Rongeurs

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le parasite de la leishmaniose est injecté dans l'oreille, puis les lésions sont suivies pendant plusieurs mois, le porteur indiquant que des ulcérations peuvent se développer et durer jusqu'à douze semaines. Il étudie le rôle d'un récepteur immunitaire dans cette maladie et situe le bénéfice, une thérapie, à long terme. Il affirme que les mécanismes inflammatoires ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un organisme entier.

Objectifs

Les leishmanioses sont des pathologies causées par le parasite leishmania qui font de plus en plus de ravages autour du monde. Aujourd’hui plus d’un milliard de personnes vivent dans des zones endémiques et peuvent donc contracter le parasite et développer la maladie. Les manifestations cliniques des leishmanioses cutanées chez l’homme peuvent varier de nodules, pustules, ulcères, jusqu’à atteindre des défigurations au niveau du visage et parties externes du corps. La nature de la réponse immunitaire dans la physiopathologie des leishmanioses cutanées joue un grand rôle dans la résolution ou la persistance de la maladie. La reconnaissance du pathogène par le système immunitaire se fait grâce à des recepteurs présents sur les cellules immunitaires. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’interaction du parasite avec un récepteur immunitaire pour comprendre le rôle que joue ce dernier dans cette pathologie et suivre la réponse immunitaire qui peut en résulter.

Bénéfices attendus

Les leishmanioses cutanées peuvent être contractées par l’homme de tout âge, comme par l’animale. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer des traitements efficaces mais à ce jour il n’existe pas de traitement effectif pour cette pathologie. Il devient donc de plus en plus urgent de se pencher sur cette pathologie car cette dernière risquerait de se propager rapidement dans les prochaines années. Cela serait dû à plusieurs facteurs dont le réchauffement climatique. L’objectif à long terme est de développer une thérapie efficace en ciblant des récepteurs présents sur des cellules immunitaires afin de réduire et limiter ainsi l’invasion parasitaire.

Procédures

-1 Injection dans l'oreille pendant 15 secondes -Suivi hebdomadaire de l'évolution des lésions pendant 15 mois

Impact sur les animaux

Suite à l’injection de parasites, les souris peuvent présenter une douleur modérée, une inflammation localisée au site de l’injection. Par la suite, des ulcérations peuvent se développer à partir de la semaine 2-3 et peuvent durer jusqu’à 12 semaines. La manipulation de souris pour le suivie s’effectuera à partir du moment de l’injection jusqu’à la semaine 20 post injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocol expérimental afin de réaliser diverses prélèvements (tissus, sang, organes...)

Remplacement

Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle du récepteur CD32a dans la réponse inflammatoire dans le cas des leishmanioses cutanées. La pathologie étant cutanée, le développement de lésion est le symptôme dominant observé dans cette pathologie. Ainsi, les mécanismes physiologiques et immunologiques complexes aboutissant à cette inflammation ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo.

Réduction

Un total de 96 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 3 études de 6 groupes (groupes contrôles et groupes infectés) avec 6 animaux par groupe (pour les groupes infectés) et 4animaus (pour les groupes contrôles) sur une durée de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable de 5. La nourriture, et l’eau de boisson seront fournies. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être ainsi que de l'enrichissement (batonnet de bois, coton, maison en cellulose). Au moment de leur entrée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation (une semaine) et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C). Les souris seront surveillées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse général et avec un analgésique. Les injections sous la peau seront réalisées avec grand soin pour éviter d’atteindre le muscle. On a mis en place une fiche de scoring comme point limite fafin de prendre en charge l’animal au cas où il y a atteinte à son bien-être et pour éviter la souffrance animal.

Choix des espèces

Deux modèles murins sont choisis pour étudier le rôle du récepteur, des souris sauvages qui n’expriment pas le récepteur et une lignée transgénique de souris exprimant ce récepteur. La souris adulte, agée entre 6 et 8 semaines, est le modèle le plus utilisé dans l'étude de la leishmaniose cutanée puisque c'est un mammifère et qu'il est aussi bien connu. En plus de cela, le comportement de la souris est bien étudié ce qui nous permet de lui administrer les soins nécessaires pour limiter et réduire sa douleur.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injection de virus et implantation d'une fibre optique, un isolement d'une semaine pour la calorimétrie, une restriction hydrique pour les tests d'apprentissage et une aversion olfactive provoquant un inconfort gastrique. Le porteur étudie le rôle de neurones de l'hypothalamus dans la prise alimentaire et l'olfaction, en lien avec l'obésité. Il affirme que ces paramètres comportementaux ne peuvent être obtenus ni in vitro ni chez les invertébrés, dépourvus des structures cérébrales équivalentes.

Objectifs

Le métabolisme et le comportement alimentaire sont en majeur partie régulé par le cerveau. L'expression des certains facteurs au niveau cérébral pourrait en particulier avoir des effets sur le dialogue entre olfaction et métabolisme . Ces mécanismes étant encore très mal connus, le but de cette étude est de les disséquer afin de comprendre leur impact des conditions physiologiques et physiopathologiques (obésité). L’inactivation ou la surexpression ciblée de facteurs de transcription dans des régions précises du cerveau de souris sera mise en place pour mieux comprendre leur rôle. La balance énergétique des animaux (calorimétrie indirecte) ainsi que différents comportements (tests olfactifs) seront alors analysés. L’activité des neurones sera également enregistrée à l’aide d’une méthode optique (photométrie fibrée). Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le métabolisme et le comportement de l'animal. Ce projet utilisera le minimum de souris nécessaire (4 études comportant des groupes de 12 à 16 souris (contrôles et traitées); soit 396 souris sur les 4 ans de projet) et respectera le bien-être animal. Lors de ces études la règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum et nous raffinerons les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Nous effectuerons l'administration d'analgésique lors des procédures. Les cages individuelles sont agrémentées d’un nid végétal et quelques croquettes sont mises à même le sol pour éviter les douleurs de tension au niveau de la suture après les opérations.

Bénéfices attendus

En combinant des études comportementales et métaboliques après l’inactivation ou la surexpression ciblée d'une protéine dans des régions précises du cerveau de souris, nous comprendrons mieux les liens entre les régulations neuronales hypothalamiques et la métabolisme en lien avec l'obésité. Nous considérons que cette étude apportera également une information importante concernant la composante olfactive de la prise alimentaire et de la balance énergétique chez la souris dans les différentes conditions décrites. Ce sont des paramètres très sensibles où le bien-être animal est absolument crucial, autant pour l’animal que pour la validité des résultats obtenus.

Procédures

Nous utiliserons différentes procédures de chirurgie pour l’injection de virus et l’implantation chronique de fibre optique pour des études chez les souris éveillées (chirurgie entre 40 min et 1h), Analyse de calorimétrie indirecte (les animaux sont isolés pour environ 7 jours), Analyse métabolisme du glucose (prélèvements de sang sur environ 2h d’expérience), Tests olfactifs (30 min d'habituation à la cage puis 30 min de test le jour suivant), aversion olfactive conditionnée (injection d’une solution induisant un inconfort gastrique de 1 heure environ, test le jour suivant), test d'apprentissage (environ 1 séances de 20 min par jour pendant 8-10 jours, la prise hydrique des animaux est diminuée dans la cage d'hébergement, les animaux boivent dans la cage de test).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pourront se produire lors de la chirurgie cérébrale, lors de la mise en restriction alimentaire ou hydrique, lors de l'isolement des souris. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour toutes ces raisons, nous avons prévu des injections d'anti-inflammatoire et une récupération post-chirurgicale sous surveillance pour détecter toute perte de poids ou d'autres problèmes de santé ou de bien-être. Pour les tests métaboliques, des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir mais nous avons prévu les prélévements en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes (détaillées dans les procédures expérimentales). Lors de la restriction alimentaire les souris sont surveillées, si un mal être est observé chez un individu il est immédiatement remis ad libitum. Pour la procédure de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion.

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux afin de prélever le cerveau pour vérifications des points d'injections et analyses.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles).

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 3 mois) afin que les réseaux neuronaux soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale accrue.

1 010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras pendant quinze semaines, des injections quotidiennes, des tests métaboliques dont un test à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie sévère, et des séances de nage forcée deux fois par jour, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur étudie le remodelage cardiaque lié à l'obésité et au vieillissement et attend une amélioration des fonctions cardiaques par un composé testé. Il présente l'analyse de la fonction cardiaque, décrite comme celle d'un "organe entier", comme impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Dans un premier temps, il s’agit d’effectuer une analyse in vivo et histologique de modèles murins pour les tissus d’intérêt comme le cœur, le rein, le foie et le tissu adipeux dont le but est de : 1) comparer la reproductibilité des données en utilisant un protocole unique et standardisé sur les modéles murins de diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses, 2) mettre en place une bio-banque d’échantillons de sang et de tissus pour réaliser des analyses multi-translationnelles, 3) étudier le rôle des macrophages résidents du coeur dans un contexte d’obésité. Le deuxième objectif du projet est de définir des nouvelles stratégies thérapeutiques prévenant le développement de cardiomyopathie dont la formation est liée aux altérations induites par des troubles métaboliques (l’obésité et le diabète) et le vieillissement accéléré du cœur dans ce contexte d’obésité (inflammation, dommages faits à l’ADN, dysfonction mitochondriale). Etape 1) Evaluer l’effet de molécules à fin thérapeutique modulant spécifiquement l’action de molécules impliquées dans le métabolisme sur la fonction cardiaque. Etape 2) Valider et optimiser la molécule cible sur les troubles métabolliques. Etape 3) Définir les mécanismes d’action spécifiques de la molécule thérapeutique sur l’amélioration de la fonction cardiaque et sur la résolution de l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité des données en comparant dans différents laboratoires en Europe l’impact d’un régime riche en graisses chez des souris mâles et femelles de type C57BL/6 sur la structure et la fonction cardiaque ainsi que l’évaluation métabolique et l’impact sur d’autres organes comme le foie, le rein ou le tissu adipeux. L’identification du rôle des macrophages dans le vieillissement cardiaque permettra d’identifier de nouvelles voies pathophysiologiques et donc d’envisager de nouvelles thérapies. Enfin, nous attendons une action géroprotrectrice et plus généralement une protection renforcée des tissus avec une haute tolérance du produit chez les animaux traités. De plus, de façon plus spécifique, nous attendons une amélioration des fonctions cardiaques avec une action anti-fibrotique ainsi qu’une amélioration des dommages faits à l’ADN. Ces données pourraient permettre de repositionner certaines molécules dans le traitement des cardiomyopathies métaboliques, pourvoyeuses d’insuffisance cardiaque en pathologie humaine.

Procédures

Echocardiographie : Geste non-invasif permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé sur animaux vigiles préalablement épilés, sur tous les animaux. Il s’agit de maintenir les animaux sur le dos pour une durée de 3-4 minutes, le temps d’appliquer la sonde d’échographie et de procéder à l’enregistrement de l’échocardiogramme. Grip test : Test de préhension soutenue non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire. Il sera réalisé sur animaux vigiles pour l’ensemble des animaux. Il s’agit de laisser les animaux s’agrippés par leurs pattes avant en utilisant les barres reliées à un capteur permettant d’enregistrer le temps de résistance musculaire à une force et de quantifier la force maximale du rongeur (en secondes). Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goûte de sang à la queue que l’on récupère afin de procéder à la lecture de la glycémie. Injections : Sur animaux vigiles, on effectue en quelques secondes une injection quotidienne en i.p. ou en sous-cutané (selon l’efficacité de distribution du produit) en utilisant des aiguilles fines afin de limiter la souffrance chez l’animal. Exercice physique : Séances biquotidiennes de natation en cuve d’eau chauffée à 33°C ± 2°C espacées de 6h et augmentant progressivement de 5 à 40 min pendant une période de 6 semaines. Après la natation, les animaux sont essuyés et laisser sous lampe chauffante le temps du séchage. Régime riche en graisse : Alimentation des souris avec un régime enrichie en graisse apportant 60% de l’apport énergétique sous forme de lipides pendant 15 semaines. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mient à jeun pendant 6h, injection en i.p. (vol max 200µl, calculé en fonction du poids de l’animal) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime. Gavage : Technique non utilisée sur les animaux âgés (8 et 24 mois) et uniquement dans le contexte d’un produit ne pouvant être administré en eau de boisson. Sur animaux vigiles, on effectue un gavage quotidien ( maximum 30 sec) pendant 30 jours à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une sonde de gavage adaptée sans induire de souffrance ou détresse chez les souris.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu lors de la réalisation de l’échocardiographie ou du test de tolérance au glucose. Lors de la réalisation du test métabolique de tolérance à l’insuline, l’injection d’insuline peut entraîner une hypoglycémie sévère qui pourra être détectée par mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre et qui sera immédiatement prise en charge par l’administration d’une dose de glucose. L’animal sera alors sous haute surveillance jusuqu’au rétablissement d’une glycémie normale, c’est-à-dire à partir de 80 mg/dL. La pratique de l’exercice physique peut entraîner une perte de poids et une fatigue chez l’animal qui est directement lié à la pratique régulière d’une activité physique. À la suite de ces observations, les temps de pratique de l’exercice physique seront ré-évalués chez les animaux concernés. Le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métabloliques. La surveillance hebdomadaire de la prise de poids puis un contrôle de la glycosurie en cas de prise de poids trop importante assurera le suivi nécessaire à cet effet. Les injections quotidiennes peuvent entraîner l’apparition d’un hématome. Pour éviter cela, les injections seront pratiquées en changeant de côté régulièrement pour laisser du temps à la résorption d’un éventuel hématome. L’administration orale du produit se fera autant que possible dans l’eau de boisson. Nous limiterons l’utilisation de la méthode de gavage pouvant entraîner un stress chez les animaux, surtout âgés et afin de limiter les désagréments chez l’animal et le dépôt de la substance dans le poumon ou la rupture de l'estomac ou de l'œsophage.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Pour cela, nous utilisons le modèle expérimental de la souris. Nous remplaçons les cellules primaires par des lignées cellulaires dans nos tests "in vitro" : soit en utilisant les lignées cellulaires H9C2 de cardiomyocytes, les lignées 3T3L1 d'adipocytes pour les co-cultures, soit des lignées cellulaires de macrophages murins (raw264) comme cible de l’action sénolytique des molécules thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour nous assurer de l’obtention de résultats concluants afin de répondre aux questions posées en tenant compte des expériences antérieures du laboratoire sur le stress métabolique induit par le régime riche en graisse ayant été étudié préalablement sur ce fond génétique: il faut entre 10 à 15 animaux par lot pour obtenir une réponse statistique fiable des expériences puisque nous n'obtenons pas de réponse équivalente chez tous les animaux en expérimentation. De même, le nombre de souris a été optimisé pour chacune de nos procédures expérimentales tout en assurant une reproductibilité et une robustesse dans nos expérimentations, mettant à profit nos connaissances sur les tranches d’âge auxquelles nous devons réaliser nos expérimentations afin d’être le plus pertinent possible dans l’établissement de nos procédures. Enfin, afin d’utiliser au mieux les animaux, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus)..

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

La cardiomyopathie est bien caractérisée chez les mammifères avec des méthodes d’analyse facilement accessibles et reproductibles. Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Le modèle expérimental choisi est donc la souris. Ce modèle murin présente l’avantage de développer un vieillissement relativement rapide et d’offrir des conditions très reproductibles de développement d’une cardiomyopathie métabolique. Enfin, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. L’étude se fera sur des souris à un stade de jeune adulte (5 mois) et à deux stades âgés (12, 18 mois) et à un stade très âgé (24 mois). Pour l’étude portant sur le vieillissement cardiaque, nous utiliserons des animaux mâles âgés de 12, 18 et 24 mois. Pour l’étude de l’obésité conjugué au viellissement, nous utiliserons des souris jeunes adultes de 5 mois dont le fonctionnement du système cardiovasculaire commence à subir les effets du vieillissement et de 12 mois d’âge dont leur système cardiovasculaire est altéré spontanément par le vieillissement.

3 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une molécule induisant une fibrose pulmonaire est injectée dans la trachée après incision et suture, puis un traitement ciblant un récepteur immunitaire, avant mise à mort et prélèvement des poumons. Le porteur indique que la fibrose peut provoquer des difficultés respiratoires, une perte de poids et une mortalité inférieure à 20 %. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser un organe entier et qualifie la souris d'animal "incontournable" pour les enjeux de santé humaine.

Objectifs

Le système immunitaire regroupe des récepteurs permettant de réguler la réponse immunitaire. L’une des thérapies anti- cancéreuses révolutionnaires consiste à bloquer un sous type des récepteurs immunitaires. La Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) est une maladie respiratoire chronique associée à une mortalité élevée. Toutefois, l’étude des récepteurs immunitaires dans la FPI représente un domaine sous-étudié. Nos précédents travaux de recherche ont montré l’implication d’un récepteur X dans le contrôle des maladies respiratoires, telles que l’asthme allergique. Nos nouveaux résultats préliminaires suggèrent aussi une implication remarquable du récepteur X dans la FPI. L’hypothèse qui sous-tend ce projet de recherche est que le ciblage du récepteur X dans la FPI permettrait de reprogrammer les cellules immunitaires vers une fonction anti-fibrosante. Les objectifs du projet sont 1) d’évaluer l’expression de X sur les différentes cellules immunitaires dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence du récepteur X sur le développement de la fibrose pulmonaire dans une souris transgénique et 3) d’étudier l’efficacité d’un traitement ciblant X dans un modèle de souris humanisée. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider X comme une nouvelle cible thérapeutique dans la FPI.

Bénéfices attendus

La FPI est une maladie respiratoire chronique et fatale. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle modulateur d’un récepteur immunitaire dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. Atteindre cet objectif de recherche exige l’étude des mécanismes immunitaires pertinents dans un organisme animal vivant respectant la complexité du système immunitaire qui implique plusieurs organes, types cellulaires et médiateurs. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.

Procédures

Nous utilisons dans ce projet des souris contrôles, des souris transgéniques n'ayant pas le récepteur X et des souris humanisées ayant un système immunitaire humain fonctionnel. En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, les souris recevront deux doses d’une protéine thérapeutique permettant de moduler le récepteur X. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’œsophage au lieu de la trachée. Avant l’injection thérapeutique un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à des temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose. Dans les modèles de fibrose adoptés, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose, à partir du 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection. La mortalité ne survient en règle générale pas au décours immédiat de l'injection ni entre J0 et J7 après celle-ci, ce qui suggère qu'elle est la conséquence du développement de la fibrose et non du geste en lui-même. Cette mortalité est en général < 20% des effectifs.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères; des conférences en pneumologie/immunologie, et une recherche bibliographique approfondie. Il faut noter que des méthodes alternatives basées sur l'utilisation des cellules humaines sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions. En particulier, ces modèles n’intègrent pas les cellules immunitaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme de leur recrutement aux poumons.

Réduction

Des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction. Nous allons par exemple collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales et partager des tissus/organes au sein de notre unité de recherche. Dans ce même contexte, nous adoptons une approche bio-informatique qui permet de prédire une réaction biologique, et ainsi réduire le nombre de souris nécessaires pour la réalisation de ce projet. En outre, des mesures strictes seront prises pour éviter les biais expérimentaux comme la randomisation et le travail en aveugle.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les gestes invasifs (injections intratrachéales et intranasales) sont réalisés sous anesthésie. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’à la fin du protocole. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie, posture, rythme respiratoire...), la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par surdosage en anesthésique en injection péritonéale.

Choix des espèces

D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie et a permis de tester la sécurité et l’efficacité des thérapies ciblant les récepteurs immunitaires avant les essais cliniques humains. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. En outre, les souris reconstituées avec des cellules immunitaires humaines permettent la mise en place de modèles bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie d'électroporation in utero, les souriceaux une électroporation sous anesthésie par le froid, et la moitié des portées est placée huit jours dans un environnement appauvri en oxygène. Le porteur indique que cette hypoxie provoque un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses, tout en affirmant qu'elles n'entraînent pas de troubles du comportement. Il décrit l'approche in vivo comme "incontournable", les lésions post-hypoxiques dépendant de mécanismes qu'il juge impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Objectifs fondamentaux du projet : 1) fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral; 2) développer de nouvelles approches permettant de promouvoir la régénération du cerveau après une lésion périnatale.

Bénéfices attendus

Sur un plan fondamental, nos résultats permettront de caractériser le rôle des voies de signalisation morphogéniques (c-à-d les voies impliquées dans le développement du tissu) dans l’induction de quiescence et l’activation des cellules souches neurales du cerveau postnatal. Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale est limitée après la naissance, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. Nos résultats permettront aussi d’évaluer la pertinence d’une manipulation de ces voies de signalisation pour encourager la régénération du cerveau après une lésion précoce.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des femelles et des souriceaux seront soumis à une administration unique de tamoxifène. Des souriceaux seront soumis à une procédure d'électroporation postnatal qui ne nécessite pas de chirurgie, mais qui s'effectue sous cryo-anesthésie. Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie

Impact sur les animaux

Pour les souris femelles : L’injection de tamoxifène peut entraîner des complications lors de la mise bas, qui sont prévenues par co-injection de progestérone. L’administration se fera par gavage afin d’éviter tout risque d’injection à proximité d’un embryon. L’hypoxie chronique peut entrainer une réduction de la quantité et qualité de lait que produisent les femelles, qui est évitée en échangeant régulièrement les femelles entre les conditions normales et réduites en oxygène. Pour les souriceaux : L’électroporation postnatale implique une anesthésie sur glace. Afin d’éviter toute brulure cutanée, le souriceau est isolé de la glace. L’hypoxie chronique entraîne un retard de croissance transitoire et des lésions cérébrales diffuses, qui n’induisent cependant pas de troubles du comportement spontané des souris élevées en cage.

Devenir

Afin d'effectuer des analyses permettant d'étudier l'impact des manipulations sur le comportement et le devenir des cellules souches neurales, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour collecter les tissus et effectuer des analyses transcriptomiques ou histologiques.

Remplacement

Une approche in vivo est incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les lésions neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer la complexité des différents micro environnements dans lesquelles les cellules souches neurales transitent et se développent.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d’expériences publiées. Les portées seront analysées au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus certaines expériences en conditionneront d'autres. Par exemple, si l’électroporation d’une forme inactive d’un récepteur n’induit aucune activation des cellules souches neurales, alors les expériences de knock-out conditionnel de ce récepteur prévues dans la procédure 2 seront abandonnées, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages variés, nous permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissue permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (anesthésie et analgésie). Un suivi journalier des animaux post chirurgie ou post hypoxie, permet de déterminer des points limites stricts et spécifiques au projet par le calcul un score d'inconfort à partir duquel l’animal reçoit une injection d’analgésique, un suivi plus fréquent, ou est euthanasié. Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les femelles seront régulièrement échangées entre les cages standards et celles réduites en oxygène, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, nous avons établi des méthodes d’étude des cellules souches neurales et des progéniteurs de la zone périventriculaire et un modèle de lésion cérébrale périnatale, qui nous assurent que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines. Pour les expériences de manipulations génétiques in utero, des embryons de 15±1 jours seront ciblés. Pour les expériences de manipulations génétiques postnatales, des souriceaux de 2±1 jour seront utilisés. Le choix de ces deux temps d’intervention se fera en fonction de la nature des protéines ciblées, pour permettre une expression maximale au moment de l’hypoxie. Les souriceaux seront placés en condition hypoxique du 3ème jour au 11ème jour après la naissance. Cette période correspond au 3ème semestre de croissance intra-utérin chez l’homme. Ce modèle permet donc de reproduire les périodes d’hypoxie fréquentes observées chez les grands prématurés. Enfin l’administration de molécules thérapeutiques se fera en fin de période hypoxique aux jours 11 et 12, afin de tester leur capacité à régénérer le tissu.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections intramusculaires et jusqu'à sept prélèvements de sang, avant mise à mort pour prélever les muscles injectés. Le porteur affirme n'attendre aucun signe clinique et présente ce contrôle d'immunogénicité comme "nécessaire" à son dossier réglementaire avant des essais cliniques sur un candidat myorelaxant. Sur le remplacement, il indique que la pertinence des modèles cellulaires reste débattue et que le système immunitaire ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité de notre produit (FTP-501) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène (développement de réaction pro-inflammatoire) de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) (anticorps dirigé contre notre propre molécule) suite aux injections de notre composé. Cette molécule pourrait a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante. De plus ce test est nécessaire pour l’évaluation de notre dossier règlementaire en vu des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ainsi, ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections du composé FTP-501 et que par conséquent notre produits est très bien toléré après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 6 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 3 min - Pesée des animaux = 10 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 5 min / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (7 maximum).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure sont concernés En effet, les muscles injectés seront prélevés pour analyse histologie.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis) a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 20 animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seront surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 30 semaines maximum en fin d’expérimentation. Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire

Pour reproduire l'amblyopie, un trouble de la vision qui se constitue dans la petite enfance, 144 ratons Long Evans vont être utilisés entre leur 12e et leur 22e jour de vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Sous anesthésie profonde, l'équipe coud une paupière aux ratons opérés, en quatre points, avant l'ouverture des yeux, puis rend chacun à sa mère. Le porteur affirme, en s'appuyant sur la littérature, que ces gestes sont "non douloureux en période post-opératoire" et que la suture est "bien tolérée", et dit avoir choisi ces rats pour leur acuité visuelle, supérieure à celle des rats Wistar. En cas de problème lié à la suture, une infection par exemple, le raton est "écarté du lot" et mis à mort aussitôt.

Objectifs

Notre équipe a le projet de décrypter les mécanismes de plasticité neuronale mis en jeu dans l’amblyopie, une pathologie dont la conséquence première est une vision anormale. Elle est l’une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Ce n’est pas une maladie de l’œil, le récepteur visuel étant normal mais du système nerveux intégrateur. L’acuité visuelle à la naissance est faible à cause de l’immaturité du système nerveux visuel. Pendant une période de forte plasticité neuronale chez le petit enfant, des différences de réfraction, d’alignement entre les deux yeux ou une opacité d’un œil amènent à un défaut d’intégration des signaux neuronaux provenant de l’œil faible. Le traitement, seulement possible avant 6-7 ans, se fait d'abord en corrigeant le défaut visuel, puis en rééduquant l’œil amblyope par pénalisation de l’œil dominant. Ce projet propose de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires de la plasticité cérébrale au cours du développement des neurones du corps genouillé lateral dorsal (dLGN), premiers relais thalamiques de la stimulation visuelle en mimant l’amblyopie sur le rat Long Evans par suture d’une paupière avant l’ouverture des yeux.

Bénéfices attendus

L’amblyopie est un déficit visuel fonctionnel chez l’humain qui, s’il n’est pas traité dans une période de temps limité avant 6-7 ans, est irréversible. C’est la principale cause de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes neuronaux à l’origine de la perte de réponse du cortex cérébral aux stimuli visuels dans l’objectif d’allonger la fenêtre thérapeutique au-delà de l’enfance.

Procédures

Suture de la paupière (4 points de sutures) sur un matelas chauffant sous anesthésie profonde associée à une analgésie locale oculaire. Après le réveil les ratons sont remis à la mère . Durée totale de l’intervention : 10 minutes. Dans la littérature ces gestes chirurgicaux sont non douloureux en période post-opératoire, la suture est bien tolérée par l’animal (pas de signe de grattage, automutilation, ni réaction négative de la part de la mère). On réalise ensuite une surveillance journalière de la tolérance des sutures de paupières.

Impact sur les animaux

Suite à la procédure de privation visuelle monoculaire par suture palpébrale, l’apparition d’effets indésirables sera contrôlée quotidiennement, en particulier : - risque d’infection au niveau des points de suture - risque d’arrachement des points de suture.

Devenir

Euthanasie préalable au prélèvement du tissu cérébral sur lequel seront réalisées les expérimentations.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est indispensable dans le cadre de ce projet dans la mesure où il est nécessaire de priver le système nerveux d’entrées sensorielles au cours du développement. L’utilisation de culture de neurones est donc naturellement exclue.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux sera faite -Grâce à l’utilisation de rat des 2 sexes. - En multipliant le nombre d’expérimentateurs qui travaillent en parallèle sur le cerveau d’un rat sacrifié pour les mesures des phénomènes électriques des neurones, leur durée de survie étant limitée. -En miniaturisant le matériel cellulaire à prélever pour les analyses biochimiques grâce à l’utilisation de technologies de dernière génération de grande sensibilité. -En maintenant une formation régulière du personnel sur les techniques de sutures de paupières par les praticiens hospitaliers de notre laboratoire

Raffinement

Suture de la paupière (4 points de sutures) sur un matelas chauffant sous anesthésie profonde associée à une analgésie locale oculaire. Après le réveil les ratons sont remis à la mère en vérifiant que celle-ci les reprend bien en charge. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement par un personnel expérimenté. En cas de problème lié à la suture (par exemple infection) l’animal sera écarté du lot et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus utilisé actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux de plasticité du système visuel. Notre laboratoire a acquis depuis quelques années une grande expertise dans le domaine de l’électrophysiologie neuronale, en particulier chez le rat. Nous avons choisi de mener notre étude sur des rats Long Evans dont l’acuité visuelle est supérieure à celle des rats Wistar habituellement utilisés au laboratoire. Les animaux seront utilisés entre J12 et J22, période critique de développement de la fonction visuelle.

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une septicémie provoquée par ligature et perforation du caecum, un modèle que le porteur reconnaît induire une mortalité élevée, avant injection de cellules stromales dans la cavité péritonéale. Les souris sont réparties par âge, jusqu'à deux ans, pour évaluer l'effet du traitement au cours du vieillissement. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de confirmer in vivo des effets déjà montrés in vitro et qu'une étude chez la souris est "nécessaire".

Objectifs

L'objectif du projet est de mettre en évidence l'effet de différentes populations de cellules stromales sur la résolution d'une septicémie induit après une péritonite au cours du vieillissement et de comprendre les mécanismes d'action des différentes populations cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en évidence l’effet des cellules stromales mésenchymateuses "naives" ou primées sur l’inflammation et la résolution d'une septicémie induite après une péritonite et d’étudier l’intérêt de ce traitement au cours du vieillissement. En effet, nous espérons que les cellules stromales mesenchymateuses diminueront l’inflammation induite par la péritonite augmentant ainsi la survie des animaux. De plus, notre étude nous permettra de mieux comprendre le mode d'action des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de péritonite.

Procédures

La péritonite est induite chez certains animaux par ligature et ponction du caecum. Les souris sont endormies par inhalation d’un gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. La profondeur de l’anesthésie est évaluée par l’absence de réponse à la stimulation des extrémités. Une incision cutanée au niveau de l’abdomen est réalisée puis l’ouverture de la cavité péritonéale est réalisée au ciseau. Le caecum est ligaturé et perforé à l’aide d’une aiguille. Après injection de différentes populations de cellules stromales mésenchymateuses dans la cavité péritonéale encore ouverte, la fermeture du péritoine en deux plans est réalisée. Réalisée par une personne entrainée, la chirurgie dure entre 7 et 10 min. Avant l'intervention, un analgésique est injecté sur animaux endormis Pour les animaux chez qui la péritonite sera induite par injection de composés protéiques, les animaux auront 2 injections intrapéritonéales l’une contenant le composés protéiques l’autres les cellules thérapeutiques. Avant l'intervention, une injection sous cutané d’analgésique est réalisée sur animaux vigiles. L'injection d'analgésique sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours

Impact sur les animaux

Le modèle de péritonite induit par ligature et ponction ceacale est un modèle qui induit une mortalité assez élevée chez les animaux opérés. La douleur induite par la chirurgie et par l'induction de la péritonite est gérée par administration d'analgésiques.

Devenir

Tous les animaux suivant ces différents protocoles seront mis à mort afin de permettre l'analyse de l'effet des différents traitements sur la réponse immunitaire, l'inflammation générale et les lésions des différents organes de la cavité péritonéale.

Remplacement

L'effet immunomodulateur des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses a été démontré in vitro mais il est indispensable de confirmer ces résultats in vivo, en ayant une vraie situation d’inflammation mettant en jeu l’ensemble des partenaires cellulaires qui interviennent lors de l’inflammation. Une étude chez la souris s’avère donc nécessaire.

Réduction

Notre expérience nous permet de déterminer que le nombre de 5 souris par groupe et la réalisation en triplicat de l'expérience nous permettra d'évaluer l'effet de nos différentes populations cellulaires et de diminuer ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous inclurons suffisamment de souris par groupe et effectuerons trois expériences indépendantes pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’expérience de notre laboratoire nous permet de déterminer le nombre optimal de souris à utiliser par lot.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés sous gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. Un antalgique est placé dans l'eau de boisson des animaux 24h avant l'intervention puis de manière continue après la chirurgie. Vu la stabilité de la molécule, le biberon sera changé tous les jours. De plus, une injection d’un analgésique sera effectuée au moment de la chirurgie sur animaux endormis afin de diminuer la douleur. Cette injection sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Les animaux seront élevés à 5 animaux par cage) afin de limiter le stress lié à la chirurgie et à l'isolement. Du papier type kleenex ainsi que des cabanes type "igloo" seront ajoutés dans la cage afin de respectivement permettre la formation du nid et d’enrichir l’environnement de vie des animaux. Des croquettes imbibées d'eau contenant un analgésique seront placées directement dans la cage afin de limiter au maximum l'extension des animaux opérés. De plus, une grille de score et l’utilisation de point limite adaptés permettront de définir les critères d’arrêt de souffrance et d'entraîner la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle complexe qui nous permettra d'évaluer l'effet de nos cellules d'intérêt sur la réponse inflammatoire locale mais également en systèmique. De plus, le modèle de sepsis chez la souris est très bien décrit nous donnant des informations essentielles au bon déroulement de notre procédure. Enfin, les outils techniques et biochimiques nécessaires à l'analyse des données obtenues sont développées chez cette espèce. Les personnes âgées présentent un risque accru de mortalité lors d’une évolution négative d’une péritonite. L'utilisation d'animaux à différents âges (8 semaines, 1 an, 2 ans) nous permettra d'évaluer l'intérêt d'utiliser les différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses comme traitement d'un sepsis induit après péritonite au cours du vieillissement.