 minute). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Des animaux subiront une irradiations localisée sur la tumeur par animal (durée 10 minutes).
Impact sur les animaux
Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la capacité de la souris à s’alimenter et affaiblir fortement la souris. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections (peu de nuisances car anesthésie locale) et des séances d'imagerie (stress de préhension).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés car ils seront porteurs de tumeurs. De plus, sur certains lots, des analyses post-mortem seront efectuées sur des tissus .
Remplacement
Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. Les modèles in vivo s’avèrent indispensables pour valider ces résultats avec un système d’administration proche à celle que sera utilisée en clinique (injections intratumorales). Le recours à des modèles animaux est aussi incontournable pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle alternatif permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire complet, et permettant l'étude du microenvironnement tumoral.
Réduction
Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. ces tests ont permis de sélectionner certaines types de nanoparticules qui ont montré une meilleures efficacité en combinaison avec la radiothérapie. Nous allons donc effectuer les test in vivo uniquement avec le meilleur candidat sélectionné sur la base de ces tests préliminaires, ce qui va nous permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires. En outre, la connaissance des deux modèles tumoraux nous permet d'utiliser uniquement deux doses unique de radiothérapie, car nous connaissons déjà la radiosensibilité de ces modèles. De plus, ces modèles sont bien maitrisés au laboratoire, ce qui a permis d'avoir un tas d'inclusion élevé (très bonne prise de croissance des tumeurs). Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet nous nous sommes basés sur des analyses statistiques. Le suivi hebdomadaire des animaux permettra de réduire le nombre d'animaux utilisées (augmentation de la puissance statistique).
Raffinement
Un suivi quotidien clinique pour recherche de signes éventuels de souffrance sera effectué, et des mesures d'analgésies seront mises en oeuvre en cas de besoin. Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral grâce à l'imagerie in vivo et par des mesures directes. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement appliqués. L'environnement sera enrichi avec des sizzlenests et des tunnels en carton afin de diminuer l'angoisse. Les interventions (injections, imagerie) seront faites sous anesthésie.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: - La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature.